JPH0466870A

JPH0466870A - 新規な標識体及びそれを用いた免疫測定法

Info

Publication number: JPH0466870A
Application number: JP18025390A
Authority: JP
Inventors: Eiji Ishikawa; 石川　栄治; Takeyuki Kono; 河野　武幸
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-07-07
Filing date: 1990-07-07
Publication date: 1992-03-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規な標識体及びそれを用いた免疫測定法に関
する。更に詳しくは、ビオチンとアビジンの結合又はビ
オチンとストレプトアビジンの結合を介して標識をした
免疫反応物質及び該免疫反応物質を用いた、目的物質の
免疫測定法に関する。

〔従来の技術〕

従来、免疫測定法による検体中の目的物質の定量的測定
は、該目的物質と免疫複合体を形成し得る免疫反応物質
に対して直接標識物を結合させ、該標識体と固相に結合
した他の免疫反応物質との間で、サンドイッチ状に該目
的物質の免疫複合体を固相上に形成せし杓、次いで、固
相に結合した標識物を測定する免疫測定法が広く行なわ
れている。

例えば、標識物が酵素であり検体中の目的物質が抗体の
場合は、酵素標識抗抗体と固相に結合した抗原とで目的
物質である抗体とのサンドイッチ状免疫複合体を固相上
に形成し、固相に結合した酵素の活性を測定する方法が
一般的に用いられている。また、検体中の目的物質が抗
原の場合は、酵素標識抗体と固相に結合した抗体とで、
目的物質である抗原とのサンドイッチ状免疫複合体を固
相上に形成し、固相に結合した酵素の活性を測定する方
法が一般的に用いられている。

しかし、抗原、抗体等の目的物質の測定における最大の
問題点は、標識体の固相への非特異結合にある。標識体
の固相への非特異結合の原因には、標識体の固相への直
接の非特異結合と検体中の標識体と結合可能な物質の非
特異結合を介しての２種類に大別される。この非特異結
合の影響をできるだけ低減せしめることにより、測定感
度の上昇及び測定値の信頼性を向上する方法が幾つか発
表されている。例えば、酵素標識体の固相への直接の非
特異結合を低減するため、酵素標識体の製造方法が種々
検討されているし石川ら、「蛋白質・核酸・酵素」別冊
Ｎｏ、３１．３７〜４５（１９Ｂ？）］。また、検体中
の標識体と結合可能な物質の固相への非特異結合は、目
的物質が抗体の場合、重要な問題であるが、この場合の
非特異結合を低減する方法として、標識抗原と固相に結
合した抗原とで目的物質である抗体とのサンドイッチ状
免疫複合体を固相上に形成し、固相に結合した標識物を
測定する方法が報告されている（遠藤ら、Ｃｌ１ｎ、　
Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　１０３．６フー７７　（１９
８０））。

最近、改良方法として、抗原を直接結合した固相の代わ
りに、ジニトロフェニル基のようなハプテンを結合した
抗原を用いて、目的物質である抗体と標識抗原のサンド
イッチ状免疫複合体を形成し、該サンドイッチ状免疫複
合体を抗ジニトロフェニル基抗体のような抗ハプテン抗
体を結合した固相に結合し、固相に結合した標識物を測
定する方法が報告されている。この方法は、抗原と特異
抗体との反応を溶媒中で行い、形成されたサンドイッチ
状免疫複合体を結合能の高い結合で固相に結合すること
ができ、短時間で高感度の抗体測定が可能となった（特
開平１−３１２４６４号）。

更に、標識体の固相への非特異結合を低減させる方法が
本発明者により開発されている。即ち、上述のような固
相上に形成された検体中の目的物質、標識物及び免疫反
応物質からなるサンドイッチ状免疫複合体を固相から溶
出せしめた後、標識物を測定する方法である。例えば、
抗体の測定において、サンドイッチ状免疫複合体を結合
した固相にハプテンを加えることにより、固相よりサン
ドイッチ状免疫複合体を溶出せしめ、溶出液中の酵素活
性を測定することにより、さらに高感度の測定が可能と
なった（特願平１−１７８７３号）。

また、この溶出液を抗抗体の結合した固相に結合させる
ことにより、抗体のクラス別の測定（１ｍｍｕｎｅ　Ｃ
ｏｍｐｌｅｘ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｍｅｔｈｏｄ法）も
可能となった（特開平２−２８５５８号）。

このように、標識体を用いる抗原、抗体等の測定は有用
な方法であり、種々の改良方法が提案されている。

例えば、抗体、抗原であるタンパク質やペプタイド等の
酵素標識体の製造方法としては、種々の酵素標識法が開
発されてきた。抗体、抗原の酵素標識法の開発について
は、石川ら（蛋白質・核酸・酵素、前出）に記載されい
てる。つまり、古くは抗体のアミノ基と酵素のアミノ基
を利用したグルタルアルデヒド法が用いられてきた。近
年、新しい二官能性架橋剤が開発され、アミノ基同士で
はなく一方のアミノ基と他方のチオール基を用いること
により、重合体の生成を抑制し、測定感度の向上が達成
されてきている。

しかし、従来の方法を用いての酵素標識体の製造は、い
ずれも生理活性物質である抗原、抗体と酵素を直接結合
させるものであるため、反応が微妙で再現性に問題があ
る、製造に一定以上のサンプル量が必要であり応用でき
る範囲に限界がある、等の問題が指摘されているのが実
情であった。即ち、−船釣に、抗体の酵素標識において
も、抗体のクラスにおける違いのみならず抗体個々にお
いても最適条件が異なる。特に、臨床診断上に重要な抗
体に対する抗原は不安定であったり、溶解するため特殊
な条件の検討が必要であったり、一つの抗原中にアミノ
基とチオール基が共存する場合には、既存の二官能性架
橋剤では抗原の重合体が生成したりする等の問題がある
。そのため、抗原ごとに標識方法、標識条件の検討をす
る必要があった。また、分子量の大きい抗原と酵素を反
応させるには、両者の濃度を上げる必要があり、また少
しの条件の変化が標識体の性質に影響し、再現性が悪い
ことも指摘されていた。更に、場合によっては、現在の
直接標識技術では標識体が得られない場合がある。

例えば、ＨＴＬＶ−１、ＨＣＶ、ＨＢｓやＨＩＶのよう
なウィルス抗体に必要な抗原およびアセチルコリンリセ
ブターやＴ　Ｓ　Ｈリセブター〇ようなりセプター抗体
測定に必要なりセプターは膜タンパクであり、酵素との
結合が可能な濃度に抗原を溶解するには、界面活性剤を
多量に含む条件が必要である。しかし、この条件では多
くの酵素は活性を失うことになる。また、この問題を解
決するため、抗体の認識部分であるエピトープのベプタ
イドを抗原として用いる方法もあるが、この場合、認識
部分にリジンやシスティンのような酵素標識の間に反応
に関与するアミノ酸を含む場合が多く、従来の直接酵素
標識法を用いることには限界があった。

