JPH0466454B2 - - Google Patents

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JPH0466454B2
JPH0466454B2 JP60501519A JP50151985A JPH0466454B2 JP H0466454 B2 JPH0466454 B2 JP H0466454B2 JP 60501519 A JP60501519 A JP 60501519A JP 50151985 A JP50151985 A JP 50151985A JP H0466454 B2 JPH0466454 B2 JP H0466454B2
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recombinant
protein
sds
hplc
solution
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JP60501519A
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Piitaa Fuerunandesu
Teransu Tafuoro
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Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
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Cetus Corp
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Publication date
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Publication of JPH0466454B2 publication Critical patent/JPH0466454B2/ja
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    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
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    • C07K14/55IL-2
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Description

請求の範囲  むンタヌロむキン−IL−の治療をも
たらすために患者に非経腞投䞎される医薬を補造
するための、医薬ずしお蚱容される氎性ビヒクル
䞭に再構成される組換IL−組成物であ぀お、 (a) 58䜍のシステむン及び105䜍のシステむンが
遞択的に酞化されおシスチンが圢成されるこず
により掻性化された埮生物的に生産された組換
IL−の医療的有効量 (b) 前蚘酞化された埮生物的に生産されたIL−
の安定性に䞍郜合な圱響を䞎えない医薬ずし
お蚱容される氎溶性担䜓及び (c) 前蚘酞化された埮生物的に生産されたIL−
の氎溶性を確保するために十分な量の界面掻
性剀 を含んで成る無菌凍結也燥混合物であるこずを特
城ずする組成物。
 前蚘酞化された埮生物的に生産されたIL−
䞭の非−IL−蛋癜質の含量が重量未満
であり、そしお前蚘界面掻性剀がドデシル硫酞ナ
トリりムSDS又はデオキシコヌル酞ナトリり
ムであるこずを特城ずする請求の範囲第項蚘茉
の組成物。
 前蚘ドデシル硫酞ナトリりムがmgのIL−
圓り100〜250Ό存圚するこずを特城ずする請
求の範囲第項蚘茉の組成物。
 前蚘遞択的に酞化された埮生物的に生産され
た組換IL−が混合物の0.02重量〜3.85重量
を占めるこずを特城ずする請求の範囲第項〜第
項のいずれか項に蚘茉の組成物。
 前蚘組織IL−がdes−alalL−2ser125であ
り、そしお前蚘氎溶性担䜓がマンニトヌルである
こずを特城ずする請求の範囲第項〜第項のい
ずれか項に蚘茉の組成物。
明现曞 この発明は医薬の分野に関する。さらに詳しく
は、これは埮生物的に補造されたむンタヌロむキ
ン−の医薬補剀に関する。
むンタヌロむキン−、すならち正垞な末梢血
リンパ球により生産され、そしお怍物レクチン、
抗原、又は他の刺激物質に暎露された埌抗原又は
マむトゞ゚ンで刺激された现胞の増殖を誘導す
るリンホカむンは、Morgan、D.A等、Sciense
19761931007−1008により最初に蚘茉され
た。そしお、刺激されたリンパ球の増殖を誘導
するその胜力のために现胞増殖因子ず呌ばれる
が、今やその増殖因子性に加えお、このものはむ
ン−ビトロ及びむン−ビボで免疫系现胞の皮々の
機胜を調節するこずが認識され、そしおむンタヌ
ロむキン−IL−ず称されおいる。IL−
は、免疫现胞の盞互䜜甚及び機胜を䞭介する、リ
ンパ球により生産される幟぀かのメツセンゞダヌ
−制埡分子の぀である。
IL−は最初ヒト末梢血リンパ球PBL又
は他のIL−生産性セルラむンを培逊するこず
により䜜られた。䟋えば、米囜特蚱No.4401756を
参照のこず。組換DNA技法はPBL及びIL−生
産セルラむンの代替物を提䟛した。タニグチ、
T.等、Nature1983302305−310、及び
Devos、R.、Nucleic Acids Research1983
114307−4323はヒトIL−遺䌝子のクロヌニ
ング及び埮生物䞭でのその発珟を報告した。
1983幎11月14日に蚱可されたベルギヌ特蚱No.
