JPH0458311B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はオキシランを有するポリマーよりなる
担体に酵素を固定（immobilization）せしめる
ことに関するものである。特にオキシランペンダ
ント基を有し、高い多孔性、大きな径の細孔及び
大きな表面積を有する改良されたポリマー及びそ
の製造方法に関するものである。 （従来の技術） 酵素はいろいろの反応に於いて触媒として有用
であり、酵素は酵素を造り出す有機体から純粋な
形で分離されたものの使用が望ましい。このよう
な純粋な状態では酵素は比較的不安で容易に変性
し、またはそれは溶液反応媒体から回収すること
が困難である。 これ等の困難を克服するためには、酵素を何等
かの不溶性の担体の上に固定することが望まし
く、その場合、反応媒体中で反応物と容易に接触
でき、しかし安定性の増大と、瀘過のような単純
な方法によつて容易に回収出来ると云う両方の利
点が得られる。 担体の上に蛋白質酵素を固定する通常の機能
は、酵素上の活性水素を持つ基例えばアルコー
ル、アミン又はメルカプタン基と、不溶性のポリ
マーから突き出ているオキシランつまりエポキシ
環ペンダクト基との反応による。この反応により
環が開き、下記のように酵素基からの水素がオキ
シラン酸素とでヒドロキシル基を作る。 このようにして、有意な量のオキシラン環を含
有する担体は、容易に蛋白質酵素を固定すること
が出来る。 このような担体は、従来通常の懸濁重合により
約35μｍから約２mmの直径のビーズ（beads）の
形で造られてきた。 このような担体の代表的なものは、米国特許第
3844892号及び米国特許第3932557号明細書に記載
されている。これらの文献は、オキシランつまり
エポキシ環を含有する多くのモノマーを教示して
いる。 上記の文献に記載されている担体は、通常のゲ
ルのビーズである。このような担体はそのままで
は、マクロ細孔を持たず、このビーズと同じ直径
の球体の表面積とほぼ同じ表面積を有する。酵素
は、担体の表面で反応し、そこに留る傾向がある
ので、表面積はより大きいことが望まれる。慣用
の懸濁重合によるビーズの表面積は、相分離剤、
即ちモノマー相からのコーポリマーの分離を起さ
せる液体を加えてマクロ孔性を導入することによ
つて典型的に増加される。 そのようなマクロ孔性が酵素担体において有用
であるためには、孔は、固定される酵素及び反応
媒体の成分がともに自由に通過するのに充分な大
きさでなければならない。 担体ビーズにマクロ孔性を導入するための方法
は、英国特許第1512462号公報及び米国特許第
4070348号明細書に明らかに報告されている。し
かしながらこれらの方法によつて製造された担体
は、酵素固定プロセスでの利用にかなりの限界を
有している。上記米国の文献における、油相中に
モノマーの水溶液が滴状に懸濁している逆懸濁重
合プロセスは、比較的表面積の小さい担体ビーズ
を作る。一方、英国の文献で相分離剤として使用
されるアルコールは、オキシラン環と反応して、
酵素を固定するために利用出来る部位の数を減少
せしめる。 （発明が解決すべき課題） 本発明は、大きな表面積及び酵素固定のための
高密度の活性オキシラン部位をもつ酵素固定化用
担体及びその製造法を提供することを目的とす
る。 （課題を解決するための手段） 本発明の担体は、オキシラン環と反応しない相
分離剤の存在下に、アクリル又はメタクリル酸の
グリシジルエステル、又はアクリルグリシジルエ
ーテルと、親水性を有するトリビニルモノマーた
とえばトリメチルプロパン、トリメタクリレー
ト、トリメチルプロパン トリアクリレート又は
トリアリル イソシアネート又はこれらの混合物
とをフリーラジカル懸濁重合させることによつて
製造される。 モノビニルグリシジル化合物とトリビニル化合
