JPH0458900A - 存在の予想された核酸の検出方法及びそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液（血球、血清、血漿）、胆汁、膿汁、髄
液、糞便、唾液、喀談、動植物組織又は細胞からの核酸
抽出液等の生体試料中に存在すると予想される、特定の
塩基配列部分を有する核酸を検出する方法に関するもの
であり、詳しくは一回の測定で同時に複数の核酸の存在
を検出する方法に関するものである。また本発明は、こ
のような検出方法を実施するための試薬キットに関する
ものである。

（従来の技術とその課題） 従来より臨床検査等の分野においては、例えば細菌によ
る感染症の疑いがあるとされた場合には、検体を染色検
鏡することによりその存在を検出し、次にこの検体を各
種培地で培養することで細菌種の同定等を行う方法が知
られている。

この方法は細菌等の種類までも判別可能であるという特
徴を有する半面、検体の培養を実施しなければならない
ためにその実施には長期間を必要とする、実施者に感染
の危険性がある、培養設備等が必要である、等の課題が
ある。

一方、迅速な診断を実現可能とするものとして、ＤＮＡ
診断が行われるようになっている。ＤＮＡ診断には、核
酸中の特定の塩基配列（通常、核酸中の特徴的な塩基配
列部分）と相補的な塩基配列を有する核酸プローブを使
用した方法が知られている。核酸プローブを使用した方
法には、詳しくはドツトプロット法、サンドイツチ法、
カラム法等がある。一般に広く使用されているドツトプ
ロット法は、フィルターに一本鎖核酸に変換された試料
核酸を固定化し、予想された核酸中の特定塩基配列部分
に対して相補的に設計された核酸プローブに標識を付し
たものをこれに添加し、ハイブリダイズしなかった核酸
プローブを洗浄・除去し、最終的に除去されなかった成
分中の標識物を検出する、ことからなる方法である。

ドツトプロット法に代表される核酸プローブを使用した
検出方法は、検出感度が良好である、前記した培養操作
を伴う方法に比較して簡便な操作で実施可能である、等
の利用から、頻繁に利用されている。

ところが、以上のような核酸プローブを使用した方法に
おいては、例えばドツトプロット法では試料核酸を適当
なフィルターに固定化するなど、プローブ又は検出され
るべき核酸のいずれか一方を適当な固相に固定化するこ
とが必要であり、固定化操作等の前処理操作等が必要と
なるという課題がある。更には、これら核酸プローブを
使用する方法において一回の操作で使用する核酸プロー
ブは通常一種類であり、試料中にある一種類の核酸が存
在するか否かを検出するには好適であるものの、複数種
の核酸の存在を同時に検出するためにはプローブごとに
異なる標識物を付し、これら標識物ごとに検出操作を行
う必要がある等の課題がある。

以上のような従来の技術とその課題に鑑み、本発明者は
、核酸の固定化等の前処理を行うことなく、複数種の予
想された核酸が試料中に存在するか否か、存在する核酸
は具体的にどの核酸であるか、を−度の測定で検出可能
とすることを目的として鋭意研究を行った。その結果、
核酸伸長反応が行われた場合に地組とは異なる塩基数の
合成核酸を出現するように設計された２本の核酸プライ
マーからなる核酸プライマー組の複数種組及びＤＮＡポ
リメレースとその伸長反応に必要な基質等を用いること
により、これら課題を解決し得ることを見出だし、本発
明を完成させた。