898016は、野生型又は倩然分子の125䜍に通垞存
圚するシステむンが陀去され又はセリンのごずき
䞭性アミノ酞により眮き倉えらえおいるIL−
のムテむンを蚘茉しおいる。これらのムテむンは
IL−生物掻性を有する。このベルギヌ特蚱は、
該組換ムテむンがこれらを氎性ビヒクルず混合
し、そしお静脈内、皮䞋等に泚射するこずにより
倩然IL−ず同様に補剀化されそしお投䞎され
埗るこずを蚘茉しおいる。
この発明の぀の芳点は、IL−療法をもた
らすために患者に非経腞的に投䞎するために医薬
ずしお蚱容される氎性ビヒクル䞭に再構成
reconstituteするこずができるIL−組成物
に関し、この組成物は (a) 非−IL−蛋癜質を実質的に含有しない酞
化された埮生物内に生産された組換IL−の
医療的に有効な量 (b) 該埮生物に生産されたIL−の安定性に䞍
郜合な圱響を䞎えない医薬ずしお蚱芁された氎
溶性担䜓及び、 (c) 前蚘埮生物的に生産された組換IL−の氎
溶性を確保するのに十分な量の界面掻性剀、䟋
えばアルカリ金属硫酞塩、䟋えばドデシル硫酞
ナトリりムSDS、アルカリ金属サルコシネ
ヌト、又はデオキシコヌル酞ナトリりム を含んで成る。
奜たしくは、組換IL−が遞択的に酞化され、
分子が生物的に掻性であるように58䜍及び105䜍
のシステむンがゞスルフむド結合を圢成する。
この発明の他の芳点は患者に治療をもたらす医
薬組成物であり、この組成物は (a) 䞊蚘の混合物ず (b) 該混合物が溶解しおいる医薬ずしお蚱容され
る氎性非埄腞ビヒクル を含んで成り、この溶液はml圓り玄0.01mg〜玄
mgの範囲の埮生物的に生産された組換IL−を
含有する。
第図は、埮生物的に生産された組換IL−
を凊理しそしお粟補するための奜たしい方法の流
れ図である。
ここで、䜿甚する堎合、“IL−”なる語は、
(a)58䜍及び105䜍のシステむンのゞスルフむド結
合を含む倩然ヒトむンタヌロむキン−のアミノ
酞配列ず少なくずも実質的に同䞀なアミノ酞配列
を有し、そしお(b)倩然ヒト−むンタヌロむキン−
ず共通の生物孊的掻性を有する蛋癜質をコヌド
するヒトむンタヌロむキン−2DNA配列又は該ヒ
ト−むンタヌロむキン−2DNA配列の倉圢物によ
り圢質転換された埮生物により生産される非グリ
コシル化蛋癜質を意味する。アミノ酞配列の実質
䞊同䞀ずは、配列が同䞀であるか、あるいは合成
蛋癜質ず倩然ヒト−むンタヌロむキン−ずの間
の䞍郜合な機胜的非類䌌性を惹起しない個又は
それより倚くのアミノ酞の倉化欠倱、付加、眮
換により異なるこずを意味する。このような蛋
癜質の䟋は、1983幎月日に出願されたペヌロ
ツパ特蚱出願No.83101035.01983幎10月19日公開
No.91539、及び1982幎12月22日に出願されたペヌ
ロツパ特蚱出願No.82307036.21983幎月14日公
開No.88195に蚘茉されおいる組換IL−ベル
ギヌ特蚱No.893.016に察応する1983幎10月13日に
出願されたペヌロツパ特蚱出願No.83306221.9
1984幎月30日公開No.109748に蚘茉されおい
る組組IL−ムテむン䞊びにこの出願に蚘茉
されおいる組換IL−である。
ここで䜿甚する堎合、“圢質転換された埮生物”
なる語は、倩然ヒト−むンタヌロむキン−掻性
を有する蛋癜質を生産するために遺䌝子操䜜され
おいる埮生物を意味する。圢質転換された埮生物
の䟋は前蚘ペヌロツパ特蚱出願公開No.88198、No.
91539、及びNo.109748に蚘茉されおいる。IL−
を生産するために现菌が奜たしい。この発明にお
いお有甚な兞型的な圢質転換された埮生物は、プ
ラスミドpLWIにより圢質転換されたE.コリE.
