JPH0456597B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0456597B2 JPH0456597B2 JP57227912A JP22791282A JPH0456597B2 JP H0456597 B2 JPH0456597 B2 JP H0456597B2 JP 57227912 A JP57227912 A JP 57227912A JP 22791282 A JP22791282 A JP 22791282A JP H0456597 B2 JPH0456597 B2 JP H0456597B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tryptophan
- chorismate mutase
- acid
- culture
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、発酵法によるＬ−トリプトフアン
（以下、トリプトフアンと記す）の製造法に関す
る。 従来トリプトフアンの製造法としては、トリプ
トフアンの前駆物質であるアントラニル酸、イン
ドール或は３−インドールピルビン酸よりトリプ
トフアンを製造する方法が知られている。 これら前駆物質を使用する方法に対し、前駆物
質を使用しないで、糖類等を炭素源とし、バチル
ス属に属しトリプトフアンアナログに耐性を有す
る変異株を使用して直接発酵法によりトリプトフ
アンを生産する方法（特公昭48−18828、特公昭
53−39517）が開発されている。 そこで、本発明者らはバチルス属の微生物を用
いて更に糖類等の炭素源からトリプトフアンを直
接発酵法により安価に製造する方法を開発すべく
研究を行つた結果、バチルス属の上記のようなト
リプトフアンアノログ耐性を有するトリプトフア
ン生産菌から誘導したコリスミ酸ムターゼの活性
の弱化した変異株が更に大量のトリプトフアンを
生産することを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて更に研究の結果完
成されたものである。 本発明でいうコリスミ酸ムターゼとは、バチル
ス属の微生物においてＬ−チロシンならびにＬ−
フエニルアラニンの生合成に関与する酵素であ
り、芳香族アミノ酸の生合成の中間体であるコリ
スミ酸をプレフエン酸に異性化せしめる酵素（酵
素番号EC5.4.99.5）である。コリスミ酸ムターゼ
活性は公知の方法、例えばR.G.H.Cotton and F.
Gibson、Biochim.Biophys.Acta、100巻、76ペ
ージ、1965年、或はI.Shiio and S.Sugimoto、J.
Biochem.、86巻、17ページ、1979年などの文献
に記載された方法で測定することができる。 本発明でいうトリプトフアンアナログとはバチ
ルス属に属する微生物の生育を阻害し、この生育
阻害がＬ−トリプトフアンの存在によつて部分的
又は完全に解除されるような薬剤をいい、例えば
５−メチルトリプトフアン等の５，６又は７−低
級アルキルトリプトフアン、５−フルオロトリプ
トフアン等の５又は６−ハロゲノトリプトフア
ン、トリプトフアンハイドロキサメート、又は７
−アザトリプトフアン等がある。 本発明で使用する変異株は、バチルス属に属
し、上記のトリプトフアンアナログに耐性を有し
コリスミ酸ムターゼの活性が弱化しかつトリプト
フアン生産能を有する変異株であり、例えば次の
ような変異株が代表例として挙げられる。 バチルス・ズブチリス AJ11984 FERM−
P6845（５−Ｆ−Trpr、CMw） バチルス・ズブチリス AJ11985 FERM−
P6846（５−Ｆ−Trpr、CMw） (註) ５−Ｆ−Trpr：５−フルオロトリプトフア
ン耐性 CMw：コリスミ酸ムターゼ弱化 これら本発明で使用される変異株は、バチルス
属のトリプトフアンアナログ耐性のトリプトフア
ン生産菌を親株とし、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線照射或はＮ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学
薬剤処理を施し、変異処理した菌液の中からコリ
スミ酸ムターゼの活性の低い株を選び出すことに
より得られる。 コリスミ酸ムターゼ活性の低い変異株の選択方
法としては直接コリスミ酸ムターゼ活性を測定し
て選ぶ方法をはじめとして種々の方法を用いるこ
とが出来るが、本発明は変異株の選択方法に何ら
限定されることはなく、コリスミ酸ムターゼ活性
の弱化株を用いる点に特徴がある。 上記の親株としては、トリプトフアンアナログ
耐性の他にトリプトフアン生産に有用な性質を有
するトリプトフアン生産菌、例えば、Ｌ−アルギ
ニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシンもしくはＬ−フ
エニルアラニン要求性のトリプトフアン生産菌
（特公昭53−39517号公報）、更にはトリプトフア
ンアナログ耐性でかつインドールマイシン耐性の
トリプトフアン生産菌（特開昭56−92796号公報）
等も使用できる。 その他、本発明の変異株はバチルス属の野生株
を親株とし、これからコリスミ酸ムターゼの活性
の弱化した変異株を選択した後、その変異株にト
リプトフアンアナログ耐性を付与することによつ
ても誘導することができる。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等
の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が使