また、最近、蛍光物質や発光物質を抗原や抗体に直接標
識した標識体も用いられているが、この場合にもリジン
やシスティンを認識部位に含むペプタイドにおいては直
接標識法を用いる限界があった。

これらのことから、より簡単で応用範囲の広い酵素標識
法の開発が当業界で要請されているが、このような要請
に応えるものとして、ビオチン標識法が開発されている
。

例えば、ビオチン標識抗体及び抗体を結合したた固相を
用いて、検体中の抗原とサンドイッチ状複合体を作製し
、次いで、アビジンやストレプトアビジンを結合した酵
素や蛍光物質等を反応させることにより、固相に結合し
た抗原量の測定を行なう方法である（Ｍ、　Ｗｉｌｋｅ
ｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　１７１．１−３２．１９８８）。

〔発明が解決しようとする課題〕

このビオチン標識体を用いた利点、欠点に関しては、Ｍ
、Ｗｉｌｋｅｒら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ。

前出）に記載されている。

この方法の利点は、ビオチンは安定な化合物であり、カ
ルボキシル基を有し、タンパク質やベブタイド等と容易
に反応し、サクシンイミド（ＳＵＣＣｉｎｉｍｉｄｏ）
基等の官能基の導入が容易であり、この化合物を用いる
ことにより容易にかつ簡単にビオチンをタンパク質やペ
プタイド等に導入することができる点にある。既に様々
な官能基を導入した化合物が市販されている。

一方、ビオチンと結合能を有するアビジンやストレプト
アビジンに標識物を結合したアビジンやストレプトアビ
ジン標識体は、共通試薬であり、既に種々の標識物につ
いてのアビジン等との結合物が市販されており、容易に
合成や入手が可能である。ビオチンとアビジン、ストレ
プトアビジンの結合力は高く、希薄な溶液中でも定量的
に結合することができる。

しかしながら、このビオチン標識体を用いた方法の欠点
は、アビジンやストレプトアビジンを結合した標識物が
、固相に非特異的に結合しやすいため、測定感度が向上
しない点にある。即ち、ビオチン標識体を用いた場合、
測定操作中にアビジン等を介して標識することは容易で
あっても測定感度に問題があり、この問題を解決するた
め、様々な努力がなされているが、現在まで解決される
に到っていない。

従って、本発明の目的は、免疫測定に有用な新規な標識
体を提供することにある。

本発明の他の目的は、標識体を用いた高感度な免疫測定
法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実情下、本発明者らは鋭意研究を重ねた。

そして、まず、抗原等の免疫反応物質のビオチン結合体
とアビジン標識体又はストレプトアビジン標識体とを結
合させて、予めビオチン−アビジン又はビオチン−スト
レプトアビジンシステムを介した標識体を作成し、次に
単離精製した該標識体を用いて、サンドイッチ型免疫測
定を行なうと、従来の標識体を用いたのと同様にサンド
イッチ型免疫測定を行い得ることを見いだし、本発明に
到った。即ち、本発明は、（１〕　　一般式（ａ）又は（ｂ）で示されるビオチン
とアビジンの結合またはビオチンとストレプトアビジン
の結合を介した標識体、（ａ）　：　Ｘ−ビオチン−アビジン−標識物（ｂ）：
Ｘ−ビオチン−ストレプトアビジン−標識物（式中、Ｘ
は抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれる免疫反
応物質を表す。）、（２）上記（１）記載の標識体及び
固相化物質を用いて、検体中の目的物質を含むサンドイ
ッチ状免疫複合体を固相上に形成せしめる工程を有する
ことを特徴とする目的物質の免疫測定法、に関するものである。

本発明の標識体において、Ｘは抗原、抗体及び抗抗体か
らなる群から選ばれる免疫反応物質を表し、検体中の目
的物質と免疫複合体を形成し得るものである。従って、
例えば目的物質が抗体の場合、Ｘは抗原又は抗抗体を、
目的物質が抗原の場合、Ｘは抗体を表す。

ここで、抗原とは抗原抗体反応、免疫応答を誘起し得る
物質を言い、タンパク質、多糖、それらの複合体、脂質
との複合体等が挙げられ、またこれらの抗原の抗原決定
基を含むベブタイドをも表すものである。また、このペ
プタイドには常法により合成された合成ベプタイドをも
含むものであり、例えば抗原決定基の合成ペプタイドが
あげられる。

ここで、抗体とは、抗体の一部である（Ｆａｂ）　２や
Ｆａｂ’を含む。

ここで、標識物とは免疫測定法において使用できるもの
であれば特に限定されず、通常、酵素、発光物質、蛍光
物質、金属化合物、放射性物質が挙げられる。例えば、
酵素としてはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、蛍光物質としてはフル
オレセインイソチオシアネート、金属化合物としてはユ
ーロピウム錯体、発光物質としてはアクリジウム塩、放
射性物質としては３）（、１４Ｃ，＋２Ｓｉ、　＋３１
１．３２ｐ等が用いられる。

本発明の標識体は、次のようにして容易に製造すること
ができる。即ち、まず抗原、抗体等の免疫反応物質にビ
オチンを結合させ、次いで、該ビオチン結合体とアビジ
ンまたはストレプトアビジン標識体を反応せしめ、必要
に応じてカラム等を用いて精製することにより得ること
ができる。

ビオチン結合体の製造は既存の公知技術に従って容易に
行なうことができる（Ｂａｙｅｒ、　Ｂ、Ａ、他。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６２
．’　３０８−３１５　（１９７９））。

即ち、ビオチンの誘導体、例えばサクシンイミド誘導体
と抗原等の免疫反応物質を緩衝液中で混合するか、又は
光反応で行なわれる。反応後、必要に応じて未反応のビ
オチン誘導体をカラム等を用いて除去する。

また、抗原等の免疫反応物質とビオチンとの間にスペー
サを入れることが望ましい場合がある。

例えば、抗原にグルタチオン基（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ
ｅ）を導入し、次いでビオチン誘導体を反応せしめるこ
とによって得ることもできる。

また、種々のビオチン誘導体、例えば、ＭＰＢ（３−（
Ｎ−マレイミド−プロピオニル）ビオシチン）　　、Ｂ
ＮＨ３（ビオチンＮ−ヒドロキシサクシニミドエステル
）　、ＢＣＨ２（Ｎ６−ビオチニルし一リジンヒドラジ
ット）あるいはＤＢＢ　（ｐ−ジアゾベンゾイル　ビオ
シチン）を用いて各々、チオール基、アミノ基、アルデ
ヒド又はカルボジイミド活性化カルボキシル基、あるい
は、フェノール又はイミダゾール基にビオチンを結合さ
せることができる。

更に、免疫反応物質が１００個以下のアミノ酸からなる
ペプチドの場合、公知のペプチド合成法により、所望の
位置にペプチドの免疫活性を変えることなくビオチンを
導入することができる。

