JPH0459797A - 抗体の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫グロブリンＭ（以下、ＩｇＭ）の精製法に
関する。さらに詳しくは、ＩｇＭを含む試料を、疎水作
用を利用したクロマトグラフィにかけることにより、効
率よく短時間に簡便にしかも純度良く該物質を精製する
方法に関するものである。

（従来の技術） ＩｇＭは、現在臨床検査の免疫学的測定法の試薬として
重要な位置を占めており、また一方癌やウィルス感染症
等のミサイル治療薬として、将来非常に期待されている
タンパク質である。このように、臨床的に多くの分野で
応用されうるＩｇＭの高度な精製方法は、特に切望され
るものである。

ＩｇＭの精製方法は従来よりいくつか知られている。な
かでも代表的な例は、試料溶液中のタンパク質の分子量
の大小の違いを利用して分離するゲル濾過法である。こ
の方法は、その原理から分子量が太き（違うタンパク質
では非常に簡便に分離できるが、同等の分子量を有する
タンパク質ではそれらを分離することは不可能である。

ＩｇＭの分子量は約９０万であり、ゲル濾過法で分取す
ることは可能である。しかしながら、−度に大量のＩｇ
Ｍを分離精製することはできない。なぜなら、ゲル濾過
法では一回の精製工程でのサンプル量には限界があり、
普通は一度に数ミリリットルしか処理できない。また数
十ミリグラム以上のタンパク質を、−回に処理するよう
な分離精製には適さない。それ以上の大量のタンパク質
を、ゲル濾過法で分離精製するには、より高価で大きな
機器とカラムを用意しなければならない。

その他にイオン交換クロマトグラフィを利用する精製法
が知られている。詳しくは、ＩｇＭを含む試料溶液を塩
濃度の低い緩衝液に透析し、カチオン交換樹脂（スルホ
プロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）基を有す
る樹脂）、またはアニオン交換樹脂（ジエチルアミノエ
チル（ＤＥＡＥ）、クオータナリイアミノエチル（ＱＡ
Ｅ）基を有する樹脂）のカラムに吸着させ、塩濃度を徐
々に上げたり、−度に上げたりすることにより吸着した
ＩｇＭを選択的に溶出させ分離精製する方法である。こ
の方法では多くのＩｇＭは、低塩濃度の緩衝液に透析し
ている際に、非可逆的に沈殿してしまうこともあり、収
量の低下は免れない。

また多くの夾雑タンパク質もカラムに吸着するので、効
率良く分離精製することも容易ではない。

またカラムにかける前処理として、開始緩衝液に透析す
る操作は煩雑であり、長時間おこなわなければならない
などの不都合が生じる。

一方、ＩｇＭに対する親和性をもつタンパク質や、Ｉｇ
Ｍの抗原特異性をうまく利用した精製方法も考え出され
ている。ＩｇＭの定常領域に特異性を持つ抗体（ポリク
ロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗体）や、抗原自体を不
溶性の支持体に固定化し、ＩｇＭを特異的にかつ可逆的
に吸着させた後、ジオキサン（１０％）などの有機溶媒
、プロピオン酸（ｐＨ−２，５、ＩＭ）　、塩酸（ｐＨ
−２，５）などの酸性の溶液、エチレングリコール（５
０％）、カオトロピックイオン（１−、ＣＦ３　ＣＯＯ
−３ＣＮ−、ＣＣ１３ＣＯＯ−ｐＨ−７，０〜８．０゜
３Ｍ）等で、ＩｇＭとそれに対する抗体あるいは抗原と
の相互作用を減少させることにより、または尿素（ｐＨ
−７，０、８Ｍ）　、塩酸グアニジン（ｐＨ−３，１，
６Ｍ）等のタンパク変性剤によりＩｇＭを遊離させ溶出
させる。溶出の最適条件は、抗原抗体反応の結合の強さ
と抗体の安定性によって決まるものであり、−船釣に、
抗体の活性や収率の低下は免れ得ないものである。また
担体の劣化も早く、再現性やコストの面でも不利である
。

