JPH0458958B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は脂肪酸とアルコール残基を与える反応
物をリパーゼの触媒作用のもとに反応させてエス
テルを製造する方法に関する。本発明の一つの適
用方法はリパーゼの転位触媒作用による脂肪及び
植物油の転位である。 脂肪及び植物油の転位においては、脂肪及び油
の大部分を構成するトリグリセリドの脂肪酸成分
がその反応用に選択された触媒に基いて大なり小
なりトリグリセリド上で転位を起す。アルカリ金
属、それらの水酸化物、及びアルコキシドの作用
下では転位は常にランダムに行われる。 つい最近開発された方法であつて、米国特許第
4275081号に開示されているリパーゼ触媒を用い
た方法では選択したリパーゼ、及び反応組成物中
に遊離酸又はアルキルエステルとして存在するそ
の他の脂肪酸基に関連して転位はランダム又は選
択的となる。この方法及び他の文献に記載されて
いるように、酵素が無機及び／又は有機の不活性
な担持体物質上に固定されるのが好ましい。又、
反応は、反応物に対する溶媒の有無に関係なく、
各種の温度で、そして反応物が水−不混和性の均
一液相にあり、触媒が活性であるという条件のも
とで、回分式又は連続式に行われる。 アルカリ金属触媒の作用を受ける転位操作は石
けんの生成を伴う副反応及び触媒活性の損失を避
けるために水を厳密に除外した状態で行われなけ
ればならないが、酵素触媒は反応の間活性を保つ
ために少量の水を必要とする。酵素がベツド内の
触媒担持体上に固定されており、供給原料がその
ベツドを通過する連続反応の場合には供給原料中
に存在する水で十分であり得る。そして、その水
の量は、通常、供給原料の１重量％未満であり、
0.1重量％程度であることもある。これより実質
的に多量の水が存在する時、触媒は活性なままで
あるが反応は加水分解生成物の生成の方向に向
き、トリグリセリドの損失を伴う。一方におい
て、存在する水の量をできるだけ少なくしようと
すると触媒活性が低下する。 リパーゼ酵素の触媒作用のもとに行われるエス
テル化反応（アルコーリシスを含む）において
も、許容される水の量に制限があることに関して
同様な考慮が必要である。そしてこの反応におい
てはエステルのアルコール残基−このエステルは
勿論トリグリセリドのようなグリセリドエステル
であつてもよい−が他のアルコール残基と置き換
えられる。これらの反応は、不要な加水分解生成
物の生成を避けるために転位操作同様、反応系内
の水を極微量に保つことを必要とする。 担持された酵素リパーゼの触媒作用のもとで極
微量の水の存在のもとに行われる前述の転位操作
又はそれと関連する操作においては、酵素を大き
な表面積を持つ担持体物質上に沈積させる。この
担持体物質は無機質、例えばシリカ及びその誘導
体、特にセライト（Celite）（ケンソウ土の商品
名）、又は有機質、例えば酵素が収容される孔が
マクロ孔質構造になつているイオン交換樹脂、で
ある。従来、これらの反応において、酵素を担持
体物質に付着させるのは次の方法によつて行われ
る。すなわち、酵素を親水性の担持体表面に沈澱
させることによる物理的な方法、又は欧州特許公
開第147914号に開示されているように有機金属の
結合化合物（Coupling Compound）を用いて酵
素を、疎水性の環境を作りながら担持体に化学的
に結合させる方法、又は欧州特許公開第140542号
に開示されているようにイオン交換物質にイオン
的に付着させる方法などである。米国特許第
4551482号には改質ポリスチレンポリマーへの酵
素のイオン的付着が開示されている。酵素の固定
以前に、もともと疎水性であつたポリマー表面を
長い連鎖のカチオン性表面活性剤の稀薄溶液に浸
漬して調製することが米国特許第4539294号に開
示されている。 本発明の目的は脂肪酸エステルの改良された製
造方法を提供することである。 本発明により、担持された活性リパーゼ触媒の
作用のもとで、本質的に非水均一反応系における
トリグリセリドの転位及びエステル製造のための
他の反応の改良された方法が見出された。この方
法においては酵素の担持体物質への付着は好まし
くは溶液からの吸着によつて当該担持体物質の疎
水性多孔性表面に対して行われる。 本発明の反応は実質的に非水液相で行なわれる
が若干の水が酵素に結合していることが必要であ
る。この水の量はほとんど測定できない程微量で
ある。例えば非水液相を水で飽和させるだけで十
分であり、事実50％以上の飽和で十分である。水
溶液相は存在しない。 本発明において使用するのに適切な担持体物質
にはポリエチレン及びホリプロピレンなどのマク
ロ孔質のポリオレフインが含まれる。それらは一
般に単一ポリマー及び共重合体であつてそのポリ
マー単位はビニル及びビニリデン単位などのエチ
レン系のもの、例えばポリビニル、及びポリビニ
リデン、ハロゲン化物、ポリウレタン及びポリカ
ーボネートである。他の合成担持体物質にはブタ
ジエン及びイソブレンの重合体又は共重合体、ポ
リエステル、ポリアミド例えばナイロンなどが含