即ち、アミノ酸側鎖の官能基を半永続的（ｓｅｍｉｐｅ
ｒｍａｎｅｎｔ）保護基でブロックしておき、Ｎ末端ア
ミノ基を一時的（ｔｅｍｐｏｒａｒｙ）保護基で置換し
、順次アミノ酸を付加していく有機ペプチド合成の常法
により、任意の位置のビオチン化が行なえる。

保護基、除去条件の選択は、底置に示された技術を応用
して当業者が適宜行なえるものである（「ペプチド合成
の基礎と実験」昭６０年泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦
、脇道典共著、発行所　丸善、ｐｐ、　　１４３−１７
３）。

一例として、ペプチド合成の際にＮε−２−クロロベン
ジルオキシカルボニル−リシンと５−４−メチルベンジ
ル−システィンを用いて、リジンのε−アミノ基やシス
ティンのβ−チオール基を保護しておき、αアミノ基を
ＢＯＣ（Ｎα−１−ブチロキシカルボニル）基で保護し
てペプチド合成を行なう方法が挙げられる。ペプチド合
成後、Ｎ末端ＢＯＣを緩和な酸ＴＦＡ　（テトラフルオ
ロ酢酸）で切断して、Ｎ末端α−アミノ基のみをフリー
にし、ビオチンを結合させ、その後、Ｎε−２−タロロ
ペンジルオキシ力ルボニル基と４−メチルベンジル基を
、より強い酸ＨＦ　（、フッ化水素）で切断して、Ｎ末
端のみビオチン化されたペプチドを得ることができる。

この他、側鎖官能基としてグルタミン酸、アスパラギン
酸のα、β−カルボキシル基、セリン、トレオニンのβ
−水酸基、チロシンの芳香族水酸基などが挙げられるが
、これらが既成のペプチドのビオチン化方法では、ブロ
ックされてしまう場合、上述の方法は特に有用であり、
場合によっては必須の方法である。

近年、注目されているＨＩＶ　（ヒト免疫不全ウィルス
）　、ＨＣＶ　（Ｃ型肝炎ウィルス）等の表面抗原にも
、このような活性官能基を含むペプチド鎖があり、本発
明のビオチン−アビジンシステムを介した標識物の好適
な素材である。

免疫反応物質が抗体又は分子量５万以上の抗原の場合、
抗体又は抗原１分子に結合するビオチンは、通常１分子
から１０分子までであり、好ましくは１分子から４分子
が望ましい。

免疫反応物質が分子量５．０００以上５万未満の抗原又
は抗体の一部の場合、抗体１分子に結合するビオチンは
通常１分子から５分子までであり、好ましくは１分子か
ら２分子が望ましい。

免疫反応物質が分子量５．０００未満の抗原又は抗原の
抗原決定基を含むペプタイドの場合は、抗体１分子に結
合するビオチンは、通常、１分子から２分子までであり
、好ましくは１分子である。

アビジン又はストレプトアビジン標識体の製造も公知の
技術で容易に行なうことができる（Ｂａｙｅｒ他、前出
）。例えば、標識物が酵素の場合、β−ガラクトシダー
ゼのアビジン標識酵素は、アビジンとＮ−サクシニミジ
ル−６−マレイミドヘキサノエート　（Ｎ−ｓｕｃｃｉ
ｍｉｎｉｄｙｌ−６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎ。

ａｔｅ）を反応せしめることにより、アビジンまたはス
トレプトアビジンにマレイミド基を導入し、次いでβ−
ガラクトシダーゼと反応せしめることによって得ること
ができる。

酵素１分子に結合するアビジン又はストレプトアビジン
は、通常１分子から４分子までであり、好ましくは１分
子から２分子が望ましい。

標識物が発光物質や蛍光物質の場合、発光や蛍光を有す
る物質の反応体、例えばサクシニミジルを有する反応体
とアビジン又はストレプトアビジンを混合することによ
り得ることができる。

アビジン又はストレプトアビジン１分子に結合する発光
物質や蛍光物質の数は１分子から３０分子、通常、２分
子から１０分子である。

ビオチン結合体とアビジン又はストレプトアビジン標識
体の反応は、両者の溶液を混合することによって得られ
る。例えば、ｐＨ６〜９の緩衝液中で、通常０〜４０℃
、好ましくは４〜３７℃で、通常１０分〜４８時間、好
ましくは１０分〜８時間反応させる。ビオチン結合体と
アビジン又はストレプトアビジン標識体の混合比率は、
モル比率で、通常０．　１〜１００であり、好ましくは
０゜３〜１０の範囲が望ましい。

免疫反応物質が低分子で容易に生成した標識体と未反応
ビオチン結合体の分離が容易な場合は、ビオチン結合体
を過剰に入れることができる。

免疫反応物質が高分子で容易に生成した標識体と未反応
アビジン又はストレプトアビジン標識体の分離が容易な
場合は、アビジン又はストレプトアビジン標識体を過剰
に入れることができる。

本発明の免疫測定法は、前記のような方法により得られ
た標識体及び固相化物質を用いて、検体中の目的物質を
含むサンドイッチ状免疫複合体を固相に結合した後、標
識物を測定することにより目的物質の量を測定するもの
である。ここで、固粗化物質とは、目的物質を固相に結
合させ、サンドイッチ状免疫複合体を固相上に形成せし
めることのできる物質をいう。通常目的物質が抗原の場
合は抗体を、目的物質が抗体の場合は、抗原又は抗抗体
等を表すものである。固相化物質は固相上に結合させる
か、結合対の一方を標識して用いられる。

次に、本発明の免疫測定法について説明する。

この方法には次の２つの方法に分類され４種の態様が例
示される。

第１の方法は、固相上に形成されたサンドイッチ状免疫
複合体中の標識物を測定する方法である。

第２の方法は、固相上に形成されたサンドイッチ状免疫
複合体を固相より溶出した後、標識物を測定する方法で
ある。

まず、第１の方法の例である第１の態様は、標識体と固
相に結合した固相化物質とで測定対象物質である検体中
の目的物質とのサンドイッチ状免疫複合体を固相上に形
成し、固相に結合した標識物を測定する方法である。

測定方法としては、目的物質を含む検体と固相化物質と
を反応せしめ、検体を吸引後固相を洗浄し、次いで、固
相と標識体を反応せしめる。未反応の標識体を吸引し、
固相を洗浄した後、固相に結合した標識物を測定する。

あるいは、標識体、固相化物質、及び目的物質を含む検
体を同時に反応させ、反応液を吸引し、固相を洗浄した
後、固相に結合した標識物を測定する方法でもよい。測
定の条件は既知のサンドイツチ法免疫測定法と同様に行
なうことができる。

