JPH0453508B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 或種の微生物、特に特定の微生物−欠損突然変
異体が、ステロイド化合物の中間分解生成物とし
てヘキサヒドロ−インダノン−誘導体を生成させ
ることは知られている。すなわち、例えばノカル
デア・コラリナ（Nocardia corallina）IFO3338
から誘導される突然変異株はコレステリンから就
中構造式： で表わされる3aα−Ｈ−4a−〔3′−プロピオン酸〕
−5α−ヒドロキシ−7αβ−メチル−ヘキサヒドロ
−１−インダノン−δ−ラクトンを生成させるこ
とが知られている〔T.ナカマツ（Nakamatsu）
著、アグリツク・ビオロ・ケミ（Agric.Biol.
Chem.）第44巻(7)、第1469〜1474頁（1980年）参
照〕。その際に、発酵過程の第一反応生成物とし
て所属の遊離のヒドロキシカルボン酸、３−（5α
−ヒドロキシ−7αβ−メチル−１−オキソ−3aα
−Ｈ−ヘキサ−ヒドロインダン−4α−イル）−プ
ロピオン酸が生成する。この分解生成物を含有す
る培養液を、例えば硫酸を用いてPH2.0又はそれ
以下に酸性化することにより、前記のδ−ラクト
ンが生成する（フランス特許第2387288号明細書
参照）。その他の著述者は、シトステリンを突然
変異体ノカルデイア（Nocardia）SP.M29で前記
の構造のα−ヒドロキシカルボン酸に変換するこ
とについて記述している（u.シエーマー
（Scho¨mer）著等、ヨ−ロビアン・ジエイ・アツ
プル・ミクロビオル・ビオテクノル
（EuropeanJ.Appl.Microbiol.Biotechnol.）第10
巻、第99〜106頁（1980年）比較〕。その他に、こ
のステリンの部分的分解生成物、特にシトステロ
ールの生成に関しては、米国特許第4176123号及
び第4042459号明細書並びにドイツ特許出願公開
2746323号明細書に見い出される。胆汁酸の微生
物分解についてもヘキサヒドロ−１−インダノン
−δ−ラクトンの生成が確認されている−これに
ついての比較、例えばナカマツ（Nakamatsu）
等著、前記の文献、第1473頁及びS.ハシモト
（Hashimoto）等著、ビオシエム・ジエイ
（Biochem.J.）第164巻、第715頁（1977年）。

本発明は従来記載されていない突然変異体ロー
ドコツカスエリスロポリス（Rhodococcus
erythropolis）−K14を使用することを目的とし、
この突然変異体K14はコレステリン分解の野生株
コール（Chol）149から紫外線照射により単離し
たものであり、これは好気的条件下で水性培養基
中で天然のステリンを微生物分解して３−（5α−
ヒドロキシ−7αβ−メチル−１−オキソ−3aα−
Ｈ−ヘキサ−ヒドロ−インダン−4α−イル）−プ
ロピオン酸もしくは前記構造の相応のδ−ラクト
ン−化合物にするためのものである。新種の微生
物−突然変異体コール149−K14は特許手続上の
微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約第二条（）の国際寄託当局であるドイチエ
ン・ザンムルング・フオン・ミクロオルガニスメ
ン（Doutschen Sammlung von
Mikroorganismen）（DSM）、グリーゼバツハー
ストラーセ（Griesebach−Strasse）８、Ｄ／
3400、ゲツチンゲン（Go¨ttingen）に寄託番号
DSM2065として寄託されている。

ロードコツカス属は、ノカルジア（Nocardia）
属と共にノカルジアセアエ（Nocardiaceae）科
を形成する。コリネバクテリアセアエ
（Corynebacteriaseae）及びマイコバクテリアセ
アエ（Mycobacteriaseae）は、ほぼ同類である。
これらは、ノカルジアセアエと同様にミコール酸
−α分枝された、βヒドロキシル化された長鎖の
脂肪酸−を合成することができる。

重要な化学分類学的特徴の証明−全体で約40個
のＣ−原子を有し、全長12及び14C−原子を有す
るタイプＣ／Ｎのミコール酸は、膜脂質中でα分
枝化、マナキノンMK−８（H2）及びチユーバー
キユルステアリン酸（Tuberculstearinsaeure）
を形成する−によつて、ロードコツカス ロード
チロウス（Rhodococcus rhodochrous）グルー
プに属することが明らかに立証される。このグル
ープの代表物との正確な呈色の一致は、認めるこ
とができなかつた。ロードコツセン
（Rhodococcen）は、多少とも強い赤色を有する
が、分離片は、アイボリーホワイトである。生理
学的試験は、ロードコツカスエリスロポリスと高
い一致（アスパラギン酸を除く）を生じる。この
種は、ほんの弱い淡紅黄灰色を呈する。したがつ
て、分離片（DSM2065）は、ロ−ドコツカス
ロードチロウスの色変種である。

