JPH0456596B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるアミノ酸の製造法に関す
る。さらに詳しくは本発明はコリネ型グルタミン
酸生産菌に属し、Ｌ−アスパラギン酸を窒素源と
して利用して生育する能力が増強され、かつＬ−
イソロイシン、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニン
から選ばれるアミノ酸を生産する能力を有する微
生物を栄養培地に培養して培養液中にＬ−イソロ
イシン、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニンから選
ばれるアミノ酸を蓄積せしめ、該培養液からＬ−
イソロイシン、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニン
から選ばれるアミノ酸を採取することを特徴とす
る発酵法によるＬ−イソロイシン、Ｌ−リジンお
よびＬ−スレオニンから選ばれるアミノ酸の製造
法に関する。その目的とするところは、工業的に
有利なアミノ酸の製造法を提供することにある。 従来、発酵法によるアミノ酸の製造には、種々
の変異株が使用され、それらがアミノ酸の経済的
な工業生産に貢献している。しかしながら、近年
アミノ酸の医薬・食品・飼料その他への需要の増
大によつて益々その製造法の改善が望まれてい
る。 本発明者らは、このような状況にかんがみ、ア
ミノ酸生産菌のアミノ酸生産能力の向上について
鋭意研究を重ねた結果、コリネ型グルタミン酸生
産菌に属し、Ｌ−アスパラギン酸を窒素源として
利用して生育する能力の増強された微生物を用い
ることにより、アミノ酸の生産性が著しく向上す
ることを見い出した。このようにアミノ酸生産性
の向上する現象は、他の炭素源あるいは窒素源と
共に、Ｌ−アスパラギン酸又はその塩を発酵基質
として発酵培地に添加する場合に特に著しく認め
られる。 このような性質を有する微生物がすぐれたアミ
ノ酸生産性を有することの原因は不明であるが、
Ｌ−アスパラギン酸の細胞膜透過性の増大、ある
いはＬ−アスパラギン酸の代謝経路の増強が結果
としてアミノ酸生成酵素類の活性の増強をもたら
すこと等が考えられる。 従来、Ｌ−アスパラギン酸を窒素源として利用
して生育する能力の増強されたコリネ型グルタミ
ン酸生産菌に属する微生物を用いるアミノ酸の製
造法は知られておらず、本発明はかかる新規な知
見に基づいて完成されたものである。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明に使用する微生物は、コリネ型グルタミ
ン酸生産菌に属し、アミノ酸生産性を有し、かつ
Ｌ−アスパラギン酸を窒素源として利用して生育
する能力の増強された微生物である。 コリネ型グルタミン酸生産菌とは、コリネバク
テリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロバク
テリウム属等に属するＬ−グルタミン酸生産菌を
意味する。 また、本発明にかかわる性質の微生物は、Ｌ−
アスパラギン酸を唯一の窒素源とする最少培地
で、親株より速かに生育する微生物の中から選択
することができ、このような性質の微生物は通常
の変異処理、あるいは細胞融合法あるいは、形質
導入法、その他の遺伝子的技法によつても得るこ
とができる。さらに、該微生物は、他の性質（例
えば、各種栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性、
薬剤依存性等）を合せ持つていてもよい。 生産されるアミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アルギニ
ン等があげられる。 本発明に使用する微生物の具体例としては次の
ものがあげられる。 すなわち、Ｌ−リジン生産菌としては、コリネ
バクテリウム・グルタミクムATCC21543（ホモセ
リン要求性−ロイシン要求性−ペニシリン耐性−
チアリジン耐性）から誘導したRL−９−14（微工
研菌寄第6914号）及びブレビバクテリウム・ラク
トフエルメンタムATCC21759（パントテン酸要求
性、チアリジン耐性）から誘導した652−20（微工
研菌寄第6915号）を、Ｌ−スレオニン生産菌とし
ては、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21660（メチオニン要求性−チアリジン耐性
−α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性）から
誘導した440−９（微工研菌寄第6916号）及びブレ
ビバクテリウム・フラブムATCC21269（α−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性）から誘導した
311−６（微工研菌寄第6917号）を、Ｌ−イソロイ
シン生産菌としてはコリネバクテリウム・グルタ
ミクムFERM Ｐ−6830（アルギニン要求性−チ
アリジン耐性）から誘導した39−21−15（微工研
菌寄第6918号）をあげることができる。これらの
菌株は、Ｌ−アスパラギン酸を唯一の窒素源とし
て含む最少培地で、Ｌ−アスパラギン酸を窒素源
