【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、ブレビバクテリウム属に属する菌体
の培養方法に関するものである。
本発明の方法によれば、ブレビバクテリウム属
に属する菌体内に産生されるアスパルターゼ含量
を増加させることができ、アスパルターゼ相対比
活性が著しく大きくなる。
アスパルターゼが、フマール酸とアンモニアか
らＬ−アスパラギン酸を生成する反応の酵素触媒
であることはよく知られている。また、このＬ−
アスパラギン酸は、重要なアミノ酸の一つとして
広く知られており、医療品や食品添加物等として
用いられている。
従来、種々の菌体を用いた醗酵法或いは、これ
ら菌体の産生するアスパルターゼを利用する酵素
法により、フマール酸及びアンモニア等からＬ−
アスパラギン酸を製造する試みが数多く提案され
ている。
この場合、高いアスパルターゼ活性を有する菌
体を新たに自然界から採取することは重要なこと
である。しかしながらこの様な菌体を入手するこ
とは極めて困難であるので、これに代つて例え
ば、本発明者らの提案（特開昭56−26196号公報）
した、ブレビバクテリウム属に属する菌体にα−
アミノ−ｎ−酪酸耐性を付与し、フマール酸及び
アンモニアからＬ−アスパラギン酸を合成する能
力を高める方法、またI.Chibata et.al.、Appl.
Microbiol.、27，878（1974）の提案しているアス
パルターゼ生産菌としてエシエリヒア・コリを用
い、該菌体の培養終了後、該菌体をフマール酸を
含む水溶液に37℃にて数10時間浸漬することによ
り約10倍、アスパルターゼ活性を増加させ得るこ
とが知られている。この方法における活性の増加
は、菌体の細胞膜が自己消化により破壊され、基
質および生成物の透過効率が向上したため、見か
け上活性が上昇したことが明らかにされている。
更に、特開昭57−138383号公報では、アスパルタ
ーゼ活性を有する微生物等を酸処理してフマラー
ゼ活性のみを選択的に失活させてＬ−アスパラギ
ン酸の収率を高める方法を提案している。
しかしながら、Ｌ−アスパラギン酸を工業的に
製造することを目的とする場合、上述した、培養
後のアスパルターゼを含む菌体の処理によりアス
パルターゼ活性を高める等によりＬ−アスパラギ
ン酸の収率を向上することは異なり、菌体の産生
するアスパルターゼの量を増大させることも重要
なことである。
本発明者らは、上記観点から短い培養時間でか
つ高収量でアスパルターゼを得る方法につき、ブ
レビバクテリウム属に属する菌体の培養法を鋭意
検討したところ、該菌体をフマール酸の特定量を
含有する培地で好気的に培養すると菌体内に産生
されるアスパルターゼ含量が短い培養時間で著し
く増加することを見い出し本発明を完成した。
即ち、本発明は、ブレビバクテリウム属に属す
る菌体を培養する方法において、該アスパルター
ゼ産生能を有する菌体をフマール酸を0.5〜2.8％
含有する培地で好気的に培養することを特徴とす
るブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法を
提供するものである。
本発明において用いられるアスパルターゼを産
生する菌体は、ブレビバクテリウム属に属する菌
体である。例えば、ブレビバクテリウム・フラバ
ム MJ233（FERM3068）、ブレビバクテリウ
ム・フラバム MJ233からα−アミノ−ｎ−酪酸
耐性株として誘導した菌株：ブレビバクテリウ
ム・フラバム MJ233−AB−41（FERM3812）
特開昭56−26196号公報参照）等がある。
本発明において使用する培地の炭素源、窒素源
及び無機塩等の培地組成は特に限定されるもので
はない。炭素源としては、例えばエタノール、ｎ