（課題を解決するための手段） 以上に説明した目的をもって完成された本発明は、即ち
、複数種の核酸を含むことが予想される試料について、
これら核酸が二本鎖であると予想される場合にはそれを
一本鎖に変換し、存在が予想される一本鎖核酸中の特定
の塩基配列部分にハイブリダイズ可能な第１の核酸プラ
イマーとこの一本鎖核酸と相補的な核酸中の特定の塩基
配列部分にハイブリダイズ可能な第２の核酸プライマー
からなる核酸プライマー組の複数種組及びこれら核酸プ
ライマーを始点とした核酸伸長反応のためのＤＮＡポリ
メレースとその基質等を添加して核酸の伸長反応を実現
し、少なくともその５−末端に前記第１の核酸プライマ
ーが位置する合成核酸を含む二本鎖核酸を出現させ、次
にこれら二本鎖核酸を一本鎖核酸に変換して前記複数種
組の核酸プライマー組の存在下で更に核酸伸長反応を実
現し、少なくともその５′末端には前記第２の核酸プラ
イマーが位置し、その３−末端には前記第１の核酸プラ
イマーに相補的な塩基配列を有する合成核酸を含む合成
二本鎖核酸を出現させ、更に必要に応じて二本鎖核酸を
一本鎖核酸に変換する操作と核酸の伸長反応を繰り返し
た後、試料中に出現した５′末端にいずれかの核酸プラ
イマーを有し、３′末端にいずれか他方の核酸プライマ
ーと相補的な塩基配列を有する合成核酸を分別すること
からなる存在の予想された核酸の検出方法であり、それ
ぞれの核酸プライマー組に関連して出現する５゛末端に
前記第２の核酸プライマーを、３′末端に前記第１の核
酸プライマーに相補的な塩基配列を有する合成核酸及び
／又は必要に応じて行われる核酸伸長反応によりこの核
酸プライマー組に関連して出現する５′末端に前記第１
の核酸プライマーを、３−末端に前記第２の核酸プライ
マーに相補的な塩基配列を有する合成核酸は、他の核酸
プライマー組に関連して出現する同様の合成核酸と異な
った塩基数となるようにそれぞれの核酸プライマー組を
構成する第］及び第２の核酸プライマーが設計されてお
り、前記合成核酸の分別が合成核酸の塩基数の違いを利
用して実現されることを特徴とする方法である。また本
発明は、少なくとも、存在が予想される一本鎖核酸中の
特定の塩基配列部分にハイブリダイズ可能な第１の核酸
プライマーとこの一本鎖核酸と相補的な核酸中の特定の
塩基配列部分にハイブリダイズ可能な第２の核酸プライ
マーからなる核酸プライマー組の複数種組及びこれら核
酸プライマーを始点とした核酸伸長反応のためのＤＮＡ
ポリメレースとその基質等を含んでなる存在の予想され
た核酸を検出するための試薬キットである。以下、本発
明の詳細な説明する。

本発明は、ＤＮＡポリメレースと核酸プライマーを使用
した核酸の伸長反応を利用するものである。この核酸の
伸長反応は一般に、 Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ
　ｍｅｔｈｏｄ　（Ｐ　ＣＲ法）と呼ばれるものである
（ＳＣＩＥＮＣＥ、２３［１，１３５０−１３５４゜１
９８５年）。ＰＣＲ法は簡単に説明すれば、−本鎖核酸
中の特定の塩基配列部分にハイブリダイズ可能な核酸プ
ライマーと、この−本鎖核酸と相補的な核酸中の前記特
定の塩基配列部分の３′側に存在する他の特定の塩基配
列部分にハイブリダイズ可能な核酸プライマーからなる
核酸プライマーを調製し、これら核酸プライマーと当該
−本鎖核酸を接触させ、次にＤＮＡポリメレースを作用
させてハイブリダイスしたプライマーの３一方向（鋳型
となる、−本鎖核酸の５′方向）への核酸伸長反応を行
うものである。この後、もとの核酸と新たに合成された
５′末端に前記核酸プライマーが位置する合成核酸との
二本鎖核酸を一本鎖に変換して同様の操作を繰り返すこ
とで、両５′末端には前記いずれか一方の核酸プライマ
ーが位置し、３′末端には他方の核酸プライマーと相補
的な塩基配列を有する合成二本鎖核酸を出現させること
が可能である。このような反応を２０サイクル実施する
ことで、約１００万倍程度に増幅された合成核酸を得る
ことが出来るのである。

本発明は、複数種の核酸を含む試料について実施される
ものである。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであっても
良いが、ＲＮＡについて本発明を実施する場合には核酸
伸長反応に先立ち、ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔａｓｅ　　（逆転写酵素）処理を実施しておくと良
い。また核酸は、試料中で一本鎖核酸状態で存在すれば
良い。二本鎖状態の核酸について本発明を実施する場合
には、これを−重鎖に変換しておけば良い。本発明でい
う核酸とは、即ち、後に説明される１組の核酸プライマ
ーに関連して最終的に出現する、その５−末端に第１又
は第２のいずれか一方の核酸プライマーが位置し、３′
末端に他方のプライマーと相補的な塩基配列を有する合
成核酸と同一の塩基配列からなる塩基配列部分を含む核
酸である。なお、試料は厳密には複数種の核酸を含むと
予想される核酸含有溶液である。具体的には、血液（血
球、血清、血漿）、胆汁、膿汁、髄液、糞便、唾液、喀
談、動植物組織又は細胞からの核酸抽出液等の生体試料
であり、特に感染症の疑いのある患者等から取得された
生体試料が例示出来る。

