JPH0466876B2

JPH0466876B2 -

Info

Publication number: JPH0466876B2
Application number: JP23909783A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Myake; Takanori Oka
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1983-12-19
Filing date: 1983-12-19
Publication date: 1992-10-26
Also published as: JPS60130597A

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景技術分野本発明は、DNAやRAN等の核酸を合成するた
めの合成器に関する。さらに詳しくは、本発明
は、固相法によるオリゴヌクレオチド合成法の原
理を用いて手動によつて所望のDNAやRNA等の
オリゴヌクレオチドの合成が可能な核酸合成器に
関するものである。先行技術近年、遺伝子工学の飛躍的な進歩にともない、
核酸に関する研究において特に合成オリゴヌクレ
オチドの需要が増加しており、その合成技術も高
度化している。ところで、オリゴヌクレオチドの化学合成法と
しては、ジエステル法（Sciecn、203、614、
（1979））、トリエステル法（Nucleic Acids
Research、８、2331（1980）、同８、5193（1980）、
同８、5491（1980））、固相法（Nature、281、18
（1979）、Biochemistry、1980、6096（1980））、液
相法（Proc、Natl、Acad、Scr.USA75、5765
（1978））、酵素を用いる方法（Nucleic Acids
Research、８、5753、（1980）、ホスフアイト法
（Tetrahedron Letters22、1859（1981））、あるい
は現在繁用されているものとしてトリエステル法
−固相法（Nucleic Acids Researc、８、5507
（1980））、ホスフアイト法−固相法（J.Am.
Chem.Soc.103、3185−3191（1981））等の組み合
わせた方法等があり、最近これらの組み合わせた
方法に基づいて完全に自動化された核酸合成装置
が考案され、すでに数機種が販売されるに到つて
いる。しかしながら、完全に自動化された酸核合
成装置はいずれも大変高価なものであつて、容易
に購入し難いのが現状である。一方、現在、遺伝子工学の分野で必要なオリゴ
ヌクレチオドとしてはプライマー、プローブおよ
びリンカー等があるところ、これらは何れも鎖長
が15〜25のものが多く、１回の遺伝子操作の実験
で用いるオリゴヌクレオチド鎖は数本程度であ
り、また使用量もオリゴヌクレオチド鎖１につき
0.5OD程度である。従つて、高価な自動化された
核酸合成装置を購入するまでもなく、簡単な操作
でかつ安価にオリゴヌクレオチドの合成可能な装
置の開発が望まれているところである。発明の概要要旨本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、手動によつて容易にDNAやRNA等のオリゴ
ヌクレオチドの合成ができる核酸合成器を提供す
ることによつてこの目的を達成しようとするもの
である。従つて、本発明による固体支持体粒子上での反
応によつて核酸を合成するための核酸合成器は、
下記の部材からなること、を特徴とするものであ
る。 (A) 該固体支持体樹脂粒子を収容して該反応を行
なわせるのに十分な容積を有する円筒からなる
反応室。 (B) 反応室Ａの下方への延長部をなしかつ反応室
Ａの下部より内径の小さい、該固体支持体樹脂
粒子保持用フイルターを取付けるための取付
座。 (C) 取付座Ｂに取付けられた、該固体支持体樹脂
粒子保持用フイルター。 (D) 反応室Ａのさらに取付座Ｂの下方への延長部