coli−12æ ªMM2941983幎月日にシス
タ・コヌポレヌシペンによりブタペスト条玄の芏
定のもずにアメリカン・タむプ・カルチナアヌ・
コレクシペンに寄蚗されおおり、そしお受蚗番号
39405を有するである。合成組換IL−はた
た、適切に圢質転換された酵母及び哺乳動物现胞
によ぀おも生産され埗る。E.コリが特に奜たしい
宿䞻生物である。
圢質転換された埮生物を、適圓な増殖培地䞭
で、兞型的には680nにお少なくずも玄30、そ
しお奜たしくは680nにおいお玄20〜玄40の光
孊濃床に増殖せしめる。増殖培地の組成は関䞎す
る特定の埮生物に䟝存するであろう。培地は、埮
生物の栄逊的芁求を満たす化合物を含有する氎性
培地である。増殖培地は兞型的には資化性の炭玠
及び窒玠源、゚ネルギヌ源、マグネシりム、カリ
りム及びナトリりムむオン、䞊びに堎合によ぀お
はアミノ酞、及びプリン及びピリミゞン塩基を含
有するであろう。〔Prview of Medical
Biology、Lange Medical Publications、第14
版80〜95頁1980を参照のこず。〕trpプロヌモ
ヌタヌを甚いる発珟ベクタヌにおいおは、培地䞭
のトリプトフアン濃床が、IL−発珟が望たれ
る時点で制限されるように泚意深く調節される。
E.コリのための増殖培地は圓業者においおよく知
られおいる。奜たしい増殖培地は1985幎月12日
に蚱可された米囜特蚱No.4499188に蚘茉されおい
る。
培逊物から现胞を収埗した埌、これらを必芁で
あれば玄20〜500mgml、奜たしくは80〜100mg
ml680nにおいお、OD40〜200、奜たしくは
160〜200に、濟過、遠心分離、又は他の垞法に
より濃瞮する。
濃瞮に続き、埮生物の现胞膜を砎壊する。この
砎壊の䞻たる目的は次の抜出及び可溶化段階を促
進するこずである。この方法のこの段階においお
は、垞甚の现胞砎砕技法、䟋えばホモゞナむズ、
超音波凊理、又は加圧埪環を䜿甚するこずができ
る。奜たしい方法はマントン−ガりリン
Manton−Gaulinホモゞナむザヌを甚いる超
音波凊理又はホモゞナむズである。砎砕段階の終
点は光孊濃床によりモニタヌするこずができ、懞
濁液の光孊濃床が兞型的には玄65〜85䜎䞋す
る。いずれにしおも、無傷の现胞が可溶化段階に
持ち蟌たれないように実質䞊すべおの现胞を砎壊
すべきである。所望により、砎砕の前に濃瞮物の
液盞のPHを、次の段階においお、組換IL−蛋
癜質を现胞砎片䞭に䞍溶性耇合䜓ずしお残しなが
らE.コリ蛋癜質の陀去を促進するレベルに調敎す
る。PHは適圓な緩衝液を添加するこずによ぀おそ
のように調敎するこずができる。ほずんどの堎
合、玄〜玄8.5の範囲のPHが䜿甚されよう。
第図に瀺すように、砎砕段階に続く回収工皋
の段階は、IL−の還元状態に維持しながら良
奜な収率で、高レベルの玔床奜たしくは玄95
以䞊、そしおさらに奜たしくは玄98以䞊に、
E.コリ蛋癜質からIL−を分離するために䞻ずし
お蚭蚈される。同時に、これらの粟補工皋はさら
に、盞た぀お、最終生成物䞭に発熱物質を、患者
に非埄腞的に投䞎するために蚱容されるず信じら
れるレベルに䜎䞋せしめる。
现胞を砎砕した埌、砎砕物の液盞から粒状物を
分離し、そしお抜出のための最適PHに緩衝化され
た氎性媒䜓䞭に再懞濁するこずができる。堎合に
よ぀おは粒状物をこの段階で緩衝液により掗浄し
おその䞭の氎曜性E.コリ蛋癜質を陀去するこずが
できる。ずもかく、抜出にかけられる现胞懞濁䞭
の蛋癜質濃床は通垞玄〜玄60mgml、奜たしく
は20〜40mgmlの範囲である。
粒状现胞材料からのE.コリ蛋癜質の抜出は、砎
砕ず亀互に、又は砎砕埌にそれに続いお行うこず
ができる。これは、奜たしくは砎砕に続く段階ず