コロニー構造及び色 コロニーは、GC−寒天（メルク社）上での増
殖で丸みをおびた、軽くしわのよつた表面を有す
る。軟度は固い。菌糸は全く形成されない。コロ
ニーは、著しく着色しない。色調は、RAL色見
本の1014（アイボリー）又はオストワルド色見本
のCa2である。サイラー（Seiler）によるコード
化によれば、コロニーの形及び色をコード(11)（帯
黄乳白色）に属する。

顕微鏡： 初期培養は短く、僅かに分枝された菌糸を形成
し、これは直ちに崩壊して球状になる。

同定法は、ボウスフイールド（Bousfield），I.
J.，スミス（Smith），G.L.，ダンド（Dando），
T.R.＆ホブス（Hobbs），G.1983コリネ形及びノ
カルジオ形及び幾つかのい他の微生物の同定にお
ける全脂肪酸の数字的分析プロフイール．ジヤー
ナル オブ ジエネラル マイクロバイオロジー
（Journal of general Microbiology）129，375
−394、コリンズ（Collins），M.D.＆クロツペン
ステツト（Kroppenstedt），R.M.1983幾つかの
コリネ形微生物−A4タイプを含有する−蛋白質
グリカンの分類に、ガイドとしての脂肪組成物
（Schleifer及びKandler）、システマチツク アン
ド アプライド マイクロバイオロジー
（Systematic and Applied Microbiology）４，
316−354中に記載されている。

突然変異体DSM2065は天然のステリンの部分
的分解に特に有効であることが証明された。転換
のために適する天然のステリン、例えばコレステ
リン、シトステリン、スチグマステリン及び／又
はエルゴステリンである。これらの誘導体、例え
ばコレステノン、シトステノン、スチグマステノ
ン等も適する。同じことが、胆汁酸、例えばコー
ル酸、デスオキシコール酸、リトコール酸及びそ
れらの混合物にあてはまる。しかしステロイド基
本構造を有するその他の化合物も適する、例えば
置換基C17が既に部分的に又は完全に分解してい
る天然のステリンの部分的分解生成物である。

分解反応の工業的実施は原則的に公知方法で行
なう。すなわち、例えば使用原料として選んだス
テリンを微生物培養に培養期間中加えるが、又は
それを突然変異体の接種前に培養基に添加してよ
い。一種のステリン又は数種のステリンの混合物
も使用することができる。好ましくはステリンを
約0.1〜100ｇ／の量で培養に加える。培養工程
中で転換すべきステリンの最適濃度は簡単な予備
実験により調べることができる。培養基中のステ
リンの濃度は一般に好ましくは50ｇ／以上では
なく、かつ屡々30ｇ／以上ではないが、１ｇ／
以上の量が好ましい。

その際更に好ましいことは、部分的に分解をさ
せるべき基質を反応培養基に一度に加えないで、
この添加を反応経過中に徐々に行なうことであ
る。この実施態様で出発基質は実際に連続的に分
解反応の経過中反応混合物に有利に加えられる。
この方法で所望の分解生成物の収率を高めること
ができる。

培養は培養基中で行なわれ、この培養基は炭素
源として転換すべきステリンか、或はなお付加的
な代謝可能な炭素源、並びに通常これらの微生物
が必要とする栄養−及び発育素を含有する。微生
物の発育に特に有利なものは、例えばパラフイ
ン、グリセリン、カルボン酸、澱粉、デキストリ
ン、蔗糖、ブドウ糖、フルクトース及び含糖分解
物質である。適する窒素源はアンモニウム塩、硝
酸塩、ペピトンン、とうもろこし浸漬水、大豆
粉、酒精醗酵液の蒸留残液及び魚粉である。更に
発酵促進剤、例えば酵母抽出物及びビタミンを添
加することができる。培養基は通常更に無機塩、
例えば燐酸ナトリウム、燐酸カリウム又は燐酸ア
ンモニウム又はカルシウム−、マグネシウム−、
マンガン−及び／又は鉄塩を含有する。

ステリン−出発原料の培養基中での乳化は好ま
しくは公知の乳化剤を用いて、例えば脂肪酸−ソ
ルビタンエステル又はその酸化エチレン付加体、
ポリオキシエチレン、モノラウリルエーテル又は
脂肪酸アミドアルキルベタインを用いて行なう。

