JPH0459879B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0459879B2 JPH0459879B2 JP58222943A JP22294383A JPH0459879B2 JP H0459879 B2 JPH0459879 B2 JP H0459879B2 JP 58222943 A JP58222943 A JP 58222943A JP 22294383 A JP22294383 A JP 22294383A JP H0459879 B2 JPH0459879 B2 JP H0459879B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- red blood
- mouse
- cell fusion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、単クローン性抗G3m（21）抗体に関
する。 ヒトIgGのＨ鎖のアロタイプであるGm型抗原
についての研究は近年とみに盛んになつており、
GrubbによるG1m（１）の発見から現在までに20
種類以上のGm型抗原が見出されている。この
Gm型は、血液の遺伝標識のうち、個人識別、親
子鑑定、集団遺伝学においても最も有用なもので
あり、最近では、疾患とGmの関係が注目されて
いる。しかしながら、血球凝集阻止反応に頼る
Gm型判定は、ヒト由来の特異抗Gm血清や、各
種Gm抗原を担つたIgGである血球感作用抗Ｄ抗
体の入手が非常に困難であるため、実務に広く利
用されていない。最近、Gm型判定ルーテイーン
化の為、ヒト由来の抗血清に代わるウサギ抗Gm
抗血清の作製が試みられたが、抗血清の作製に多
大の時間と費用を要し、また、抗原となる種々の
Gm型のヒト血清の収集が困難であるため、抗血
清の再生産能力に限界があり、また、抗血清の抗
体価が低く、特異性にも問題が残る為、実用化に
は到つていない。そこで、本発明者らは、特異的
で、かつ抗体価が高く、しかも再生産が容易な抗
Gm抗体を得るべく、ハイブリドーマによつて生
産される単クローン性抗Gm抗体の作製について
鋭意研究を重ねた結果、単クローン性抗G3m
（21）抗体を創製するに到つた。本発明で得られ
た抗体の特異性と抗体価を調べた結果を表１に示
す。
する。 ヒトIgGのＨ鎖のアロタイプであるGm型抗原
についての研究は近年とみに盛んになつており、
GrubbによるG1m（１）の発見から現在までに20
種類以上のGm型抗原が見出されている。この
Gm型は、血液の遺伝標識のうち、個人識別、親
子鑑定、集団遺伝学においても最も有用なもので
あり、最近では、疾患とGmの関係が注目されて
いる。しかしながら、血球凝集阻止反応に頼る
Gm型判定は、ヒト由来の特異抗Gm血清や、各
種Gm抗原を担つたIgGである血球感作用抗Ｄ抗
体の入手が非常に困難であるため、実務に広く利
用されていない。最近、Gm型判定ルーテイーン
化の為、ヒト由来の抗血清に代わるウサギ抗Gm
抗血清の作製が試みられたが、抗血清の作製に多
大の時間と費用を要し、また、抗原となる種々の
Gm型のヒト血清の収集が困難であるため、抗血
清の再生産能力に限界があり、また、抗血清の抗
体価が低く、特異性にも問題が残る為、実用化に
は到つていない。そこで、本発明者らは、特異的
で、かつ抗体価が高く、しかも再生産が容易な抗
Gm抗体を得るべく、ハイブリドーマによつて生
産される単クローン性抗Gm抗体の作製について
鋭意研究を重ねた結果、単クローン性抗G3m
（21）抗体を創製するに到つた。本発明で得られ
た抗体の特異性と抗体価を調べた結果を表１に示
す。
【表】
本発明の抗体は、G3m（21）を欠くGm標準血
清存在下では、G3m（21）をもつ抗Ｄ抗体で感作
された赤血球を強く凝集し、その抗体価は、抗体
を含むマウス腹水の希釈倍数で表わした場合、
１：16，384という大きな値を示した。また、
G3m（21）を含む標準血清存在下では、本発明の
抗体と、G3m（21）をもつ抗Ｄ抗体で感作された
赤血球との凝集は完全に阻止された。この結果
は、本抗体がG3m（21）に特異的に反応し、G1m
（１）、G1m（２）、G1m（３）、G3m（５）、G3m
（13）、G3m（15）、G3m（16）とは反応しないこと
を証明した。 本発明の抗体、即ち［−］単クローン性抗
