JPH02290900A - 抗体精製方法 - Google Patents

抗体精製方法

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JPH02290900A
JPH02290900A JP2089289A JP8928990A JPH02290900A JP H02290900 A JPH02290900 A JP H02290900A JP 2089289 A JP2089289 A JP 2089289A JP 8928990 A JP8928990 A JP 8928990A JP H02290900 A JPH02290900 A JP H02290900A
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acid
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buffer solution
protein
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That T Ngo
ザット・テイー・ンゴ
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BIOPROBE INTERNATL Inc
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、抗体の精製方法に関する。より特別な１つの
側面において、本発明は哺乳類から誘導された免疫グロ
ブリンの精製に関する。
〔発明の背景〕
臨床診断学および癌の療法における試薬として抗体の使
用が増加するに伴い、このような抗体を精製することが
必要となっている。従来の精製技術には、抗体を含む混
合物を適切なカラム中に通し、この混合物から抗体を選
択的に吸着させ、その後でこの吸着された抗体を精製物
の形でカラムから溶出する方法があるが、これは上記の
目的のために使われてきたものである。しかしながら、
こうして得ることのできる単離された抗体の収率および
純度は、使用するカラムに特異性が欠けているため限界
がある。
従来の免疫グロブリンの精製方法は、例えば免疫グロプ
リンに対する吸着剤の吸着容量が比較的低く問題があっ
た。このような方法の１つにおいて、異なる哺乳類種の
血清から分別された多種の免疫グロブリン部分は、ｐＨ
７またはそれ以上でプロテインＡ−セファロース１吸着
剤上゛に吸着され、ｐＨ値２．５〜Ｂ．・５の範囲で溶
出された［Ｒ．リンドマーク、Ｋ．ソレンー　トーリン
グ、』．スヨキスト、“プロテインＡへの免疫グロブリ
ンの結合および哺乳類血清における免疫グロブリンのレ
ベル（Ｂｉｎｄ１ｎｇ　　ｏｒ　　Ｉａａ＋ｕｎｏｇｌ
ｏｂｕｌｌｎｓ　　ｔｏ　　ＰｒｏＬｅＩｎＡ　　ａｎ
ｄＩｍｓｕｎｏｇｌｏｂｕｌｌｎ　Ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ
　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｓｅｒａ）　”のプロテインＡ
−セファロース３への結合はｐＨ値に依存すること、お
よび最適な吸着は０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８
．０の緩衝溶液を使ったときに起こることもまた知られ
ていた［Ｐ．Ｌ．Ｅｙ，　Ｓ．Ｊ．プロウズ、Ｃ．Ｒ．
ジエンキン“プロテインＡ−セファロースを使った純粋
なＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ免疫グロブリ
ンのハツカネズミ血清よりの単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
　　ｏｆ’　　Ｐｕｒｅ　　　ＩｇＧ１．ｌｇＧ２ａ　
　ａｎｄ　　ｌ’ｇＧ２ｂＩｍＩＩｌｕｎｏｇ１ｏｂｕ
ｌｉｎｓ　　ｒｒｏｌａ　　Ｍｏｕｓｅ　　Ｓｅｒｕｍ