この第一の態様における固相化物質の製造は、既知のタ
ンパク質を固相に結合するいずれの方法であってもよい
。

例えば、固相としては、アガロース、ポリスチレン、ポ
リアクリル、テフロン、紙、ガラス等が通常用いられ、
好ましくはポリスチレンがよい。

抗原を固相に結合する方法としては、通常物理的吸着に
より行なうことができる。また、抗原がハプテンのとき
は、抗原を適当なキャリアタンパクと結合して、固相に
結合する。キャリアタンパクとしでは、アルブミン、非
特異イムノグロブリン等が挙げられる。また、抗体と結
合した固相の製造方法は、石川らによる方法（Ｓｃａｎ
ｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ。

１９．８．４３　（１９７８））の方法により行なうこ
とができる。

第１の方法の例である第２の態様は、検体中の目的物質
と免疫複合体を形成する同相化物質中の抗原等が第１の
態様では直接固相に結合しているのに対し、第２の態様
では、−組の結合対を有する物質の固定化物質を介して
サンドイッチ状免疫複合体を固相上に形成される方法で
ある。ここでいう結合対とは、物理的結合によって強固
に選択的に結合できる物質の対をいう。例えば、ハプテ
ンと抗ハブテン抗体が例として挙げられる。本発明の結
合対にはビオチン−アビジン又はストレプトアビジンの
結合対は含まない。また、測定対象である目的物質と標
識体の反応に影響する結合対は用いることができない。

望ましい結合対はジニトロフェニル基と抗ジニトロフェ
ニル基抗体カ例示される。

固相化物質に標識する結合対の一方（例えば、前記の例
ではジニトロフェニル基）は、低分子側が望ましい。即
ち、ハプテンと抗ハブテン抗体の結合対においては、ハ
プテンを抗原等に標識するのが望ましい。

このような望ましい結合対の一方としてジニトロフェニ
ル基が挙げられる。

結合対の一方を結合させた抗原又は抗体の製造法は公知
の方法によって得られる。例えば、橋田他、　Ｊ、　Ａ
ｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　６．５６　（１９８４
）に記載されたようにＮ−サクシニミジル−６−マレイ
ミドヘキサノエートを架橋剤として用い、容易に得るこ
とができる。

結合対の他方（例えば、前記の例では抗ジニトノフェニ
ル基抗体）は、一方がハプテンの場合抗ハプテン抗体で
ある。このような望ましい結合対の他方として、抗ジニ
トロフェニル基抗体が挙げられる。

結合対の他方が結合した固相の製造方法は既知のタンパ
ク質を固相に結合するいずれの方法であってもよい。

測定方法としては、標識体と結合対の一方で標識した固
相化物質を目的物質を含む検体に加え、反応後、結合対
の他方が結合した面相に反応液を加え反応を行い、その
後、反応液を吸引し、面相を洗浄した後、固相に結合し
た標識体を測定する方法、あるいは標識体、結合対の一
方で標識した固相化物質、及び結合対の他方が結合した
固相を同時に目的物質を含む検体中に加え、反応後、反
応液を吸引し、固相を洗浄した後、固相に結合した標識
体を測定する方法である。後者の方がステップが少なく
、望ましい。

測定の条件は既知のサンドイツチ法免疫測定法と同様の
方法で行なうことができる。

本発明においては第１の態様、第２の態様のいずれにお
いても、従来法に比し高感度の結果が得られるが、第２
の態様の方がより感度の高い結果が得られ、望ましい。

第２の方法の例である第３の態様は、第１又は第２の態
様で固相に結合したサンドイッチ状免疫複合体を溶出し
た後、溶出液中の標識物を測定する方法である。

標識体を用い、検体中の目的物質を含むサンドインチ状
免疫複合体を形成せしめる方法として第１の態様を採っ
た場合には、抗原等を固相に結合する際に、サンドイッ
チ状免疫複合体を解離せずに溶出できる結合を介して結
合しておく必要がある。

望ましい方法は、第２の態様でサンドイッチ状免疫複合
体を固相に結合し、洗浄後、結合対の方またはそれを含
む化合物を加え、固相よりサンドイッチ状免疫複合体を
溶出することができる。

結合対の一方又はそれを含む化合物の具体例として、結
合対の一方で標識した抗原としてジニトロフェニル基標
識抗原を、結合対の他方が結合した面相として抗ジニト
ロフェニル基抗体を結合した固相を用いた時は、゛ジニ
トロフェノールーリジンが挙げられる。

溶出には、結合対の一方又はそれを含む化合物を０．１
〜１０ｍＭ含むｐＨ６，０〜９．０の緩衝液を加え、通
常０〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃、通常１０分〜
４８時間、好ましくは１〜６時間で行なうのが望ましい
。

第２の方法の例である第４の態様は、第３の態様で溶出
された免疫複合体を、新しい固相に結合する方法である
。新しい固相としては、サンドイッチ状免疫複合体を結
合する能力があり、標識体を結合する能力のない固相を
いう。望ましい固相として目的物質が抗体の場合、抗抗
体を結合した固相が挙げられる。特に抗抗体として、Ｉ
ｇＧ、Ａ、Ｍ等の抗体のクラスを識別できる抗体を選ぶ
ことにより、検体中の抗体のクラス別の抗体を測定する
ことができる。

測定方法としては、第３の態様で結合対の一方又はそれ
を含む化合物と同時に新しい固相を加えると、サンドイ
ッチ状免疫複合体を固相から溶出と同時に新しい固相に
結合させることができ、望ましい方法である。その後、
反応液を吸引し、新しい固相を洗浄した後、新しい固相
に結合した標識物を測定する方法である。

標識物の測定は、通常の免疫測定法における測定と同様
に行われ、公知の方法で行うことができる。

標識体の固相への非特異的吸着の影響を低減するには、
第２の方法が好ましく、特に第４の態様が望ましい。

〔以下余白〕

〔実施例〕以下、実施例、参考例により本発明を更に詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの標準液の調製：アンギオテンシン■をグルタルアルデヒドを用いる公知
の方法で牛血清アルブミンと結合した。

このアンギオテンシン■−牛血清了ルブミンを６乃至９
週間の間隔で完全フロインドアジュバントと共にニュー
シーラント　ホワイト　ラビットに免疫し、ウサギ抗ア
ンギオテンシン■抗血清を得た〔田中ら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｓ、Ｒｅｓ、［：ｏｍｍｕｎ、、　１
６０、４０−４５　（１９８９））。

この抗血清より、硫酸ナトリウムによる塩析とＤＥＡＥ
セルローズを用い、ｒｇＧを精製し、単位体積当りのＩ
ｇＧを測定した。

得られた全ＩｇＧを用いてＰａｂ”−ペルオキシダーゼ
を作成し〔田中ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｓ、
Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ９、前出］、この標識体をアンギオテンシ
ンＩ−セファローズ４Ｂカラムに吸着させた。カラムに
附加されたペルオキシダーゼ活性のうち、５．１％が吸
着された。抗血清の全１ｇＧ中の５，１％が抗アンギナ
テンシンＩＩｇＧであった。