本発明における二本鎖核酸を一本鎖核酸に変換する操作
は、例えばホルムアルデヒド等の二本鎖核酸の安定性を
低下させる化学物質を適当ｆｆｉ添加することによって
も達成出来るが、この場合、後に核酸プライマーを一本
鎖に変換された核酸にハイブリダイズさせる際に当該化
学物質の濃度を低下させる等の操作が必要になる。従っ
て、従来からＰＣＲ法において採用されている、熱変性
による変換操作が好ましい。

本発明では、−重鎖核酸中の特定の塩基配列部分にハイ
ブリダイズ可能な第１の核酸プライマー、この−重鎖核
酸と相補的な核酸中の特定の塩基配列部分にハイブリダ
イズ可能な第２の核酸プライマーからなる核酸プライマ
ー組の複数種組を使用する。複数種組とは即ち、少なく
とも一種の核酸に対して前記のように設計された核酸プ
ライマー組と、これとは異なる他種の核酸に対して前記
のように設計された核酸プライマー組の２種組以上を使
用することを意味する。ここで、特定の塩基配列部分と
して、存在が予想される核酸を他の核酸から識別し得る
程度に特徴的である部分を選択すると良い。換言すれば
、ある核酸中の特定の塩基配列部分とハイブリダイズす
るように設計された核酸プライマーが、当該核酸中の他
の部分又は他種の核酸とハイブリダイズし得ない（し難
い）程度に特異的な部分であることが好ましい。

現在では、種々の疾患を引き起こすウィルス、細菌等の
核酸についての解析が進んだ結果、多くのウィルス、核
酸種の特定の塩基配列が知られるようになっている。更
には、例えばコンビニ−ター検索等を行い、目的とする
核酸の塩基配列と他の核酸のそれを比較し、特徴的な部
分を選択しても良い。核酸プライマーに対し、このよう
な−重鎖核酸中の特定の塩基配列に対する特異性を与え
るために、その塩基数を１５塩基、好ましくは２０塩基
以上としても良い。

ここで、核酸中の特定の塩基配列部分とじては、通常、
存在を予想した核酸ごとに異なるように選択し、核酸プ
ローブを設計するが、本発明においては後に説明する条
件を満足する限りにおいて、異なる核酸に関して同一の
塩基配列部分を特定の塩基配列部分として選択すること
が出来る。

即ち、２種組以上のプライマー組に共通なプライマーを
使用することも出来る。例えば、第１及び第２の核酸プ
ライマーが両方とも同一である２種組の核酸プライマー
であっても、これら核酸プライマー組に関連して２種の
核酸より異なる塩基数の合成核酸が出現するような場合
である。この他、一方のプライマーのみが共通であって
も良い。

本発明において使用する核酸プライマー組は、ＰＣＲ法
により核酸の伸長反応を少なくとも２回行った段階で出
現する、５−末端に第１又は第２いずれか一方の核酸プ
ライマーが位置し、３−末端に他方のプライマーと相補
的な塩基配列を有する合成核酸として、他種組の核酸プ
ライマーに関連して出現する合成核酸とは異なる塩基数
のものを出現するように設計される。即ち、１組の核酸
プライマーと他種組の核酸プライマーは、それぞれの組
を構成するプライマーが予想される核酸に対してハイブ
リダイズした場合にプライマー間の間隔が異なるように
設計されているのである。なお、本発明では後に説明す
るように、前記合成核酸を他種組のプライマーに由来す
る合成核酸と分別する際にその塩基数の差異を利用する
ものであるため、使用するいずれのプライマーとも、出
現する合成核酸がことなる塩基数を有するように設計す
る。