をなす、反応室Ａへ該反応に関与する液相材料
を出入させるための給排液口。 (E) 反応室の上部に取付けられた、気体の圧力に
よつて給排液口Ｄから反応室へ液相材料を出入
させるための、給排気装置。たゞし、この給排
気装置Ｅは正負圧発生源Eaおよび弁装置Ebか
らなり、また正負圧発生源Eaは弁装置Ebを介
して反応室Ａの上部と連通している。効果このように本発明は手動操作が可能な核酸合成
器に関するものであるが、本発明の核酸合成器
は、操作マニユアルに従つてオリゴヌクレオチド
の合成を行なえば、有機化合成未経験者であつて
も、簡単な操作で確実にしかも高収率で所望のオ
リゴヌクレオチドを得ることができるというもの
である。従つて、高価な自動化された核酸合成装
置を使うまでもなく、安価に所望のオリゴヌクレ
オチドが得られるということはいうまでもない。また、本発明の核酸合成器は遺伝子工学の分野
において常用されるプライマー、プローブ、リン
カー等の合成が容易にできるということから該分
野の研究開発に多大な貢献をなすといえよう。本発明核酸合成器をその構成要素の面からみた
場合の一つの特色は、固相合成に必要な樹脂粒子
の層を支持すべく円筒反応器部分の底部に装着さ
れるフイルターがこの円筒反応器の直径より小さ
い直径の該円筒延長部に存在するということであ
る。この特色は、樹脂を反応器の特定部にあつめ
ることにより反応スケールを小さくし、かつ樹脂
と単量体ヌクレオシド溶液ないし溶媒との接触を
良好にするという点から有意義である。すなわ
ち、円筒反応器の値径より小さい直径の該円筒部
にフイルターを有するので、反応器に樹脂粒子を
入れると反応器の特定部に樹脂をあつめることが
できる。また、フイルター上に堆積した樹脂層は
単量体ヌクレオシド溶液ないし溶媒を下向きに流
した後はかなり密に充填された状態となるが、そ
の状態で次に溶液ないし溶媒をフイルター下方よ
り上向きに流すと、樹脂層が円筒部分（すなわ
ち、上下方向で内径が実質的に同一であるもの）
に存在する場合には、樹脂層がそのまゝの姿で、
すなわち個々の樹脂粒子に分解しないで、円筒部
で移動するだけであり、従つて樹脂粒子と溶液な
いし溶媒との接触が不十分となる。このような状
況において、本発明に従つて樹脂層を収容する反
応室が樹脂層上方において樹脂層部分より拡径さ
れているので、樹脂層はその下方から流入する溶
液ないし溶媒によつて個々の樹脂粒子に分解し、
その結果、樹脂粒子と溶液ないし溶媒との接触が
良好となる。固相法が樹脂粒子表面での反応を対
象としているところより、これらの特色は核酸合
成効率（洗浄効率を含む）の向上をもたらすもの
である。本発明装置は、また、反応室への液相材料の出
入を気体の圧力によつて行なうという点にも一つ
の特徴を有する。すなわち、反応室内に正圧条件
または負圧条件をつくり出すことによつて、液相
材料を反応室に出入させるので、液相材料を直接
に圧入する場合に比べて液相材料出入目的達成の
ための装置が簡単なものでよく（例えば第１図中
Eaのようにピストンとシリンダーとからなるも
の）、そのため液相材料変換の際の反応室および
樹脂の洗浄が容易でかつ確実である。というの
は、液相材料を圧入する場合は、圧入目的を達成
するために新たな装置を用いるか、あるいは液相
材料を圧入しやすくするために装置の変更の必要
性が生じ、また、装置変更に伴なつて液相材料変
更のたびに必要な洗浄操作が繁雑となつてくるか
らである。発明の具体的説明核酸合成器合成器の概要本発明による核酸合成器は、固体支持体樹脂粒
子上での反応によつて、すなわち固相法によつ
て、核酸を合成するのに使用する装置であつて、
前記の部材Ａ〜Ｅからなるものである。本発明装
置の可動部分は主として給排気装置Ｅであるが、
この部分の駆動は電動によりあるいは合成操作を
コンピユーター管理の下に行なうことも勿論可能
であるけれども、実験者が手動でこれを操作する
ことが本発明装置を利用するうえで最も好まし
い。手動によつて手軽に利用することを考えれば、