として利用して速かに生育できる点で親株と明確
に区別することができる。 次に、このような微生物を得る具体的な操作例
を、コリネバクテリウム属のＬ−イソロイシン生
産菌について説明すれば次のとおりである。な
お、他の本発明使用菌も同様の手法で得ることが
できる。 操作例 コリネバクテリウム・グルタミクムのＬ−イソ
ロイシン生産菌FERM Ｐ−6830を常法により、
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジン処理（250μｇ／ml、30℃で30分間）した後、
以下に示すＬ−アスパラギン酸を唯一の窒素源と
して含む以下に記述する最少寒天培地の表面に塗
抹して30℃で３日間静置培養した。元来、親株で
あるFERM Ｐ−6830は弱いＬ−アスパラギン酸
資化能力を持つているので、寒天培地の表面全面
に親株の細胞の弱い生育が認められたが、その中
で、10^-6〜10^-8の頻度で親株より速かに生育する
大きなコロニー状の変異株の発現が認められた。
これらの生育の速いコロニーを、同じくＬ−アス
パラギン酸を唯一の窒素源とする最少寒天培地に
塗抹して２日間30℃で静置培養して、親株より明
らかに生育の速い株30株を、Ｌ−アスパラギン酸
を唯一の窒素源として利用して生育する能力の増
強された微生物として分離した。なお、これらの
菌株は、いずれもＬ−アスパラギン酸の代りに硫
酸アンモニウムを窒素源として含む通常の最少寒
天培地で、親株と同等の速さで生育することを確
認した。 これらの30株をＬ−イソロイシン発酵試験（実
施例１と同じ）にかけ、親株よりＬ−イソロイシ
ン生産性のすぐれた菌株として39−21−15を選択
した。 Ｌ−アスパラギン酸を唯一の窒素源とする最少
培地の組成：グルコース0.5ｇ／dl、Ｌ−アスパ
ラギン酸ソーダ0.15ｇ／dl、KH₂PO₄0.15ｇ／dl、
K₂HPO₄0.05ｇ／dl、NaCl0.01ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、CaCl₂・2H₂O1μｇ／
ml、MnCl₂・4H₂O7μｇ／ml、FeSO₄・7H₂O10μ
ｇ／ml、チアミン・HCl0.1μｇ／ml、ビオチン
30μｇ／、Ｌ−アルギニン・HCl50μｇ／ml、寒
天1.5ｇ／dl、PH7.2（NaOHで調整） これらの微生物を用いて、該当するアミノ酸を
生産する方法としては炭素源、窒素源、無機塩
類、生育因子等を含有する通常の栄養培地を用い
て常法により行うことができる。 使用する炭素源としては、グルコース、シユー
クロース、乳糖、糖蜜、デンプン、デンプン加水
分解物などの炭水化物、酢酸、プロピオン酸、ギ
酸、乳酸、ピルビン酸、フマール酸、リンゴ酸な
どの有機酸類、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラ
ギン等のアミノ酸類、メタノール、エタノール、
ｎ−プロパノール等のアルコール類その他炭化水
素類が単独あるいは組み合わせて使用できる。 窒素源としては、硫安、硝安、塩安、リン安、
尿素、アンモニア水、その他を使用できる。 無機塩類としてはリン酸２水素カリウム、リン
酸１水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシ
ウム等を使用できる。また、栄養要求性を示す変
異株の場合には、栄養物を純標品もしくはそれら
を含有する天然物として添加することができる。 本発明によれば培地中にＬ−アスパラギン酸又
はその塩を含有させることにより、目的アミノ酸
の収量をさらに増大させることができる。かかる
Ｌ−アスパラギン酸の塩としては特に限定はない
がナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩、アミン塩（例え
ばエチレンジアミン塩）、塩基性アミノ酸との塩
（例えばオルニチン、リジン等との塩）等が使用
可能である。 Ｌ−アスパラギン酸又はその塩の培地への添加
量はアスパラギン酸として0.05ｇ／dl以上が目的
達成のため必要であり、効果の限界及び経済性を
考慮すれば10ｇ／dl以下であることが望ましい。
もつとも好適には0.1〜３ｇ／dlであることが好
ましい。 なお、Ｌ−アスパラギン酸又はその塩は炭素源
や窒素源としても役立つていることはもちろんで
ある。 アミノ酸の発酵生産のための発酵条件として
は、通気培養がよく、発酵温度は24〜37℃、発酵
日数は２〜７日間である。発酵液のPHは５〜９の
範囲に維持されるが、PH調整には無機あるいは有
機の酸あるいはアルカリ、さらには尿素、炭酸カ
ルシウム、アンモニアガス、リン酸マグネシウム
等を使用することができる。 発酵液からのアミノ酸の単離は通常イオン交換
樹脂法その他の公知の方法を組み合わせて行われ
る。 以下に実施例を示す。 実施例 １ コリネバクテリウム・グルタミクムのＬ−イソ
ロイシン生産菌39−21−15（アルギニン要求性−
チアリジン耐性−Ｌ−アスパラギン酸資化性増強
株）を、300ml容三角フラスコ中の20mlの種培地
（グルコース５ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／dl、ペ
プトン１ｇ／dl、尿素0.3ｇ／dl、NaCl0.25ｇ／