−パラフイン、糖蜜等を使用することができ、窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩もしくは
アンモニア、尿素などが適当である。無機塩とし
ては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリ
ウム、硫酸アグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育に必要であれば、ベプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザ
ミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し
て用いることもできる。
培養は通気攪拌、振とう等を行いながら好気的
条件下で行なう。培養温度は20〜40℃、好ましく
は25〜35℃で行なう。培養途中のPHは５〜10、好
ましくは約７〜約８にて行なう。また、培養液の
PHの調整には、酸或いはアルカリを添加する公知
の方法が用いられる。
本発明の方法は、上記ブレビバクテリウム属に
属する菌体を上記の培地中で培養するが、その際
にフマール酸を0.5〜2.8重量％、好ましくは１〜
2.6重量％の範囲で添加して行う必要がある。上
記フマール酸の添加量がこの範囲から外れると培
養物のアスパルターゼ相対比活性の改良が小さい
か殆どない。培養開始時のエタノール濃度は１〜
５容量％、好ましくは２〜３容量％が適する。培
養期間は通常15〜24時間行われる。
本発明の方法で培養した菌体は、活性の高いア
スパルターゼを高濃度に含有しているので、この
菌体を含む培養液、培養液から分離した菌体、菌
体の破壊物又は磨砕物、菌体の自己消化液及び菌
体を固定化したものなどを用いる公知手法によ
り、フマール酸または、そのナトリウム塩もしく
はカルシウム塩等のフマール酸塩およびアンモニ
アまたは、塩化アンモニウムもしくは炭酸アンモ
ニウム等のアンモニウム塩から効率的にＬ−アス
パラギン酸を生合成することができる。
Ｌ−アスパラギン酸の製造法としては、例えば
Ｌ−アスパラギン酸の製造に供する酵素源とし
て、本発明の方法で培養した菌体、又はその固定
化物等の処理物を用いることができ、さらに好ま
しくは該菌体もしくはその固定化物をあらかじめ
Ｌ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの存
在下で且つPHのアルカリ域に於いて40℃以上60℃
以下に加熱処理した処理物を用いることもでき
る。
フマール酸又はその塩とアンモニア又は無機ア
ンモニウム塩を用いる場合には、これら２成分の
モル比は１：１〜５の間にあるのが適当である。
酵素反応は、０〜60℃の温度範囲で実施すること
ができるが、アスパルターゼの安定性を考慮して
20〜50℃で実施するのが好ましい。
実施例 １
第１表に示した培地50mlを500ml容三角フラス
コに分注し、120℃で15分間滅菌処理したものに、
エタノール２容量％を添加後、アスパルターゼ生
産菌であるブレビバクテリウム・フラバム
MJ233−AB−41（FERM3812）を植菌し、30℃
にて24時間培養を行なつた。この培養液20mlを、
２のジヤーフアーメンター中の第２表に示す組
成の培地１に接種し、33℃、PH7.6（28％アンモ
ニア水で調整）にて、通気量1vvm、攪拌回転数
800rpmにて20時間培養を行つた。この際、添加
するフマール酸の温度を第４表に示した通り０〜
2.5重量％と変化させた。すべての実験において
培地中のエタノール濃度は１〜1.5容量％に保た
れるようにエタノールを断続的に添加した。
培養終了後、培養液を遠心分離（4000rpm、15
分間）したのち集菌体を蒸留水に懸濁し、O.D.