物の重量比は、約５：95〜95：５、好ましくは約
５：95〜50：50、より好ましくは約10：90〜30：
70である。 この適当な比率は、大きな表面積、及び酵素を
固定するのに利用できる対応する高濃度のオキシ
ラン基を有する担体の形成を促進する。 相分離剤は、有機層の重量％を基にして約20％
〜90重量％の量で存在してよい。 本発明の製造方法に適当な層分離剤は、オキシ
ラン環と反応しないものであるが、上述の相分離
剤の一般的定義をなお満す。これらの分離剤の例
には、トルエン、キシレン、ベンゼン、メシチレ
ン、クロロホルム、エチレンジクロライド、メチ
ルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、オク
タン及びこれらの混合物が含まれる。より望まし
い相分離剤は、炭化水素相分離剤であり、もつと
も望ましい分離剤はトルエンである。 通常のフリーラジカル開始剤、例えばアゾ又は
過酸化物開始剤が重合の開始のために使用され、
その使用量はモノマーの重量を基礎にして約0.1
から約４重量％である。 モノマーの混合物及び相分離剤よりなる有機相
は、懸濁媒体の全重量を基礎にして１〜10重量％
の、モノマー又は開始剤と反応しない無機塩類、
好ましくは塩化ナトリウム、及び0.1〜20重量％
の通常の懸濁助剤、好ましくはゼラチン及び／又
はポリアクリル酸ナトリウムまたはポリビニルア
ルコール溶液を含む水性懸濁媒体中に撹拌により
懸濁される。有機相の水性相に対する比率は約
0.5：１から約２：１である。 重合は、開始剤の分解をおこすのに充分なほど
高いが、選択した圧力で有機又は水性相が沸騰す
るのをふせぐような低い温度で撹拌しながら行な
われる。好ましい温度は約40℃から約90℃であ
る。圧力は、耐圧容器を使用しなくてもよいよう
に、普通には大気圧が選ばれるが、望むならば数
気圧の下でも行い得る。 本発明はまた、このようにして作られた担体に
関し、担体は好ましくは、下記の実施例で示され
るように少くとも140m²／ｇの表面積、少くとも
1.14cm³／ｇの多孔率及び少くとも0.18ミリ当量／
ｇの表面オキシランを有する。 （作用） 得られたコーポリマーのビーズは、マクロ孔性
であり、大きな表面積を有している。このビーズ
は、酵素又は反応物が容易に侵入するのに充分な
大きさの孔を有し、酵素固定の部位として利用で
きる高密度のオキシラン基を有している。これら
の性質は以下に述べる実施例によつてさらに説明
する。 酵素は蛋白質であり、総ての蛋白質は担体のオ
キシラン基と反応できる活性水素含有基、たとえ
ばアミン、アルコールまたはメルカプタン基を有
しているので、事実上総ての酵素は本発明による
担体に固定するのに適している。固定できる酵素
の例としては、ペニシリン Ｇ アシラーゼ、ペ
ニシリン、Ｖ アシラーゼ、グルコアミラーゼ、
グルコースイソメラーゼ、ラクターゼ、テルモア
ーゼ、シアニド、ヒドロラーゼ、セフアロスポリ
ン ヒドロラーゼ及びエステラーゼがある。 本発明の担体のオキシラン環は、酵素の固定に
加うるに、活性水素を有する他の物質の固定にも
利用出来る。酵素以外の蛋白質も、酵素淡白と同
様な反応によつて固定出来る。アミノ酸のような
キラル（chiral）基も、結合されうる。この結合
は、アミノ酸のラセミ混合物の分離に利用されう
る。生きている細胞は、それの蛋白質の反応によ
り担体の表面に固定されうる。 本発明の担体が適している特定の用途は、担体
に結合する成分を含有する混合物が、担体の床中
を流通するところのアフイニテイクロマトグラフ
イーである。結合する成分は混合物から取り除か
れ、残つた成分は妨げられずに床を通過する。其
の他の同じような用途は、当業者にとつて明白で
ある。 以下実施例により本発明を説明する。しかしこ