　　ＵｓｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
）　”免疫化学（　ｌｍｍｕｎｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ）
　　、１５：４２９（１９７ｇ）］　　。
最近、特別な組成をもった緩衝溶液を用いて多種の免疫
グロブリンの回収を増加させる努力がなされている［″
ハツカネズミの単分枝系１ｇＧｌのアフィーゲル３プロ
テインＡを用いた精製（Ｍｏｕｓｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ　ＩｇＧｌ．Ｐｕｒｙｆｌｃａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ
Ａｒ『［−ＧｅｌＲＰｒｏｔｅｉｎＡ）　”広報１１７
２，バイオーラッド研究所（Ｂｕｌｌｌｔｅｌｎｌｌ７
２　Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ）パイ
オーラッド化学分会、カリフォルニア、リッチモンド、
（＋９８４）］。特別なｐＨ値で特定されたある範囲内
の濃度において、無機塩を使うことにより免疫グロブリ
ンが精製されることが、米国特許第４．７０４，３６６
号に記載されている。緩衝液中に特定のｔＲ度範囲で１
価のカチオンおよび多塩基アニオンの化合物を用いた免
疫グロブリンの別の精製方法が、米国特許第４．８０１
．８６７号に記載されている。このような現状にもかか
わらず、免疫グロブリンの収率を最終的に尚一層高める
精製方法を提供することが望まれている。
従って本発明の目的は、改良された抗体精製方法を提供
することである。
本発明の別な目的は、精製段階が増えないような精製方
法を提倶することである。
本発明のさらなる目的は、前記のような吸芒技術による
精製において回収される抗体の収率を改善するために、
速く、使い易くそして経済的に実用性のある方法を提供
することである。
本発明のその他の目的および利点については、以下の詳
細な開示より明らかにする。
〔発明の概要〕
本発明は、免疫グロブリンのような抗体の精製方法を提
供する。本方法では、精製される抗体を従来実施されて
いたものより高い収率で回収することができる。本方法
は、少なくとも１つのポリカルボン酸を濃度約０．５〜
０．９Ｍで含有する緩衝溶液を使う点で特徴的である。
本発明の好ましい態様に従えば、次のような抗体精製方
法が提倶される。この方法は免疫グロブリンを含む媒質
１容量部を、約ｐＨ６〜１０の範囲のｐＨ値を有し、か
つ少なくとも１つのポリカルボン酸を濃度約０．５〜０
．９Ｍで含有する緩衝溶液約０．５〜５容量部と混合し
、緩衝液処理された免疫グロブリン媒質を与えることと
、こうして得られた緩衝液処理された免疫グロブリン媒
質を固定化免疫グロブリン結合性吸＠剤に接触させ、緩
衝液処理された免疫グロブリン媒質中に存在する免疫グ
ロブリンを該吸着剤に吸着させることの各段階を含んで
いる。続いて免疫グロブリンを吸着した吸着剤をｐＨ値
が約ｐＨ２〜５の範囲にある緩衝溶液と接触させること
によって、この吸着剤から免疫グロブリンの全部もしく
は一部分が除去される。緩衝液処理された免疫グロブリ
ン媒質のうち他成分から分離された免疫グロブリンは、
このようにしてさらに純粋な形で回収されることができ
る。本発明の方法により実現した免疫グロブリンの収率
は著しく増大し、従来技術により得ることのできた収率
を約７０％から３００％以上も超えている。
〔発明の詳細な記述〕
本発明の方法は、モノクローナル抗体およびポリクロー
ナル抗体の両方を含む色々な種類の免疫グロブリンを精
製するのに有用である。それは、ＩｇＧｌ，　ＩｇＧ２
ａ，　ＩｇＧ２ｂ，およびその他のような多くのＩｇＧ
のサブクラスにおいても適用ｎＪ能である。ハツカネズ
ミ、アレチネズミ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ、および
ヒトの抗体を含む広く多種に渡る宿主から得られる抗体
が、本発明の方法を用いて精製される。一般的にこの方