この抗アンギナテンシンＩＩｇＧをウサギ血清で希釈し
て、種々の濃度のウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの
標準液を調製した。

緩衝液：緩衝液Ａ：０．ＩＭ！Ｊン酸ナトリウム緩酸液トリウム
緩衝液調製し緩衝液Ａとした。

緩衝液Ｂ　：　５ｍＭ　［ｌ！ＤＴＡを含む０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，０を調製し緩衝液Ｂと
した。

緩衝液Ｃ：０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１ｇ／　Ｉ！
ウシ血清アルブミン（フラクションＶ１アーマー社、カ
ンカキ−、イリノイ州）　、１．０ｍＭ塩化マグネシウ
ムおよび１．０ｇ／βアジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０を調製し緩衝液Ｃ
とした。

緩衝液Ｄ　：　１．０ｇ／　１２ウシ血清アルブミン、
１．０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１、Ｏｇ／Ｉｌアジ
化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７゜０を調製し緩衝液りとした。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性測定：β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性は、４−メチルウンベリフェリル　β−
Ｄ−ガラクトシドを基質として、３０℃、１５０分間反
応後、公知の方法で蛍光光学的に測定した〔今用ら、Ａ
ｎｎ、　ＣＩ　ｉｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

、２１．３１０−３１７（１９８４）　：］。蛍光強度
は、１０−８Ｍ　４メチルウンベリフエロンを溶解した
Ｏ、　１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐ　Ｈ１０，３
を標準として測定した。

実施例１１、マレイミド−アビジンの調製アビジン（アビジンＤ、ベクターラボラトリーズ社、カ
ルフォルニア）　３ｍｇを溶解した緩衝液ＡＯ０３ｍｌ
に、３．３ｍＭＮ−サクシニミジル−６−７レイミドヘ
キサノエート（同位化学研究所、熊本）のＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミド溶液３０μｌを加え３０℃、３０分間
反応した。反応液からセファデックスＧ−２５のカラム
（１，ＯＸ　３０ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｂを溶出液と
して精製した。

アビジンの量は２８０ｎｍの吸光係数を１．４ｇ−’、
　１ｉｔａｒ、　ｃｍ””、分子量を６８．０００とし
て計算した。アビジン１分子当たり１．０個のマレイミ
ド基が結合していた。

２、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−アビジンの調製β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ２．０ｍｇ　（３，７％ｍｏｌ）を
溶解した緩衝液８８０μｌに、マレイミド−アビジン０
、５ｍｇ（７，４％ｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ｂ　Ｏ，
５４−を加え４℃、２０時間反応した。反応液からウル
トロゲルＡｃＡ２２のカラム（１，５Ｘ　４５ｃｍ）を
用い、緩衝液Ｃを溶出液として精製した。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼ１分子当たり１．２個のアビ
ジンが結合していた。

３、マレイミドーアンギオテンシンＩの調製アンギオテ
ンシン１　１．５ｍｇ（１，２，Ｕｍｏｌ）を溶解した
蒸留水０．１３ｍ１’と０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，５）　１．２ｍｌを混合し、混合液に５５
ｍＭ　Ｎ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエ
ートのＮ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液０．１３−
を加え３０℃、３００分間反応た。反応液からセファデ
ックスＧ−１０のカラム（１，ＯＸ　４５）を用い、緩
衝液Ｂを溶出液として精製した。

４、グルタチオンーアンギオテンシンＩの調製マレイミ
ドーアンギオテンシンＩ　　０．６９ｍｇ（０，４６μ
ｍｏｌ）を溶解した緩衝液８２ｍｌに、３．１ｍＭグル
タチオンを含む緩衝液Ｂ０．２ｍ１．を加え３０℃、３
００分間反応た。反応後、０．１ＭＮ−エチルマレイミ
ドを含む緩衝液８２０μｌを加え、３０℃、３００分間
反応た。

５、ビオチニルーグルタチオンーアンギオテンシン■の
調製４、のグルタチオンーアンギオテンシン■溶液２、２ｍ
ｌ！に、１．０Ｍ水酸化ナトリウム１３０μｌを加え、
ｐＨ７，２に調整後、３４ｍＭビオチン−Ｎ−ハイドロ
キシサクシニミドのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液
０．２ｒｎｌを加え、３０℃、３００分間反応た。反応
液からセファデックスＧ−１０のカラム（１，ＯＸ　４
５ｃｍ　）を用い、緩衝液Ａを溶出液として精製した。

６、β−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニル
ーグルタチオンーアンギオテンシン■の調製 β−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジン０．２２ｍｇ（０
，３６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ｃ１，５ｍｌに、ビ
オチニルーグルタチオンーアンギオテンシンＩ７３μｇ
　（３，６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ａ０．３ｒｄを
加え、３０℃、３時間反応した。反応液からウルトロゲ
ルＡｃＡ４４のカラム（１、ＯＸ４５Ｃｍ）を用い、緩
衝液Ｃを溶出液として精製した。

ンＩの調製１、ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンの調製ウシ血清アルブミンにＳ−アセチルメルカプトサクシニ
ック・アンハイドライドを用いる公知の方法でチオール
基を導入し、マレイミド基を導入したジニトロフェニル
−し−リジンと反応した〔河野ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｌ
ａｂ、Ａｎａｌ、、　２．２０９−２１４　（１９８８
）　）。

ウシ血清アルブミンの量は２８０ｎｍの吸光係数を０．
６３ｇ　−’、　１ｉｔｅｒ、ｃｍ−’、分子量を６６
、２００として計算シた。ジニトロフェニル基の量は３
６０ｎｍの吸光係数を１７．４００　ｍｏド’、　１ｉ
ｔｅｒ、　ｃｍ−’として計算した。

２８０ｎｍと３６０ｎｍの吸光度測定から、ウシ血清ア
ルブミン１分子当たり５．５個のジニトロフェニル基が
結合していた。

２、メルカプトアセチル−ジニトロフェニル−ウシ血清
アルブミンの調製ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン３．７　ｍｇを
溶解した緩衝液Ａ　１．　Ｏｒｒｔｇに、３ＪｍＭＮ−
サクシニミジル−８−アセチルチオアセテートのＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミド溶液０．１−を加え、３０℃、
３００分間反応た。反応後、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０）５０μβ、０．１　Ｍ　Ｂ［１ＴＡ（ｆ）
）１７．０）　５０μβ及び１Ｍヒドロキシルアミン溶
液（ｐＨ７，０）　７５μ矛を添加し、３０℃で１５分
間反応した後、反応液からセファデックスＧ−２５のカ
ラム（１，ＯＸ　３０ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｂを溶出
液として精製した。ジニトロフェニル−ウシ血清アルブ
ミン１分子当たり２．３個のチオール基が結合していた
。