本発明においては、核酸プライマーの複数種組とＤＮＡ
ボリメレース及び核酸の伸長反応に必要な基質等を、前
記した二本鎖核酸の一本鎖核酸への変換の後に試料に添
加しても良いし、この変換の際に共存させておいても良
い。ＤＮＡポリメレースとしてｋｌｅｎｏｖ　ｆ’ｒａ
ｇｍｅｎｔ　（ｋｌｅｎｏｖ　ｆｒａｇｍｅｎｔｏｆ　
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ　Ｉ）等の熱失活しやすい酵素を使用する
場合であって二本鎖核酸の一本鎖核酸への変換を熱変性
にて実施する場合には、当該酵素の熱変性を考慮して変
換操作の後にこれを添加し、後のＰＣＲ反応のサイクル
での熱変性操作の度にこれを添加する。二本鎖核酸の一
本鎖核酸への変換は、前述した理由により熱変性により
行うことが好ましいが、このためには、９５℃条件下で
２０分間処理した場合でも約４０％の活性が残余するＴ
ｈｅｒＩＩｌｕｓ　ａｑｕａｔｌｃｕｓ　ＹＴＩから分
離された耐熱性ＤＮＡポリメレース（Ｔａｑボリメレー
ス）等を使用することが好ましい。この酵素を使用すれ
ば、二本鎖核酸の一本鎖核酸への変換のたびに新たに酵
素を添加する必要がなくなり、単なる熱処理の繰り返し
により複数サイクルのＰＣＲ法を実施することが可能と
なる。

複数種組の核酸プライマー組の共存下で核酸伸長反応を
生じさせることで、５′末端に第１の核酸プライマーが
位置する合成核酸と存在が予想された一本鎖核酸からな
る二本鎖核酸が出現する。

ここで試料中に当該存在が予想された核酸と相補的な核
酸が存在していた場合には、更に５′末端に第２の核酸
プライマーが位置する合成核酸と存在が予想された一本
鎖核酸に相補的な一本鎖核酸からなる二本鎖核酸も出現
する。もしも、試料中に存在すると予想された核酸が実
際には存在しない場合には、核酸プライマーが試料中の
核酸とノ＼イブリダイズしない結果、プライマーを始点
とした核酸伸長反応が生じないため、合成核酸は出現し
ない。また、偶然にも存在すると予想した核酸に対して
設計された核酸プライマーが無関係の核酸とハイブリダ
イズした結果合成核酸が出現したとしても、予定された
塩基数の合成核酸が最終的に出現する可能性は極めて低
い。

続いて、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変換した後、第２サ
イクルめのＰＣＲを行うことで、５′末端に第２の核酸
プライマーが位置し、３′末端に第１の核酸プライマー
に相補的な塩基配列を有する合成核酸が始めて出現する
。試料中に当該存在が予想された核酸と相補的な核酸が
存在していた場合には、更に５′末端に第１の核酸プラ
イマーが位置し、３′末端に第２の核酸プライマーに相
補的な塩基配列を有する合成核酸も出現する。

いずれにせよ、本発明ではＰＣＲを２サイクル行うこと
により、予定された塩基数の合成核酸が出現するのであ
る。本発明においては、１０サイクル以上のＰＣＲを行
って、５′末端に第２の核酸プライマーが位置し、３″
末端に第１の核酸プライマーに相補的な塩基配列を有す
る合成核酸及び５゛末端に第１の核酸プライマーが位置
し、３−末端に第２の核酸プライマーに相補的な塩基配
列を有する合成核酸を充分に出現させると良い。

本発明においては、存在が予想された複数種の核酸に対
する核酸プライマーの複数種組を使用する。これら予想
された核酸のうち、２種以上が存在したとしても、出現
する合成核酸はその塩基数が異なるため、容易に分別可
能である。しかも、別途塩基数が既知である核酸につい
て同一の分別方法により分別試験を実施しておけば、分
別された合成核酸が予想された核酸のうちのいずれに関
連して出現したものであるかをも容易に知ることが出来
る。合成核酸の分別は、塩基数の違いを利用してこれを
行うものであれば制限はないが、例えば、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲルを使用する電気泳動法、サイズ分画用
ゲルを使用する液体クロマトグラフィー法等を例示する
ことか出来る。

特に電気泳動法等により分別を行った場合には、後に臭
化エチジウム等の核酸とインターカレートする蛍光物質
によって核酸を染色するとその検出が容易である。また
、プライマーに適当な標識を付しておけば、その検出は
、例えばＵＶの吸収を１１Ｆｌ定する等により検出する
方法に比較してより容易で精度よく行うことが出来る。

