【発明の詳細な説明】
本発明は、発酵法によるＬ−トリプトフアン
（以下、トリプトフアンと記す）の製造法に関す
る。
従来トリプトフアンの製造法としては、トリプ
トフアンの前駆物質であるアントラニル酸、イン
ドール或は３−インドールピルビン酸よりトリプ
トフアンを製造する方法が知られている。
これら前駆物質を使用する方法に対し、前駆物
質を使用しないで、糖類等を炭素源とし、バチル
ス属に属しトリプトフアンアナログに耐性を有す
る変異株を使用して直接発酵法によりトリプトフ
アンを生産する方法（特公昭48−18828、特公昭
53−39517）が開発されている。
そこで、本発明者らはバチルス属の微生物を用
いて更に糖類等の炭素源からトリプトフアンを直
接発酵法により安価に製造する方法を開発すべく
研究を行つた結果、バチルス属の上記のようなト
リプトフアンアノログ耐性を有するトリプトフア
ン生産菌から誘導したコリスミ酸ムターゼの活性
の弱化した変異株が更に大量のトリプトフアンを
生産することを見い出した。
本発明はこの知見に基づいて更に研究の結果完
成されたものである。
本発明でいうコリスミ酸ムターゼとは、バチル
ス属の微生物においてＬ−チロシンならびにＬ−
フエニルアラニンの生合成に関与する酵素であ
り、芳香族アミノ酸の生合成の中間体であるコリ
スミ酸をプレフエン酸に異性化せしめる酵素（酵
素番号EC5.4.99.5）である。コリスミ酸ムターゼ
活性は公知の方法、例えばR.G.H.Cotton and F.
Gibson、Biochim.Biophys.Acta、100巻、76ペ
ージ、1965年、或はI.Shiio and S.Sugimoto、J.
Biochem.、86巻、17ページ、1979年などの文献
に記載された方法で測定することができる。
本発明でいうトリプトフアンアナログとはバチ
ルス属に属する微生物の生育を阻害し、この生育
阻害がＬ−トリプトフアンの存在によつて部分的
又は完全に解除されるような薬剤をいい、例えば
５−メチルトリプトフアン等の５，６又は７−低
級アルキルトリプトフアン、５−フルオロトリプ
トフアン等の５又は６−ハロゲノトリプトフア
ン、トリプトフアンハイドロキサメート、又は７
−アザトリプトフアン等がある。
本発明で使用する変異株は、バチルス属に属
し、上記のトリプトフアンアナログに耐性を有し
コリスミ酸ムターゼの活性が弱化しかつトリプト
フアン生産能を有する変異株であり、例えば次の
ような変異株が代表例として挙げられる。
バチルス・ズブチリス AJ11984 FERM−
P6845（５−Ｆ−Trpr、CMw）
バチルス・ズブチリス AJ11985 FERM−
P6846（５−Ｆ−Trpr、CMw）
(註) ５−Ｆ−Trpr：５−フルオロトリプトフア
ン耐性
CMw：コリスミ酸ムターゼ弱化
これら本発明で使用される変異株は、バチルス
属のトリプトフアンアナログ耐性のトリプトフア
ン生産菌を親株とし、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線照射或はＮ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学
薬剤処理を施し、変異処理した菌液の中からコリ
スミ酸ムターゼの活性の低い株を選び出すことに
より得られる。
コリスミ酸ムターゼ活性の低い変異株の選択方
法としては直接コリスミ酸ムターゼ活性を測定し
て選ぶ方法をはじめとして種々の方法を用いるこ
とが出来るが、本発明は変異株の選択方法に何ら
限定されることはなく、コリスミ酸ムターゼ活性
の弱化株を用いる点に特徴がある。
上記の親株としては、トリプトフアンアナログ
耐性の他にトリプトフアン生産に有用な性質を有
するトリプトフアン生産菌、例えば、Ｌ−アルギ
ニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシンもしくはＬ−フ
エニルアラニン要求性のトリプトフアン生産菌
（特公昭53−39517号公報）、更にはトリプトフア
ンアナログ耐性でかつインドールマイシン耐性の
トリプトフアン生産菌（特開昭56−92796号公報）
等も使用できる。
その他、本発明の変異株はバチルス属の野生株
を親株とし、これからコリスミ酸ムターゼの活性
の弱化した変異株を選択した後、その変異株にト
リプトフアンアナログ耐性を付与することによつ
ても誘導することができる。
本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等
の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が使
用される。炭素源としてはグルコース、シユーク
ロース、マルトース、澱粉水解物、糖蜜等が使用
され、その他エタノール、酢酸、クエン酸等も単
独或は上記他の炭素源と併用して用いられる。窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸塩、尿素、ペプトン等有機或は無機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、
ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含
有するベプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆
蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要
求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求
される栄養素を補添することが必要である。無機
塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養は通常の培養条件下で行えばよく、PHを５
ないし９、温度を20ないし40℃に制御しつつ１〜
４日間振盪培養又は通気撹拌培養することにより
培養液中に著量のトリプトフアンが蓄積される。
培養中にPHが下がる場合には、炭酸カルシウムを
別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニ
アガス等のアルカリで中和する。又、有機酸を炭
素源とする場合はPHの上昇を鉱酸又は有機酸で中
和する。
培養液からトリプトフアンを採取する方法は、
公知のトリプトフアン回収方法に従つて行えばよ
く、培養液から菌体を除去した後濃縮晶析する方
法或はイオン交換クロマトグラフイー等によつて
採取される。
以下、実施例にて説明する。
実施例 １
第１表に示す組成の培地を500ml容振とうフラ
スコに50ml宛分注し、110℃で10分間加熱殺菌し
て培地を調製した。
第 １ 表
菌体培養培地の組成（PH7.0） 成 分 濃度
グルコース 50ｇ／
塩化アンモニウム 10 〃
KH2PO4 １ 〃
KCl ２ 〃
MnSO4・4H2O 10mg／
FeSO4・7H2O 10 〃
カザミノ酸 ４ｇ／
MgSO4・7H2O 0.4 〃
CaCO3 40 〃
本培地に第２表に示した菌株を接種し、30℃で
24〜48時間振とう培養を行い、培養液の26倍稀釈
液の570nmの吸光度が0.3〜0.4になつた時点で培
養を停止した。遠心分離によつて菌体を集め、
5mMのジチオスレイトールを含む50mMリン酸
カリバツフアー（PH7.0）で２回洗浄後、同バツ
フアー10mlに懸濁し、細胞を超音波破砕した後、
15000回転、20分間遠心分離して得られた上澄を
粗酵素液として用いた。
コリスミ酸ムターゼの活性はI.Shiio、S.
