JPH0468906B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0468906B2 JPH0468906B2 JP22807283A JP22807283A JPH0468906B2 JP H0468906 B2 JPH0468906 B2 JP H0468906B2 JP 22807283 A JP22807283 A JP 22807283A JP 22807283 A JP22807283 A JP 22807283A JP H0468906 B2 JPH0468906 B2 JP H0468906B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aspartase
- bacterial cells
- culture
- acid
- fumaric acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、ブレビバクテリウム属に属する菌体
の培養方法に関するものである。 本発明の方法によれば、ブレビバクテリウム属
に属する菌体内に産生されるアスパルターゼ含量
を増加させることができ、アスパルターゼ相対比
活性が著しく大きくなる。 アスパルターゼが、フマール酸とアンモニアか
らＬ−アスパラギン酸を生成する反応の酵素触媒
であることはよく知られている。また、このＬ−
アスパラギン酸は、重要なアミノ酸の一つとして
広く知られており、医療品や食品添加物等として
用いられている。 従来、種々の菌体を用いた醗酵法或いは、これ
ら菌体の産生するアスパルターゼを利用する酵素
法により、フマール酸及びアンモニア等からＬ−
アスパラギン酸を製造する試みが数多く提案され
ている。 この場合、高いアスパルターゼ活性を有する菌
体を新たに自然界から採取することは重要なこと
である。しかしながらこの様な菌体を入手するこ
とは極めて困難であるので、これに代つて例え
ば、本発明者らの提案（特開昭56−26196号公報）
した、ブレビバクテリウム属に属する菌体にα−
アミノ−ｎ−酪酸耐性を付与し、フマール酸及び
アンモニアからＬ−アスパラギン酸を合成する能
力を高める方法、またI.Chibata et.al.、Appl.
Microbiol.、27，878（1974）の提案しているアス
パルターゼ生産菌としてエシエリヒア・コリを用
い、該菌体の培養終了後、該菌体をフマール酸を
含む水溶液に37℃にて数10時間浸漬することによ
り約10倍、アスパルターゼ活性を増加させ得るこ
とが知られている。この方法における活性の増加
は、菌体の細胞膜が自己消化により破壊され、基
質および生成物の透過効率が向上したため、見か
け上活性が上昇したことが明らかにされている。
更に、特開昭57−138383号公報では、アスパルタ
ーゼ活性を有する微生物等を酸処理してフマラー
ゼ活性のみを選択的に失活させてＬ−アスパラギ
ン酸の収率を高める方法を提案している。 しかしながら、Ｌ−アスパラギン酸を工業的に
製造することを目的とする場合、上述した、培養
後のアスパルターゼを含む菌体の処理によりアス
パルターゼ活性を高める等によりＬ−アスパラギ
ン酸の収率を向上することは異なり、菌体の産生
するアスパルターゼの量を増大させることも重要
なことである。 本発明者らは、上記観点から短い培養時間でか
つ高収量でアスパルターゼを得る方法につき、ブ
レビバクテリウム属に属する菌体の培養法を鋭意
検討したところ、該菌体をフマール酸の特定量を
含有する培地で好気的に培養すると菌体内に産生
されるアスパルターゼ含量が短い培養時間で著し
く増加することを見い出し本発明を完成した。 即ち、本発明は、ブレビバクテリウム属に属す
る菌体を培養する方法において、該アスパルター
ゼ産生能を有する菌体をフマール酸を0.5〜2.8％
含有する培地で好気的に培養することを特徴とす
るブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法を
提供するものである。 本発明において用いられるアスパルターゼを産
生する菌体は、ブレビバクテリウム属に属する菌
体である。例えば、ブレビバクテリウム・フラバ
ム MJ233（FERM3068）、ブレビバクテリウ
ム・フラバム MJ233からα−アミノ−ｎ−酪酸
耐性株として誘導した菌株：ブレビバクテリウ
ム・フラバム MJ233−AB−41（FERM3812）
特開昭56−26196号公報参照）等がある。 本発明において使用する培地の炭素源、窒素源
及び無機塩等の培地組成は特に限定されるもので
はない。炭素源としては、例えばエタノール、ｎ
−パラフイン、糖蜜等を使用することができ、窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩もしくは
アンモニア、尿素などが適当である。無機塩とし