まれる。本発明において用いるのに適切な天然の
ポリマーには天然ゴム及びグツタペルカが含まれ
る。これらの物質は多孔性に作られねばならず、
これは重合の時に発泡剤を用いることによつて行
われる。ガラス及び耐熱性物質、例えばシリカの
ような無機多孔性物質であつて、その表面が例え
ばシラン処理によつて疎水性にされたものも又適
切である。酵素の固定を良好にするため担持体物
質の平均の細孔の大きさは50nm以上、好ましく
は0.05乃至5μである。平均の細孔の大きさとは水
銀ポロシメトリーの標準的な技術によつて測定さ
れた平均細孔直径である。適切な物質の粒子の大
きさはポリオレフインの場合は0.01乃至５mm、特
に0.1乃至1.5mm、シリカのような耐熱性物質の場
合は0.5乃至３mmである。 疎水性物質に担持された酵素は米国特許第
4629742号に開示されており、この場合、これら
の酵素は脂肪の加水分解に用いられる。本発明に
おいて特に有益な合成ポリマーは欧州特許公開第
60138号に開示されている高分散相エマルジヨン
法（high internal phase emulsion technique）
によつて製造される合成ポリマーである。これら
は、リビニル系のポリマー物質、例えばポリスチ
レンである。 担持体物質は、全細孔容積が50％以上であり、
過半数が穴によつて相互に連絡している気孔を含
み、その気孔の平均直径が１乃至150μmの範囲内
にある多孔性ポリマー物質から成るのが好まし
い。全細孔容積が75％以上、例えば90％又はそれ
以上であるのが一層好ましい。 本発明において使用するのに適切な多孔性物質
に関してさらに詳細な事項は上述の欧州特許公開
第60138号に記載されているがその他欧州特許公
開第105634号、欧州特許公開第156541号、欧州特
許公開第157504号、英国特許第2155481号、欧州
特許公開第200528号、欧州特許公開第223574号、
欧州特許公開第239360号、欧州特許公開第240342
号、欧州特許公開第264268号、欧州特許公開第
289238号、欧州特許公開第288310号及び、欧州特
許出願88306447.9（1988年７月15日出願の米国特
許出願第219231号に対応する）などにも見出され
る。これらの特許明細書の各々は本発明の多孔性
に対する要件を満たす多孔性物質を開示してい
る。すべての場合において、物質は出発物質を高
分散相エマルジヨン（high internal phase
emulsion）の形で重合させて製造することがで
きる。そしてこのエマルジヨンは油中水型エマル
ジヨン、水中油型エマルジヨン又は二つの実質的
に混和しない溶液間に形成されるエマルジヨンの
いづれかであつてもよい。「水」は水溶液系を意
味し、「油」は水溶液と混和しない系を意味する。
それぞれの明細書に開示されている物質は出発物
質及び／又は仕上がりの性質が異なる。今述べた
特許明細書はすべて、参考として本明細書中に採
用する。 日本国特許出願公告第59−91883号は酵素溶液
をスチレン又はメタクリル酸エステルと接触させ
ることによる担持された酵素の製造を開示して
い。スチレンポリマーはソ連特許第804647号明細
書において酵素担持体物質として提案されてい
る。ホツク（H0q）他（JAOCS 61、（４）1984
年４月、pp.776−81）は疎水性の多孔性支持対物
質、例えばポリプロピレン、上に固定されたリパ
ーゼの触媒作用のもとに、混和しない水相と非水
液相を含む不均一系反応集団内で行われるグリセ
リド合成を開示している。 本発明において有益なその他の担持体は無機質
の耐熱性物質例えばシリカ又はガラスである。こ
のような物質は疎水性の有機シリカ重合体被膜を
有し得る。 本発明において使用するのに適切な酵素にはム
コール（Mucor）、アスペルギルス
（Aspergillus）、リゾプス（Rhizopus）、シユウ
ドモナス（Pseudomonas）、カンジタ
（Candida）、フミコーラ（Humicola）、サーモマ
イセズ（Thermomyces）、及びペニシリウム
（Penicillium）属のリバーゼ種からのリパーゼが
含まれる。 本発明において用いられる脂肪酸及びアルコー
ル残基を与えるための反応物はグリセリドエステ
ル、例えば１種類以上の脂肪酸及び油から成るの
が好ましい。 好ましい１つの反応物系はグリセリドエステル
と共に１種類以上の遊離酸又はそのアルキルエス
テルを含む。 例 本発明を説明するため以下に多くの例を示す。
言うまでもなく、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。 これらの例において、リパーゼ用に各種の担持
体が用いられる。それらの特性は次のとおりであ
る： EP−100，EP−400，EP−900 オランダのエンカ社（Enka）から入手でき
る。 種類：ポリプルピレン（EP−100，EP400）
又はポリアミド（EP−900）のマクロ孔質
粒子であつて穴で相互に連絡された大きな
隔室（気孔）を持つ。 商品名：アキユレル（Accurel）