本発明装置での正負圧発生装置Eaはシリンダー
とピストンとからなる注射器であることが好まし
く、また正負圧発生装置Eaと弁装置Ebとの間な
らびに弁装置Ebと反応室Ａとの間、特に弁装置
Ebと反応室Ａとの間、は着脱自在に連結されて
いることが好ましい。本発明による合成器の一具体例は、第１図に示
す通りである。反応室Ａ反応室Ａは、固相合成用固体支持体樹脂粒子を
収容して該反応を行なわせるのに十分な容積を有
する円筒からなる。ここで「円筒」とは、断面が
実質的に円形であつて、直径（断面が真円でない
場合は相当直径）に比べて長さが十分に大きいも
の（特に、長さが少なくとも直径と同一であるも
の）を意味する。また、その断面の形状ないし大
きさは長さ方向に関して同一でなくてもよく、必
要に応じて内部に突起を有するものであつてもよ
い。反応室Ａの上部には、弁装置Ebの三方コツク
（詳細後記）の一つの口と連結しうるよう、直径
の小さい連結具Aaが設けてあることがふつうで
ある。連結具Aaは反応室上部の蓋をも兼ねてい
る。第１図の具体例では、反応室Ａと頂部構造物
Aaとは、テープないしチユーブAbで連結されて
いる。一方、反応室Ａの下部には、反応室円筒の内径
より小径のフイルター取付座Ｂが設けられている
（詳細後記）。反応室部分の材質は有機溶媒に耐性のものであ
れば如何なるものでもよく、ステンレス鋼、テフ
ロン、ガラス等の材質が適当なものとして考えら
れる。反応の状態や樹脂の状態が容易に確認でき
るということからは、ガラスが好ましい。また、
反応器の内壁をシリコンで被覆することによつて
ヌクレオチドの縮合反応に際して使用する樹脂が
付着しないようにすればさらに好ましい。なお、
円筒の内径としては通常10mm程度であれば十分で
ある。フイルター取付座Ｂ固体支持体樹脂粒子保持用フイルター（詳細後
記）を取付けるための取付座Ｂは、反応室Ａの下
方への延長部分をなし、かつ反応室Ａの下部より
直径の小さい部材である。ここで「反応室Ａの下
部より内径の小さい」ということは、このフイル
ターが取付けられている当該個所がこのフイルタ
ー取付座Ｂが接続されている個所での反応室Ａの
内径より小さければよいということを意味するも
のである。従つて、反応室Ａの上方にさらに小径
の部分が存在している場合を排除しないのであ
り、また第１図に示したもののようにこのフイル
ター取付座Ｂの内径が下方に向つて連続的に減少
する場合をも、またこのフイルター取付座Ｂの当
該フイルター取付個所より下方で拡径されている
場合をも、包含するものである。フイルター取付座Ｂの一具体例は図示のような
ロート状のものである。図示のものは直径に比べ
て上下方向の寸法が比較的小さいが、図示のもの
よりも縦長のロート状であつても勿論差支えな
い。また、ロートの内径は連続的に減少（下方
へ）していてもよいが、内径の減少は段階的であ
つてもよい。フイルターＣフイルターＣは、固相合成法用の固体支持体樹
脂粒子を支承しかつ液相材料の通過を許容する構
造のものであれば任意の形状、素材その他のもの
でありうる。最も典型的なフイルターは、所謂ガラスフイル
ターとして知られている過部構造のものであ
る。また、セラミツクもフイルター部材と考えら
れる。フイルターとしての開孔度は、支持体樹脂
粒子が逸脱しないよう40〜50ミクロン程度（ガラ
スフイルターでいえばＧ−２規格品程度）である
ことが好ましい。フイルターの他の具体例は、グラスウールであ
る。フイルターＣは取付座Ｂに取付けられている
が、ここで「取付けられた」ということは取付座
から着脱可能である場合と着脱不能の場合のいず
れをも包含するものとする。着脱可能である場合
には、その下方より進入してくる合成反応用液相
材料によつて上方に押上げられないようにその取
付け方に配慮すべきである。給排気口Ｄ給排液口は、反応室Ａのさらに取付座Ｂの下方
への延長部をなして存在する。これは、単なる開
口である場合の外に、第１図に示したように給排