標識を付すためには、例えばＤＮＡポリメレースの基質
として放射性物質で標識されたモノヌクレオチド三燐酸
を使用する等の方法が例示出来る。

なお、出現した合成核酸の分別は、ＰＣＲを終了した時
点の、二本鎖核酸について実施しても良いし、この後、
合成二本鎖核酸を一本鎖核酸に変換して実施しても良い
。

本発明は更に、以上説明したような存在の予想された核
酸の検出するための試薬キットを提供するものである。

このキットは、少なくとも、存在が予想される一本鎖核
酸中の特定の塩基配列部分にハイブリダイズ可能な第１
の核酸プライマーとこの一本鎖核酸と相補的な核酸中の
特定の塩基配列部分にハイブリダイズ可能な第２の核酸
プライマーからなる核酸プライマー組の複数種組及びこ
れら核酸プライマーを始点とした核酸伸長反応のための
ＤＮＡポリメレースとその基質等を含んでなるものであ
る。このキットは、より詳しくは試料を保持し反応空間
を提供する反応カップ中に、前記試薬等を凍結乾燥した
状態等で封入したようなものが例示出来る。

（発明の効果） 本発明によれば、未知の試料中にどのような核酸が存在
するかを検出することが可能である。

しかも、本発明では同時に複数の核酸の存在を検出する
ことが可能であり、しかもその操作は、実質的に二本鎖
核酸を一本鎖核酸に変換する操作のみである。しかも本
発明は、−回の実施により複数種の核酸の存在を検出す
ることが可能である。

即ち、存在か予想される複数種の核酸について、複数種
紐の核酸プライマーを設計し７て使用すれば、後に出現
する合成核酸をその塩基数の違いにより分別するという
極めて簡便な操作を実施するのみでどの核酸が実際に試
）４中に存在するか、が明確になるのである。

例えば臨床診断の分野においては、患者の症状によりあ
る程度感染している細菌あるいはウィルスの種類を特定
することが可能である。したがって、感染が予想される
複数の核酸について、従来の知見に基づいて核酸プライ
マー組を設計し、本発明を実施すれば、具体的な感染細
菌又はウィルスが特定出来ると考えられる。しかも、近
縁のウィルス等については、それらに共通する核酸につ
いての核酸プライマー組を使用すると共に、例えば種に
より特異的な蛋白質等をコードする核酸部分について設
計された核酸プライマー組を同時に使用すれば、ウィル
スの感染の有無とその種を同時に知ることが出来るので
ある。

本発明は、試料を保持する容器等やＰＣＲ法による核酸
伸長反応を実施するための試薬、等の、広く一般に使用
されてきる器材と試薬により実施することが可能である
。また、本発明の核酸プライマーについても、１５〜２
０塩基程度のもので十分であるため、ＤＮＡ合成機等を
使用することで容易に調製することが可能である。以上
のことは、本発明を実施するに当たっては従来の技術に
見られたような大規模の施設・設備が必要ないことを示
している。

更に本発明では、試料核酸又は核酸プローブ（核酸プラ
イマー）を固定化する等の繁雑な前処理を実施する必要
がなく、容易に実施可能である。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、この実施例は本発明の一例にすぎず、本発明を
限定するものではない。

実施例 ＢＬＶ　　　（Ｂｏｖｉｎｅ　　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　　
Ｖｊｒｕｓ　　Ｓ　ＶＩＲＯＬＯＧＹ。

第１３８巻、第８２頁、１９８４年）のＤＮＡから、参
考例に従ってプラスミドｐｌＢ＋７６Ｂｌ及びｐｌＢ１
７ＥｉＢ２を調製した（以下、ＢＬＶｌ、ＢＬＶ２とい
う）。更に、ウロキナーゼ前駆体（Ｐｒｏ−ＵＫ）のＤ
ＮＡ　　（Ａｇｒｌｃ、ＢｉｏｌＣｈｅＩ！、　５２（
２）、ｐ３２９−３３６．１９８８年）を含むプラスミ
ド（以下ＵＫという）及びＭ　１３フアージＤＮＡ　　
（以下Ｍ　１３という、宝酒造（株）製、Ｍ　１３　ｍ
ｐ１８　）を調製し、それぞれ大腸菌ＪＭ　１０９をト
ランスフオームし、　２ＸＴＹ培地（ＴＹ培地の組成；
１，６％トリプトン、１％イーストエクストラクト、０
．５％ＮａＣ１）で−晩培養した。

それぞれのプラスミドを含む培養液５０μＩずつに５０
μｍずつの５ＸＳＳＣ溶液（０，７５Ｍ　ＮａＣ１，０
゜０７５Ｍクエン酸ナトリウム）を添加し、更に　３０
０μｍの６月チオシアン酸グアニジン溶液を添加し攪拌
した。