使用する培養基は微生物−発育の開始前に好ま
しくは加熱によつて滅菌する。冷却し、かつ適当
に前培養した突然変異体を培養基に接種した後
に、25〜55℃、好ましくは27〜30℃で培養する。
培養液のPH値はPH４〜8.5、好ましくは6.8〜8.0で
ある。培養は振盪、攪拌又は通気によつて酸素供
給され、所望の段階にまで、好ましくはステリン
の完全な分解にまで培養する。

ステリンの分解は、基質−濃度及びその他の醗
酵条件に応じて一般に24〜160時間を必要とする。
一定の阻害物質又は微生物−発育を抑制する発育
阻止物質を一緒に使用する必要はない。

醗酵の中止後に通常は培養汁から細胞質を分離
し（例えば過により）、方法生成物を培養汁か
ら単離する。培養汁を、場合により前もつて蒸発
濃縮した後に（例えば薄層蒸発器中で）、PH値2.0
又はそれ以下に酸性化することが有利であること
が証明された。この時に方法生成物として直接ヘ
キサヒドロ−１−インダノン−δ−ラクトン化合
物を得ることができる。酸性化には鉱酸、しかし
有機酸も適するが、好ましくは硫酸で酸性化す
る。

好ましくは蒸発濃縮し、かつ酸性化した培養汁
を水と混合不可能な溶剤で抽出する。適する溶剤
は例えばメチル−イソプロピルケトン、酢酸エス
テル−ヘキサノール−ｎ−オクタノール、ｎ−ヘ
キサン又は特にハロゲン化炭化水素化合物、例え
ばクロロホルム又は塩化メチレンである。有機相
の蒸発濃縮後に反応粗成物が生じ、これは常法で
例えば結晶化により精製することができる。

γ−ラクトン（閉環された）と開環した酸から
なる得られ生成物の濃度割合は、酵素触媒による
のではなく、PH−環境に依存する。上記の培養条
件下では主に開環形（約70〜80％）が多く得られ
るが、酸性条件下で生成物の抽出の後、最終生成
物は主にラクトン化合物（約80〜90％）として存
在する。

本発明により製造したヘキサヒドロ−１−イン
ダノン−δ−ラクトンもしくは所属の遊離の置換
したプロピオン酸化物は薬学的に有効なステリン
化合物の製造のための重要な中間生成物である。
これは19−ノルステロイドの合成において特に重
要な役割をはたす。

例 株種コール149／K14（DSM2065）を75入り
醗酵器（かさ容量50）中で次の培養基で300℃
で好気的に培養する： ブドウ糖 0.50重量％ 酵母抽出物 0.5 〃 とうもろこし浸漬水 0.80 〃 とうもろこしグルテン 1.50 〃 K₂HPO₄ 0.13 〃 （NH₄）2X、HPO₄、PH7.0 0.09 〃 24時間培養した後に先ず コレステリン 0.1重量％を、 乳化剤（DK−エステル F50） 0.50重量％ と共に添加する。

更に６時間後に、 乳化剤 0.5重量％ コレステリン 1.5 〃 ブドウ糖 0.5 〃 を36時間をかけて加える。

124時間の発酵時間後に装具をとりはずし、細
胞質を別し、細胞を含まない培養汁を薄層蒸発
器中で３：１に濃縮し、濃縮物を水性の硫酸でPH
0.2に調整し、最後に容積比１：１で塩化メチレ
ンを用いて抽出する。塩化メチレン相を分離す
る。有機用の蒸発濃縮後に、3aα−Ｈ−4a−
〔3′−プロピオン酸〕−5α−ヒドロキシ−7αβ−メ
チル−ヘキサヒドロ−１−インダノン−δ−ラク
トンが約63モル％の収率で得られる。

同様に処理を行うが、コレステリンの代りに、
β−シトステリンを使用した場合、最終生成物が
40〜45％の収率で得られ、ゲネロール122（58％シ
トステリン、29％カンペステリン及び５％スチグ
マステリン）を使用した場合、最終生成物が38〜
42％の収率で得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 天然のステリンを、水性培養基中で好気的条
   件で微生物分解して3aα−Ｈ−4a−〔3′−プロピ
   オン酸〕−5α−ヒドロキシ−7αβ−メチル−ヘキ
   サヒドロ−１−インダノン又はそのγ−ラクトン
   を製造するにあたり、微生物−欠損突然変異体−
   ロードコツカス エリスロポリス
   （Rhodococcus erythro−polis）−コール（Chol）
   149−K14（DSM2065）を使用することを特徴と
   する、三環ステロイド−分解生成物の製法。