液管Daの形をなしていてもよい。給排気装置Ｅ給排気装置Ｅは、反応室内に正圧および負圧を
必要に応じてつくり出して、その圧力によつて反
応室内への液相材料の出入を行なわせるためのも
のである。従つて、この装置は正負圧発生装置
Eaと弁装置Ebとからなつており、また正負圧発
生源Eaは弁装置Ebを介して反応室Ａの上部と連
通している。正負圧発生装置Eaは、合目的的な任意のポン
プ装置であることができる。しかし、装置ないし
操作の簡便性からすれば、第１図に示したような
シリンダーとピストンとからなるものが好まし
い。弁装置Ebは、三方コツクからなるものがふつ
うである。その場合には、第一の口が反応室Ａの
上部と連通しており、第二の口が正負発生源Ea
（これがシリンダーとピストンとからなるもので
ある場合には、シリンダー）と連通しており、第
三の口が閉鎖されているように管路が構成されて
いることが好ましい。第三の口は、固相法用樹脂
粒の乾燥のためあるいは反応系雰囲気形成のため
の不活性ガス（たとえば窒素）を導入するために
便利に使用することができる。上記の好ましい三
方コツクの構造は、第１図の三方コツクEbにつ
いてその回転部分に点線で示した管路を有する。操作マニユアル本発明の核酸合成器の操作、すなわち本発明核
酸合成器によるオリゴヌクレオチドの合成、は下
記のマニユアルに従つて行なうことがふつうであ
る。なお、この操作マニユアルは好ましい具体例
についてのそれであるので、下記以外の操作条件
もありうることはいうまでもない。核酸合成の概要 DNA、RNA等の核酸の合成は、本発明の核酸
合成器を用い固相法によつてヌクレオチドを縮合
させることにより行なうものである。本発明によ
る合成器は、DNAやRNA等のオリゴヌクレオチ
ドの合成を主目的としてなされたものであり、オ
リゴヌクレオチドの合成方法としては樹脂に固定
されたヌクレオチドにモノマーを順次縮合させた
り、ヌクレオチドブロツク（モノマー、ダイマ
ー、トリマー等）を適宜選択して縮合をくり返す
ことにより所望のオリゴヌクレオチドを得る方法
等が考えられるが、何れで行なうかは原料ヌクレ
オチドブロツクの調製、反応の回数縮合の平均収
率および目的生成物の分離精製等を考慮して適宜
選択すればよい。具体的な固相法によるオリゴヌ
クレオチドの合成方法は後記実施例および文献
（Nucleic Acids Rcsearch８、5507（1980））等を
参照されたい。 3¹−末端ヌクレオチドの樹脂への導入オリゴヌクレオチド合成に使用する樹脂に所望
のオリゴヌクレオチドの3¹−末端ヌクレオシドを
固定化する。樹脂とヌクレオシドの結合方法は種
種考えられるが、アミノ基をもつ樹脂とヌクレオ
シドのコハク酸誘導体との縮合（Nucleic Acids
Research、８、5473（1980））によるのが通例で
ある。なお、手取り早いものとしては、核酸合成
用試薬として5¹−水酸基が保護されたヌクレオシ
ドが樹脂に固定化されたものが市販されており、
例えばアミノメチルポリスチレン樹脂（0.10〜
0.15ｍmol／ｇ、１％ジビニルベンゼン100〜
200mesh）〔バイオサーチ社〕等がある。本発明
の場合は該市販品を用い、これを反応器に20mg詰
める。樹脂の膨潤固相法でオリゴヌクレオチド等の合成をすると
きの通例の操作であり、通常は脱保護に使用する
溶媒（本発明では塩化メチレン）で樹脂を膨潤さ
せる。本発明では、塩化メチレンを注射器Eaで
吸収し、反応室Ａ内にこれを一定時間放置するこ
とにより行なう。膨潤後の溶媒は、注射器Eaの
ピストンを押して反応室内を正圧にすることによ
つて反応室外へ排出する。脱保護操作ヌクレオチド鎖の延長は、まず樹脂に固定化さ
れたヌクレオシドの5¹−末端水酸基の脱保護を行
なつたのち、これとヌクレオチドブロツクのリン
酸残基との脱水縮合反応を行ない、ついで未反応
5¹−水酸基の保護を行ない、以下同様の一連の操
作をくり返すことにより行なう。通常5¹−水酸基
の保護基はジメトキシトリチル基であるので、ベ
ンゼンスルホン酸、ZnBr₂（Nucleic Acids