G3m（21）抗体を産生するハイブリドーマの作製
方法は通常、下記の５工程よりなる。 １ 抗原の調製 ２ 免疫 ３ 細胞融合 ４ 抗体生産ハイブリドーマの選択 ５ 単クローン化 本発明の抗体を生産するハイブリドーマの作製
に用いる免疫抗原は、G3m（21）をもつ正常ヒト
血清から得たIgG3を使用する。IgG3は生理食塩
水或いは緩衝液などに溶解し、マウス又はラツト
１匹あたり１回に1μｇから300μｇを投与するの
が好ましい。免疫は数回に分けて行うが、初回免
疫はアジユバントと共に行うことが一般的であ
る。アジユバンドとしてはフロイントアジユバン
ト、水酸化アルミなどが使用される。免疫は１〜
３週間の間隔で行い、初回以外はアジユバンドを
使用せず、緩衝液、生理食塩水などに溶解し、腹
腔内或いは静脈内に投与するのが普通である。 免疫動物としては、細胞融合に使用する腫瘍細
胞株によつて決められるが、一般にはラツト、マ
ウスが多く用いらる。マウスの中でも免疫グロブ
リンを産生しない腫瘍細胞株の確立されている
BALB／ｃがよく用いられる。 最終免疫後２〜４日後に、リンパ節或いは、脾
臓を摘出し、得られるリンパ球を細胞融合に供す
る。 一方、細胞融合に使用される腫瘍細胞株として
は、免疫グロブリンを生産しないP3−X63−8AZ
−U1やP3−NS−１などが使用される。細胞融合
時にはリンパ球を腫瘍細胞の５〜20倍量多く用い
る。 細胞融合には、HVJ（センダイウイルス）或い
は、ポリエチレングリコール（PEG）を用いて
行うが、一般には取扱いの便利なPEGの平均分
子量１，000〜８，000の40〜60％溶液を使用す
る。融合を促進する為に、コルヒチン、ジメチル
スルホキシド、ポリ−Ｌ−アルギニン等を添加す
ることもあるが必須ではない。 フイーダー細胞としては、同系のラツト或いは
マウスの胸腺細胞、脾細胞等が用いられ、濃度と
しては0.5〜２×106／mlとなるように添加する。 抗体産生ハイブリドーマの選択は、細胞融合後
数週間後に血球凝集阻止反応などにより、培養液
中の光体生スクリーニングを行い、これを選択す
る。ハイブリドーマを得たならば次にクローニン
グを行うが、クローニングの方法としては、
FACS（Fluorescent Activated Cell Sorter）を
用いたり、Soft Agarを用いてコロニーを拾い上
げる方法、一般によく用いられる限界希釈法など
がある。どの方法を用いてもクローニングは２回
以上繰返し、完全に単一クローンとする。 このような工程を経て得られたハイブリツドー
マを用いて、単クローン性抗G3m（21）抗体を作
製する方法としては、in vitro法、in vivo法の
いずれでもよいが、in vivo法の方が抗体価がは
るかに高いので望ましい。 次に実施例により本発明の単クローン性抗体の
作製方法について詳細に述べる。 実施例 [1] 単クローン性抗G3m（21）抗体を生産するハ
イブリドーマの作製方法 １ 抗原の調製 Gm（１，21）型の正常ヒト血清から、35
％飽和硫安で粗グロブリンを沈澱させ、それ
をDEAEセルロースカラムクロマトグラフイ
ーで精製し、IgGを得た。さらに、それをプ
ロテインＡのカラムクロマトグラフイーで精
製し、IgG3を得て、これを抗原とした。 ２ 免疫 抗原100μｇにフロイント・コンプリー
ト・アジユバントを添加して、BALB／ｃ
マウスの腹腔内に注射した。その後、10日間
隔でリン酸緩衝液に溶解した抗原100μｇを
腹腔内に２回注射した。 ３ 細胞融合 最終免疫より４日後、免疫マウスの脾臓を
摘出し、単一細胞の浮遊液とした。この１×
108個の脾細胞と１×107個の８−アザグアニ
ン耐性骨髄腫細胞NS−１とを50％ポリエチ
レングリコール（平均分子量６，000）を用
いて融合させた。融合させた細胞に、フイー
ダー細胞として同系マウスの胸腺細胞を加え
て、牛胎児血清を15％含むRPM1640倍地に
浮遊させ、24穴組織培養プレートに文注し
た。24時間後、培養液上清の半分をHAT倍
地（ヒポキサンチン１×10-4M、アミノプリ
テン４×10-7M、チミジン1.6×10-5M）に
交換した。細胞融合後、12日目まで、２〜３
日間隔で同様に培養液交換を行つた。その
後、３〜５日間隔で３回、HT倍地（HAT
倍地かアミノプリテンを除いたもの）で培養