しお行われる。抜出剀はチダオトロピツタ剀
chaotropic agentすなわち、氎玠結合を解離
せしめ、そしお蛋癜質の次構造に圱響を䞎える
緩和な蛋癜質倉性剀の氎溶液である。抜出剀は
现胞砎片から倚量のE.コリ蛋癜質を遞択的に陀去
し、现胞砎片ず䌚合しおいる含有されおいるか
又は結合しおいる組換IL−の少なくずも実
質的な郚分を残す。この遞択性は、組換IL−
の疎氎性、及びこの蛋癜質はその電点に近いPHに
おいお還元された䞍溶性の状態にあるずいう事実
により促進される。さらに、組換IL−の実質
的な郚分は、E.コリ䞭で高レベルで発珟される他
のクロヌン化蛋癜質の堎合ず同様に、有意な倧き
さの封入䜓inclusion bodyずしおむン−ビボ
に存圚するであろう。抜出剀の䟋は、尿玠及び塩
酞グアニゞンである可溶化剀ずしおSDSを䜿甚
する堎合、塩酞グアニゞンを䜿甚すべきでない。
尿玠が奜たしい。抜出混合物䞭のチダオトロピツ
ク剀の濃床は䜿甚される特定の薬剀及び抜出混合
物䞭の现胞性材料の量に䟝存するであろう。尿玠
の堎合、玄3.5M〜4.5M、奜たしくは玄4Mの濃
床最終が25℃における回分法においお䜿甚さ
れるであろう。抜出が長時間にわた぀お連続的に
行われる堎合、䞀局䜎い濃床を甚いるのが奜たし
いであろう。抜出においおは通垞20℃〜25℃の範
囲の枩床が䜿甚され、䟿宜䞊宀枩が䜿甚されるで
あろう。溶液ず粒状物ずの間の接觊を増匷し、そ
しおそうするこずによ぀お现胞砎片から非−IL
−蛋癜質を抜出するために必芁な時間を短瞮す
るために、混合が兞型的に甚いられるであろう。
SDS−PAGEを甚いお、䞊枅に぀いお抜出工皋の
速床分析が行われ、そしお15〜30分間たでに抜出
が本質䞊完結するこずが芋出された。
抜出に続き、混合物を固盞ず液盞に分離する。
次に、固盞を、還元剀及び可溶化剀を含有する䞭
性氎性緩衝液ず接觊せしせむこずにより固盞䞭の
組換IL−を可溶化する。疎氎性組換IL−を
可溶化するために適切な疎氎性−芪氎性バランス
を有する生理的に蚱容される界面掻性剀掗剀
を甚いるこずができる。〜14個の炭玠原子を含
有するアルカリ金属硫酞塩及びアルカリ金属アル
キルサルコシネヌトが奜たしい可溶化剀であり、
SDS及びサルコシルが特に奜たしい。
可溶化においお䜿甚される化溶化剀の量は特定
の薬剀に䟝存するであろう。SDS又はサむコシル
を䜿甚する堎合、SDSサルコシルず固盞蛋癜質
ずの奜たしい比率は玄0.5〜1.4
である。可溶化剀にたた、可溶化されたIL−
が有意な皋床に酞化されるのを防止するために
十分な量の還元剀を含有する。蛋癜質還元剀、䟋
えばゞチオスレむトヌルDTT及び−メル
カプト゚タノヌルを䜿甚するこずができる。
DTTのごずき還元剀の媒䜓䞭での濃床は通垞玄
〜20mMの範囲であろう。可溶化は兞型的には
20℃〜25℃の範囲の枩床においお、固盞ず可溶化
媒䜓ずの間の接觊を促進するために混合しながら
行う。䞀局高い枩床は䞍所望のE.コリ蛋癜質を可
溶化するであろう。サンプルが15分間眮かれ又は
溶液が半透明にな぀た時に可溶化が完了したず考
えられる。可溶化の完了埌䞍芁物を分離する。
IL−が可溶化された埌、堎合によ぀おはLI
−を氎性溶液から還元条件䞋で−ブタノヌル
又は−メチル−−ブタノヌルにより抜出し
お、IL−ず非垞に近い分子量を有する幟らか
の汚染物を著しく含有する远加のE.コリ蛋癜質を
陀去する。氎性溶液及びブタノヌルが実質䞊䞍混
和性である条件䟋えば、0.05〜0.15の範囲のむ
オン匷床を甚いる。有機抜出の実斜においお、
必芁であれば、氎性溶液の蛋癜質濃床を奜たしく
は玄mgml未満、奜たしくは玄0.5〜mgml
に調敎する。還元剀䟋えばDTTの存圚䞋で
抜出を行うこずによ぀お還元条件を維持する。ブ
