JPH0555114B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は発酵法によるＬ−リジンの製造法に関
する。さらに詳しくは、本発明はコリネ型グルタ
ミン酸生産菌に属し、β−ナフトキノリンに抵抗
性を有し、かつＬ−リジン生産能を有する微生物
を培地に培養して、該培養物からＬ−リジンを採
取することを特徴とする発酵法によるＬ−リジン
の製造法に関する。 その目的とするところは必須アミノ酸の１つで
あり、医薬品あるいは飼料や食品への添加剤とし
て需要の大きいＬ−リジンを工業的に安価に製造
する方法を提供することにある。 従来の技術 従来、発酵法によるＬ−リジンの製造法に関し
てはコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、アースロバクター属、バチルス属の細菌やそ
の他の微生物のホモセリン（またはメチオニンと
スレオニン）要求性変異株（特公昭36−6499号、
USP2979439）やその他要求性変異株〔特公昭48
−28677号、同51−21078号、同51−34477号、
（USP3825472）、同55−1040号、特開昭56−8692
号、同55−9784号〕を用いる方法、また各種薬剤
抵抗性変異株〔特公昭48−28078号
（USP3707441）、同53−1833号、同53−43591号、
同59−4993号、特開昭53−9394号、同55−9785
号、特公昭55−44597号（USP3687810）〕などを
用いる方法、あるいはこれらの組合せの性質を有
する微生物を用いる方法などが知られている。 発明が解決しようとする問題点 必須アミノ酸の１つであり、医薬品あるいは飼
料や食品への添加剤として需要の大きいＬ−リジ
ンを、工業的に安価に製造する方法の開発は常に
望まれている。 問題点を解決するための手段 本発明者は、Ｌ−リジンの生産性の改良された
菌株を得るため種々研究を重ねた結果、コリネ型
グルタミン酸生産菌に属するＬ−リジン生産菌株
にさらにβ−ナフトキノリン抵抗性を付与する
と、Ｌ−リジン生産性が飛躍的に向上することを
見出し、本発明を完成するに至つた。発酵法によ
りＬ−リジンの製造に際し、キノリン類に対する
耐性を付与することによつてリジン生産能が向上
することが知られている（特公昭59−4993号）
が、これらの薬剤による生育阻害はＬ−ロイシン
で解除されることが示されている。従つて、これ
らのキノリン類は、Ｌ−ロイシンアナログとして
作用していることが推定される。しかし、β−ナ
フトキノリンによる生育阻害は、Ｌ−ロイシンで
回復されないことから、β−ナフトキノリンは特
公昭59−4993号におけるキノリン類とは別の範疇
に属する物質であると考えられる。このような性
質をもつたβ−ナフトキノリンに抵抗性を有する
菌株を用いればＬ−リジンの生産性が飛躍的に改
善されることは本発明者によつてはじめて見出さ
れた知見である。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明は、コリネ型グルタミン酸生産菌に属
し、β−ナフトキノリンに抵抗性を有し、かつＬ
−リジン生産能を有する微生物を培地に培養し、
培養物中にＬ−リジンを生成蓄積させ、該培養物
からＬ−リジンを採取することを特徴とするＬ−
リジンの製造法を提供する。 本明細書において、コリネ型グルタミン酸生産
菌とは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム属、ミクロバクテリウム属またはアースロバ
クター属に属する一群のグルタミン酸生産菌をい
う〔「発酵と工業」第40巻、102、1982年参照〕。 本発明で用いる微生物は、コリネ型グルタミン
酸生産菌に属し、β−ナフトキノリンに抵抗性を
有するＬ−リジン生産菌株であればいかなる菌株
をも用いることができる。すなわち、本発明では
コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、Ｌ−リジン
生産能を有する菌株にβ−ナフトキノリン抵抗性
を付与させた菌株を用いてもよいし、コリネ型グ
ルタミン酸生産菌に属し、β−ナフトキノリン抵
抗性を有する菌株にＬ−リジン生産能を付与させ
た菌株を用いてもよい。 コリネ型グルタミン酸生産菌に属するＬ−リジ
ン生産能を有する菌株としては、各種の栄養（例
えばホモセリン、メチオニン、スレオニン、ヒス
チジン、プロリン、アラニン、ロイシン、イソロ