Sugimoto、J.Biochem.、86巻、17ページ、1979
年に記載の方法で測定した。反応液は0.4ml中に
50mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）、2.5mMコ
リスミ酸及び粗酵素液を含み、反応を30℃で20分
間行つた後、0.4mlの1N塩酸を添加して停止し
た。次いでそのまま37℃で10分間更に加温して生
成したプリフエン酸を定量的にフエニルピルビン
酸に変換した後、3.2mlの1N苛性ソーダを加え、
フエニルピルビン酸を320nmにおける吸光度で測
定した。また粗酵素液中の蛋白量は常法により
O.H.Lowryら、J.Biol.Chem、193巻、265ペー
ジ、1951年に記載の方法で定量した。
一方、同菌株をグルコース80ｇ／を含む上記
培地を用いて30℃にて96時間振盪培養し培養液中
に生成したトリプトフアンを常法に従い定量し
た。第２表に本発明の変異株のコリスミ酸ムター
ゼ活性とトリプトフアンの蓄積量を示す。第２表
に示す結果はコリスミ酸ムターゼ活性の弱化によ
りトリプトフアンの生産性が増大することを示し
ている。
【表】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing L-tryptophan (hereinafter referred to as tryptophan) by a fermentation method. As a conventional method for producing tryptophan, a method for producing tryptophan from anthranilic acid, indole, or 3-indolepyruvic acid, which is a precursor of tryptophan, is known. In contrast to methods using these precursors, tryptophan is produced by direct fermentation using a mutant strain belonging to the genus Bacillus that is resistant to tryptophan analogs and using sugars as a carbon source without using any precursors. Method (Tokuko Sho 48-18828, Tokko Sho
53-39517) has been developed. Therefore, the present inventors conducted research to develop a method to inexpensively produce tryptophan from carbon sources such as sugars by a direct fermentation method using microorganisms of the genus Bacillus. We have found that a mutant strain with weakened chorismate mutase activity derived from a tryptophan-producing bacterium that is resistant to tophan analogs produces even larger quantities of tryptophan. The present invention was completed as a result of further research based on this knowledge. In the present invention, chorismate mutase refers to L-tyrosine and L-tyrosine in microorganisms of the genus Bacillus.
It is an enzyme involved in the biosynthesis of phenylalanine and isomerizes chorismate, which is an intermediate in the biosynthesis of aromatic amino acids, to prephenic acid (enzyme number EC5.4.99.5). Chorismate mutase activity was determined using known methods, such as RGHCotton and F.
Gibson, Biochim. Biophys. Acta, vol. 100, p. 76, 1965, or I. Shiio and S. Sugimoto, J.
Biochem., vol. 86, p. 17, 1979. The tryptophan analog used in the present invention refers to a drug that inhibits the growth of microorganisms belonging to the genus Bacillus, and this growth inhibition is partially or completely canceled by the presence of L-tryptophan, such as 5- 5,6 or 7-lower alkyltryptophans such as methyltryptophan, 5- or 6-halogenotryptophans such as 5-fluorotryptophan, tryptophan hydroxamates, or 7
-Azatryptophan etc. The mutant strain used in the present invention belongs to the genus Bacillus, is resistant to the above-mentioned tryptophan analogs, has weakened chorismate mutase activity, and has the ability to produce tryptophan, such as the following mutations. Stocks are a typical example. Bacillus subtilis AJ11984 FERM−
P6845 (5-F-Trrp r , CM w ) Bacillus subtilis AJ11985 FERM-
P6846 (5-F- Trrp , CMw ) (Note) 5-F- Trrp : 5-fluorotryptophan resistance CMw : Chorismate mutase weakened These mutant strains used in the present invention are Bacillus spp. A tryptophan-producing bacterium resistant to tryptophan analogs is used as a parent strain, and this is subjected to conventional mutagenesis operations, such as ultraviolet irradiation or chemical treatment with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, etc. It is obtained by selecting strains with low chorismate mutase activity from the mutagenized bacterial fluid. Various methods can be used to select mutant strains with low chorismate mutase activity, including a method of directly measuring chorismate mutase activity, but the present invention is not limited to the method of selecting mutant strains. The unique feature is that a strain with weakened chorismate mutase activity is used. The above-mentioned parent strain may include tryptophan-producing bacteria that have properties useful for tryptophan production in addition to tryptophan analog resistance, such as tryptophan-producing bacteria that require L-arginine, L-lysine, L-leucine, or L-phenylalanine. Bacteria (Japanese Patent Publication No. 53-39517), and tryptophan-producing bacteria resistant to tryptophan analogs and indolmycin (Japanese Patent Publication No. 56-92796)
etc. can also be used. In addition, the mutant strain of the present invention can also be produced by using a wild strain of the genus Bacillus as a parent strain, selecting a mutant strain with weakened chorismate mutase activity, and then imparting tryptophan analog resistance to the mutant strain. can be induced. The medium used in the present invention is a conventional nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic micronutrients such as amino acids and vitamins as necessary. As the carbon source, glucose, sucrose, maltose, starch hydrolyzate, molasses, etc. are used, and ethanol, acetic acid, citric acid, etc. are also used alone or in combination with the other carbon sources mentioned above. As the nitrogen source, organic or inorganic nitrogen sources such as ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, nitrates, urea, and peptone are used. Organic micronutrients include amino acids,
Vitamins, fatty acids, nucleic acids, as well as beptone containing these things, casamino acids, yeast extract, soybean protein decomposition products, etc. are used, and when using auxotrophic mutant strains that require amino acids etc. for growth, It is necessary to supplement the nutrients. As the inorganic salts, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, etc. are used. Cultivation can be carried out under normal culture conditions, with a pH of 5.