当然、大量精製へのステップアップでも不利である。

更に現在、抗体（ＩｇＧクラス）の精製に多用されてい
る、比較的安価なりコンビナンドのプロティンＡやプロ
ティンＧにはＩｇＭはほとんど吸着しないので、利用す
ることができない。

大量に高純度なＩｇＭを得ようとする際に、後者の精製
方法を使用するには、上述したようにコスト的な問題が
大きいので、通常、大量分取するには、前者のイオン交
換クロマトグラフィを用いた非特異的な精製方法が用い
られる。

しかしながら、前者のイオン交換クロマトグラフィを用
いた精製方法で行う場合、前処理として塩濃度の低い開
始緩衝液に透析し、脱塩する操作を必ず行わなければな
らない。よって、タンパク質試料を、稀薄溶液というタ
ンパク質にとっては非常に不安定な条件にさらすことに
なる。試料によっては非可逆的に沈殿してしまうため、
クロマトグラフィーの開始緩衝液を、高い塩濃度で始め
なければならないという不都合を生じる場合もある。さ
らにその場合、塩濃度グラジェントをかけて溶出を行う
と、溶出されるピークがブロードしてしまうということ
がしばしば観察され、夾雑タンパク質の混入を余儀無く
されることもある。ＩｇＭ産生株のハイブリドーマを培
養したカルチャメデウムでは、濃縮操作が困難である。

特に、添加されているフェノールレッド等のｐＨ指示薬
の除去は難しく、簡便で有効な硫酸アンモニウムによる
塩析法や限外濾過膜法でも、十分に除くことができない
。これは、ＩｇＭの分離精製に最後まで大きく影響して
いる。またｐＨ指示薬は、充填剤に一度吸着するとなか
なか溶離できず、しばしば充填剤の劣化を早めることも
認められている。

近い将来、ヒト型ＩｇＭあるいはそのキメラ抗体などの
大量培養法が確立し、ＩｇＭを、特に癌などの新生生物
やウィルス感染細胞に対する薬剤あるいは薬剤のキャリ
アーとして、治療面で応用されることが期待されるが、
その時は精製法も製造工程の中で非常に重要なウェイト
を占めることは明らかであり、その方法の開発は欠くこ
とはできない。

最近、タンパク質の大量精製には高速液体クロマトグラ
フ（−（Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕ
ｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、以下ＨＰＬＣ）を
用いて精製するケースが多くなってきた。その理由は、
この方法が非常に迅速に大量に効率よく精製できるから
である。ただし残念なことに、この装置と専用の充填剤
はそれ自体非常に高価で、しかも装置の制御方法も熟練
を要する。またその様な装置および器具を使用する場合
は、できるだけ充填剤の劣化を防ぐため、試料中の不溶
物や脂質などの夾雑物をあらかじめ除去する工程が必要
となる。具体的には遠心分離、塩析、透析、限外濾過等
の前処理である。それに装置自体のメンテナンスも欠か
すことができない。多くの点を考慮すると、消耗材とし
ての充填剤は、一般にコスト、取扱い、メンテナンスと
もＨＰＬＣ充填剤よりも中速液体クロマトグラフィー充
填剤の方が優れている。

（発明か解決しようとする課題） 本発明の目的は、大巾に利用価値のあるＩｇＭを精製す
る方法を提供することにある。詳しくは、ＩｇＭおよび
夾雑タンパク質を、疎水相互作用を利用したクロマトグ
ラフィを用いて、塩溶液中でカラムに吸着させ、徐々に
あるいは一度に塩濃度を下げて、ＩｇＭを選択的に充填
剤より分離溶出させることによって、従来の方法よりも
より簡便な操作で前処理せずかつ短時間に、くわえて効
率良く高純度に、しかも−度に大量にＩｇＭを精製する
方法を提供するものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果本発明に
到達した。