法は、免疫グロブリン結合性吸青剤（典型的にはプロテ
イン）と親和性のあるどの免疫グロブリンに対しても適
用可能である。免疫グロブリンは、捕乳類の正常血清も
しくは免疫血清、または腹水、またはハイブリドーマ、
または組織培養液、または他のいかなる抗体源からも得
ることが可能である。
本発明の方法は、免疫グロブリンと選択的に結合する傾
向を示すどの物質をも吸着剤に利用してよい。特に、適
切な吸着剤は固定化プロテインＡ１または固定化プロテ
インＧ１または同様のプロテイン吸着剤を含む。多種の
免疫グロブリン−（特に哺乳類から得られるＩｇＲ　）
は、精製溶解状態およびホルマリンで凝固したバクテリ
ア形のいずれの形ででもプロテインＡおよびプロテイン
Ｇの両方と結合することが知られている。しかし、不溶
化された状態以外のプロテインＡまたはプロテインＧを
使うことは、一般的に例えば架橋アガロースもしくは他
の保持体上に固定化されたプロテインＡまたはプロテイ
ンＧを利用するほど実用的ではない。不溶化された形の
プロテインＡまたはプロテインＧは、慣用的にカラム内
でまたは薄膜の形で使イつれ、これによって上記の精製
方法が容品になる。
適切な免疫グロブリン結合性固定化プロテイン吸着剤の
多くは、商業的に人手可能である。架橋アガロースビー
ズに化学的に安定なアミド結合によって結合された精製
プロテインＡは、バイオーラッド研究所（リッチモンド
、カリフォルニア）よりアフィーゲル３プロテインＡ　
（Ａｆｆｌ−ＧｅｌｌｌＰｒｏｔｅｉｎ＾）として得る
ことができる。ブロテインＡ−アガロースは、ティムド
研究所（バーリンガム、カリフォルニア）からも入手可
能である。
この製品は、ＣＮＢｒ一基で活性化されたセファロース
”　４Ｂ（ＳｅｐｂａｒｏｓｅＲ４Ｂ）と結合した純粋
なプロテインＡと説明されている。同様の製品プロテイ
ンＡセフ７ロース”　ＣＩ−４Ｂ　（Ｐｒｏｔｅｌｎ　
Ａ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲＣｌ−４Ｂ）およびプロテイ
ンＧセファロースＲ４ファストフＯ　−　（Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ｇ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅＲ４　Ｐａｓｃ　Ｐｌｏ
ｗ）もまた、ファーマシアファインケミカル社（ウプサ
ラ、スウェーデン）より入手可能である。プロテインＡ
−ウルトラゲルＲ（ＰｒｏｔｅｌｎＡ−Ｕｌｔｒａｇｅ
ｌＲ）はレアクティフ　ＩＢＰ社（フランス）より入手
可能である。これは、異なった唾乳類から得られる免疫
グロブリンＧとの相互作用が可能な生物特異的なアフィ
ニティーク口マトグラフィー吸収剤として説明されてお
り、そして、純粋なプロテインＡをグルタルアルデヒド
で活性化させた電気泳動的に固定化することにより調製
される。架橋構造のビーズ状アガロースと共有結合した
プロテインＡは、ビースケミカル社より入手可能である
。
アガロースビーズ上に固定化された連鎖球菌状プロテイ
ンＣの組み換え形は、ゲネックスコーポレーション（ゲ
ティスバーグ、メリーランド州）よりガンマバインドＴ
”Ｇ−アガロース（Ｇａｍａ＋ａｂｉｎｄＴ″ＡＧ−Ａ
ｇａｒｏｓｃ）として人手可能である。固定化組み換え
プロテインＡのゲルは、レプリゲン社（ケンブリッジ、
マサチューセッツ州）より人手可能である。薄膜状の固
定化組み換えプロテインＡは、例えばマス’　　（Ｍａ
ｓｓＩ１）としてＮＹジエネ社（ヨンカース、ニューヨ
ーク州）より入手可能である。
固定化プロテインＡおよび固定化プロテインＧは、米国
特許第４．５８２．８７５号（この特許は、本発明と同
じ譲受人に譲渡されており、その開示内容全体が参考文
献として本明細書中に組み入れられている）において開
示された技術を使っても提供される。この特許は、２−
フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スル