ては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリ
ウム、硫酸アグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育に必要であれば、ベプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザ
ミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し
て用いることもできる。 培養は通気攪拌、振とう等を行いながら好気的
条件下で行なう。培養温度は20〜40℃、好ましく
は25〜35℃で行なう。培養途中のPHは５〜10、好
ましくは約７〜約８にて行なう。また、培養液の
PHの調整には、酸或いはアルカリを添加する公知
の方法が用いられる。 本発明の方法は、上記ブレビバクテリウム属に
属する菌体を上記の培地中で培養するが、その際
にフマール酸を0.5〜2.8重量％、好ましくは１〜
2.6重量％の範囲で添加して行う必要がある。上
記フマール酸の添加量がこの範囲から外れると培
養物のアスパルターゼ相対比活性の改良が小さい
か殆どない。培養開始時のエタノール濃度は１〜
５容量％、好ましくは２〜３容量％が適する。培
養期間は通常15〜24時間行われる。 本発明の方法で培養した菌体は、活性の高いア
スパルターゼを高濃度に含有しているので、この
菌体を含む培養液、培養液から分離した菌体、菌
体の破壊物又は磨砕物、菌体の自己消化液及び菌
体を固定化したものなどを用いる公知手法によ
り、フマール酸または、そのナトリウム塩もしく
はカルシウム塩等のフマール酸塩およびアンモニ
アまたは、塩化アンモニウムもしくは炭酸アンモ
ニウム等のアンモニウム塩から効率的にＬ−アス
パラギン酸を生合成することができる。 Ｌ−アスパラギン酸の製造法としては、例えば
Ｌ−アスパラギン酸の製造に供する酵素源とし
て、本発明の方法で培養した菌体、又はその固定
化物等の処理物を用いることができ、さらに好ま
しくは該菌体もしくはその固定化物をあらかじめ
Ｌ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの存
在下で且つPHのアルカリ域に於いて40℃以上60℃
以下に加熱処理した処理物を用いることもでき
る。 フマール酸又はその塩とアンモニア又は無機ア
ンモニウム塩を用いる場合には、これら２成分の
モル比は１：１〜５の間にあるのが適当である。
酵素反応は、０〜60℃の温度範囲で実施すること
ができるが、アスパルターゼの安定性を考慮して
20〜50℃で実施するのが好ましい。 実施例 １ 第１表に示した培地50mlを500ml容三角フラス
コに分注し、120℃で15分間滅菌処理したものに、
エタノール２容量％を添加後、アスパルターゼ生
産菌であるブレビバクテリウム・フラバム
MJ233−AB−41（FERM3812）を植菌し、30℃
にて24時間培養を行なつた。この培養液20mlを、
２のジヤーフアーメンター中の第２表に示す組
成の培地１に接種し、33℃、PH7.6（28％アンモ
ニア水で調整）にて、通気量1vvm、攪拌回転数
800rpmにて20時間培養を行つた。この際、添加
するフマール酸の温度を第４表に示した通り０〜
2.5重量％と変化させた。すべての実験において
培地中のエタノール濃度は１〜1.5容量％に保た
れるようにエタノールを断続的に添加した。 培養終了後、培養液を遠心分離（4000rpm、15
分間）したのち集菌体を蒸留水に懸濁し、O.D.
（光学密度、波長610mmでの吸光度）値50の菌体懸
濁液を調整し、該菌体懸濁液を供試液とした。 アスパルターゼ活性の測定は、第３表に示した
反応液の1.0mlを46℃にて１時間反応を行つた後、
該反応終了液を遠心分離（4000rpm、15分間）
後、その上澄液中のアスパラギン酸生成量をロイ
コノストツクメセンテロイデス ATCC8042によ
る微生物定量法により求めることにより行ない、
アスパルターゼ活性は、フマール酸無添加で培養
した菌体の酸素活性を100とする相対比活性をも
つて表示した。 得られた結果を第４表に示した。 第１表 尿素 ４ ｇ （NH4）2SO4 14 〃 K2HPO4 0.5〃 KH2PO4 0.5〃 MgSO4・7H2Ｏ 0.5〃 酵母エキス １ 〃 カザミノ酸 １ 〃 ビオチン 200 μｇ 塩酸チアミン 100 〃 FeSO4・7H2Ｏ ６ mg MnSO4・４〜6H2Ｏ ６ 〃 蒸留水 1000 ml 第２表 （NH4）2SO4 23 ｇ KH2PO4 0.5〃 K2HPO4 0.5ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.5〃 酵母エキス ３ 〃 カザミノ酸３ 〃 ビオチン 200 μｇ 塩酸チアミン 100 〃 FeSO4・7H2Ｏ 20 mg MnSO4・４〜6H2Ｏ 20 〃 蒸留水 1000 ml 第３表 フマール酸 500 μmole MgSO4・7H2Ｏ 10 〃 Tween20* １ μl 供試液 0.1ml 全量