イシン、バリン、セリン、グルタミン酸、パント
テン酸、ニコチン酸アミド、酢酸、アデニン、ヒ
ポキサンチン、イノシトールおよびこれらの組合
せ）要求性、各種のアミノ酸アナログ（例えばリ
ジン、スレオニン、メチオニン、ロイシン、イソ
ロイシン、バリン、アスパラギン酸、トリプトフ
アンあるいはヒスチジンのアナログおよびこれら
の組合せ）抵抗性、その他薬剤（例えば各種抗生
物質、サルフア剤、各種有機酸、キノン化合物、
キノリン化合物およびこれらの組合せ）抵抗性の
１つあるいはこれらの組合せの性質を有するＬ−
リジン生産菌株が挙げられる。 したがつて、上記のようなＬ−リジン生産菌株
に、さらにβ−ナフトキノリン抵抗性を付与する
ことによつて本発明に使用する菌株を得ることも
できるし、コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、
β−ナフトキノリン抵抗性を有する菌株に上記の
ような各種栄養要求性、各種アミノ酸アナログ抵
抗性、またはその他薬剤の抵抗性を付与すること
によつて得られるＬ−リジン生産菌株を本発明で
使用することもできる。また、本発明に用いる菌
株は上記のような性質の他にＬ−リジン生産に寄
与するいかなる性質を備えていてもさしつあえな
い。 本発明の変異株を誘導する際に用いられる親株
としては、コリネ型グルタミン酸生産菌として知
られている下記微生物があげられる。例えば、コ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032、
コリネバクテリウム・グルタミクムＨ−3149
（FERM BP−158）、コリネバクテリウム・アセ
トアシドフイラムATCC13870、ブレビバクテリ
ウム・ラクトフエルメンタムATCC13869、ブレ
ビバクテリウム・フラバムATCC14067などがあ
る。 本発明における変異株の誘導は、紫外線照射や
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンなどによる化学処理など、通常用いられる変
異処理方法により行うことができる。 変異処理した菌株から本発明の変異株を分離す
るには、親株が生育阻害を示す濃度のβ−ナフト
キノリン（40μｇ／ml以上）を含む最少培地寒天
平板上に生育する変異株を取得すれよい。 本発明に使用する微生物のうち、β−ナフトキ
ノリン抵抗性菌株の具体的一例として、コリネバ
クテリウム・グルタミクムＨ−4412の取得例を以
下に示す。 コリネバクテリウム・グルタミクムＨ−3149
（FERM BP−158）（チアリジン抵抗性、リフア
ンピシン抵抗性、ストレプトマイシン抵抗性、６
−アザウラシル抵抗性）を親株として用いる。こ
の親株を0.1Nトリス−マレイン酸緩衝液（PH6.0）
中に10⁸細胞／mlの濃度に懸濁し、ここにＮ−メ
チル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを
最終濃度0.2mg／mlになるように添加し、室温で
30分間静置する。親株が生育阻害を示す濃度のβ
−ナフトキノリン（例えば40μｇ／mlを含む下記
のような組成を有する最少培地寒天平板上に塗抹
し、生育するコロニーの中から変異株を選択す
る。その１株がＨ−4412であり、β−ナフトキノ
リン抵抗性を有する点で第１表に示すように、親
株のＨ−3149と明らかに区別できる。 最少培地寒天平板培地組成： グルコース10ｇ／、NN₄Cl １ｇ／、尿素２
ｇ／、KH₂PO₄1ｇ／、K₂HPO₄3ｇ／、
MgSO₄・7H₂O 0.4ｇ／、FeSO₄・7H₂O 10
mg／、MnSO₄・4H₂O4mg／、ビオチン50μ
ｇ／、ニコチン酸５mg／、ZnSO₄・7H₂O1
mg／、CuSO₄・5H₂O1mg／
（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O、１mg／、寒天２％、
PH7.0

【表】 ：充分な生育、＋：わずかに生育、
−；生育せず
Ｈ−3149を変異誘導することによつて得られた
β−ナフトキノリンに抵抗性を有するＨ−4412
は、昭和61年５月27日付で工業技術院微生物工業
技術研究所（微工研）にFERM BP−1069とし
て寄託されている。 本発明に使用する培地組成としては使用菌株の
利用しうる炭素源、窒素源、無機物その他の必要
な栄養素を程良く含有するものであれば合成培
地、天然培地のいずれも使用できる。 すなわち炭素源としてはグルコース、フラクト
ース、ソルビトール、グリセロール、蔗糖、澱