Research、10、1755（1982））、TCA（三塩化酢
酸）等で脱保護を行なう。本発明では、TCA含
有塩化メチレンを吸収し、反応室内にこれを一定
時間放置することにより行なう。離脱した保護基
を含む溶媒は注射器Eaの操作によつて反応室か
ら排出させ、必要に応じて溶媒を反応室Ａ内に吸
収し、次いでこれを排出させる操作を繰返すこと
によつて樹脂を洗浄する。縮合反応縮合反応は、縮合剤存在下で、樹脂上の5¹−水
酸基とヌクレオチドブロツク（その5¹−水酸基は
たとえばジメトキシトリエチル基で保護してあ
る）のリン酸基との脱水縮合によつて行なう。縮
合剤としては、アレンスルホン酸のトリアゾリ
ド、テトラゾリド誘導体が種々開発されている
が、２，４，６，−トリメチルベンゼンスルホニ
ル−３−ニトロトリアゾリド（以下MSNTと記
す）や、トリイソプロピルベンゼンスルホニルテ
トラゾリド（TPSTeと記す）が代表的である。
本発明の合成器では、縮合剤、およびヌクレオチ
ドブロツクを溶解したピリジン溶液を吸引して、
これを反応室内に少なくとも30分放置することに
より縮合反応を行なう。縮合後は、過剰の反応体
等を排出させ、必要に応じて考えこのように樹脂
を洗浄する。未反応5¹−水酸基の保護縮合反応は必らずしも定量的に進行しないの
で、上記の縮合反応の場合も所定鎖長に達しない
ものが副成するのは避け難い、そのような短鎖長
物が混在したまゝさらに縮合反応を行なうと、縮
合反応の各段階でそれぞれ短鎖長物が副成するの
で、ある縮合工程後には各種の鎖長のものが混在
していることになる。そのような状態になるのを
避けるため、一回の縮合工程実施後に、縮合が起
らないで5¹−水酸基が脱保護されたまゝで存在す
る短鎖長物をその後の縮合反応に関与しないよう
にその5¹−水酸基を保護することが望ましい。こ
のような短鎖長物の5¹−水酸基の保護は、アセチ
ル化等によつて行なうことがふつうである。本発
明ではジメチルアミノピリジンを含むピリジン−
無水酢酸（９：１（ｖ／ｖ））を吸引したのち、少
なくとも５分間放置することによりアセチル化を
行なうことによつて、未反応5¹−水酸基の保護を
行なう。このように短鎖長物の反応性を封鎖したのち、
所望の回数だけ上記脱保護、縮合、および未反応
5¹−水酸基の保護の一連の操作をくり返すことに
よつて、所望のオリゴヌクレオチドを得ることが
できる。なお、本発明の場合の縮合反応の収率
は、上記脱保護操作で遊離するトリチル基を比色
定量することにより行なう。オリゴヌクレオチドの回収および精製オリゴヌクレオチドの回収・精製は、通常、樹
脂に固定化されたオリゴヌクレオチドの遊離と5¹
−末端ヌクレオチドの5¹−水酸基の保護基以外の
脱保護とを行なつたのち、5¹−水酸基の脱保護を
行ない、ついでクロマトグラフイー、電気泳動等
を行なうことからなる。その一実施態様としては、反応室中にテトラメ
チルグアニジン−ピリジン−２−カルボアルドキ
シメイトのジオキサン−水（９：１、ｖ／ｖ）溶
液を吸引してこれを室温で少なくとも一昼夜放置
したのち、この溶液を排出させて回収する。この
溶液に濃アンモニア水を加えて55℃で放置し、つ
いで脱トリチル（例えば80％酢酸処理）を行なつ
たのち、脱塩し、HPLCで精製を行なうという方
法が考えられる。また、本実施態様では樹脂からオ
リゴヌクレオチドを遊離させる前に、反応器中の
樹脂をピリジンに懸濁させて、この懸濁液を反応
器から耐圧性容器にとり出し、ピリジンを留去し
たのち、上記と同様のヌクレオチドの樹脂からの
遊離、つづく脱保護操作を行なつてもよい。な
お、詳細な操作等については後記実施例を参照さ
れたい。塩基配列の確認上記のようにして合成器から取出した核酸は所
定の塩基配列のものである筈であるが、必要に応
じてその確認を行なうことができる。塩基配列の
確認は、レイ・ウーらの塩基配列決定法
（Methods in Enzymology65、Nucleic Acids
Part 、620、（1980））、あるいはマキサム・