ホネート（ＰＮＰ）を使って、水酸基を含む高分子担体
を活性化することを一般的に教示している。このような
活性化ボリマーは、バイオブローブインターナショナル
社（タスティン、カリフォルニア州）より商業的に入手
可能である。アビッドーゲルＴＭＦＭＰ−活性化親水ゲ
ルＴ　　（Ａｖｉｄ−Ｇｅｌ０ＭＦＭＰ−ａｃｒｉｖａ
ｔｅｄ　ＨｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃＧｅｌ　Ｔ）は、Ｎ−
アクリロイル−２−アミノ　ー２−ヒドロキシメチル−
１．３−プロパンジオール（トリスアクリルＣＰ２００
０、リアクティフＩＢＰ社、フランス）をＦＭＰで活性
化したボリマーである。アビッドーゲル”ＰＭＰ一活性
親水ゲル（＾ｖ１ｄ−ＧｅｌＴＭＰＭＰａｃｔ１ｖａｔ
ｅｄ１１ｙｄｒｏｐｈｉｌｌｅ　Ｇｅｌ　Ｆ）は、炭素
、水素、および酸素元素のみから構成された親水性ビニ
ルアルコールポリマー（フラクトゲルＴＳＫ　Ｅ．メル
ク社、ダルムシュタット、ドイツ）をＰＮＰで活性化し
たものである。これらはいずれも固定化プロテインＡま
たは固定化プロテインＧを提供するために使われる。
本発明の方法の好ましい態様における最初の段階では、
ｐＨ値が約ｐＨ　１３〜１０、好ましくは約ｐＨ８〜９
の範囲にある緩衝液を使用する。この緩衝液は、少なく
とも１つのポリカルボン酸を濃度約０．５〜０．９Ｍ、
好ましくは約０．６〜０．８Ｍで含有する。他の点では
、純粋でない免疫グロブリンを含む媒質と共用するのに
適切であれば、どのような緩衝液も必要なｐＨ値を提供
するのに使用可能である。例えば、リン酸塩緩衝液、ま
たはグリシン緩衝液、またはホウ酸塩またはトリス緩衝
液（ｔｒ１ｓ　ｂｕｆ’ｆ’ｅｒ）が使用可能であり、
特にリン酸塩緩衝液が好ましい。緩衝液の濃度は、一般
的に約０．０１〜０．２５Ｍの範囲であるべきである。
本発明の文中、“ポリカルボン酸”という語は、１個以
上のカルボキシル基を有するどのような有機酸をも含む
ものとして考えられおり、そしてその塩形成物を含むこ
とも意味している。一般的には、そのナトリウム塩およ
びカリウム塩が入手可能であるためよく使われる。しか
し、他の金属塩も十分に溶解して必要なポリカルボン酸
濃度を提供するならば、同様に使用可能である。アンモ
ニウム塩もまた使用可能であるが、ｐＨ値が高くなると
アンモニアを脱離する傾向があるため、上記のアルカリ
金属塩ほど望ましくない。もちろん２種以上のポリカル
ボン酸塩および／またはそれらの塩の混合物は、本発明
に従った用途に関し同様に適切である。
上記で指摘されたように、吸着剤は免疫グロブリンと接
触して精製されるのを容易にするために、カラム中で使
用することが好ましい。純粋でない免疫グロブリンを含
む媒質をこのカラムに適用する前に、該カラムを好まし
くはベッド容量の数倍量の緩衝液（ｐｉｌｅ〜ＩＯで、
少なくとも１つの有機ポリカルボン酸を濃度範囲約０．
６〜０、９Ｍで含有する）で平衡状態にする。こうして
、その環境は確実に該免疫グロブリンを該カラムに吸着
させるための最適条件となる。免疫血清または他の免疫
グロブリン源のような、精製されるべき免疫グロブリン
を含む媒質は、容量比で約１：０．５〜１：５、好まし
くは約ｌ：２〜ｌ：４の割合にあるポリカルボン酸を少
なくとも１つ含む緩衝液と混合される。次いで、こうし
て得られた混合物を該カラム中に通し、免疫グロブリン
を該カラムに吸着させる。それから、カラムに強く吸着
していない不純物を溶出させるために、このカラムをポ
リカルボン酸を少なくとも１つ含む緩衝液を加えて洗浄
することが好ましい。一方、免疫グロブリンは、ポリヵ
ルボン酸を少なくとも１つ含む緩衝液の存在によって吸
着剤に対する親和力が強くなるために、カラムに強く吸
着されるようになる。
同じ緩衝溶液で洗浄することにより、本発明の好ましい
態様に従って不要な不純物を除去し、続いてｐＨ値が酸
性すなわち約ｐｉ　２．０〜５．５の範囲にある緩衝液
を用いて、カラムより精製された免疫グロブリンをカラ
ムから溶出させてもよい。該免疫グロブリンは、ｐＨ値