液交換を行つた。 ４ 抗体産生ハイブリドーマの選択 細胞融合後３週間目に血球凝集阻止反応に
より、培養液中の抗体生産スクリーニングを
行つた。まず、マイクロフロキユレーシヨン
スライドの穴に、各々の培養液上清を１滴
と、Gm標準血清１滴を加えて混合した後、
さらに、G3m（21）をもつ抗Ｄ抗体で感作し
た赤血球の0.2％浮遊液を１滴加えた。スラ
イドを振り混ぜながら、室温下で、30分〜２
時間反応させた後、赤血球凝集の有無を観察
した。全培養液上清のうち、唯１つのもの
が、G3m（21）を含まないGm標準血清存在
下で感作赤血球を凝集させ、かつ、G3m
（21）を含む標準血清存在下で用いた場合は、
感作赤血球の凝集が阻止された。従つて、こ
の培養液上清中には、抗G3m（21）抗体が含
まれていることが確認された。そこで、この
抗体を生産したハイブリドーマを選択した。 ５ 単クローン化 選択されたハイブリドーマを、限界希釈法
によりクローン化し、96穴組織培養プレート
に分注し、牛胎児血清を15％含むRPMI1640
培地で培養した。クローン化は２度行つた。 [2] 単クローン性抗体の作製 (a) in vitro法 ［１］で得られたハイブリドーマクローンを
牛胎児血清を15％含むRPMI1640培地で培養
し、その培養液上清を得た。 (b) in vivo法 BALB／ｃマウスに予め（移植の７〜14日
前）、プリスタン（２，６，10，14−テトラメ
チルペンタデカン）を注射した。次に［１］で
得られたハイブリドーマクローンをマウス１匹
当たり、約１×107個、腹腔内に注射すること
により移植した。移植後、７〜14日目に、腹水
を採取した。 [3] 単クローン性抗体の特異性の確認とマウス
腹水中の抗体価の測定 単クローン性抗体を含むマウス腹水を段階希釈
し、マイクロキユレーシヨンスライドの穴にその
１滴と、Gm標準血清１滴を加えて混合し、さら
にG3m（21）をもつ抗Ｄ抗体で感作した赤血球の
0.2％浮遊液を１滴加えた。スライドを振り混ぜ
ながら、30〜２時間反応させた後、赤血球の凝集
の有無を観察した。その結果は表１に示すとおり
である。即ち、G3m（21）を含まないGm標準血
清存在下で、希釈倍数１：16384まで感作赤血球
を凝集させ、かつG3m（21）を含むGm標準血清
存在下では、感作赤血球の凝集が完全に阻止され
た。従つて、この単クローン性抗体はG3m（21）
に特異的に反応し、G1m（１）、G1m（２）、G1m
（３）、G3m（５）、G3m（13）、G3m（15）、G3m
（16）とは反応しないことが証明された。また、
マウス腹水の抗体価は、１：16384であつた。
清存在下では、G3m（21）をもつ抗Ｄ抗体で感作
された赤血球を強く凝集し、その抗体価は、抗体
を含むマウス腹水の希釈倍数で表わした場合、
１：16，384という大きな値を示した。また、
G3m（21）を含む標準血清存在下では、本発明の
抗体と、G3m（21）をもつ抗Ｄ抗体で感作された
赤血球との凝集は完全に阻止された。この結果
は、本抗体がG3m（21）に特異的に反応し、G1m
（１）、G1m（２）、G1m（３）、G3m（５）、G3m
（13）、G3m（15）、G3m（16）とは反応しないこと
を証明した。 本発明の抗体、即ち［−］単クローン性抗
G3m（21）抗体を産生するハイブリドーマの作製
方法は通常、下記の５工程よりなる。 １ 抗原の調製 ２ 免疫 ３ 細胞融合 ４ 抗体生産ハイブリドーマの選択 ５ 単クローン化 本発明の抗体を生産するハイブリドーマの作製
に用いる免疫抗原は、G3m（21）をもつ正常ヒト
血清から得たIgG3を使用する。IgG3は生理食塩
水或いは緩衝液などに溶解し、マウス又はラツト
１匹あたり１回に1μｇから300μｇを投与するの
が好ましい。免疫は数回に分けて行うが、初回免
疫はアジユバントと共に行うことが一般的であ
る。アジユバンドとしてはフロイントアジユバン
ト、水酸化アルミなどが使用される。免疫は１〜
３週間の間隔で行い、初回以外はアジユバンドを
使用せず、緩衝液、生理食塩水などに溶解し、腹
腔内或いは静脈内に投与するのが普通である。 免疫動物としては、細胞融合に使用する腫瘍細
胞株によつて決められるが、一般にはラツト、マ
ウスが多く用いらる。マウスの中でも免疫グロブ
リンを産生しない腫瘍細胞株の確立されている
BALB／ｃがよく用いられる。 最終免疫後２〜４日後に、リンパ節或いは、脾