即ち本発明は、ＩｇＭ及び塩を含む試料溶液を、疎水相
互作用を利用したクロマトグラフィを用いて目的とする
ＩｇＭを塩溶液中で吸着させ、塩濃度を下げてＩｇＭを
選択的に脱離させ分離溶出させることを特徴とするＩｇ
Ｍの精製法である。

以下その詳細について説明する。

精製されるＩｇＭとしては、例えばハイブリドーマを移
植した動物の腹水液、ハイブリドーマおよびリンパ球の
培養液、または動物の血清などがあげられる。ＩｇＭは
ポリクロ−ナル抗体でもモノクロ−ナル抗体でもよい。

ＩｇＭの定常領域は、哺乳動物由来であるものが好まし
く、例えばヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウシ、ウマ、
ヒツジ等があげられる。

試料溶液に含まれる塩及びその濃度は、通常、疎水クロ
マトグラフィーに用いられるように使用すればよい。例
えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、リン酸ナト
リウム等が用いられる。

疎水相互作用を利用したクロマトグラフィーとしては、
とくに限定はなく、試料であるＩｇＭの疎水性との兼ね
合いによりるが、疎水性が比較的弱いものを用いる方が
好ましい。例えば親水性ポリマー系樹脂などがあげられ
、ＴＳＫゲルトヨパールＨＷ−６５（東ソー■製）など
が使用される。又、ゲル濾過クロマトグラフィーに用い
られる充填剤を用いることもできる。

ＩｇＭの精製手順はまずＩｇＭに塩を含む緩衝液または
塩をそのまま添加する。これをそのまま疎水相互作用を
利用したクロマトグラフィーに吸着させ、次いで塩濃度
を下げてＩｇＭを選択的に脱離させ、分離溶出させれば
よい。塩濃度は徐々にまたは一度に下げてもよい。吸着
・分離溶出は、バッチ法、カラム法、ステップワイズ法
、グラジェント法などいずれも行うことができる。

特に腹水中のＩｇＭは、フィルターカットしたものを直
接クロマトグラフィーにかけるだけでよく、他の一切の
前処理は不要であるため、非常に簡便に精製を行うこと
ができる。

（発明の効果） 以上の説明から明らかなように、本発明によれば、従来
法に比べてより簡便な操作で短時間に、かつ効率よく高
純度に、しかも−度に大量にＩｇＭを精製することが可
能である。ＩｇＭはＩｇＧなどと比較して、疎水性が大
なので、ＩｇＧ等にはむかない本発明方法も、ＩｇＭの
精製には好ましく用いられる。

（実施例） 以下、その条件等、実施例を挙げて詳細に説明する。し
かし、これら実施例のみに本発明は限定されるものでは
ない。

［実施例１］ハイブリドーマの培養上清からＩｇＭを分
離精製する （１）ヒトミオグロビンに対するモノクロ−ナル抗体（
ＩｇＭ）を産生ずるハイブリドーマ１０４ｃｅｌｌｓ／
ｍｌを１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含む
Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｄｕｌｂｅｃｅｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆ
’ｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｓｍｅｄｉｕｍ　；ギブコ社製
）（以下１０％ＰＣ８−ＤＭＥＭと略）１００ミリリツ
トルに植え込み、３７℃、５％二酸化炭素ガス濃度、９
５％湿度の条件で培養を始めた。培養開始後１０日目間
培地を１，０００回転、５分間、２５℃で遠心して、ハ
イブリドーマを除いた培地を上清として得た。再度同様
の操作を行い、沈殿を除去した後、硫酸アンモニウムを
１３．２ｇ加えて培地中の最終硫酸アンモニウム濃度を
ＩＭとした。この培地に、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む
リン酸緩衝化生理食塩水（０，８５％ＮａＣ１含有０，
０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７，２＝以下ＰＢＳ）で平衡
化しておいたＴＳＫｇｅｌ　　　トヨパール　ＨＷ　−
６５（Ｆｉｎｅ）　　（東ソ（株）社製）を４ミリリツ
トル添加した。室温で２時間静置した後、この培地を流
速０．２１／１ｎになるようペリスタポンプでエコノ・
カラム（バイオラッド社製）に流し込み、さらに１００
１の１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳで充填剤を洗浄
した。洗浄後ただちに溶離液である０、７Ｍ硫酸アンモ
ニウムを含むＰＢＳで、ＩｇＭを一段階で選択的に溶離
した。溶出液を２ｍｌずつフラクションコレクターに分
取し、それぞれの溶液の吸光度を検出波長２８０ｎｍで
測定した。