（光学密度、波長610mmでの吸光度）値50の菌体懸
濁液を調整し、該菌体懸濁液を供試液とした。
アスパルターゼ活性の測定は、第３表に示した
反応液の1.0mlを46℃にて１時間反応を行つた後、
該反応終了液を遠心分離（4000rpm、15分間）
後、その上澄液中のアスパラギン酸生成量をロイ
コノストツクメセンテロイデス ATCC8042によ
る微生物定量法により求めることにより行ない、
アスパルターゼ活性は、フマール酸無添加で培養
した菌体の酸素活性を100とする相対比活性をも
つて表示した。
得られた結果を第４表に示した。
第１表
尿素 ４ ｇ
（NH4）2SO4 14 〃
K2HPO4 0.5〃
KH2PO4 0.5〃
MgSO4・7H2Ｏ 0.5〃
酵母エキス １ 〃
カザミノ酸 １ 〃
ビオチン 200 μｇ
塩酸チアミン 100 〃
FeSO4・7H2Ｏ ６ mg
MnSO4・４〜6H2Ｏ ６ 〃
蒸留水 1000 ml
第２表
（NH4）2SO4 23 ｇ
KH2PO4 0.5〃
K2HPO4 0.5ｇ
MgSO4・7H2Ｏ 0.5〃
酵母エキス ３ 〃
カザミノ酸３ 〃
ビオチン 200 μｇ
塩酸チアミン 100 〃
FeSO4・7H2Ｏ 20 mg
MnSO4・４〜6H2Ｏ 20 〃
蒸留水 1000 ml
第３表
フマール酸 500 μmole
MgSO4・7H2Ｏ 10 〃
Tween20* １ μl
供試液 0.1ml
全量
１ml（28％アンモニア水にてPH９ ．４に調整）
〔＊印：和光純薬(株)製非イオン系界面活性
剤、商品名〕
The present invention relates to a method for culturing bacterial cells belonging to the genus Brevibacterium. According to the method of the present invention, it is possible to increase the content of aspartase produced within microbial cells belonging to the genus Brevibacterium, and the relative specific activity of aspartase is significantly increased. It is well known that aspartase is an enzymatic catalyst for the reaction that produces L-aspartic acid from fumaric acid and ammonia. Also, this L-
Aspartic acid is widely known as one of the important amino acids and is used as a medical product and food additive. Conventionally, L- is produced from fumaric acid, ammonia, etc. by fermentation methods using various bacterial cells or enzymatic methods using aspartase produced by these bacteria.
Many attempts have been proposed to produce aspartic acid. In this case, it is important to newly collect bacterial cells with high aspartase activity from nature. However, it is extremely difficult to obtain such bacterial cells, so instead, for example, the proposal of the present inventors (Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-26196)
α-
A method for conferring amino-n-butyric acid tolerance and increasing the ability to synthesize L-aspartic acid from fumaric acid and ammonia, also by I. Chibata et.al., Appl.
Microbiol., 27, 878 (1974) proposed Escherichia coli as an aspartase-producing bacterium. After culturing, the bacterium was placed in an aqueous solution containing fumaric acid at 37°C for several tens of hours. It is known that immersion can increase aspartase activity by about 10 times. It has been revealed that the increase in activity in this method is due to the destruction of the bacterial cell membrane by autolysis, which improves the permeation efficiency of substrates and products, resulting in an apparent increase in activity.
Furthermore, JP-A-57-138383 proposes a method of increasing the yield of L-aspartic acid by treating microorganisms with aspartase activity with acid to selectively inactivate only fumarase activity. . However, when the purpose is to industrially produce L-aspartic acid, the yield of L-aspartic acid can be improved by increasing the aspartase activity by treating the aspartase-containing bacterial cells after culturing as described above. It is also important to increase the amount of aspartase produced by the bacterial cells. In view of the above, the present inventors have intensively investigated a method for culturing bacteria belonging to the genus Brevibacterium in order to obtain aspartase in a short culture time and in high yield. The present invention was completed based on the discovery that when cultured aerobically in a medium containing the following, the content of aspartase produced within the microbial cells increases significantly in a short culture time. That is, the present invention provides a method for culturing microbial cells belonging to the genus Brevibacterium, in which the microbial cells having aspartase-producing ability are cultured with fumaric acid in an amount of 0.5 to 2.8%.