３、マレイミド−アビジンの調製は前項に従った。

４、ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−アビジン
の調製メルカプトアセチル−ジニトロフェニル−ウシ血清アル
ブミン１．０ｍｇ　（１５ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液
Ｂ　Ｏ，７ｄにマレイミド−アビジン１．０ｍｇ　（１
５ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液８１．１ｄを加え、４℃
、２００時間反応た。反応液をウルトロゲルＡｃＡ４４
のカラム（１，５ｘ　１００　ｃｍ）を用い、緩衝液Ａ
を溶出液として精製した。

２８０　ｎｍと３６０　ｎｍの吸光度測定から、ウシ血
清アルブミン１分子当たり１．１個のアビジンが結合し
ていた。

５、ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジン
ービオチニルーグルタチオンーアンギオテンシンＩの調
製ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−アビジン４８
μｇ　（０，３６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ａ　１．
７　ｉｎに、ビオチニルーグルタチオンーアンギオテン
シンＩ　　７３　、！ｊ　ｇ　（３６ｎｍｏｌ）を溶解
した緩衝液Ａ　０．３　ｉｌｌ！を加え、３０℃、３時
間反応した。反応液からウルトロゲルＡｃＡ４４のカラ
ム（１，Ｏｘ　４５ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｃを溶出液
として精製した。

ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　
ＩｇＧをジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−セフ
ァローズ４Ｂのカラムに吸着後、ｐＨ２゜５で溶出した
。このアフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニル
ーウシ血清了ルブミン）Ｉ８ＧＩ７）０．１ｇ／Ａ溶液
を用いて、３．２　ｍｍ中のポリスチレンビーズ表面上
に公知の方法〔石川ら、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、第８巻（補７）４３頁（１９７ｇ）　］で物理
吸着により不溶化した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μβを０．３３Ｍ　
ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ１３０μβに溶解したジニトロ
フェニル−ウシ血清アルブミン−アビジン−ビオチニル
−グルタチオン−了ンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏ
ｌ）及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオチ
ニルーグルタチオンーアンギオテンシンＩ　（１００ｆ
ｒｎｏｌ）と共に２０℃にて３時間振盪下保温する。保
温後、反応液をアフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロ
フェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相（
２個）と共に２０℃にて３時間振盪下保温、その後、４
℃にて一晩静置した。その後、アフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相を０．１　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ２
ｍｌで２回洗浄後、結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
活性を測定した。

その結果を第１図に示した。

実施例■ ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービ
オチニルーグルタチオンーアンギオテンシン１１β−Ｄ
−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルーグルタチ
オンーアンギオテンシン■及びアフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相は実施例Ｉの方法で調製した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｌを０．３３Ｍ　
ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ１３０μＡに溶解したジニトロ
フェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービオチニル
ーグルタチオンーアンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏ
ｌ）及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼー了ビジンービオチ
ニルーグルタチオンー了ンギオテンシンＩ　（１００ｆ
ｍｏｌ）と共に２０℃にて３時間振盪下保温する。保温
後、反応液をアフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフ
ェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相（２
個）と共に２０℃にて３時間振盪下保温、その後、４℃
にて一晩静置した。その後、アフィニティー精製ウサギ
（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ
　不溶化固相を０．１　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ２
−で２回洗浄した。洗浄後、アフィニティー精製ウサギ
（抗ジニトロフェニルーウシ血清了ルブミン）　ＩｇＧ
　不溶化固相を１．０　ｍＭジニトロフェニル−Ｌ　−
ＩＪジン及び０．３　Ｍ　ＮａＣ］を含む緩衝液Ｄ１５
０μＡと共に２０℃にて１時藺振盪下保温する。保温後
、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウ
シ血清了ルブミン）　ＩｇＧ不溶化面相を取り去り、溶
液中に含まれるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定し
た。

その結果を第１図に示した。

実施例■ ジニトロフェニル−ウシ血清子ルブミンー了ビジンービ
オチニルーグルタチオンーアンギオテンシン■、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼーアビジンビオチニルーグルタチオ
ンーアンギオテンシン１及びアフィニティー精製ウサギ
（抗ジニトロフェニルーウシ血清了ルブミン）　ＩｇＧ
不溶化面相は実施例Ｉの方法で調製した。

アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ不溶化
固相の調製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧをウサギＩｇＧ−セファロ
ーズ４Ｂのカラムに吸着後、ｐＨ２，５で溶出した。こ
のアフィニティー精製ウサギ（抗ウサギＩｇＧ）　Ｉｇ
Ｇの０．１ｇ／β溶液を用いて、３．２鮒Φのポリスチ
レンビーズ表面上に公知の方法〔石川ら、５ｃａｎｄ。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ、前出〕で物理吸着により不溶
化した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μｍを０．３３　Ｍ
　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ１３０μＡに溶解したジニト
ロフェニル−ウシ血清アルブミンーアビジンービオチニ
ルーグルタチオンーアンギオテンシンＩ　（１００ｆｍ
ｏｌ）及びβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオ
チニルーグルタチオンーアンギオテンシンＩ　（１００
ｆｍｏｌ）と共に２０℃にて３時間振盪下保温する。保
温後、反応液をアフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロ
フェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相（
２個）と共に２０℃にて３時間振盪下保温、その後、４
℃にて一晩静置した。その後、アフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相を０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ
２ｄで２回洗浄した。洗浄後、アフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　Ｉｇ
Ｇ　不溶化固相を１．０　ｍＭジニトロフェニル−Ｌ−
ＩＪリジンび０．３　Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ１５
０μｌとアフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　Ｉｇ
Ｇ不溶化固相（２個）と共に２０℃にて１時間振盪下保
温する。保温後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニト
ロフェニルーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相
を取り去り、さらに２０℃にて２時間振盪下保温した。

アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ不溶化
固相を０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ２ｍ１２
で２回洗浄後、結合したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性
を測定した。

その結果を第１図に示した。

実施例■ アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ
血清アルブミン）ＩｇＧ不溶化固相は、実施例■の方法
で調製した。アフィニティー精製（抗ウサギＩｇＧ）　
ＩｇＧ不溶化固相は実施例■の方法で調製した。

ルーアンギオテンシンＩの調製１、ビオチニルーアンギオテンシンＩの調製アンギオテ
ンシンＩ　　１．Ｏｍｇ（０，７７μｍｏｌ）を溶解し
た蒸留水０．１８−と緩衝液Ａ１．６−を混合し、混合
液に４４　ｍＭビオチン−Ｎ−ハイドロキシサクシニミ
ドのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液０．１８ｒｎｆ
！を加え、３０℃、３０分間反応した。反応液からセフ
ァデックスＧ−１０のカラム（１，ＯＸ　４５ｃｍ　）
を用い、緩衝液Ａを溶出液として精製した。