【表】

【表】 S.980G シエル社（Shell）より入手できる。 種類：多孔性シリカ球形粒子 粒子の大きさ 1.5mm 細孔容積 1.2ml／ｇ 表面積 63m²／ｇ かさ密度 0.4ｇ／ml 平均細孔直径 60nm 5693−93，78−7300 英国、ナシヨナルスターチ・アンド・ケミカ
ル社（National Starch＆ Chemical Ltd.）か
ら入手できる。 種類：穴によつて相互に連絡した大きな隔室
（気孔）を持つてマクロ孔質ののポリチレ
ン粒子であつて、連続相（external
phase）にモノマー、そして大きな分散相
（internal phase）容積の乳化重合によつ
て製造されたもの。全細孔容積は90％より
大である。

【表】 アンバーライト（AMBERLITE）XE−305 ローム・アンド・ハース社（Rohm ＆
Haas）より入手できる。 種類：マクロ孔質のポリスチレン粒子 表面積（BET） 43.7m²／ｇ 孔の大きさ分布 30−200nm 平均細孔直径 55nm PG−2000−120 シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.
Ltd.）から入手できる。 種類：細孔−制御のガラスビーズ 表面積 11.1m²／ｇ 平均細孔直径 205.9nm 実施例 １ 固定化 ８ｇのEP−100を100mlのエタノールに加えて、
すべての粉末が確実に湿潤するように激しく攪拌
した。60mlの過剰のエタノールをデカンテーシヨ
ンで除き、0.1Mリン酸緩衝液PH7.0を200ml加え
て攪拌し完全に混合させた。過剰の緩衝液をガラ
ス濾過器上で穏やかに吸引して除いた。湿潤粉末
にムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）の１，
３選択的リパーゼ粉末（デンマーク、ノボ社
（Novo）から入手可能）10.0ｇを含む0.1Mリン
酸緩衝液PH7.0を100ml加えてゆつくりと攪拌し
た。ポリマーによるリパーゼの吸着は溶液からの
リパーゼ活性の損失によつて評価した。28時間後
に担持体はリパーゼ活性の93％を吸着し、
16000LU／ｇ（リパーゼ ユニツト／ｇ）の理論
上の吸着量を与えた。この触媒を濾過によつて取
り出し、0.1Mリン酸緩衝液PH7.0で２回洗浄し
て、室温で真空乾燥した。 エステル交換反応 2.0ｇの触媒をプレカラム（pre−column）と
して用いる。3.2ｇの水を含む４ｇの湿潤IDシリ
カゲル（英国クロスフイールズ社（Crosfields）
から入手可能）と共に、直径15mmのカラムに充填
した。オレイン酸エステル含量の高いひまわり油
１重量部、ラウリン酸0.7重量部、石油エーテル
（沸点100−120℃）４重量部を含み、水で飽和し
た供給原料を流速25.0ml／時でカラムに通した。
この時カラムは水ジヤケツトを用いて50℃に維持
していた。トリグリセリド中に組込まれたラウリ
ン酸の量はFAME／GC分析（脂肪酸メチルエス
テル／ガスクロマトグラフイー分析）で決定し
た。 対象実験を同様の条件下、（親水性の）イオン
変換樹脂上のムコール・ミエヘイのリパーゼを基
体とする触媒、登録商標「リポザイム
（Lipozyme）」（ノボ社）を用いて行つた。結果
を供した原料油のトリグリセリド分析、及び生成
物について表わした表１で比較した。