The present invention provides a method for culturing bacteria belonging to the genus Brevibacterium, which is characterized by culturing aerobically in a medium containing the present invention. The aspartase-producing bacterial cells used in the present invention belong to the genus Brevibacterium. For example, Brevibacterium flavum MJ233 (FERM3068), a strain derived from Brevibacterium flavum MJ233 as an α-amino-n-butyric acid resistant strain: Brevibacterium flavum MJ233-AB-41 (FERM3812)
(Refer to Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-26196). The composition of the medium used in the present invention, including the carbon source, nitrogen source, and inorganic salts, is not particularly limited. Examples of carbon sources include ethanol, n
- Paraffin, molasses, etc. can be used, and suitable nitrogen sources include ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate, or ammonia, urea and the like. As the inorganic salt, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, agnesium sulfate, etc. are used. In addition, nutrients such as veptone, meat extract, yeast extract, cornstarch liquor, casamino acids, and various vitamins can be added to the medium if necessary for the growth of the bacteria. Cultivation is carried out under aerobic conditions with aeration, stirring, shaking, etc. The culture temperature is 20-40°C, preferably 25-35°C. The pH during the cultivation is 5 to 10, preferably about 7 to about 8. In addition, the culture solution
A known method of adding acid or alkali is used to adjust the pH. In the method of the present invention, the bacterial cells belonging to the genus Brevibacterium are cultured in the above medium, and at this time, fumaric acid is added in an amount of 0.5 to 2.8% by weight, preferably 1 to 2.8% by weight.
It is necessary to add it within the range of 2.6% by weight. When the amount of fumaric acid added is outside this range, the improvement in the relative aspartase activity of the culture is small or almost non-existent. Ethanol concentration at the start of culture is 1~
5% by volume, preferably 2-3% by volume is suitable. The culture period is usually 15 to 24 hours. Since the bacterial cells cultured by the method of the present invention contain highly active aspartase at a high concentration, culture fluid containing these bacterial cells, bacterial cells isolated from the culture fluid, destroyed or ground bacterial cells , Fumaric acid or a fumarate salt such as its sodium salt or calcium salt, and ammonia or an ammonium salt such as ammonium chloride or ammonium carbonate, by a known method using an autolytic solution of bacterial cells or immobilized bacterial cells. L-aspartic acid can be efficiently biosynthesized from In the method for producing L-aspartic acid, for example, bacterial cells cultured by the method of the present invention or a treated product such as an immobilized product thereof can be used as an enzyme source for producing L-aspartic acid, and more preferably. The bacterial cells or their immobilized products were heated in advance at 40°C or higher and at 60°C in the alkaline pH range in the presence of L-aspartic acid and ammonium ions.
A heat-treated product can also be used below. When using fumaric acid or a salt thereof and ammonia or an inorganic ammonium salt, the molar ratio of these two components is suitably between 1:1 and 5.
The enzymatic reaction can be carried out at a temperature range of 0 to 60°C, but considering the stability of aspartase,
Preferably it is carried out at 20-50°C. Example 1 50 ml of the culture medium shown in Table 1 was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 120°C for 15 minutes.
After adding 2% by volume of ethanol, Brevibacterium flavum, an aspartase producing bacterium
Inoculated with MJ233-AB-41 (FERM3812) and 30℃
Culture was carried out for 24 hours. 20ml of this culture solution,
Inoculate medium 1 with the composition shown in Table 2 in the jar fermenter No. 2 at 33°C, pH 7.6 (adjusted with 28% ammonia water), aeration volume 1vvm, and stirring speed.
Culture was performed at 800 rpm for 20 hours. At this time, the temperature of the fumaric acid added is 0 to 0 as shown in Table 4.
The content was changed to 2.5% by weight. In all experiments, ethanol was added intermittently so that the ethanol concentration in the medium was maintained at 1 to 1.5% by volume. After culturing, centrifuge the culture solution (4000 rpm, 15
minutes), then suspend the collected bacteria in distilled water and OD
A bacterial cell suspension with a (optical density, absorbance at a wavelength of 610 mm) value of 50 was prepared, and this bacterial cell suspension was used as a test solution. Aspartase activity was measured by reacting 1.0 ml of the reaction solution shown in Table 3 at 46°C for 1 hour.
Centrifuge the reaction completed solution (4000 rpm, 15 minutes)
After that, the amount of aspartic acid produced in the supernatant was determined by a microbial quantitative method using Leuconostocmesenteroides ATCC8042.