用される。炭素源としてはグルコース、シユーク
ロース、マルトース、澱粉水解物、糖蜜等が使用
され、その他エタノール、酢酸、クエン酸等も単
独或は上記他の炭素源と併用して用いられる。窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸塩、尿素、ペプトン等有機或は無機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、
ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含
有するベプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆
蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要
求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求
される栄養素を補添することが必要である。無機
塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。 培養は通常の培養条件下で行えばよく、PHを５
ないし９、温度を20ないし40℃に制御しつつ１〜
４日間振盪培養又は通気撹拌培養することにより
培養液中に著量のトリプトフアンが蓄積される。
培養中にPHが下がる場合には、炭酸カルシウムを
別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニ
アガス等のアルカリで中和する。又、有機酸を炭
素源とする場合はPHの上昇を鉱酸又は有機酸で中
和する。 培養液からトリプトフアンを採取する方法は、
公知のトリプトフアン回収方法に従つて行えばよ
く、培養液から菌体を除去した後濃縮晶析する方
法或はイオン交換クロマトグラフイー等によつて
採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 第１表に示す組成の培地を500ml容振とうフラ
スコに50ml宛分注し、110℃で10分間加熱殺菌し
て培地を調製した。 第 １ 表 菌体培養培地の組成（PH7.0） 成 分 濃度 グルコース 50ｇ／ 塩化アンモニウム 10 〃 KH2PO4 １ 〃 KCl ２ 〃 MnSO4・4H2O 10mg／ FeSO4・7H2O 10 〃 カザミノ酸 ４ｇ／ MgSO4・7H2O 0.4 〃 CaCO3 40 〃 本培地に第２表に示した菌株を接種し、30℃で
24〜48時間振とう培養を行い、培養液の26倍稀釈
液の570nmの吸光度が0.3〜0.4になつた時点で培
養を停止した。遠心分離によつて菌体を集め、
5mMのジチオスレイトールを含む50mMリン酸
カリバツフアー（PH7.0）で２回洗浄後、同バツ
フアー10mlに懸濁し、細胞を超音波破砕した後、
15000回転、20分間遠心分離して得られた上澄を
粗酵素液として用いた。 コリスミ酸ムターゼの活性はI.Shiio、S.
Sugimoto、J.Biochem.、86巻、17ページ、1979
年に記載の方法で測定した。反応液は0.4ml中に
50mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）、2.5mMコ
リスミ酸及び粗酵素液を含み、反応を30℃で20分
間行つた後、0.4mlの1N塩酸を添加して停止し
た。次いでそのまま37℃で10分間更に加温して生
成したプリフエン酸を定量的にフエニルピルビン
酸に変換した後、3.2mlの1N苛性ソーダを加え、
フエニルピルビン酸を320nmにおける吸光度で測
定した。また粗酵素液中の蛋白量は常法により
O.H.Lowryら、J.Biol.Chem、193巻、265ペー
ジ、1951年に記載の方法で定量した。 一方、同菌株をグルコース80ｇ／を含む上記
培地を用いて30℃にて96時間振盪培養し培養液中
に生成したトリプトフアンを常法に従い定量し
た。第２表に本発明の変異株のコリスミ酸ムター
ゼ活性とトリプトフアンの蓄積量を示す。第２表
に示す結果はコリスミ酸ムターゼ活性の弱化によ
りトリプトフアンの生産性が増大することを示し
ている。 【表】
（以下、トリプトフアンと記す）の製造法に関す
る。 従来トリプトフアンの製造法としては、トリプ
トフアンの前駆物質であるアントラニル酸、イン
ドール或は３−インドールピルビン酸よりトリプ
トフアンを製造する方法が知られている。 これら前駆物質を使用する方法に対し、前駆物
質を使用しないで、糖類等を炭素源とし、バチル
ス属に属しトリプトフアンアナログに耐性を有す
る変異株を使用して直接発酵法によりトリプトフ
アンを生産する方法（特公昭48−18828、特公昭
53−39517）が開発されている。 そこで、本発明者らはバチルス属の微生物を用
いて更に糖類等の炭素源からトリプトフアンを直
接発酵法により安価に製造する方法を開発すべく
研究を行つた結果、バチルス属の上記のようなト
リプトフアンアノログ耐性を有するトリプトフア
ン生産菌から誘導したコリスミ酸ムターゼの活性
の弱化した変異株が更に大量のトリプトフアンを
生産することを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて更に研究の結果完
成されたものである。 本発明でいうコリスミ酸ムターゼとは、バチル
ス属の微生物においてＬ−チロシンならびにＬ−
フエニルアラニンの生合成に関与する酵素であ
り、芳香族アミノ酸の生合成の中間体であるコリ
スミ酸をプレフエン酸に異性化せしめる酵素（酵
素番号EC5.4.99.5）である。コリスミ酸ムターゼ
活性は公知の方法、例えばR.G.H.Cotton and F.