ギルバート法（同、499、（1980））によつて容易
に行なうことができる。実験例実験例１下記の手順に従つてGTTCT（ただし、Ｇはグ
アニンを、Ｔはチミンを、Ｃはシトシンを、また
以下の実験例においてＡとあるのはアデニンを、
それぞれ含有するヌクレオチドを示す）を合成し
た。 (1) 樹脂の膨潤ジメトキシトリチルチミジンが固定化された
樹脂（市販品）30mgを反応室につめ、塩化メチ
レン（以下CH₂Cl₂とする）を容器CH−３
（CH₂Cl₂は三つの容器に用意しておき、各々の
容器をCH−１、CH−２、CH−３とした）よ
り吸引し、さらに空気１mlを吸引（以下この操
作を行なうのは樹脂が均一に懸濁されるのを目
的とするものである）した。さらにCH₂Cl₂を
吸引、排出する操作を２回くり返し、３回目に
CH₂Cl₂を吸引したまま30分間放置した。 (2) 脱トリチル ○イ容器CH−１より吸引したCH₂Cl₂を排出し
たのち、３％TCA含有CH₂Cl₂1ml吸を上げ
（この場合、反応室内の溶液は橙色であつ
た）、さらに空気１mlを吸引したのち少なく
とも１分間放置してから、溶液を排出した
（なお、この溶液は回収率を求めるため保存
した）。 ○ロついでCH₂Cl₂を容器CH−２より１ml吸引
し、さらに空気１mlを吸引したのち直ちに排
出した。なお、この操作は３回行なつた（ト
リチル化剤を洗いおとすため）。 ○ハ３％TCA含有CH₂Cl₂（以下、３％TCA／
CH₂Cl₂と略記）で着色（橙〜黄色）が見ら
れなくなるまで、○イ、○ロの操作をくり返した
（脱トリチルの確認）。なお、ここで注意すべ
きことは、２回目以降の３％TCB／CH₂Cl₂
処理の時間は10秒以内に限る（というのは、
脱トリチル反応は１回でほぼ確実におこなわ
れるが、確認の意味で○ハを操作を行なうわけ
である。従つて、脱トリチルされたものに、
さらに脱トリチル化剤を加えるので長時間処
理すると副反応であるデブリネーシヨンが起
こつて塩基が脱落する恐れがあるからであ
る）ということである。 ○ニ CH₂Cl₂を容器CH−３より１ml吸引し、さ
らに空気１mlを吸引したのち直ちに排出した
（洗浄）。この操作は計３回行なつた。 (3) 縮合反応 ○イ無水ピリジン（以下無水ピリジンをPyと
し、これも三つの容器に用意し各々容器を
Py−１、Py−２、Py−３とした）を容器Py
−１より１ml吸引し、さらに空気１mlを吸引
したのち直ちに排出した。ついでこの操作を
２回くり返した。 ○ロ容器Py−２よりPy1mlを吸い上げ、○イと同
様の操作を計３回くり返した。 ○ハ容器Py−３を用いて上記○イ、○ロと同様の
操作を２回くり返した。 ○イ〜○ハの操作は溶液の変換を目的として行なつ
た。 ○ニ三方コツクでピストン側だけを閉じたの
ち、ガス流入口より窒素ガスを300ml／分の
流速で10分間通じた。（樹脂の乾燥）。 ○ホ三方コツクでガス流入口だけを閉じ、Py
に溶解したMSNT（20mg）およびヌクレオチ
ド（TCのダイマー20mg）の溶液0.3mlを反応
室内に吸引したのち、反応器部分の溶液吸入
口を密封して室温で30分間放置してから、溶
液を排出した。 ○ヘ縮合剤および反応ヌクレオチドを洗いおと
すため、○イ〜○ハの操作をくり返した。 (4) 未反応5¹−水酸基の保護（マスキング） ○イ触媒量（約10mg）のジメチルアミノピリジ
ンを含むPy−無水酢酸（９：１（ｖ／ｖ））
溶液１mlを吸引し、さらに空気１mlを吸引
後、反応器の溶液吸引口を密封し５分間放置
してから、溶液を排出した。 ○ロ上記(3)の操作中、○イおよび○ロと同様の操
作
を行なつた（洗浄）。 ○ハ CH₂Cl₂を容器CH−１より１ml吸引し、つ
いで空気１mlを吸引したのち直ちに溶液を排
出した。この操作を計３回行なつた。 ○ニ容器CH−３からのCH₂Cl₂を用い、上記○ハ
と同様の操作を３回くり返した（以上○ハ、○ニ
は洗浄）。ここまでの段階でトリヌクレオチドである
TCTが合成され、ついでダイマー（GT）を用い