２、β−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニル
ーアンギオテンシンＩの調製実施例■で調製したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジ
ン０．２２ｍｇ　（０，３６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝
液Ｃ１，５ｍｆｆに、ビオチニルーアンギオテンシンＩ
５゜５　μｇ　（３，６ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ａ
０．３−を加え、３０℃、３時間反応した。反応液から
ウル）ロゲルＡｃＡ４４のカラム（１，ＯＸ　４５ｃｍ
　）を用い、緩衝液Ｃを溶出液として精製した。

実施例Ｉで調製したジニトロフェニル−ウシ血清アルブ
ミン−アビジン４８μｇ　（０，３６ｎｍｏｌ）を溶解
した緩衝液Ａ　Ｌ　７　ｍｆにビオチニルーアンギオテ
ンシンＩ　　５．５μｇ　（３，６ｎｍｏｌ）を溶解し
た緩衝液Ａ０゜３ｍｌを加え、３０℃、３０分間反応し
た。反応液からウルトロゲルＡｃＡ４４のカラム（１，
ＯＸ　４５ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｃを溶出液として精
製した。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの標準液２０μβを０．３３　Ｍ
　ＮａＣ１を含む緩衝液Ｄ１３０μｊ２に溶解したジニ
トロフェニル−ウシ血清アルブミンーアヒシンービオチ
ニルーアンギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏ１）及びβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジンービオチニルーアン
ギオテンシンＩ　（１００ｆｍｏｌ）と共に２０℃にて
３時間振盪下保温する。保温後、反応液をアフィニティ
ー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミ
ン）　ＩｇＧ不溶化固相（２個）と共に２０℃にて３時
間振盪下保温、さらに４℃にて一晩静置した。その後、
アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ
血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を０．　Ｉ　Ｍ　
ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ２ｒｎｌで２回洗浄した。洗浄
後、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルー
ウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化固相を１．０　ｍ
Ｍジニトロフェニル−し−リジン及び０．３　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１を含む緩衝液Ｄ１５０μｌとアフィニティー精製（
抗ウサギＩｇＧ）　ＩｇＧ不溶化固相（２個）と共に２
０℃にて１時間振盪下保温する。保温後、アフィニティ
ー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミ
ン）ＩｇＧ不溶化固相を取り去り、さらに２０℃にて２
時間振盪下保温した。アフィニティー精製（抗ウサギＩ
ｇＧ）　ＩｇＧ不溶化面相を０．１　Ｍ　ＮａＣ１を含
む緩衝液Ｄ２−で２回洗浄後、結合したβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性を測定した。

その結果を第２図に示した。

実施例■ １、　　ビオチニル−ＨＩＶエピトープペプチドの合成（Ａ）　Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）
−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｒｐ　
（Ｆｏｒ）　−Ｇ　Ｉｙ−Ｃｙｓ　（ＭＢｚｌ）　−３
ｅｔ　（Ｂｚｌ）−Ｇ　１ｙ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）−Ｌｅ
ｕ−１ｉｅ−Ｃｙｓ　（ＭＢｚｌ）−０ＣＨ２−（＝）
−ＲＢＳＩＮ表記のペプチドはアメリカ合衆国アプライ
ド・バイオシステムズ社のペプチド固相合成装置（ＡＢ
Ｉ４３０Ａ）を用い、メーカーの取扱説明にそって合成
した。概略を述べると、固相のクロロメチル化樹脂に最
初のカルボキシ末端アミノ酸を結合させたＢｏｃ−Ｃｙ
ｓ　（ＭＢｚｌ）−０ＣＬ−＠；？−ＲＢＳＩＮ　（０
，５ｍｍｏｌｅ／　ｇ　）１．０ｇを出発材料として、
カルボキシ末端から順次アミノ酸を結合させてペプチド
鎮を延長していった。用いた原料アミノ酸のうち側鎖に
官能基を持つＬｙｓ、　Ｓｅｒ、　Ｃｙｓ、　Ｔｒｐ、
　Ａｒｇはそれぞれ次のように保護した。

Ｌｙｓ（ＣＩＺ）：　Ｎ２−２−Ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚ
ｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ。

５ｅｒ（Ｂｚｌ）：　０−Ｂｅｎｚｙｌ。

Ｃｙｓ（ＭＢｚｌ）：　Ｓ−４−Ｎｅｔｈｙ］ｂｅｎｚ
ｙｌ。

Ｔｒｐ（Ｆｏｒ）：　Ｎ１′″−Ｆｏｒｎ＋ｙｌ。

Ａｒｇ（Ｔｏｓ）：　Ｎ’−Ｔｏｓｙｌ、またα−アミ
ノ基はＢｏｃ基（Ｎα−ｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂ
ｏｎｙｌ）で保護した。

合成の途上各ステップでのＢｏ叶基の切断はトリフルオ
ロ酢酸（ＴＰＡ）で、またペプチド結合形成にはジシク
ロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）を用いた。最終
的に合成した保護ペプチド樹脂を装置から取出し、乾燥
することにより１．９９ｇの固体を得た。

（Ｂ）　Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ＞−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ）−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−ＬｅｕＧｌｙ−１１ａ−
Ｔｒｐ　（Ｆｏｒ）　−Ｇ　１ｙ−Ｃｙｓ　（ＭＢｚｌ
）　−３ｅｒ　（Ｂｚｌ）　−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　（ＣＩ
Ｚ）　−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ　（ＭＥｔｚ　１）　
−ＤＣ８２会ＲＢＳ　Ｉ　Ｎ（Ａ）で合成した固体を４
０％ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ□及び（ｉ、２　Ｎ　ＨＣＩ／
Ｄｉｏｘａｎｅで処理することにより、Ｂｏｃ−基を切
断する。減圧で酸、溶媒を除去し、ガラスフィルター上
で樹脂をＣＨ２Ｃｌ２でよく洗い、乾燥させる。このも
のと１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ　
Ｏ，２８ｇ１ビオチン０．５ｇをジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）　５０ｒｄ！に懸濁させ、冷却、攪拌下で水
溶性カルボジイミド０．３７ｍ１．を加えた。室温で一
晩反応させて、ニンヒドリン反応陰性なのを確認後、樹
脂をガラスフィルター上にのせ、ＣＨ２Ｃｌ２でよく洗
い、乾燥することにより２．０ｇのビオチニル化保護ペ
プチド樹脂を得た。