臓を摘出し、得られるリンパ球を細胞融合に供す
る。 一方、細胞融合に使用される腫瘍細胞株として
は、免疫グロブリンを生産しないP3−X63−8AZ
−U1やP3−NS−１などが使用される。細胞融合
時にはリンパ球を腫瘍細胞の５〜20倍量多く用い
る。 細胞融合には、HVJ（センダイウイルス）或い
は、ポリエチレングリコール（PEG）を用いて
行うが、一般には取扱いの便利なPEGの平均分
子量１，000〜８，000の40〜60％溶液を使用す
る。融合を促進する為に、コルヒチン、ジメチル
スルホキシド、ポリ−Ｌ−アルギニン等を添加す
ることもあるが必須ではない。 フイーダー細胞としては、同系のラツト或いは
マウスの胸腺細胞、脾細胞等が用いられ、濃度と
しては0.5〜２×106／mlとなるように添加する。 抗体産生ハイブリドーマの選択は、細胞融合後
数週間後に血球凝集阻止反応などにより、培養液
中の光体生スクリーニングを行い、これを選択す
る。ハイブリドーマを得たならば次にクローニン
グを行うが、クローニングの方法としては、
FACS（Fluorescent Activated Cell Sorter）を
用いたり、Soft Agarを用いてコロニーを拾い上
げる方法、一般によく用いられる限界希釈法など
がある。どの方法を用いてもクローニングは２回
以上繰返し、完全に単一クローンとする。 このような工程を経て得られたハイブリツドー
マを用いて、単クローン性抗G3m（21）抗体を作
製する方法としては、in vitro法、in vivo法の
いずれでもよいが、in vivo法の方が抗体価がは
るかに高いので望ましい。 次に実施例により本発明の単クローン性抗体の
作製方法について詳細に述べる。 実施例 [1] 単クローン性抗G3m（21）抗体を生産するハ
イブリドーマの作製方法 １ 抗原の調製 Gm（１，21）型の正常ヒト血清から、35
％飽和硫安で粗グロブリンを沈澱させ、それ
をDEAEセルロースカラムクロマトグラフイ
ーで精製し、IgGを得た。さらに、それをプ
ロテインＡのカラムクロマトグラフイーで精
製し、IgG3を得て、これを抗原とした。 ２ 免疫 抗原100μｇにフロイント・コンプリー
ト・アジユバントを添加して、BALB／ｃ
マウスの腹腔内に注射した。その後、10日間
隔でリン酸緩衝液に溶解した抗原100μｇを
腹腔内に２回注射した。 ３ 細胞融合 最終免疫より４日後、免疫マウスの脾臓を
摘出し、単一細胞の浮遊液とした。この１×
108個の脾細胞と１×107個の８−アザグアニ
ン耐性骨髄腫細胞NS−１とを50％ポリエチ
レングリコール（平均分子量６，000）を用
いて融合させた。融合させた細胞に、フイー
ダー細胞として同系マウスの胸腺細胞を加え
て、牛胎児血清を15％含むRPM1640倍地に
浮遊させ、24穴組織培養プレートに文注し
た。24時間後、培養液上清の半分をHAT倍
地（ヒポキサンチン１×10-4M、アミノプリ
テン４×10-7M、チミジン1.6×10-5M）に
交換した。細胞融合後、12日目まで、２〜３
日間隔で同様に培養液交換を行つた。その
後、３〜５日間隔で３回、HT倍地（HAT
倍地かアミノプリテンを除いたもの）で培養
液交換を行つた。 ４ 抗体産生ハイブリドーマの選択 細胞融合後３週間目に血球凝集阻止反応に
より、培養液中の抗体生産スクリーニングを
行つた。まず、マイクロフロキユレーシヨン
スライドの穴に、各々の培養液上清を１滴
と、Gm標準血清１滴を加えて混合した後、
さらに、G3m（21）をもつ抗Ｄ抗体で感作し
た赤血球の0.2％浮遊液を１滴加えた。スラ
イドを振り混ぜながら、室温下で、30分〜２
時間反応させた後、赤血球凝集の有無を観察
した。全培養液上清のうち、唯１つのもの
が、G3m（21）を含まないGm標準血清存在
下で感作赤血球を凝集させ、かつ、G3m
（21）を含む標準血清存在下で用いた場合は、
感作赤血球の凝集が阻止された。従つて、こ
の培養液上清中には、抗G3m（21）抗体が含
まれていることが確認された。そこで、この
抗体を生産したハイブリドーマを選択した。 ５ 単クローン化 選択されたハイブリドーマを、限界希釈法
によりクローン化し、96穴組織培養プレート
に分注し、牛胎児血清を15％含むRPMI1640
培地で培養した。クローン化は２度行つた。 [2] 単クローン性抗体の作製 (a) in vitro法 ［１］で得られたハイブリドーマクローンを