溶液に更に１ｍｌのエタノールを添加してＯｏＣで１５
０００ｒｐｍの遠心分離を行い、上澄を捨てた後にエタ
ノールリンスを行った。

それぞれの沈殿を５０μｍのＴＥ温溶液　１．０　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣＩ、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）に溶解
し、それぞれの溶液又はその溶液を−のサンプルにつき
　５μｍずっ混合したものにＰＣＲ反応用の核酸プライ
マー４組を混合したものを添加した。なお、これらプラ
イマー組は、ＢＬＶ　１　ｉ：対するものは３００塩基
、ＢＬＶ２に対するものは４００塩基、ＵＫに列するも
のは２００塩基、Ｍ　１３に対するものは１４２塩基の
合成核酸が出現するように設＝１された２１塩基の、第
１プライマー及び第２プライマーからなる。

更にＰＣＲ反応用の緩衝液とｔａｑポリメレスを添加し
、９４℃−３７℃−７２℃の温度サイクルを２５回行う
ことでＰＣＲ反応を２５サイクルさせた。

反応終了後、溶液のうちの５μｍを２９６のアガロース
ゲルを利用した電気泳動に供した。電気泳動後のゲルに
ついては、後に臭化エチジウムにより染色し、υ■ライ
ト照射下で写真を撮影した。

結果を図１に示す。図１によれば、それぞれのプラスミ
ドＤＮＡの存在か明確に示されている。

参考例 実施例にて使用したｐ１３１７ＢＢｌ及びｐＢＩ７６Ｂ
２は以下のようにして調製した。

ＢＬＶ　　（ＢｏｖＪｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒ
ｕｓ　、　ＶＩＲＯＬＯＧＹ。

第１３８巻、第８２頁、１９８４年）の相補的ＤＮＡを
合成し、二本鎖とした後、Ｓａｃ　Ｉで処理してフラグ
メントを得、Ｐｓｔ　Ｉで処理したプラスミドｐＢＲ３
２２に組み込んだ。このプラスミドをＢａｎ旧で処理し
て得られた合計４つのＤＮＡフラグメントについて、塩
基配列を確認し、図２又は図３に示した塩基配列部分を
含むフラグメントをそれぞれＢ１、Ｂ２と名付け、以下
の操作に使用した。