【表】

【表】 実施例 ２ 担持体物質としてそれぞれ、EP−100，EP−
400、及びEP−900粉末を用い、別のリパーゼを
用いて、実施例１の操作を３回繰返した。用いた
リパーゼはリゾプス・ニベウス（Rhizopus
niveus）由来のもの（アマノＮ、日本、アマノ
(株)、より入手可能）であつた。操作は実施例１で
述べたように行なつたが、理論上のリパーゼ吸着
量が10000LU／ｇのものが得られた。 結果を表２に示す。

【表】 表１から明らかなように、ラウリン酸による置
換は、親水性物質の効果に比べて、疎水性触媒担
体を用いた場合の方がかなり大きい。又表２か
ら、別の担体と別の酵素を用いた場合にも良好な
効果が得られることがわかる。 実施例 ３ 担体の調製と酵素の固定化 ５ｇのシリカ球状粒子S.980Gを、10ｇのジメ
チルクロロシランを含む100mlの１，１，１−ト
リクロロエタン中で30分間振盪することによつて
疎水性にする。球状粒子を濾過して、100mlのト
リクロロエタンで２回洗浄した後、室温で脱気し
て乾燥させた。シラン化した球状粒子は50mlのエ
タノール中で穏やかに振盪して完全に湿潤させ
た。そして100mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液
PH７を加え、穏やかに振盪して完全に混合させ
た。過剰の緩衝液をデカンテーシヨンで除き、50
mlのリパーゼ水溶液（ムコール・ミエヘイ由来、
1000LU／mlの活性を有する）を加えて、球状粒
子と16時間振盪した。球状粒子を濾過し、緩衝液
で２回洗浄して前回と同様に乾燥させた。 エステル交換反応 得られた触媒を実施例１で述べた転位法に使用
した。供給原料としてひまわり油１部当りラウリ
ン酸0.53部及びミリスチン酸0.27部を含むものを
用いた。トリグリセリド分析の結果を表３に示
す。