to 9, 1 to 9 while controlling the temperature between 20 and 40℃
A significant amount of tryptophan is accumulated in the culture solution by shaking culture or aeration stirring culture for 4 days.
If the pH decreases during culture, add calcium carbonate after sterilization or neutralize with alkali such as aqueous ammonia or ammonia gas. In addition, when an organic acid is used as a carbon source, the increase in pH is neutralized with a mineral acid or an organic acid. How to collect tryptophan from culture fluid:
This may be carried out according to a known method for recovering tryptophan, and the tryptophan can be collected by removing the bacterial cells from the culture solution and then concentrating and crystallizing it, or by ion exchange chromatography. Examples will be described below. Example 1 50 ml of a medium having the composition shown in Table 1 was dispensed into a 500 ml shaking flask and heat sterilized at 110° C. for 10 minutes to prepare a medium. Table 1 Composition of bacterial culture medium (PH7.0) Ingredients Concentration Glucose 50g/ Ammonium chloride 10 〃 KH 2 PO 4 1 〃 KCl 2 〃 MnSO 4・4H 2 O 10mg/ FeSO 4・7H 2 O 10 〃 Casamino Acid 4g/ MgSO 4・7H 2 O 0.4 〃 CaCO 3 40 〃 Inoculate this medium with the strains shown in Table 2 and incubate at 30℃.
Shaking culture was performed for 24 to 48 hours, and the culture was stopped when the absorbance at 570 nm of the 26-fold dilution of the culture solution reached 0.3 to 0.4. Collect bacterial cells by centrifugation,
After washing twice with 50mM potassium phosphate buffer (PH7.0) containing 5mM dithiothreitol, the cells were suspended in 10ml of the same buffer, and the cells were disrupted by ultrasonication.
The supernatant obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes was used as a crude enzyme solution. The activity of chorismate mutase was determined by I. Shiio, S.
Sugimoto, J.Biochem., Volume 86, Page 17, 1979
It was measured using the method described in 2010. The reaction solution is in 0.4ml
The reaction mixture contained 50mM potassium phosphate buffer (PH7.0), 2.5mM chorismate, and crude enzyme solution, and the reaction was carried out at 30°C for 20 minutes, and then stopped by adding 0.4ml of 1N hydrochloric acid. Then, after further heating at 37°C for 10 minutes to quantitatively convert the produced prephenic acid into phenylpyruvic acid, 3.2ml of 1N caustic soda was added.
Phenylpyruvate was measured by absorbance at 320 nm. In addition, the amount of protein in the crude enzyme solution was measured using a conventional method.
It was quantified by the method described by OHLowry et al., J. Biol. Chem, vol. 193, p. 265, 1951. On the other hand, the same strain was cultured with shaking at 30° C. for 96 hours using the above medium containing 80 g of glucose, and tryptophan produced in the culture solution was quantified according to a conventional method. Table 2 shows the chorismate mutase activity and the amount of tryptophan accumulated in the mutant strains of the present invention. The results shown in Table 2 show that attenuating chorismate mutase activity increases tryptophan productivity. 【table】