１ml（28％アンモニア水にてPH９ ．４に調整） 〔＊印：和光純薬(株)製非イオン系界面活性
剤、商品名〕
の培養方法に関するものである。 本発明の方法によれば、ブレビバクテリウム属
に属する菌体内に産生されるアスパルターゼ含量
を増加させることができ、アスパルターゼ相対比
活性が著しく大きくなる。 アスパルターゼが、フマール酸とアンモニアか
らＬ−アスパラギン酸を生成する反応の酵素触媒
であることはよく知られている。また、このＬ−
アスパラギン酸は、重要なアミノ酸の一つとして
広く知られており、医療品や食品添加物等として
用いられている。 従来、種々の菌体を用いた醗酵法或いは、これ
ら菌体の産生するアスパルターゼを利用する酵素
法により、フマール酸及びアンモニア等からＬ−
アスパラギン酸を製造する試みが数多く提案され
ている。 この場合、高いアスパルターゼ活性を有する菌
体を新たに自然界から採取することは重要なこと
である。しかしながらこの様な菌体を入手するこ
とは極めて困難であるので、これに代つて例え
ば、本発明者らの提案（特開昭56−26196号公報）
した、ブレビバクテリウム属に属する菌体にα−
アミノ−ｎ−酪酸耐性を付与し、フマール酸及び
アンモニアからＬ−アスパラギン酸を合成する能
力を高める方法、またI.Chibata et.al.、Appl.
Microbiol.、27，878（1974）の提案しているアス
パルターゼ生産菌としてエシエリヒア・コリを用
い、該菌体の培養終了後、該菌体をフマール酸を
含む水溶液に37℃にて数10時間浸漬することによ
り約10倍、アスパルターゼ活性を増加させ得るこ
とが知られている。この方法における活性の増加
は、菌体の細胞膜が自己消化により破壊され、基
質および生成物の透過効率が向上したため、見か
け上活性が上昇したことが明らかにされている。
更に、特開昭57−138383号公報では、アスパルタ
ーゼ活性を有する微生物等を酸処理してフマラー
ゼ活性のみを選択的に失活させてＬ−アスパラギ
ン酸の収率を高める方法を提案している。 しかしながら、Ｌ−アスパラギン酸を工業的に
製造することを目的とする場合、上述した、培養
後のアスパルターゼを含む菌体の処理によりアス
パルターゼ活性を高める等によりＬ−アスパラギ
ン酸の収率を向上することは異なり、菌体の産生
するアスパルターゼの量を増大させることも重要
なことである。 本発明者らは、上記観点から短い培養時間でか
つ高収量でアスパルターゼを得る方法につき、ブ
レビバクテリウム属に属する菌体の培養法を鋭意
検討したところ、該菌体をフマール酸の特定量を
含有する培地で好気的に培養すると菌体内に産生
されるアスパルターゼ含量が短い培養時間で著し
く増加することを見い出し本発明を完成した。 即ち、本発明は、ブレビバクテリウム属に属す
る菌体を培養する方法において、該アスパルター
ゼ産生能を有する菌体をフマール酸を0.5〜2.8％
含有する培地で好気的に培養することを特徴とす
るブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法を
提供するものである。 本発明において用いられるアスパルターゼを産
生する菌体は、ブレビバクテリウム属に属する菌
体である。例えば、ブレビバクテリウム・フラバ
ム MJ233（FERM3068）、ブレビバクテリウ
ム・フラバム MJ233からα−アミノ−ｎ−酪酸
耐性株として誘導した菌株：ブレビバクテリウ
ム・フラバム MJ233−AB−41（FERM3812）
特開昭56−26196号公報参照）等がある。 本発明において使用する培地の炭素源、窒素源
及び無機塩等の培地組成は特に限定されるもので
はない。炭素源としては、例えばエタノール、ｎ
−パラフイン、糖蜜等を使用することができ、窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩もしくは
アンモニア、尿素などが適当である。無機塩とし
ては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリ
ウム、硫酸アグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育に必要であれば、ベプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザ
ミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し
て用いることもできる。 培養は通気攪拌、振とう等を行いながら好気的
条件下で行なう。培養温度は20〜40℃、好ましく
は25〜35℃で行なう。培養途中のPHは５〜10、好
ましくは約７〜約８にて行なう。また、培養液の