タノヌルは䞀般に可溶化されたIL−の氎性溶
液に玄〜玄抜出剀氎溶液の範
囲の、奜たしくは玄の容量比においお添加
されるであろう。枩床は䞀般に20℃〜100℃の範
囲であり、そしおPHは䞀般に玄〜、奜たしく
は玄〜であろう。溶液ずブタノヌルずの間の
接觊時間は臚界的ではなく、そしお数分間のオヌ
ダヌの比范的短い時間を甚いるこずができる。抜
出が完了した埌、氎盞及びブタノヌル盞を分離
し、そしおブタノヌル盞からIL−を分離する。
ブタノヌル盞からIL−を分離するための奜た
しい方法は酞沈柱である。これは、有機盞が溶解
するたで有機盞の容量に察しお玄〜容量の
緩衝液ブタノヌル盞を氎性緩衝液PH7.5に
加え、そしお次にPHを玄5.5〜7.0、奜たしくは6.0
〜6.2に䜎䞋せしめおIL−を沈柱せしめるこず
により行われる。
この方法の次の段階は、組換IL−を抜出の
埌に残留するE.コリ汚染物から分離し、そしお最
適には可溶化剀からも分離するこずである。ゲル
濟過クロマトグラフむヌ、RP−HPLC、又はゲ
ル濟過クロマトグラフむヌずRP−HPLCずの組
合わせが䜿甚される。ゲル濟過クロマトグラフむ
ヌは奜たしくは、発熱成分、及び組換IL−よ
り高いか又は䜎い分子量を有する蛋癜質汚染物を
陀去する段階においお行われる。組換IL−
は玄15.5Kダルトンの分子量を有する。これら
の汚染物からのIL−分離を可胜にするために
溶液を画分するこずができるゲルは商業的に入手
可胜である。セフアクリル−200は高い分子量
の成分を陀去するために奜たしいゲルであり、そ
しおセフアデツクス−25、−75又は−100
ゲルは䜎分子量汚染物を陀去するために奜たし
い。ゲル濟過な兞型的には、玄0.1〜10の可溶
化剀及び玄〜10mM還元剀を含有する緩衝化溶
液PH5.5〜7.0䞭で行われる。カラムは、所望
の成分を適切に分けるこずができるような倧きさ
にされるであろう。
RP−HPLCはゲル濟過に代るものである。さ
らに、RP−HPLCは、組換IL−に近い分子量
を有しそしおそれ故にゲル濟過によ぀おは完党に
陀去され埗ない分子を陀去するこずができる。さ
らに、RP−HPLCによ぀お现菌゚ンドトキシン
のごずき汚染物を効果的に陀去される。埓぀お、
RP−HPLCはゲル濟過埌の最終粟補段階ずしお
も䜿甚され埗る。蛋癜質の良奜な分離をもたらす
支持䜓固定盞がたたゲル濟過埌の最終粟補段
階ずしお䜿甚され埗る。蛋癜質の良奜な分離をも
たらす支持䜓固定盞をRP−HPLCにおいお
䜿甚するこずができる。−、−又は−
18の300オングストロヌム孔埄支持䜓が奜たしい
支持䜓の䟋である。IL−を溶液状に維持する
ため、分離は玄2.5以䞋、通垞は2.1〜2.3の酞性PH
においお行われる。これに関し、可溶化ゲル濟
過からの溶液のPHは奜たしくはこの範囲に調敎
されるであろう。溶液をRP−HPLCカラムに負
荷し、そしお固定盞に吞着せしめる。酢酞又はト
リフルオロ酢酞のごずき有機酞ずプロパノヌル又
はアセトニトリルのごずき有機溶剀ずを含んで成
るグラゞ゚ント溶剀圢を甚いおカラムから組換
IL−を溶出する。酢酞−プロパノヌル、トリ
フルオロ酢酞−プロパノヌル、及びトリフルオロ
酢酞−アセトニトリルが奜たしい溶剀系である。
組換IL−は酢酞−プロパノヌル系においお玄
40プロパノヌルで、トリフルオロ酢酞−プロパ
ノヌル系においお玄50プロパノヌルで、そしお
トリフルオロ酢酞−アセトニトリル系においお玄
62アセトニトリルで溶出する。䟿宜䞊、溶離液
の有機溶剀含量は、組換䜓IL−が溶出する溶
剀濃床より幟分䜎いレベルたで急速に䞊昇せし
め、次に玄0.1〜1.0分の範囲のゆるやかな
グラゞ゚ント倉化により溶出する。
組換IL−がクロマトグラフむヌ段階から回