れによつて本発明の特許請求の範囲を限定するも
のではない。 以下特別の記載の無い場合は総ての％は重量％
を表わす。又総ての使用した薬品は市販の良品質
のものを用いた。 実施例 １ 本実施例は、オキシランを有する多孔質のポリ
マー担体の製造および、この担体上〜の酵素の固
定について説明せんとするものである。490mlの
脱イオン水、16.2ｇの塩化ナトリウム、10.5ｇの
ポリアクリル酸ナトリウム（Acrysol（商標）GS
分散剤）12.5％溶液、及び50mlの脱イオン水に溶
かした0.9ｇのゼラチン（Pharmagel、商標）の
水性相を反応容器中で10分間撹拌した。この容器
にトリメチロールプロパン トリメタクリレート
111.4ｇ、グリシジル メタクリレート28.0ｇ、
トルエン314ｇ及びラウロイルパーオキサイド
1.35ｇの有機相を加え、この混合物を回転数
200RPMで15分間撹拌した。次に温度を65℃にあ
げ、20時間維持した。混合物を放冷し、生じた白
色のビーズを各1000mlの脱イオン水で３回洗滌
し、次に500mlのトルエンで１回洗滌し、このビ
ーズを真空乾燥した。乾燥した樹脂の試料を再び
濡らし、この２ｇを、活性180I.U.／ｇを有する
凍結乾燥したペニシリン アシラーゼ１ｇと1M
のPH６の酢酸塩緩衝液４mlの混合物に加えた。こ
の混合物を室温で暗所に48時間放置した。 次に液相をデカントし、ビーズをクロマトグラ
フのカラフに入れた。カラムに1M塩化ナトリウ
ム水溶液の250mlを流し、次に250mlの蒸留水を流
して、ビーズを洗つた。 実施例 ２ 実施例１で用いたラウロイルパーオキサイドの
代りに、1.35ｇのアゾイソブテロニトリルを用い
た以外は、実施例１を繰返した。 実施例 ３ 有機相として、トリメチロールプロパン トリ
メタクリレート124ｇ、グリシジルメタクリレー
ト14ｇ、トルエン314ｇ及びラウロイルパーオキ
サイド1.39ｇよりなるものを使用した以外は、実
施例１を繰返した。 実施例 ４ 有機相としてトリメチロールプロパン トリメ
タクリレート99.2ｇ、グリシジルメタクレート
42.2ｇ、トルエン314.1ｇ及びラウロイルパーア
キサイド1.35ｇよりなるものを使用した以外は、
実施例１を繰返した。 実施例 ５ 1000mlの水による３回目の洗滌のあとで、残留
トルエンを共沸蒸留により取り除いた以外は、実
施例１を繰返した。 実施例 ６ 有機相としてトリメチロールプロパン トリメ
タクリレート71ｇ、グリシジルメタクリレート
71.0ｇ、トルエン314.1ｇ及びラウロイル パー
オキサイド1.35ｇよりなるものを使用した以外
は、実施例１を繰返した。 実施例 ７ 水性相としてポリビニルアルコール1.1ｇ、
“Pharmagel”ゼラチン0.6ｇ及び蒸留水617ｇよ
りなるものを使用した以外は、実施例１を繰返し
た。 以下に記載する第１表には、上記の実施例によ
つて製造された担体の物理的パラメーター及び担
体上に固定されたペニシリン アシラーゼ酵素の
活性を示す。 表面積及び多孔度は、通常使われるブルナウエ
ル−エメツト−テラー（BET）の表面積のため
の窒素等温脱着試験及び多孔度のための水銀圧入
（intrusion）試験に基づく計算により決定され
た。表面オキシラン活性は、下記の手順で測定さ
れた。 表面オキシランの活性試験 ２ｇの乾燥担体樹脂を、PHコントローラーに接
続された容器中で、1.3Mチオ硫酸ナトリウム水
溶液100mlの中に撹拌しながら懸濁し、電気的に
PHを測定し、PHを７〜7.5に維持するに充分な量
の0.1Mの塩酸を計り入れた。表面オキシランの
量は、当量の水酸化ナトリウムを遊離するチオ硫
酸ナトリウムとオキシラン基の反応に基づいて計
算された。 ペニシリン アシラーゼ酵素を担体に固定した
場合又はフリーの状態の活性は次のような方法で