結果を第１図に示す。この条件でＩｇＭのピークは溶離
液に変えた後、ｉ木目のフラクションから現れた（第１
図；ピーク１）。このピークを分取して精製１ｇＭ画分
とした。以上で−通りの精製操作が終了した。

（２）分取した精製１ｇＭ画分はメルカブトエタノル還
元下の１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
とＴＳＫｇｅ　Ｉ　　Ｇ４０（ＬＯ８ＷｘＬを用いたゲ
ル濾過ＨＰＬＣを行った。電気泳動の結果を第２図レー
ン２（レーンに分子量マーカ、低分子用、ファルマシア
社製）に、ＨＰＬＣの結果を第３図に示す。第２．３図
から明らかなように、均一のＩｇＭであることが確認さ
れた。

（３）精製１ｇＭの抗体力価の酵素免疫学的測定法（Ｅ
ｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉａｖｕｎｏ　５ｏｒｂｅ
ｎｔ　Ａｓ５ａｙ、　ＥＬＩＳＡ　）による測定 未処理マイクロタイタープレート（９６ウエル・ヌンク
ブレート、インターメッド社製）の各ウェルに０．１Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した１ｇｇ
／ｍｌのヒトミオグロビンの溶液５０μｌを加えて、４
℃−夜インキユベートした。各ウェルの溶液を除去し、
ＰＢＳに０．０４％ツイーン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含
んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．１
％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ
−Ｔ溶液３００μｍを各ウェルに加えて、４℃でブロッ
キング処理しそのまま保存した。マイクロタイタープレ
ートを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、２
８０ｎｍの紫外吸光度を０．００５になるようＰＢＳで
希釈した精製１ｇＭの試料を各ウェルにそれぞれ５０μ
ｍ加えた。この状態で３７℃で９０分間放置した。

つぎにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｈ鎖
特異的；タボ社製）抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液で５０００倍
に希釈し、各ウェルにそれぞれ５０μｍずつ添加した。

そのまま室温で９０分間インキュベートした後、溶液を
除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、０．３
ｍｇ／ｍｌの２．２−アジノジ−（３−エチルベンズチ
アゾリン硫酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０
．０１％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ４，１）から成る基質溶液を各ウェ
ルに１００μｌ添加し、室温で３０分間呈色反応させた
後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００μｍ加えて酵素反
応を停止させた。

上記マイクロタイタープレートを各ウェルについて、波
長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マ
イクロタイタープレートリーダー（東ソー株式会社製、
ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果を第４図に示す
。図からも明がなように、本発明による精製を行っても
抗体の抗原に対する親和性は保持されていた。

［実施例２コマウス腹水からＩｇＭを分離精製（１）ヒ
ト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するモノクロ−ナル抗体
（ＩｇＭ）を産生ずるハイブリドーマを１０６ｃｅｌｌ
ｓ　／匹になるようにＢａ１ｂ／Ｃマウス（♂）の腹腔
に移植して、得られた腹水液１０ｍ１を０．８μｍのメ
ンブレンフィルターで濾過した。その腹水液に硫酸アン
モニウム１．４ｍｇを添加し、さらに１Ｍ硫酸アンモニ
ウムを含むＰＢＳで平衡化しておいたＴＳＫｇｅｌ　　
）ヨパール　ＨＷ　−６５（Ｆｉｎｅ）　　（東ソー株
式会社製）を１０ミリリットル加え、室温で２時間静置
した。