PHの調整には、酸或いはアルカリを添加する公知
の方法が用いられる。 本発明の方法は、上記ブレビバクテリウム属に
属する菌体を上記の培地中で培養するが、その際
にフマール酸を0.5〜2.8重量％、好ましくは１〜
2.6重量％の範囲で添加して行う必要がある。上
記フマール酸の添加量がこの範囲から外れると培
養物のアスパルターゼ相対比活性の改良が小さい
か殆どない。培養開始時のエタノール濃度は１〜
５容量％、好ましくは２〜３容量％が適する。培
養期間は通常15〜24時間行われる。 本発明の方法で培養した菌体は、活性の高いア
スパルターゼを高濃度に含有しているので、この
菌体を含む培養液、培養液から分離した菌体、菌
体の破壊物又は磨砕物、菌体の自己消化液及び菌
体を固定化したものなどを用いる公知手法によ
り、フマール酸または、そのナトリウム塩もしく
はカルシウム塩等のフマール酸塩およびアンモニ
アまたは、塩化アンモニウムもしくは炭酸アンモ
ニウム等のアンモニウム塩から効率的にＬ−アス
パラギン酸を生合成することができる。 Ｌ−アスパラギン酸の製造法としては、例えば
Ｌ−アスパラギン酸の製造に供する酵素源とし
て、本発明の方法で培養した菌体、又はその固定
化物等の処理物を用いることができ、さらに好ま
しくは該菌体もしくはその固定化物をあらかじめ
Ｌ−アスパラギン酸及びアンモニウムイオンの存
在下で且つPHのアルカリ域に於いて40℃以上60℃
以下に加熱処理した処理物を用いることもでき
る。 フマール酸又はその塩とアンモニア又は無機ア
ンモニウム塩を用いる場合には、これら２成分の
モル比は１：１〜５の間にあるのが適当である。
酵素反応は、０〜60℃の温度範囲で実施すること
ができるが、アスパルターゼの安定性を考慮して
20〜50℃で実施するのが好ましい。 実施例 １ 第１表に示した培地50mlを500ml容三角フラス
コに分注し、120℃で15分間滅菌処理したものに、
エタノール２容量％を添加後、アスパルターゼ生
産菌であるブレビバクテリウム・フラバム
MJ233−AB−41（FERM3812）を植菌し、30℃
にて24時間培養を行なつた。この培養液20mlを、
２のジヤーフアーメンター中の第２表に示す組
成の培地１に接種し、33℃、PH7.6（28％アンモ
ニア水で調整）にて、通気量1vvm、攪拌回転数
800rpmにて20時間培養を行つた。この際、添加
するフマール酸の温度を第４表に示した通り０〜
2.5重量％と変化させた。すべての実験において
培地中のエタノール濃度は１〜1.5容量％に保た
れるようにエタノールを断続的に添加した。 培養終了後、培養液を遠心分離（4000rpm、15
分間）したのち集菌体を蒸留水に懸濁し、O.D.
（光学密度、波長610mmでの吸光度）値50の菌体懸
濁液を調整し、該菌体懸濁液を供試液とした。 アスパルターゼ活性の測定は、第３表に示した
反応液の1.0mlを46℃にて１時間反応を行つた後、
該反応終了液を遠心分離（4000rpm、15分間）
後、その上澄液中のアスパラギン酸生成量をロイ
コノストツクメセンテロイデス ATCC8042によ
る微生物定量法により求めることにより行ない、
アスパルターゼ活性は、フマール酸無添加で培養
した菌体の酸素活性を100とする相対比活性をも
つて表示した。 得られた結果を第４表に示した。 第１表 尿素 ４ ｇ （NH4）2SO4 14 〃 K2HPO4 0.5〃 KH2PO4 0.5〃 MgSO4・7H2Ｏ 0.5〃 酵母エキス １ 〃 カザミノ酸 １ 〃 ビオチン 200 μｇ 塩酸チアミン 100 〃 FeSO4・7H2Ｏ ６ mg MnSO4・４〜6H2Ｏ ６ 〃 蒸留水 1000 ml 第２表 （NH4）2SO4 23 ｇ KH2PO4 0.5〃 K2HPO4 0.5ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.5〃 酵母エキス ３ 〃 カザミノ酸３ 〃 ビオチン 200 μｇ 塩酸チアミン 100 〃 FeSO4・7H2Ｏ 20 mg MnSO4・４〜6H2Ｏ 20 〃 蒸留水 1000 ml 第３表 フマール酸 500 μmole MgSO4・7H2Ｏ 10 〃 Tween20* １ μl 供試液 0.1ml 全量
１ml（28％アンモニア水にてPH９ ．４に調整） 〔＊印：和光純薬(株)製非イオン系界面活性
剤、商品名〕
【表】
参考例 １
第２表の培地組成にさらにフマール酸を20ｇ／
添加した培地を用い実施例−１と同様の培養を
行なつた。この培養液の600mlを遠心分離
（6000rpm、15分間）により集菌した後、該集菌
体を２のジヤーフアーメンター中の第５表に示
す組成の溶液１に添加し、46℃にて５時間攪拌
しながらフマラーゼの失活処理を行つた。（以下
処理菌体と記す） この後、遠心分離（6000rpm、15分間）にて集
菌し、該集菌体を第６表に示した反応液にて二度
洗浄後、２のジヤーフアーメンター中の第５表