粉、澱粉加水分解物、糖蜜、果汁などの各種炭水
化物、酢酸、フマール酸、乳酸、コハク酸などの
有機酸、さらにエタノール、メタノールなどのア
ルコール類も使用できる。 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン
酸アンモニウムなどの各種無機酸のアンモニウム
塩、尿素、アミン類、その他含窒素化合物、なら
びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・
スチープ・・リカー、カゼイン加水分解物、大豆
粕酸加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物
などが使用できる。 さらに無機物としては、リン酸第一カリウム、
リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用できる。 本発明に使用する微生物が生育のために特定の
栄養素を必要とする場合には、その栄養素を適当
量培地中に存在させなければならないが、これら
の物質は窒素源として例示した天然物に含まれて
添加される場合がある。また培地中に各種の添加
物、例えば各種抗生物質、α−アミノ酪酸、シス
テイン、ロイシン、ロイシン発酵液あるいはアス
パラギン酸、グルタミン酸などを添加することに
よりＬ−リジン生産量を増加させうる場合があ
る。 培養は振盪培養あるいは深部通気撹拌培養など
の好気的条件下で行う。培養温度は通常20〜40℃
の範囲である。培地のPHは３〜９の範囲で、好ま
しくは中性付近に保持することが望ましいが、こ
れ以外の条件下でも使用菌株が生育すれば実施で
きる。培地のPH調節は炭酸カルシウム、尿素、酸
あるいはアルカリ溶液、PH緩衝剤などによつて行
う。培養時間は通常１〜６日間で培養液中にＬ−
リジンが生成蓄積する。 培養終了後、培養液より菌体などの沈殿物を除
去し、公知のイオン交換処理法、濃縮法、吸着
法、塩析法などを併用することにより、培養液か
らＬ−リジンを回収することができる。 以下、実施例をあげて本発明を具体的に示す。 実施例 １ 種菌としてコリネバクテリウム・グルタミクム
Ｈ−4412（FERM BP−1069）を使用した。 この菌株をグルコース40ｇ／、尿素３ｇ／
、KH₂PO₄1.5ｇ／、K₂HPO₄0.5ｇ／、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ／、ビオチン50μｇ／、
ペプトン20ｇ／、酵母エキス５ｇ／からなる
種培地（PH7.2）20mlを含む３ml容三角フラスコ
に接種し、30℃で24時間培養した。この培養液２
mlを廃糖蜜100ｇ／（グルコース換算）、硫酸ア
ンモニウム40ｇ／、KH₂PO₄0.5ｇ／、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ／、CaCO₃30ｇ／から
なる発酵培地（PH7.2）20mlを含む300ml容三角フ
ラスコに接種し、32℃で４日間振盪培養
（220rpm）を行つた。培養終了後、Ｌ−リジンの
生成量を酸性銅ニンヒドリン反応を用いる比色法
によつて測定した。その結果、培養液中のＬ−リ
ジン生成量は塩酸塩として52ｇ／であつた。対
照として、同一の条件で同様にして培養した親株
Ｈ−3149のＬ−リジン生成量は、塩酸塩として44
ｇ／であつた。 Ｈ−4412株を用いて得た培養液１を遠心分離
し、得られた上清液を硫酸でPH1.5に調整した後、
強酸整イオン交換樹脂ダイヤイオンSK−1B（Ｈ
＋型）（三菱化成工業社製）のカラムに通し、Ｌ
−リジンを吸着させ、カラムを水洗後、２規定の
アンモニア水で溶出して、Ｌ−リジン画分を集め
た。集めた画分を濃縮し、得られた濃縮液を塩酸
でPH2.0に調整した後、エタノールを添加しなが
ら冷却することによりＬ−リジン塩酸塩を晶出さ
せ、結晶41ｇを得た。 発明の効果 本発明方法によれば、Ｌ−リジンを工業的に安
価に供給することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、β−ナ
   フトキノリンに抵抗性を有し、かつＬ−リジン生
   産能を有する微生物を培地に培養し、培養物中に
   Ｌ−リジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−リ
   ジンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製
   造法。