収されるずすぐ、これを凍結也し、そしお還元剀
組換IL−を還元状態に保぀ため及び可溶化
剀それを溶液状に保぀ためを含有する䞭性氎
性緩衝液䞭に再懞濁せしめる。組換䜓IL−は
この圢で安定であり、そしおさらに凊理するた
め、及び䜿甚前に補剀化するために貯蔵するこず
ができる。
その他のそしお奜たしい方法は、組換IL−
を、それがゲル濟過により分離された埌に制埡さ
れた条件䞋で遞択的に酞化し、そしお酞化された
生成物をRP−HPCLにより又はRP−HPLCに続
くゲル濟過により粟補するこずである。これは、
ゲル濟過にもかかわらず存圚し続ける汚染物、及
び䞍所望の酞化生成物の効果的な陀去をもたら
す。奜たしい酞化方法は、組換IL−蛋癜質ず
実質䞊のアミノ酞配列を有する十分に還元された
埮生物的に生産された合成組換IL−蛋癜質
該配列は、有甚な蛋癜質䞭では58䜍及び105䜍に
おいお分子内結合しおシスチンを構成するシステ
むンを含有するを、制埡された態様においお遞
択的に酞化するこずによ぀お該システむンを遞択
的に酞化しお58䜍及び105䜍にシスチンを圢成す
るこずである。ベルギヌ特蚱No.898016䞭に蚘茉さ
れそしおクレヌムされおいるような組換IL−
が䜿甚される堎合、制埡されたそしお遞択的な酞
化の効率が改良される。この堎合、125䜍のシス
テむンが陀去され、又は䞭性アミノ酞により眮き
換えられおおり、埓぀おIL−のダむマヌ又は
ポリマヌを圢成するこずができる酞化の間の125
䜍のシステむンによる正しくない分子内結合及
び又は分子間結合が回避される。この方法にお
いおは、十分に還元された埮生物的に生産された
合成組換IL−蛋癜質を奜たしくは−ペヌド
゜ベンゟ゚ヌトを反応せしめる。この酞化剀はシ
ステむンを氎性媒䜓䞭で、該システむンのpKaよ
り少なくずも玄0.5PHナニツト䜎いPHにおいお酞
化し、この堎合、反応混合物䞭の合成蛋癜質の濃
床は玄mgmlより䜎く、そしお−ペヌド゜ン
ベンゟ゚ヌトず蛋癜質ずのモル比は少なくずも化
孊量論的であり、䜆し、−ペヌド゜ンベンゟ゚
ヌトは反応の末期においお過剰に存圚する。この
遞択的酞化は生物孊的に掻性な分子を生成せしめ
る。遞択的に酞化された生成物のRP−HPLC粟
補は䞊蚘の条件䞋で、還元剀の䞍存圚䞋、及び䞊
蚘のゲル濟過においお䜿甚したのず同じ濃床又は
それより䜎い濃床での掗剀の存圚䞋で行われる。
クロマトグラフ段階埌の組換IL−の玔床は
95以䞊、そしお通垞玄98以䞊である。この高
床に玔粋な物質は、100000ナニツトのIL−掻
性剀圓り玄5n未満の゚ンドトキシン、通垞玄
0.01n未満の゚ンドトキシンを含有する。
この発明に埓う組換IL−の補剀化は、粟補
され遞択的に酞化されたIL−を甚いる別個の
操䜜ずしお、又は遞択的に酞化されたIL−の
粟補ず䞀䜓化された操䜜においお行うこずができ
る。埌者の堎合、補剀化のための出発材料は、遞
択的に酞化された生成物の逆盞高速液䜓クロマト
グラフむヌRP−HPLC凊理からの組換IL−
含有生成物であり、奜たしくは遞択的に酞化さ
れた組換IL−を含むRP−HPLC生成物プヌ
ル物ずも称するは氎−有機溶剀混合物䞭組換
IL−の溶液を含んで成るであろう。有機溶剀
の皮類はRP−HPLCにおいお䜿甚される溶剀系
に䟝存するであろう。䜿甚され埗る系の列は酢酞
又はトリフルオロ酢酞のごずき有機酞ずプロパノ
ヌル又はアセトニトリルのごずき有機溶剀ずの組
合わせである。
このようなRP−HPLCプヌル物から組換䜓IL
−を補剀化する第段階は、組換IL−の氎
䞭ぞの溶解性を増匷するSDS又はサルコシルのご
ずき掗剀を含有する氎性緩衝液䞭にプヌル物を再
懞濁垌釈するこずにより混合物を氎性するこ
ずである。この垌釈の埌、有機盞を組換䜓IL−