Gibson、Biochim.Biophys.Acta、100巻、76ペ
ージ、1965年、或はI.Shiio and S.Sugimoto、J.
Biochem.、86巻、17ページ、1979年などの文献
に記載された方法で測定することができる。 本発明でいうトリプトフアンアナログとはバチ
ルス属に属する微生物の生育を阻害し、この生育
阻害がＬ−トリプトフアンの存在によつて部分的
又は完全に解除されるような薬剤をいい、例えば
５−メチルトリプトフアン等の５，６又は７−低
級アルキルトリプトフアン、５−フルオロトリプ
トフアン等の５又は６−ハロゲノトリプトフア
ン、トリプトフアンハイドロキサメート、又は７
−アザトリプトフアン等がある。 本発明で使用する変異株は、バチルス属に属
し、上記のトリプトフアンアナログに耐性を有し
コリスミ酸ムターゼの活性が弱化しかつトリプト
フアン生産能を有する変異株であり、例えば次の
ような変異株が代表例として挙げられる。 バチルス・ズブチリス AJ11984 FERM−
P6845（５−Ｆ−Trpr、CMw） バチルス・ズブチリス AJ11985 FERM−
P6846（５−Ｆ−Trpr、CMw） (註) ５−Ｆ−Trpr：５−フルオロトリプトフア
ン耐性 CMw：コリスミ酸ムターゼ弱化 これら本発明で使用される変異株は、バチルス
属のトリプトフアンアナログ耐性のトリプトフア
ン生産菌を親株とし、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線照射或はＮ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学
薬剤処理を施し、変異処理した菌液の中からコリ
スミ酸ムターゼの活性の低い株を選び出すことに
より得られる。 コリスミ酸ムターゼ活性の低い変異株の選択方
法としては直接コリスミ酸ムターゼ活性を測定し
て選ぶ方法をはじめとして種々の方法を用いるこ
とが出来るが、本発明は変異株の選択方法に何ら
限定されることはなく、コリスミ酸ムターゼ活性
の弱化株を用いる点に特徴がある。 上記の親株としては、トリプトフアンアナログ
耐性の他にトリプトフアン生産に有用な性質を有
するトリプトフアン生産菌、例えば、Ｌ−アルギ
ニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシンもしくはＬ−フ
エニルアラニン要求性のトリプトフアン生産菌
（特公昭53−39517号公報）、更にはトリプトフア
ンアナログ耐性でかつインドールマイシン耐性の
トリプトフアン生産菌（特開昭56−92796号公報）
等も使用できる。 その他、本発明の変異株はバチルス属の野生株
を親株とし、これからコリスミ酸ムターゼの活性
の弱化した変異株を選択した後、その変異株にト
リプトフアンアナログ耐性を付与することによつ
ても誘導することができる。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等
の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が使
用される。炭素源としてはグルコース、シユーク
ロース、マルトース、澱粉水解物、糖蜜等が使用
され、その他エタノール、酢酸、クエン酸等も単
独或は上記他の炭素源と併用して用いられる。窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸塩、尿素、ペプトン等有機或は無機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、
ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含
有するベプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆
蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要
求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求
される栄養素を補添することが必要である。無機
塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。 培養は通常の培養条件下で行えばよく、PHを５
ないし９、温度を20ないし40℃に制御しつつ１〜
４日間振盪培養又は通気撹拌培養することにより
培養液中に著量のトリプトフアンが蓄積される。
培養中にPHが下がる場合には、炭酸カルシウムを
別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニ
アガス等のアルカリで中和する。又、有機酸を炭
素源とする場合はPHの上昇を鉱酸又は有機酸で中
和する。 培養液からトリプトフアンを採取する方法は、