測定された。 ペニシリン アシラーゼの活性試験 約50I.U.の活性を含むのに十分な、フリーの又
は担体の上に固定されたペニシリン アシラーゼ
酵素のある量を、PH7.5の燐酸塩緩衝液60mlの中
に懸濁させた。混合物は、電気的にPHを測定する
PHコントローラーに接続された容器の中で28℃に
保たれ、PHを約8.0に維持するに充分な量の0.8N
の苛性ソーダ溶液をはかり入れた。この容器に、
燐酸塩緩衝液中にペニシリンＧカリウム塩５ｇを
含有する溶液を矢張り28℃で加えた。そうしてペ
ニシリンＧの酵素触媒された加水分解によるフエ
ニル酢酸の生成速度を、PHを維持するための苛性
ソーダ溶液の添加速度から測定した。ペニシリン
Ｇ塩を加えたとき及び10分後、30分後に、容器中
の液体の試料をとつた。これ等の試料（0.5ml）
は直ちに、0.05Mの苛性ソーダ１mlと、メタノー
ル100ml当り20ｇの酢酸及び0.5ｇのパラジメチル
アミノベンズアルデヒドを含有する溶液２mlとの
溶液３mlと混合した。形成された６−アミノ ペ
ニシシラニツク アシツドの量は415nｍの波長
におけるこ号物の光吸収を分光測光することによ
り決定された。

【表】 （発明の効果） 本発明により酵素の固定のために有効な、高表
面積でマクロ孔性を有し、酵素の固定の結合点と
なる高密度のオキシラン基を有するポリマーのビ
ーズ状の担体を製造することが出き、かつこの担
体に固定された酵素は安定性があり、効力の永続
的な維持が可能であり、溶液の反応媒体から瀘過
等の単純な工程によつて容易に回収できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グリシジルアクリレート、グリシジルメタク
   リレート、アリルグリシジルエーテル、及びこれ
   らの混合物よりなる群から選ばれたオキシラン基
   含有モノビニルモノマーと親水性を有するトリビ
   ニル架橋性モノマーとを、重量比で約５：95〜
   50：50の割合で、水性懸濁媒体中で、有機相に対
   して約20％〜90％の、オキシラン基と反応しない
   相分離剤の存在の下にフリーラジカル懸濁重合さ
   せることによりなる、酵素固定のための担体の製
   造方法。 ２ モノビニルモノマー対トリビニルモノマーの
   比が約10：90から約30：70である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３ 架橋性モノマーが、トリメチロールプロパン
   トリメタクリレート、トリメチロールプロパント
   リアクリレート、トリアリル、イソシアネート又
   はこれらの混合物よりなる群から選ばれたもので
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 相分離剤が炭化水素相分離剤である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５ 炭化水素相分離剤がトルエンである特許請求
   の範囲第４項記載の方法。 ６ 酵素固定用の担体において、担体が、グリシ
   ジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、
   アリルグリシジルエーテル及びこれらの混合物よ
   りなる群から選ばれたオキシラン基含有モノビニ
   ルモノマー及び親水性を有するトリビニル架橋性
   モノマー（但し、モノビニルモノマー対トリビニ
   ルモノマーの重量比は５：95〜50：50である）か
   ら作られたポリマーのマクロ孔性ビーズであり、
   該ビーズは少くとも140m²／ｇの表面積、少くと
   も1.14cm³／ｇの多孔率及び少くとも0.18ミリ当
   量／ｇの表面オキシランを有することを特徴とす
   る担体。