（Ｃ）　　Ｂｉｏｔｉｎｙｌ−八ｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙｌｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃ
ｙｓ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ＝１１ｅ−Ｃｙ
ｓ（Ｂ）で合成したビオチニル化保護ペプチド樹脂１、
０３　ｇ　（０，２５ｍｍｏｌ）をｐ−クレゾール０．
３３−でブタンジチオール１．Ｏｍ！！を含むフッ化水
素（ＨＦ）　５．４−で−５℃、６０分間処理すること
により、樹脂および全保護基を切断した。過剰のフッ化
水素を減圧で留去後、エーテル洗いにより添加物を除く
。残渣を５％酢酸に溶かし、Ｄｏｗｅｘ　ｌＸ２（酢酸
塩）カラム（１０ｇ）にかけ、素通り画分を凍結乾燥す
ることにより３３０ｍｇの粉末を得た。このものを０．
０５％アンモニア水２００ｉに溶かし、０．０１Ｍフェ
リシアン化カリ溶液を滴下しながら加え、反応液の黄色
が褪色しない点を終点とした。このようにシスティンを
酸化させて環化したペプチドを逆相ＨＰＬＣにより１０
〜６０％ＣＨ３［：Ｎ−８２０（０，１％ＴＦ八含有へ
のグラジェントにより精製した。３０〜４５％グラジェ
ント濃度溶出画分を再度、同ＨＰＬＣの系で精製して、
最終的に３２ｍｇの目的物を得た。このものにはアミノ
酸分析により構成アミノ酸残基がすべて理論どおり導入
されていることが確認された。またアビジン・カラムに
完全に吸着されることから、ビオチニル化されていると
考えられた。

２、　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−アビジン−ビオテ
ン−ＨＩＶエピトープペプチドの調製実施例１で調製し
たβ−Ｄ−ガラクトシダーゼーアビジン０．１５ｍｇ　
（０，２５ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ｃ１，０−にビ
オチニル−ＨＩＶエピトープペプチド５、　ＯＡｔ　ｇ
　（２，５ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ａ５．０μＡを
加え、３０℃、２時間インキュベートした。反応液をウ
ルトロゲルＡｃＡ　４４のカラム（１，Ｏｘ　４５ｃｍ
）にかけ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−アビジン−ビオ
チン−ＨＩＶエピトープベブチド（０，０９ｍｇ）を精
製単離した。

参考例（抗ウサギＩｇＧ）　Ｆ　ａｂ’−ペルオキシダーゼの
調製（抗ウサギＩｇＧ）　Ｆ　ａｂ“は、Ｎ−サクシニ
ミジル−６−マレイミドヘキサノエートを架橋剤として
、公知の方法〔橋田ら、Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、、　６．５６−６３　（１９８４）］でペルオキ
シダーゼ標識した。

アンギオテンシンＩ−ウシ血清アルブミン不溶化固相の
調製１、メルカプトアセチル−ウシ血清アルブミンの調製ウシ血清アルブミン２．０　ｍｇを溶解した緩衝液Ａ０
．４ｍｌに、８．８ｍＭＮ−サクシニミジル−８−アセ
チルチオアセテートのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶
液４０μｌを加え、３０℃、３００分間反応た。反応後
、反応液を１．０Ｍ）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐＨ７゜０
）４０μβ、０．１　Ｍ　ＢＤＴＡ（ｐＨ７，０）　４
０μβ及び１．０Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩溶液（ｐ
Ｈ７，０）　６０μｐと共に３０℃で１５分間反応した
。反応液からセファデックスＧ−２５のカラム（１，Ｏ
Ｘ　３０ｃｍ　）を用い、緩衝液Ｂを溶出液として精製
した。ウシ血清アルブミン１分子当たり６．０個のチオ
ール基が結合していた。

２、アンギオテンシン■−ウシ血清アルブミンの調製メルカプトアセチル−ウシ血清アルブミン１．５ｍｇ　
（２３ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液Ｂ３ｍＮに実施例■
で調製したマレイミド−アビジン０．３４ｍｇ　（２３
０ｎｍｏｌ）を溶解した緩衝液８３ｍ１２を加え、３０
ｔ、３００分間反応た。反応液からウルトロゲルＡｃＡ
４４のカラム（１，５ｘ　４５ｃｍ　）を用い、０．１
％ＮａＮ３を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）を溶出液として精製した。

チオール基の減少から、ウシ血清アルブミン１分子当た
り６．０個のアンギオテンシン■が結合していた。

３、アンギオテンシンＩ−ウシ血清アルブミン不溶化固
相の調製アンギオテンシン■−ウシ血清アルブミンの０゜１ｇ／
ｌ溶液を用いて、３．２　ｍｍ中のポリスチレンビーズ
表面上に公知の方法〔石川ら、５ｃａｎｄ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、前出〕で物理吸着により不溶化した
。

ウサギ抗アンギナテンシンＩＩｇＧの測定ウサギ抗アン
ギナテンシンＩＩｇＧの［４液２０μｌを０．：３３　
Ｍ　ＮａＣ１及び１．０ｇ／４１’ウシ血清フルブミン
を含む１０ｍＭ　ＩＪン酸す）ＩＪウム緩衝液１３０μ
βを混合した。混合液をアンギオテンシン■−ウシ血清
アルブミン不溶化固相と共に３７℃にて３時間振盪下保
温した。その後、アンギオテンシンＩウシ血清アルブミ
ン不溶化固相を０．１　Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　２　ｄで２回洗
浄した。洗浄後、了ンギオテンシンＩ−ウシ血清Ｔルブ
ミン不溶化固相を０．３　Ｍ　ＮａＣｌ及び１．０ｇ／
ｊ２ウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ　！Ｊン酸ナナ
トリウム緩衝液ｐＨ７，０）　１５０μｐに溶解した（
抗ウサギＩｇＧ）　Ｆ−ｂ’−ペルオキシダーゼ（５０
ｎｇ）と共に３７℃にて３時間振盪下保温する。保温後
、アンギオテンシンＩ−ウシ血清アルブミン不溶化固相
を同様に洗浄し、結合したペルオキシダーゼ活性を測定
した。

ペルオキシダーゼ活性は３−（４−ヒドロキシフェニル
）プロピオン酸を水素供与体として蛍光光学的に測定し
た。蛍光強度は５０ｍＭ硫酸に溶解した１ｍｇ／βキニ
ーネを標準として測定した。

その結果を第２図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例Ｉ、■及び■の測定結果を示したもので
ある。第２図は実施例■及び参考例の測定結果を示したもので
ある。いずれの図においても、横軸は測定対象であるウサギ抗
アンギオテンシンＩＩｇＧの血清中濃度を、縦軸は検出
された標識の量を表す蛍光強度である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式（ａ）又は（ｂ）で示されるビオチンとア
ビジンの結合またはビオチンとストレプトアビジンの結
合を介した標識体。（ａ）：Ｘ−ビオチン−アビジン−標識物（ｂ）：Ｘ−ビオチン−ストレプトアビジン−標識物（
式中、Ｘは抗原、抗体及び抗抗体からなる群から選ばれ
る免疫反応物質を表す。）
（２）請求項（１）記載の免疫反応物質が合成ペプタイ
ドであることを特徴とする請求項（１）記載の標識体。
（３）請求項（１）又は（２）記載の標識体及び固相化
物質を用いて、検体中の目的物質を含むサンドイッチ状
免疫複合体を固相上に形成せしめる工程を有することを
特徴とする目的物質の免疫測定法。