て上記２〜４と同様の操作を行なうことによつ
て、最終的にペンタマー（GTTCT）を得た。なお、縮合収率は操作(2)の○イの操作で回収した
脱トリチル溶液の比色定量（OD504）を行なつ
た結果、平均93％であつた（下表参照）。

【表】 (5) オリゴヌクレオチドの回収・精製上記の縮合終了後、樹脂を乾燥し、0.5Mピ
コリンアルドキシムーテトラメチルグアニジン
のピリジン−水（９：１）溶液300μを加え
て、37℃で一夜放置した。次に、濃アンモニア
水（４ml）を加え、55℃で一夜放置後、過を
行なつて樹脂を除去し、液を水に溶解し、エ
ーテルで抽出を行なつた（脱保護）。次に、セ
フアデツクスＧ−50を用いてゲル過（溶出
液は50ｍＭトリエチルアンモニウムバイカーボ
ネート、PH7.5）を行なつた。この際、各フラ
クシヨンの260nｍの吸収を測定し、最初に溶
出したピークを集めて高速液体クロマトグラフ
イー（HPLC）を行ない、ついで８％酢酸２ml
中で室温10分間反応させて5¹−水酸基体として
目的とする合成フラグメントを分取した。な
お、カラムはμBondapak C18（逆相）を用い
た。合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列の
確認は、レイ・ウーらの法により行ない
GTTCTであることが確認できた。実験例２実験例１と同様にして鎖長13
（GCGATGCTGCGTG）のオリゴヌクレオチド
の合成を行ない、回収・精製を行なつた。また、
塩基配列の確認をレイ・ウーらの方法によつて行
なつた結果、第３図に示されるように
GCGATGCTGCGTGであることがわかつた。第
２図中右端に縦に示してあるのが塩基配列であ
る。実験例３実験例１、２と同様の操作方法で鎖長20のオリ
ゴヌクレオチドを合成した。その塩基配列は GA−CA−AAA−GC−TT−GG−GG AA−TT−Ｃであり、ヌクレオチドブロツク
としてはダイマー25mgおよびトリマー30mgを用
い、順次合成をくり返して目的の鎖長とした通算
縮合収率は35％であつた。なお、精製、回収も実
験例１と同様に行ない、塩基配列の確認はマキサ
ム・ギルバート法によつて行なつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のDNA合成装置の一具体例
を示す説明図である。Ａ……反応室、Ｂ……フイルター取付座、Ｃ…
…フイルター、Ｄ……給排気液口、Ｅ……給排気
装置。第２図は、レイ・ウーらの塩基配列決定法
を行なつたときのオートラジオグラムを模写した
ものである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の部材からなることを特徴とする、固体
支持体樹脂粒子上での反応によつて核酸を合成す
るための核酸合成器。 (A) 該固体支持体樹脂粒子を収容して該反応を行
なわせるのに十分な容積を有する円筒からなる
反応室。 (B) 反応室Ａの下方への延長部をなしかつ反応室
Ａの下部より内径の小さい、該固体支持体樹脂
粒子保持用フイルターを取付けるための取付
座。 (C) 取付座Ｂに取付けられた、該固体支持体樹脂
粒子保持用フイルター。 (D) 反応室Ａのさらに取付座Ｂの下方への延長部
をなす、反応室Ａへ該反応に関与する液相材料
を出入させるための給排液口。 (E) 反応室の上部に取付けられた、気体の圧力に
よつて給排液口Ｄから反応室へ液相材料を出入
させるための、給排気装置。たゞし、この給排
気装置Ｅは正負圧発生源Eaおよび弁装置Ebか
らなり、また正負圧発生源Eaは弁装置Ebを介
して反応室Ａの上部と連通している。２正負圧発生源Eaがシリンダーおよびピスト
ンからなり、弁装置Ebが三方コツクからなつて
いて、この三方コツクはその第一の口が反応室Ａ
の上部と着脱自在に連結されており、第二の口が
正負圧発生源Eaのシリンダーと連結されてお
り、、第三の口が閉鎖されるように管路が構成さ
れたものである、特許請求の範囲第１項記載の核
酸合成器。