Aspartase activity was expressed as relative specific activity, with the oxygen activity of bacterial cells cultured without fumaric acid added as 100. The results obtained are shown in Table 4. Table 1 Urea 4 g (NH 4 ) 2 SO 4 14 K 2 HPO 4 0.5 KH 2 PO 4 0.5 MgSO 4・7H 2 O 0.5 Yeast extract 1 Casamino acid 1 Biotin 200 μg Thiamine hydrochloride 100 FeSO 4・7H 2 O 6 mg MnSO 4・4～6H 2 O 6 〃 Distilled water 1000 ml Table 2 (NH 4 ) 2 SO 4 23 g KH 2 PO 4 0.5〃 K 2 HPO 4 0.5 g MgSO 4・7H 2 O 0.5 Yeast extract 3 Casamino acids 3 Biotin 200 μg Thiamine hydrochloride 100 FeSO 4・7H 2 O 20 mg MnSO 4・4～6H 2 O 20 Distilled water 1000 ml Table 3 Fumaric acid 500 μmole MgSO 4・7H 2 O 10 〃 Tween20 * 1 μl Test solution 0.1 ml Total volume 1 ml (adjusted to PH9.4 with 28% ammonia water) [*marked: nonionic surfactant manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., product name]
【表】
参考例 １
第２表の培地組成にさらにフマール酸を20ｇ／
添加した培地を用い実施例−１と同様の培養を
行なつた。この培養液の600mlを遠心分離
（6000rpm、15分間）により集菌した後、該集菌
体を２のジヤーフアーメンター中の第５表に示
す組成の溶液１に添加し、46℃にて５時間攪拌
しながらフマラーゼの失活処理を行つた。（以下
処理菌体と記す）
この後、遠心分離（6000rpm、15分間）にて集
菌し、該集菌体を第６表に示した反応液にて二度
洗浄後、２のジヤーフアーメンター中の第５表
に示した反応液１に添加し、46℃にて10時間攪
拌しながら反応を行つた。
反応終了後、遠心分離（6000rpm、15分間）に
より菌体を除いた反応残液中のリンゴ酸濃度及び
アスパラギン酸濃度を測定した。リンゴ酸量は液
体クロマトグラフイーにより測定し、アスパラギ
ン酸量はロイコノストツク・メセンテロイデス−
60 ATCC8042による微生物定量法により求めた。
結果は第７表に、フマラーゼの失活処理を行な
わない（未処理菌体と記す）菌体での反応結果と
共に示した。
第５表
アスパラギン酸 750 mM
MgSO4・7H2Ｏ 10 mM
Tween 20 0.1容量％
NH3 ２ Ｍ
第６表
フマール酸 830 mM
MgSO4・7H2Ｏ 10 mM
Tween 20 0.1容量％
NH3 ４ Ｍ[Table] Reference example 1 Add 20g/fumaric acid to the medium composition in Table 2.
Culture was carried out in the same manner as in Example-1 using the added medium. After collecting 600 ml of this culture solution by centrifugation (6000 rpm, 15 minutes), the collected cells were added to solution 1 with the composition shown in Table 5 in the jar fermenter of 2, and heated at 46°C. Fumarase was inactivated while stirring for 5 hours. (hereinafter referred to as treated bacterial cells) After this, the bacteria were collected by centrifugation (6000 rpm, 15 minutes), and the collected bacteria were washed twice with the reaction solution shown in Table 6, and then The mixture was added to Reaction Solution 1 shown in Table 5 in Mentor, and the reaction was carried out at 46°C for 10 hours with stirring. After the reaction was completed, the malic acid concentration and aspartic acid concentration in the reaction residual solution after removing the bacterial cells by centrifugation (6000 rpm, 15 minutes) were measured. The amount of malic acid was measured by liquid chromatography, and the amount of aspartic acid was determined by Leuconostoc mesenteroides.
60 Determined using the microbial quantitative method according to ATCC8042. The results are shown in Table 7 together with the reaction results for bacterial cells that were not subjected to fumarase inactivation treatment (referred to as untreated bacterial cells). Table 5 Aspartic acid 750 mM MgSO 4・7H 2 O 10 mM Tween 20 0.1% by volume NH 3 2 M Table 6 Fumaric acid 830 mM MgSO 4・7H 2 O 10 mM Tween 20 0.1% by volume NH 3 4 M
【表】【table】