【表】 表３の結果は担持酵素の影響でひまわり油中の
不飽和脂肪酸がラウリン酸及びミリスチン酸によ
つて非常によく置換されたことを示している。 実施例 ４ 多孔性担体の調製 油相がスチレン・ジビニルベンゼン、及び界面
活性剤スパン80（Span 80）をそれぞれ4.42Kg、
0.44Kg、0.88Kg、含み、水相が水、過硫酸ナトリ
ウム、及び塩化カルシウムをそれぞれ44.25Kg、
0.097Kg、9.0Kg含む、高分散相である油中水型エ
マルジヨンを形成させた。スパン80はソルビタン
モノオレイン酸エステルである。エマルジヨンは
30分間85rpmで後形成剪断を施した。続いて60℃
で40時間かけて重合を行つた。得られたポリマー
は粉砕し、所望の粒子大にふるい分け、イソプロ
パノールでソツクスレーを抽出してスパン80を除
いた。続いて脱イオン水で洗浄し、最終的に乾燥
させた。顕微鏡検査によると、このポリスチレン
物質は90％の多孔度を有し、隔室（気孔）の大き
さは30μm以上、連続穴の大きさは10μm以上であ
り、粒度は0.1乃至2.0mmであつた。 固定化 2.0ｇのポリマーを135mlの無水エタノール中に
入れ、ポリマーを完全に湿潤させた。過剰のエタ
ノール120mlをデカンテーシヨンで除き、200mlの
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液を加えて２時間穏
やかに攪拌し、完全に混合させた。過剰の液体
195mlをデカンテーシヨンで除き、続いて200mlの
緩衝液を加えて10分間攪拌した。過剰の液体200
mlを再びデカンテーシヨンで除いた。7.4ｇのリ
ゾプス・ニベウス由来リパーゼ（アマノ）を含む
0.1Mリン酸ナトリウムPH７のリパーゼ溶液100ml
を加えて穏やかに攪拌した。リパーゼの吸着は溶
液からの酵素活性の損失を測定してモニターし
た。24時間後にポリマーは92.7％のリパーゼ活性
を吸着し、理論上の吸着量は9270LU／ｇポリマ
ーであつた。ポリマーを濾過によつて取り出し、
200mlのリン酸緩衝液で２回洗浄し、室温で真空
乾燥した。 エステル交換反応 上述の触媒のエステル交換反応活性を以下のよ
うにして評価した。100mgの試料を反応用バイア
ルに入れ、0.5ｇのオリーブ油、0.129ｇのミリス
チン酸、及び10.0mlの石油エーテル（沸点100−
200℃）から成る溶液を加えた。バイアルを密封
し、振盪器付の40℃の水浴に入れた。１時間後に
試料を取り出し、トリグリセリド中に組込まれた
ミリスチン酸量をFAME／GC分析で決定した。 得られた結果を、リポザイム触媒（ノボ社、イ
オン変換樹脂上のムコール・ミエヘイ由来リパー
ゼ）の結果と併せて表４に示す。ノボLuアツセ
イ（Novo Lu Assay）は酵素活性を決定する簡
便な標準検定法である。

【表】 ン
リポザイム 10.6 557

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 実質的非水均一液相中において、触媒として
   作用するリパーゼの存在下で、脂肪酸残基供与性
   反応物とアルコール残基供与性反応物（ただしモ
   ノグリセリドもしくはジグリセリドと遊離脂肪酸
   との組合せを除く）を反応させる工程を含む脂肪
   酸エステルの製造方法において、上記リパーゼが
   平均細孔径0.05乃至5μの疎水性多孔質固体担持体
   に吸着によつて物理的に付着していることを特徴
   とする方法。 ２ 前記反応物がグリセリドエステルを含むこと
   を特徴とする請求項１記載の方法。 ３ 前記グリセリドエステルが１種以上の油脂を
   含むことを特徴とする請求項２記載の方法。 ４ 前記反応物が１種以上の遊離脂肪酸又は１種
   以上の遊離脂肪酸のアルキスエステルを含有する
   ことを特徴とする請求項２又は請求項３記載の方
   法。 ５ 前記担持体が、過半数が穴によつて相互に連
   絡している平均気孔径１乃至150μmの気孔を含
   み、かつ細孔の総容積が50％以上であるような多
   孔質高分子材料を含んでなることを特徴とする請
   求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。 ６ 前記多孔質高分子材料の細孔の総容積が90％
   以上であることを特徴とする請求項５記載の方
   法。 ７ 前記担持体が天然又は合成多孔質ポリオレフ
   インを含んでなることを特徴とする請求項１乃至
   請求項６のいずれか１項記載の方法。 ８ 前記担持体がビニル又はビニルデンポリマー
   を含んでなることを特徴とする請求項１乃至請求
   項７のいずれか１項記載の方法。 ９ 前記担持体がポリアミド又はポリエステルを
   含んでなることを特徴とする請求項１乃至請求項
   ６のいずれか１項記載の方法。 １０ 前記担持体が耐熱姓材料を含んでなること
   を特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１
   項記載の方法。 １１ 前記担持体がシリカを含んでなることを特
   徴とする請求項１０記載の方法。 １２ 前記担持体の表面が疎水姓有機シリカ重合
   体被膜を有することを特徴とする請求項１０又は
   請求項１１記載の方法。 １３ 前記担持体がガラスを含んでなることを特
   徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項記
   載の方法。