約３．０の緩衝液を使用して溶出可能であり、これは全
ての免疫グロブリンを本質上同時に溶出させるのに効果
的である。しかしながら、もし必要ならばｐｉ値を約ｐ
１　５．５〜２．０の間で低下させることにより、多種
の分画を別々に溶出させることが可能である。ｐＨ値を
段階的に低下させることにより、望ましい特定の免疫グ
ロブリンを含む精製免疫グロブリン分画を別々に単離す
ることが可能である。ｐＨ値が適切であればどのような
緩衝液も溶出に使うことができる。例えば、酢酸一酢酸
塩緩衝液がこの目的のために使われる。濃度範囲約０，
０１〜０．２５Ｍの緩衝液は、この目的のための使用に
好都合である。特に濃度範囲約０．０５〜０．１ＯＭの
緩衝液が好ましい。
こうして’ｌ’　Ｈされた免疫グロブリンまたはその分
画は、高純度および高収率で回収が可能であり、その収
率は従来得ることのできたものより数倍も大きくなる。
従来利用可能であった最も精巧な技術を使って得られる
収率でさえ、本発明の方法を使うことにより改答可能で
ある。
本発明は、以下の実施例を参照することによりより理解
されるであろう。この実施例は例証を目的としたもので
あり、ここに添付した特許請求の範囲で定義された本発
明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない
。
実施例１ 容積３ｍｌのカラム中に固定化プロテインＡ（プロテイ
ンＡアシッドゲル↑”、バイオブローブインターナショ
ナル社、タスティン、カリフォルニア）　　ｌｍｌを加
えた。このカラムをｐＨ８の０．　１Ｍリン酸カリウム
および種々の濃度のクエン酸カリウムからなる結合性緩
衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂＬｉｆｌ’ｅｒ）　　５ｍｌ
を用い、流速毎分１ｍｌにて洗浄した。次にヒト血清３
ｍｌを結合性緩衝液６ｍｌで希釈し、これを毎分０．５
ｍｌの速さで上記力ラム中に通した。その後、このカラ
ムを結合緩衝液１０ｍｌで洗浄し、血清およびどの未吸
着１ｇＧをも洗い落とした。次にカラム上に吸着した免
疫グロブリンを、０．１Ｍ、Ｉ）１２．１１１のグリシ
ンー塩酸５ｍｌを流速毎分０．５ｍｌでカラム中に通過
させることにより溶出させた。この溶出液の２８０ｎ１
こおける吸光度より得られた該免疫グロブリンの収率は
、緩衝液のポリカルボン酸にリン酸カリウムのみを使っ
て得られたものより約７０〜３００％の範囲で高くなっ
ていた。上記の結果を表１に示す。
結合性緩衝液 ・０．　１Ｍリン酸カリ ・０．１Ｍリン酸カリ ０，６Ｍクエン酸力 ・０．１Ｍリン酸力リ ０ゴドクエン酸カ −　０．１Ｍリン酸カリ ０．８Ｍクエン酸力 ・０−．ＩＭリン酸カリ ０．９Ｍクエン酸カ 表 ＩｇＧ吸着量 （ａ＋ｇ／ａｔゲル） ウム ウム＋ リウム ウム＋ リウム ウム士 リウム ウム＋ リウム ９．２２ １５．７４ ２３．３７ ３６．０６ ３１．０４ 実施例２ 結合性緩衝液として０．　１Ｍリン酸カリウム中に０．
７Ｍクエン酸を加え使用し、９Ｈ値を変化させて実施例
１の手順を繰り返し実施した。その結果を表２に示す。
表　　　　２ ｐＨ値 ＩｇＧ吸着量 （ｓｇ／ｍ＋ゲノレ） １７．１４ ２２．９８ ２９．３８ ２８．３０ ２８．１６ 実施例３ 結合性緩衝液として、０．１Ｍリン酸ナトリウム中に色
々なカルボン酸を加え、ｐ，Ｈ８．０で使用し、実施例
１の手順を繰り返し実施した。その結果を表２に示す。
表　　　３ カルボン酸 ０．８７Ｍ Ｏ．６７Ｍ Ｏ．６７Ｍ Ｏ．８７Ｍ Ｏ．６７Ｍ Ｏ．６７Ｍ Ｏ．０７Ｍ Ｏ．（ｉ７Ｍ Ｏ．６７Ｍ Ｏ．６７Ｍ ０．６７Ｍ ０．６７Ｍ ０．８０Ｍ ＩｇＧ吸着量 （ｍｇ／ｍｌゲル） １０．８８ ｔｏ．ａｔ １３．８８ １２．７９ １４．０５ １３．２１ １６．７１ １３．３８ １６．９２ アセテート グリシン アスパルレート グルタメート マレート グルタレート サクシネート タータレート ケトグルタレート Ｎ−（２−ヒドロエチレン） エチレンジアミントリアセテート （　ＩＩＥＤＴＡ）　　　　　　　　　　１７．４３イ