dl、コーン・ステイーブ・リカー0.5ｇ／dl、ビ
チオン50μｇ／、PH7.2）に接種し、28℃で24時
間、210rpmの回転数のロータリーシエーカー上
で振盪培養した。この種培養液２mlを、20mlの発
酵培地(1)（後述）と、この発酵培地(1)にＬ−アス
パラギン酸アンモニウム0.5ｇ／dlを添加した２
種類の発酵培地に接種して、72時間上記の種培養
と同じ方法で培養した。対照として、親株である
コリネバクテリウム・グルタミクムFERM Ｐ−
6830を同様に培養した。その結果、蓄積したＬ−
イソロイシンの量は第１表に示すとおりであり、
変異株ではＬ−イソロイシンの蓄積量が高かつ
た。

【表】 発酵培地(1)の組成：廃糖蜜（グルコース換算） 8.0ｇ／dl、コーン・スチーブ・リカー0.5
ｇ／dl、硫安２ｇ／dl、尿素0.3ｇ／dl、
KH₂PO₄0.2ｇ／dl、K₂HPO₄0.05ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、FeSO₄・
7H₂O0.001ｇ／dl、MnCl₂・4H₂O0.001ｇ／dl、
ZnSO₄・7H₂O1mg／、ビオチン50μｇ／、
アルギニン塩酸塩500μｇ／ml（PH7.4） 実施例 ２ 種菌としてコリネバクテリウム・グルタミクム
のＬ−リジン生産菌RL−９−14（ATCC21543か
ら誘導したＬ−アスパラギン酸資化性増強株）お
よびブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
のＬ−リジン生産菌652−20（ATCC21759から誘
導したＬ−アスパラギン酸資化能増強株）を用い
る。 これらの菌株を、グルコース４ｇ／dl、ポリペ
プトン２ｇ／dl、KH₂PO₄0.15ｇ／dl、
K₂HPO₄0.05ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O0.05ｇ／dl、
ビオチン50μｇ／、尿素0.3ｇ／dl、酵母エキス
0.5ｇ／dl（PH7.2）の組成の種培地で30℃で24時
間振盪培養したものを、下記の組成の発酵培地(2)
とそれにＬ−アスパラギン酸アンモニウム0.5
ｇ／dlを添加した培地の２通りの発酵培地に５％
（Ｖ／Ｖ）の割合で接種し、30℃で４日間振盪培
養した。 対照として、親株であるATCC21543と
ATCC21759を用いて、同様に培養した。その結
果、得られたＬ−リジン蓄積量は第２表に示すと
おりであつた。 発酵培地(2)の組成：糖蜜（グルコース換算） ９ｇ／dl、大豆粕硫酸分解物（大豆粕換算）
２ｇ／dl、KH₂PO₄0.07ｇ／dl、MgSO₄・
7H₂O0.05ｇ／dl、尿素0.3ｇ／dl、硫安0.5ｇ／
dl、CaCO₃3ｇ／dl（PH7.5、アンモニア中和）

【表】 実施例 ３ 種菌としては、コリネバクテリウム・グルタミ
クムのＬ−スレオニン生産菌440−９
（ATCC21660から誘導したＬ−アスパラギン酸資
化能増強株）及びブレビバクテリウム・フラバム
のＬ−スレオニン生産菌311−６（ATCC21269か
ら誘導したＬ−アスパラギン酸資化能増強株）を
用いる。 これらの菌株を、実施例２と同様の方法で種培
養して、下記の組成の発酵培地(3)とそれにＬ−ア
スパラギン酸アンモニウム0.5ｇ／dlを添加した
培地の２通りの発酵培地に接種して培養した結
果、第３表に示すとおりの結果を得た。 発酵培地(3)の組成：グルコース８ｇ／dl、硫安２
ｇ／dl、KH₂PO₄0.05ｇ／dl、K₂HPO₄0.05
ｇ／dl、MgSO₄・7H₂O0.1ｇ／dl、FeSO₄・
7H₂O0.001ｇ／dl、MnSO₄・4H₂O0.001ｇ／
dl、Ｌ−メチオニン150μｇ／ml、ビオチン
100μｇ／、CaCO₃2ｇ／dl（PH7.4）

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、Ｌ−ア
   スパラギン酸を唯一の窒素源として含む最少培地
   でＬ−アスパラギン酸を窒素源として利用して速
   かに生育でき、かつＬ−イソロイシン、Ｌ−リジ
   ンおよびＬ−スレオニンから選ばれるアミノ酸を
   生産する能力を有する微生物を栄養培地に培養し
   て培養液中にＬ−イソロイシン、Ｌ−リジンおよ
   びＬ−スレオニンから選ばれるアミノ酸を蓄積せ
   しめ、該培養液からＬ−イソロイシン、Ｌ−リジ
   ンおよびＬ−スレオニンから選ばれるアミノ酸を
   採取することを特徴とする発酵法によるＬ−イソ
   ロイシン、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニンから
   選ばれるアミノ酸の製造法。 ２ 栄養培地がＬ−アスパラギン酸又はその塩を
   含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載のＬ−イソロイシン、Ｌ−リジンおよびＬ−
   スレオニンから選ばれるアミノ酸の製造法。 ３ 微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバク
   テリウム属又はミクロバクテリウム属に属する微
   生物である特許請求の範囲第１項又は第２項記載
   のアミノ酸の製造法。