次にこの腹水液を流速０　、　２　ｍｌ／ｍｉｎになる
ようペリスタポンプでエコノ・カラム（バイオラッド社
製）に流し込み、さらに２００１の１Ｍ硫酸アンモニウ
ムを含むＰＢＳで充填剤を洗浄した。洗浄後ただちに硫
酸アンモニウム濃度ＩＭから０．７ＭのＰＢＳへの直線
勾配で硫酸アンモニウム濃度を８６３時間かけて下げ、
ＩｇＭを充填剤から選択的に溶離した。この時の溶離液
の流速は０．４ｍｌ／ｗｉｎで、溶出液を２１ずつフラ
クションコレクターに分取し、各溶液の吸光度を検出波
長２８０ｎｍで測定した。結果を第５図に示す。このピ
ークの８０分から３７５分までを分取して精製１ｇＭ画
分とした。以上で−通りの精製操作が終了した。

（２）分取した精製１ｇＭ画分はそれぞれメルカプトエ
タノール還元下の１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動とＴＳＫｇｅ　ＩＯ２０００５ＷＸＬを用い
たゲル濾過ＨＰＬＣを行った。

電気泳動の結果を第２図レーン３に、ＨＰＬＣの結果を
第６図に示す。またＨＰＬＣでの素通り画分の電気泳動
の結果を第２図レーン５に示す。第２．６図から明らか
なように純度９０％以上の均一のＩｇＭであることが確
認された。

（３）精ｔＪ１１ｇＭの抗体力価のＥｌ、ＩＳＡによる
測定未処理マイクロタイタープレート（９６ウエル・ヌ
ンクプレート、インターメッド社製）の各ウェルにＯ，
１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した３
、ｃｚｇ／ｍｌのＣＥＡの溶液５０μｍを加えて、４℃
−夜インキユベートした。

各ウェルの溶液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後
、０．１％ＢＳＡを溶解し７’：　Ｐ　Ｂ　Ｓ　−Ｔ溶
液３００μｍを各ウェルに加えて、４℃でブロッキング
処理しそのまま保存した。マイクロタイタープレートを
室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、２８０ｎ
ｍの紫外吸光度を０．００５になるようＰＢＳで希釈し
た精製１ｇＭの試料を各ウェルにそれぞれ５０μＩ加え
た。この状態で３７℃で９０分間放置した。つぎにペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｈ鎖特異的；タ
ボ社製）抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液で５０００倍に希釈し、
各ウェルにそれぞれ５０μｍずっ添加した。

そのまま室温で９０分間インキュベートした後、溶液を
除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、０．３
ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ及び０．０１％過酸化水素（Ｈ２
Ｏ２）を含有するＯ、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，１
）がら成る基質溶液を各ウェルに１００μｍ添加し、室
温で３０分間呈色反応させた後、２００ｍＭシュウ酸溶
液を１００μｍ加えて酵素反応を停止させた。上記マイ
クロタイタープレートを各ウェルについて、波長４１５
ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタ
イタープレートリーダー（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−
Ａ４、商品名）で測定した結果を第７図に示す。図から
も明らかなように、本発明による精製を行っても、抗体
の抗原に対する親和性は保持されていた。

［実施例３コヒト・ヒトハイブリドーマの培養上清から
ＩｇＭの分離精製 （１）　ヒト腺癌に対するモノクロ−ナル抗体（ＩｇＭ
）を産生ずるバイブリド−７１０’　ｃｅｌｌｓ／１を
ｌＯ％ＦＣ８＝ＤＭＥＭ　１００ミリリツトルに植え込
み、３７℃、５％二酸化炭素ガス濃度、９５％湿度の条
件で培養を始めた。培養開始後１４日ロー培地を１，０
００回転、５分間、２５℃で遠心して、ハイブリドーマ
を除いた培地を上清として得た。