ソシトレート　　　　　　　２１．５３シ　　ト　　レ
　ー　　ト　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２３．３１エチレンジアミンテト
ラアセテート （ＥＤＴＡ）　　　　　　　　　　　２１．１８０．６
４Ｍエチレンジアミンテトラアセテート２１．９６ ０．８５Ｍエチレンジアミンテトラアセテート２１．９
０ ０．６７Ｍエチレンジアミンテトラアセテート２２．４
５ ０．６７Ｍエチレングリコール−０．０−ビス（２−ア
ミノエチル） −Ｎ．Ｎ．Ｎ’Ｎ’−テトラアセテ−？　　２０．４７
（　ＥＧＴＡ） 実施例４ 固定化プロテインＧが充填されたカラムを使うことを除
き、実施例１の手順を繰り返し実施した。
表　　　４ ポリカルボン酸　　　　　　１ｇＧ結合量（ａ＋ｇ／ｍ
ｌゲル） ０．５５Ｍエチレンジアミン テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）　　　　　　２４．３１０．６
５Ｍクエン酸塩　　　　　　　　２８．８８以上の結果
より、色々なポリカルボン酸を使った場合に比べモノカ
ルボン酸を使った場合は、リン酸ナトリウムを単独で使
った場合（９．２２ｍｇ／ＩＩｆゲル）と本質上同等の
結果となることが示された。
上記の結果に比較して、ＰＢＳを単独で使うと、結局ゲ
ルｌ１あたりＩｇＧＩＯ　ｍｇが吸着した。
実施例５ 結合性緩衝液として０．１Ｍのリン酸ナトリウム中に２
種のポリカルボン酸混合物を加えｐＨ８．０で使用し、
他は実施例１に従った。その結果を表５に示す。
表 ポリカルボン酸 ＩｇＧ結合量 （■／ｓｌゲル） ・０．２７５Ｍエチレンジアミン テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）　＋　　　　　　２５．６０．
３２５Ｍクエン酸 ●なし　　　　　　　　　　　　１６．０上記の結果は
、ポリカルボン酸を組合せることによって、免疫グロブ
リンの固定化プロテインＡに対する吸着が約６０％高め
られることを明らかに示している。これは、各ポリカル
ボン酸濃度が比較的低い場合でも起こった。従って、２
種以上のポリカルボン酸および／またはその塩の混合物
は、その結合したポリカルボン酸濃度が示された範囲内
である限り、明らかに本発明の範囲内に入る。
本発明は、速くてかつ便利である重要な免疫グロブリン
の精製方法を提供する。本発明の方法を実施することに
より、免疫グロブリンの収率を従来技術より約７０〜３
００％以上高める程の改良が実現可能である。
以上の本発明の記載は、説明および例証のため、特に好
ましい態様について向けられたものである。
しかしながら、これらの特別な技術および物質内におけ
る多くの修正および変化は、本発明の範囲および真意か
ら逸脱せずになされ得ることが、当業者には明白であろ
う。例えば、このような吸着過程はバッチ式でまたは他
の緩衝液中でも行うことができる。出願人の意図すると
ころは、上記特許請求の範囲の記載が、本発明の真意お
よび範囲内にあるような均等物、修正、および変更の全
てに及ぶことである。

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）免疫グロブリンを含む媒質を免疫グロブリン結合
    性吸着剤に接触させることによる免疫グロブリンの精製
    方法において、ｐＨ値約ｐＨ６〜１０の範囲であり、か
    つ少なくとも１つ含のポリカルボン酸を濃度約０．５〜
    ０．９Ｍで含有する緩衝溶液の存在下において前期接触
    を行うことを含む改良された抗体精製方法。
  2. （２）前記免疫グロブリンを含む媒質と混合される前記
    緩衝溶液が、ｐＨ値約ｐＨ８〜９である請求項１記載の
    方法。
  3. （３）前記少なくとも１つのポリカルボン酸が、０．６
    〜０．８Ｍの濃度で前記緩衝溶液中に存在する請求項１
    記載の方法。
  4. （４）前記免疫グロブリン結合性吸着剤が、固定化プロ
    テインＡまたは固定化プロテインＧである請求項１記載
    の方法。