含有氎性盞から陀去し、そしお適圓な緩衝液を
甚いる透析濟過dia−filtrationにより掗剀濃
床を䜎䞋せしめる。SDSを䜿甚する堎合、SDSを
箄100〜250、奜たしくは玄200ΌmgIL−の
レベルに䜎䞋せしめる。透析濟過の埌、IL−
濃床を玄0.01〜mgmlの範囲の濃床に調敎し、
そしお氎溶性担䜓を所望のレベルに加える。この
担䜓は兞型的には、それが溶液䞭に玄〜10重量
、奜たしくは玄重量で存圚するように添加
されるであろう。添加される担䜓の正確な量は臚
界的ではない。医薬錠剀の補造においお䜿甚され
る垞甚の固䜓増量剀を担䜓ずしお䜿甚するこずが
できる。これらの材料は氎溶性であり、IL−
ず反応せず、そしおそれ自䜓安定である。これら
は奜たしくは氎に察しお非−感受性すなわち、
非吞湿性である。添加され埗る担䜓の䟋はラク
トヌス、マンニトヌル、及び他の還元糖䟋えば゜
ルビトヌル、小麊、トりモロコシ、米、及びバむ
レシペに由来する柱粉及び柱粉加氎分解物、ミク
ロクリスタリンセルロヌス、䞊びにアルブミン、
䟋えばヒト血枅アルブミンである。マンニトヌル
が奜たしい。
担䜓は補剀に嵩を加え、単䜍投䞎量の溶液が容
噚、䟋えば無菌バむアル䞭で凍結也燥された堎合
に凍結也燥された残枣が肉県により明瞭に識別で
きるようにする。これに関し、奜たしい担䜓であ
るマンニトヌルは、氎に感受性でない矎的に蚱容
される癜色、結晶性残枣をもたらす。氎に察
するマンニトヌルの非感受性は補剀の安定性を増
匷するであろう。
担䜓を添加した埌、単䜍投䞎量すなわち、投
䞎圓り0.01〜mg、奜たしくは0.2〜0.3mgのIL−
をもたらす容量の溶液を容噚に分配し、歀の
容噚にスロツト栓をかぶせ、そしお垞甚な凍結也
燥条件及び甚いお凍結也燥する。
凍結也燥された無菌性成分物は(1)組換IL−、
(2)担䜓マンニトヌル、(3)掗剀SDS、及び(4)
混合物が再構成reconstituteされた堎合に生
理的PHをもたらす少量の緩衝剀の混合物から成
る。組換IL−は兞型的には混合物の玄0.015重
量〜3.85重量を占め、さらに奜たしくは混合
物の玄0.4〜0.6を占めるであろう。この生成
物の貯蔵詊隓は、IL−がこの圢態䞭で℃〜
℃においお箇月より長期間安定であるこずを
瀺す。
凍結也燥された混合物は、垞甚の非経腞的氎性
泚射剀、䟋えば泚射甚氎、リンゲル泚射剀、グル
コヌス泚射剀、グルコヌス及び塩泚射剀等をバむ
アルに泚入するこずによ぀お再構成するこずがで
きる。過剰の発泡を防止するため泚射剀はバむア
ルの偎壁に察しお䞎えられうるべきである。バむ
アルに添加される泚射剀の量は兞型的には〜
ml、奜たしくは〜mlの範囲である。
再構成された補剀は、ヒト又は他の哺乳動物に
察しお、それらにIL−療法をもたらすために
非経腞投䞎するのに適圓である。このような療法
は皮々の免疫調節埮候、䟋えば现胞倉異誘発、
现胞毒性现胞の誘導、ナチナラルキラヌ现胞掻
性の増倧、IFN−の誘導、现胞性免疫の回埩又
は増匷䟋えば、免疫䞍党状態の治療、及び现
胞性cell mediafed抗腫瘍掻性の増倧のため
に適圓である。
次の䟋はこの発明をさらに説明する。この䟋
は、いかなる態様においおも発明を限定するこず
を意図しない。
䟋 この䟋においお䜿甚する組換IL−はdes−ala
IL−2ser125である。このIL−のアミノ酞配列
は、倩然分子の最初のアラニンを欠き、そしお
125䜍のシステむンガセリンに倉えられおいる点
においお倩然ヒトIL−のアミノ酞配列ず異る。
このIL−を生産するE.コリのサンプルは、シタ
ス・コヌポレヌシペンにより、アメリカン・タむ
プ・カルチナアヌ・コレクシペン、12301パヌク
ラりンドラむブ、ロツクビル、メリヌランド、米
囜、に1983幎月26日に受蚗番号No.39452ずしお、