に示した反応液１に添加し、46℃にて10時間攪
拌しながら反応を行つた。 反応終了後、遠心分離（6000rpm、15分間）に
より菌体を除いた反応残液中のリンゴ酸濃度及び
アスパラギン酸濃度を測定した。リンゴ酸量は液
体クロマトグラフイーにより測定し、アスパラギ
ン酸量はロイコノストツク・メセンテロイデス−
60 ATCC8042による微生物定量法により求めた。 結果は第７表に、フマラーゼの失活処理を行な
わない（未処理菌体と記す）菌体での反応結果と
共に示した。 第５表 アスパラギン酸 750 mM MgSO4・7H2Ｏ 10 mM Tween 20 0.1容量％ NH3 ２ Ｍ 第６表 フマール酸 830 mM MgSO4・7H2Ｏ 10 mM Tween 20 0.1容量％ NH3 ４ Ｍ
添加した培地を用い実施例−１と同様の培養を
行なつた。この培養液の600mlを遠心分離
（6000rpm、15分間）により集菌した後、該集菌
体を２のジヤーフアーメンター中の第５表に示
す組成の溶液１に添加し、46℃にて５時間攪拌
しながらフマラーゼの失活処理を行つた。（以下
処理菌体と記す） この後、遠心分離（6000rpm、15分間）にて集
菌し、該集菌体を第６表に示した反応液にて二度
洗浄後、２のジヤーフアーメンター中の第５表
に示した反応液１に添加し、46℃にて10時間攪
拌しながら反応を行つた。 反応終了後、遠心分離（6000rpm、15分間）に
より菌体を除いた反応残液中のリンゴ酸濃度及び
アスパラギン酸濃度を測定した。リンゴ酸量は液
体クロマトグラフイーにより測定し、アスパラギ
ン酸量はロイコノストツク・メセンテロイデス−
60 ATCC8042による微生物定量法により求めた。 結果は第７表に、フマラーゼの失活処理を行な
わない（未処理菌体と記す）菌体での反応結果と
共に示した。 第５表 アスパラギン酸 750 mM MgSO4・7H2Ｏ 10 mM Tween 20 0.1容量％ NH3 ２ Ｍ 第６表 フマール酸 830 mM MgSO4・7H2Ｏ 10 mM Tween 20 0.1容量％ NH3 ４ Ｍ
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属に属するアスパルター
ゼ産生能を有する菌体を培養する方法において、
該菌体をフマール酸を0.5〜2.8％含有する培地で
好気的に培養することを特徴とするブレビバクテ
リウム属に属する菌体の培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22807283A JPS60120983A (ja) | 1983-12-02 | 1983-12-02 | ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22807283A JPS60120983A (ja) | 1983-12-02 | 1983-12-02 | ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60120983A JPS60120983A (ja) | 1985-06-28 |
| JPH0468906B2 true JPH0468906B2 (ja) | 1992-11-04 |
Family
ID=16870751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22807283A Granted JPS60120983A (ja) | 1983-12-02 | 1983-12-02 | ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60120983A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01165984U (ja) * | 1988-05-11 | 1989-11-21 | ||
| JP2664648B2 (ja) | 1994-05-20 | 1997-10-15 | 株式会社日本触媒 | Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5626196A (en) * | 1979-08-10 | 1981-03-13 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Preparation of l-aspartic acid |
-
1983
- 1983-12-02 JP JP22807283A patent/JPS60120983A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60120983A (ja) | 1985-06-28 |
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