  5. （５）前記接触が、前記免疫グロブリン結合性吸着剤の
    充填されたカラム中で完了する請求項１記載の方法。
  6. （６）前記緩衝溶液が、リン酸塩緩衝液、グリシン緩衝
    液、ホウ酸塩緩衝液、およびトリス緩衝液の中から選ば
    れたものである請求項１記載の方法。
  7. （７）前記緩衝溶液における緩衝剤濃度が約０．０１〜
    ０．２５Ｍの範囲である請求項１記載の方法。
  8. （８）前記緩衝溶液の緩衝剤濃度が約０．０５〜０．１
    Ｍの範囲である請求項１記載の方法。
  9. （９）前記免疫グロブリン結合性吸着剤が、架橋アガロ
    ースに化学結合したプロテインＡまたはプロテインＧで
    ある請求項１記載の方法。
  10. （１０）前記免疫グロブリン結合性プロテイン吸着剤が
    、２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４
    −スルホネート活性化水酸基を含む高分子担体に化学結
    合したプロテインＡまたはプロテインＧである請求項１
    記載の方法。
  11. （１１）前記免疫グロブリンを含む媒質が、哺乳類の正
    常血清、哺乳類の免疫血清、哺乳類の血しょう、哺乳類
    の腹水、組織培養液、およびハイブリドーマ由来物質の
    中から選ばれたものである請求項１記載の方法。
  12. （１２）免疫グロブリンを含む媒質を、ｐＨ値約ｐＨ６
    〜１０の範囲でかつ少なくとも１つのポリカルボン酸を
    濃度約０．５〜０．９Ｍで含有する緩衝溶液と混合する
    ことと、こうして得られた混合物を免疫グロブリン結合
    性吸着剤と接触させ、該混合物中に存在する免疫グロブ
    リンを該吸着剤に吸着させることとを具備した免疫グロ
    ブリンの精製方法。
  13. （１３）前記免疫グロブリンを含む媒質１容量部を、前
    記緩衝液約０．５〜５容量部と混合する請求項１２記載
    の方法。
  14. （１４）前記免疫グロブリンを含む媒質１容量部を、前
    記緩衝液約２〜４容量部と混合する請求項１２記載の方
    法。
  15. （１５）前記免疫グロブリンが吸着された前記免疫グロ
    ブリン結合性吸着剤を、前記の緩衝溶液を用いてさらに
    洗浄することを含む請求項１２記載の方法。
  16. （１６）前記免疫グロブリンが吸着された前記免疫グロ
    ブリン結合性吸着剤を、ｐＨ値が約ｐＨ２〜５．５の緩
    衝溶液に接触させ、該吸着剤から吸着された免疫グロブ
    リンを除去することを含む請求項１２記載の方法。
  17. （１７）ｐＨ値が約ｐＨ２〜５．５である前記緩衝溶液
    が、酢酸−酢酸塩緩衝液である請求項１６記載の方法。
  18. （１８）ｐＨ値が約ｐＨ２〜５．５である前記緩衝溶液
    の濃度が、約０．０１〜０．２５Ｍの範囲である請求項
    １６記載の方法。
  19. （１９）ｐＨ値が約ｐＨ６〜１０である緩衝溶液が、濃
    度約０．５〜０．９Ｍのマレイン酸、フマル酸、コハク
    酸、グルタル酸、ケトグルタル酸、リンゴ酸、酒石酸、
    アスパラギン酸、グルタミン酸、クエン酸、イソクエン
    酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−
    テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ｏ，ｏ
    ′−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ−テ
    トラ酢酸（ＥＧＴＡ）、およびそれらの塩の中から選ば
    れた少なくとも１つを含む請求項１２記載の方法。
  20. （２０）免疫グロブリン結合性吸着剤から除去された免
    疫グロブリンが実質的に純粋な形で回収される請求項１
    ２記載の方法。
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