プラスミドａｌ１３１７Ｂ　（Ｉ　Ｂ　１社製）に、Ｂ
１及びＢ２を組み込み、それぞれのフラグメントを含む
プラスミドｐＩ３１７８Ｂ１、ｐＢ１７６Ｂ２を調製し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の結果を示すものである。 図中、第１のレーンはＭ　１３、第２のレーンはＵＫ。 第３のレーンは１３ＬＶ　１、第４のレーンはＩＤＬＹ
　２、第５のレーンはＭ　１３とＵＫを混合したもの、
第６のレーンはＬＩＫと　ＢＬＶ　２を混合したもの、
第７のレンはＢＬＶ　１と　ＢＬＶ２を混合したもの、
第８のレーンはＭ　１３、ＵＫ及びＢＬＶ　２を混合し
たものについての結果を示す。また、横の数字は別途調
製された、それぞれ４００．３００．２００．１００塩
基数の核酸を同様の条件下で電気泳動に供したときの位
置を示すものである。 第２図は、実施例で使用したＢＬＶ　Ｉ　ＤＮＡフラグ
メントＢ１の塩基配列の一部と、使用した核酸プライマ
ー組を示すものである。図中の記号は通常の遺伝学で使
用する記号と同じ意味である。なお、ＢＬｖノ遺伝子ハ
ＲＮＡテあり、ソノ塩基＋１Ａ、Ｇ、Ｃ，Ｕの４種類で
あるが、本実施例ではこれに相補的なりＮＡを使用した
ため、ＵをＴとして記載する。 塩基配列に付された数字は、前記した報告中で付された
数字と同一である。図中、■て示されたプライマーは、
本発明でいう第１の核酸プライマーであり、塩基配列中
、下線を付された特定の塩基配列部分と相補的である。 ■で示されたプライマ−は第２の核酸プライマーであり
、二重下線を付された部分に相補的である特定の塩基配
列部分と相補的である。これらプライマー組は、図中、
破線で示された４００塩基の核酸又はこれと相補的な４
００塩基の核酸を出現させるものである。 第３図は、実施例で使用したＢＬＶ　２　ＤＮＡフラグ
メントＢ２の塩基配列の一部と、使用した核酸プライマ
ー組を示すものである。図中の記号、塩基配列に付され
た数字、■又は■で示された核酸プライマー及び塩基配
列に付された下線等の意味は図１におけるそれと同一で
ある。これらプライマー組は、図中、破線で示された３
００塩基の核酸又はこれと相補的な３００塩基の核酸を
出現させるものである。 第４図は、実施例で使用したＰｒｏ　ＵＫ　ＤＮＡの塩
基配列の一部と、使用した核酸プライマー組を示すもの
である。図中の記号、塩基配列に付された数字、■又は
■で示された核酸プライマー及び塩基配列に付された下
線等の意味は図１におけるそれと同一である。これらプ
ライマー組は、図中、破線で示された２００塩基の核酸
又はこれと相補的な　２００塩基の核酸を出現させるも
のである。 第５図は、実施例で使用したＭ　１３　ＤＮＡの塩基配
列の一部と、使用した核酸プライマ〜組を示すものであ
る。図中の記号、塩基配列に付された数字、■又は■で
示された核酸プライマー及び塩基配列に付された下線等
の意味は図１におけるそれと同一である。これらプライ
マー組は、図中、破線で示された　１４２塩基の核酸又
はこれと相補的な１４２塩基の核酸を出現させるもので
ある。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）複数種の核酸を含むことが予想される試料につい
   て、これら核酸が二本鎖であると予想される場合にはそ
   れを一本鎖に変換し、存在が予想される一本鎖核酸中の
   特定の塩基配列部分にハイブリダイズ可能な第１の核酸
   プライマーとこの一本鎖核酸と相補的な核酸中の特定の
   塩基配列部分にハイブリダイズ可能な第２の核酸プライ
   マーからなる核酸プライマー組の複数種組及びこれら核
   酸プライマーを始点とした核酸伸長反応のためのＤＮＡ
   ポリメレースとその基質等を添加して核酸の伸長反応を
   実現し、少なくともその５′末端に前記第１の核酸プラ
   イマーが位置する合成核酸を含む二本鎖核酸を出現させ
   、次にこれら二本鎖核酸を一本鎖核酸に変換して前記複
   数種組の核酸プライマー組の存在下で更に核酸伸長反応
   を実現し、少なくともその５′末端には前記第２の核酸
   プライマーが位置し、その３′末端には前記第１の核酸
   プライマーに相補的な塩基配列を有する合成核酸を含む
   合成二本鎖核酸を出現させ、更に必要に応じて二本鎖核
   酸を一本鎖核酸に変換する操作と核酸の伸長反応を繰り
   返した後、試料中に出現した５′末端にいずれかの核酸
   プライマーと同様の塩基配列を有し、３′末端にいずれ
   か他方の核酸プライマーと相補的な塩基配列を有する合
   成核酸を分別することからなる存在の予想された核酸の
   検出方法であり、それぞれの核酸プライマー組に関連し
   て出現する５′末端に前記第２の核酸プライマーを、３
   ′末端に前記第１の核酸プライマーに相補的な塩基配列
   を有する合成核酸及び／又は必要に応じて行われる核酸
   伸長反応によりこの核酸プライマー組に関連して出現す
   る５′末端に前記第１の核酸プライマーを、３′末端に
   前記第２の核酸プライマーに相補的な塩基配列を有する
   合成核酸は、他の核酸プライマー組に関連して出現する
   同様の合成核酸と異なった塩基数となるようにそれぞれ
   の核酸プライマー組を構成する第１及び第２の核酸プラ
   イマーが設計されており、前記合成核酸の分別が合成核
   酸の塩基数の違いを利用して実現されることを特徴とす
   る方法。
2. （２）少なくとも、存在が予想される一本鎖核酸中の特
   定の塩基配列部分にハイブリダイズ可能な第１の核酸プ
   ライマーとこの一本鎖核酸と相補的な核酸中の特定の塩
   基配列部分にハイブリダイズ可能な第２の核酸プライマ
   ーからなる核酸プライマー組の複数種組及びこれら核酸
   プライマーを始点とした核酸伸長反応のためのＤＮＡポ
   リメレースとその基質等を含んでなる存在の予想された
   核酸を検出するための試薬キット。