再度同様の操作を行い、沈殿を除去した後、硫酸アンモ
ニウムを１３．２ｇ加えて培地中の最終硫酸アンモニウ
ム濃度をＩＭとした。この培地に１Ｍ硫酸アンモニウム
を含むＰＢＳで平衡化しておいたＴＳＫｇｅｌ　　トヨ
パール　ＨＷ−６５（Ｆｉｎｅ）　　（東ソー（株）社
製）を５ミリリツトル添加した。室温で一夜静置した後
、この培地を流速０　、　２５１／１Ｉｉｎになるよう
ペリスタポンプでエコノ・カラム（バイオラッド社製）
に流し込み、さらに２００１の１Ｍ硫酸アンモニウムを
含むＰＢＳで充填剤を洗浄した。洗浄後ただちにＩＭか
らＯＭの硫酸アンモニウム濃度の直線勾配で硫酸アンモ
ニウム濃度を８時間かけて下げた。溶出液を２ｍｌずつ
フラクションコレクターに分取し、それぞれの溶液の吸
光度を検出波長２８０ｎｍで測定した。結果を第８図に
示す。この条件でＩｇＭのピークは９番目のフラクショ
ンに現れた。４番目から１４番目のフラクションを分取
して精製ＩｇＭ画分とした。以上で−通りの精製操作が
終了した。

（２）分取した精製１ｇＭはメルカプトエタノール還元
下の１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と
ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ　４０００　Ｓ　Ｗ　ＸＬを用いたゲ
ル濾過ＨＰＬＣを行った。電気泳動の結果を第２図レー
ン４に、ＨＰＬＣの結果を第９図に示す。第２．９図か
ら明らかなように均一のＩｇＭであることが確認された
。

【図面の簡単な説明】

第１図、第５図および第８図は、それぞれ実施例１．２
．３における疎水相互作用クロマトグラフィのエリュー
ションパターンを示す図で、横軸がフラクションナンバ
ーで縦軸が２８０ｎｍの吸光度及び硫酸アンモニウム濃
度を示す。 第２図は実施例１．２．３における精製ＩｇＭの１２％
５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果をそれぞれレーン２．３．４に
示し、レーン１に分子量マーカ（低分子用：ファルマシ
ア社製）、レーン５に実施例２のクロマトグラフィーの
すどおり画分を示す図である。 第３図、第６図および第９図はそれぞれ実施例１．２．
３での精製１ｇＭのゲル濾過ＨＰＬＣのチャートを示す
図である。横軸が溶出時間、縦軸が２８０ｎｍの吸光度
である。 第４図および第７図はそれぞれ実施例１．２の精製１ｇ
Ｍの抗原に対する抗体価を示すものである。縦軸が呈色
反応の４１５ｎｍでの吸光度、横軸が抗原の濃度（ｎｇ
　／　ｎ１１）である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫グロブリンＭ及び塩を含む試料溶液を、疎水
   相互作用を利用したクロマトグラフィを用いて、目的と
   する免疫グロブリンＭを塩溶液中で吸着させ、塩濃度を
   下げて免疫グロブリンＭを選択的に脱離させ、分離溶出
   させることを特徴とする免疫グロブリンＭの精製法。
2. （２）クロマトグラフィー用充填剤が、親水性ポリマー
   系樹脂である特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）免疫グロブリンＭを含む試料溶液が、ハイブリド
   ーマを移植した動物の腹水液、ハイブリドーマおよびリ
   ンパ球の培養液、または動物の血清である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
4. （４）試料溶液に含まれる免疫グロブリンＭが、ポリク
   ロ−ナル抗体またはモノクロ−ナル抗体である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。
5. （５）試料溶液に含まれる免疫グロブリンＭの定常領域
   が、哺乳動物由来である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
6. （６）使用する塩が硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム
   、リン酸カリウム、リン酸ナトリウムのいずれかである
   特許請求の範囲第１項記載の方法。