牛胎児血清を15％含むRPMI1640培地で培養
し、その培養液上清を得た。 (b) in vivo法 BALB／ｃマウスに予め（移植の７〜14日
前）、プリスタン（２，６，10，14−テトラメ
チルペンタデカン）を注射した。次に［１］で
得られたハイブリドーマクローンをマウス１匹
当たり、約１×107個、腹腔内に注射すること
により移植した。移植後、７〜14日目に、腹水
を採取した。 [3] 単クローン性抗体の特異性の確認とマウス
腹水中の抗体価の測定 単クローン性抗体を含むマウス腹水を段階希釈
し、マイクロキユレーシヨンスライドの穴にその
１滴と、Gm標準血清１滴を加えて混合し、さら
にG3m（21）をもつ抗Ｄ抗体で感作した赤血球の
0.2％浮遊液を１滴加えた。スライドを振り混ぜ
ながら、30〜２時間反応させた後、赤血球の凝集
の有無を観察した。その結果は表１に示すとおり
である。即ち、G3m（21）を含まないGm標準血
清存在下で、希釈倍数１：16384まで感作赤血球
を凝集させ、かつG3m（21）を含むGm標準血清
存在下では、感作赤血球の凝集が完全に阻止され
た。従つて、この単クローン性抗体はG3m（21）
に特異的に反応し、G1m（１）、G1m（２）、G1m
（３）、G3m（５）、G3m（13）、G3m（15）、G3m
（16）とは反応しないことが証明された。また、
マウス腹水の抗体価は、１：16384であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ G3m（21）型のヒトIgG3で予め免疫されたマ
ウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞ラインから
の細胞との融合によつて形成されたハイブリドー
マによつて産生され、次の特徴を持つ単クローン
性抗体。 G3m（21）と特異的に反応し、G1m（１）、G1m
（２）、G1m（３）、G3m（５）、G3m（13）、G3m
（15）、G3m（16）とは反応しない。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58222943A JPS60115530A (ja) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | 単クローン性抗Ｇ３ｍ（２１）抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58222943A JPS60115530A (ja) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | 単クローン性抗Ｇ３ｍ（２１）抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60115530A JPS60115530A (ja) | 1985-06-22 |
| JPH0459879B2 true JPH0459879B2 (ja) | 1992-09-24 |
Family
ID=16790296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58222943A Granted JPS60115530A (ja) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | 単クローン性抗Ｇ３ｍ（２１）抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60115530A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60228421A (ja) * | 1984-04-27 | 1985-11-13 | Shionogi & Co Ltd | モノクロ−ナル抗ヒトＩｇＧ抗体およびその製造法 |
-
1983
- 1983-11-25 JP JP58222943A patent/JPS60115530A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60115530A (ja) | 1985-06-22 |
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