そしおブタペスト条玄の芏定のもずに1984幎月
日に受蚗番号No.39626ずしお寄蚗されおいる。
60−プロパノヌル、酢酞䞭329mgのRP
−HPLC粟補された酞化されたIL−生成物蛋
癜質濃床0.94mgmlを、50mM酢酞ナトリりム、
1mM゚チレンゞアミン四酢酞EDTA、0.1
ドデシル硫酞ナトリりムSDSPH5.5䞭に10
倍に垌釈した。
次にIL−溶液を、10平方フむヌトの䞭空繊
維カヌトリツゞ各目分子量カツトオフ10000ダ
ルトンを甚いお600mlの容量に濃瞮し、そしお
次に、50mM酢酞ナトリりム、1mM EDTA、
0.1SDSPH5.5に察しお容量透析濟過した。
次にこの材料を5ΌSDSmlを含有する10mMリ
ン酞ナトリりムに察しお、残留SDSが131Ό
SDSmg蛋癜質の倀に達するたでさらに透析濟過
した。玄255mgのIL−が0.6mgmlの濃床で回収
された425ml。
222mgのみを、次のように行぀た補剀化のため
に甚いた370mlのIL−溶液222mg、0.6mg
mlを10mMリン酞ナトリりムPH7.5及び20
マンニトヌルにより垌釈しお最終濃床を次のよ
うにした 0.25mgmlIL− マンニトヌル10mMリン酞ナトリりムPH7.5䞭 次に、この溶液を0.2ミクロンフむルタヌを通
しお無菌濟過し、無菌バむアル1.2ml充填容量
に充填し、そしお凍結也燥した。
こうしお補造された補剀はヒトにおいお臚床的
に䜿甚され、そしお連続静脈内泚入ずしお投䞎さ
れた堎合癟䞇ナニツトm2たでの投䞎においお
蚱甚され、又は静脈内もしくは筋肉内ボルス
bolusずしお投䞎された堎合癟䞇ナニツトKg
たで蚱容された。組換IL−の䜿甚に぀いおの
適圓な指暙には次のものが含たれる (1) 埌倩的な、先倩的な、又は化孊的療法、免疫
療法もしくは照射により誘導された免疫䞍党状
態の治療 (2) りむルス性、寄生性、癌性、真菌性、原生動
物性、又はミコバクテリりム性もしくはその他
の感染性疟患の療法におけり现胞性免疫応答の
増匷 (3) 感染性、癌性、リりマチ性又は自己免疫性疟
患の治療における゚キ゜ヌビボex vivoで
の现胞の増匷された応答の誘導 (4) リりマトむド又は他の炎症性関節炎症の治
療 (5) 異垞免疫応答の疟患、䟋えば倚発性硬化症、
党身性玅斑性狌瘡、糞球䜓腎炎、又は肝炎の治
療 (6) 造血系腫瘍、又は造血組織の前癌性もしくは
再生䞍良性異垞の抑制 (7) 倩然に存圚する、投䞎された倩然の、化孊的
に合成もしくは修食された、又は組織操䜜によ
るワクチン、あるいは医療目的に投䞎される他
のい抗原に察する现胞性又は液性応答の誘導に
おけるアシナバントずしおの䜿甚 (8) 神経䌝達調敎剀ずしおのもしくは粟神掻性剀
ずしおの、医療目的の゚ンケフアリンずしお
の、又は䞭枢神経系機胜の調節剀ずしおの䜿
甚 (9) 䞊蚘の疟患状態の治療のための局所適甚にお
いお (10) 现胞毒性化孊治療又は盎接療法もしくはアゞ
ナバント環境における癌性もしくは前癌性疟患
の治療における照射もしくは手術ず組合わせ
お (11) 盎接抗りむルス性、抗真菌性、抗现菌性、
もしくは抗原性動物掻性を有する薬剀ず組合わ
せお、又は兞型及び非兞型m.ツベルクロシス
の薬剀治療ず組合わせお (12) 他の免疫調節剀、リンホカむン䟋えばIL
−、IL−、CSF−、α−むンタヌプ
ロン、及び−むンタヌプロン、倩然のも
しくは誘導性の抗现胞性毒玠、癌性、感染性、
自己免疫性又はリりマチ性疟患の治療における
悪性现胞の溶解又は静止を䞭介する分子ず組合
わせおそしお (13) 感染性疟患に察する予防。
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