公知のトリプトフアン回収方法に従つて行えばよ
く、培養液から菌体を除去した後濃縮晶析する方
法或はイオン交換クロマトグラフイー等によつて
採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 第１表に示す組成の培地を500ml容振とうフラ
スコに50ml宛分注し、110℃で10分間加熱殺菌し
て培地を調製した。 第 １ 表 菌体培養培地の組成（PH7.0） 成 分 濃度 グルコース 50ｇ／ 塩化アンモニウム 10 〃 KH2PO4 １ 〃 KCl ２ 〃 MnSO4・4H2O 10mg／ FeSO4・7H2O 10 〃 カザミノ酸 ４ｇ／ MgSO4・7H2O 0.4 〃 CaCO3 40 〃 本培地に第２表に示した菌株を接種し、30℃で
24〜48時間振とう培養を行い、培養液の26倍稀釈
液の570nmの吸光度が0.3〜0.4になつた時点で培
養を停止した。遠心分離によつて菌体を集め、
5mMのジチオスレイトールを含む50mMリン酸
カリバツフアー（PH7.0）で２回洗浄後、同バツ
フアー10mlに懸濁し、細胞を超音波破砕した後、
15000回転、20分間遠心分離して得られた上澄を
粗酵素液として用いた。 コリスミ酸ムターゼの活性はI.Shiio、S.
Sugimoto、J.Biochem.、86巻、17ページ、1979
年に記載の方法で測定した。反応液は0.4ml中に
50mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）、2.5mMコ
リスミ酸及び粗酵素液を含み、反応を30℃で20分
間行つた後、0.4mlの1N塩酸を添加して停止し
た。次いでそのまま37℃で10分間更に加温して生
成したプリフエン酸を定量的にフエニルピルビン
酸に変換した後、3.2mlの1N苛性ソーダを加え、
フエニルピルビン酸を320nmにおける吸光度で測
定した。また粗酵素液中の蛋白量は常法により
O.H.Lowryら、J.Biol.Chem、193巻、265ペー
ジ、1951年に記載の方法で定量した。 一方、同菌株をグルコース80ｇ／を含む上記
培地を用いて30℃にて96時間振盪培養し培養液中
に生成したトリプトフアンを常法に従い定量し
た。第２表に本発明の変異株のコリスミ酸ムター
ゼ活性とトリプトフアンの蓄積量を示す。第２表
に示す結果はコリスミ酸ムターゼ活性の弱化によ
りトリプトフアンの生産性が増大することを示し
ている。 【表】
Claims (1)
- １ バチルス属に属しトリプトフアンアナログ耐
性を有しかつコリスミ酸ムターゼ活性の弱化した
Ｌ−トリプトフアン生産性変異株を好気的に培養
して培養液中にＬ−トリプトフアンを生成、蓄積
せしめ、該Ｌ−トリプトフアンを採取することを
特徴とする発酵法によるＬ−トリプトフアンの製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22791282A JPS59120091A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22791282A JPS59120091A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59120091A JPS59120091A (ja) | 1984-07-11 |
| JPH0456597B2 true JPH0456597B2 (ja) | 1992-09-08 |
Family
ID=16868242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22791282A Granted JPS59120091A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59120091A (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS561916A (en) * | 1979-06-20 | 1981-01-10 | Hideo Seo | Spectacles for preventing decrease in sight or recovering sight |
| JPS5634279A (en) * | 1979-08-28 | 1981-04-06 | Sharp Corp | Image pickup device |
-
1982
- 1982-12-27 JP JP22791282A patent/JPS59120091A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59120091A (ja) | 1984-07-11 |
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