JPH0469140B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

イムノアツセイにおいて、問題の化合物の１種
または２種以上の特異的に認識するが、問題の試
料中において直面することがある同様な構造の化
合物類へ弱く結合するかるいは結合しない受容体
を有することを必要とする。抗血清を得るために
は、ハプテン類が含まれているとき、ハプテンの
有導体類を抗原と結合するように設計することが
必要であり、ここで抗血清は所望の特異性を提供
するであろう。多くの場合において、問題のハプ
テンは高度に機能化されるので、その有導体の合
成手順はハプテン類の構造的特徴の完全性を維持
するように設計しなくてはならない。 米国特許第3817837号は、酵素の免疫検定を記
載している。HamburgerおよびDouglass、
Immuology、1969、17(4) 599−602；Orgelおよ
びHamburger、ibid、1971、20(2)、233−９；
（HamburgerおよびDouglass、ibid、1969、17
(4)、58791およびHambuger、Science、152
（379）、203−５（1966）は、クロラムフエニコー
ルに対する種々の抗体を記載している。クロラム
フエニコールの類似体、すなわち、２−ジクロロ
アセタミド−１−（４−クロロ−３−ニトロフエ
ニル）プロパン−１，３−ジオールおよび２−ジ
クロロアセタミド−１−（４−ブロモ−３−ニト
ロフエニル）プロパン−１，３−ジオールは、
CA：88(5)37348nおよびCA：74（23）125087t中に
おいて論議されている。 クロラムフエニルコール誘導体類は、ポリ（ア
ミノ酸）へ複合化（conjugate）させて、抗体お
よ酵素結合体類を製造するための抗原を調製する
ために調製される。ここで酵素複合体類および抗
体類は、組み合わせて、クロラムフエニコールの
定量に使用される。とくに、クロラムフエニコー
ルのベンゼン基は、ポリ（アミノ酸）のアミノ基
と反応するカルボニル官能基を含有する側鎖で誘
導化される。カルボニル官能基は、オキソカルボ
ニル（カルボニル基）［これはポリ（アミノ酸）
の存在するアミノ基と、還元的アミノ化により、
単一結合を形成するであろう］、または非オキソ
−カルボニル（置換カルボニル基）たとえばオキ
シカルボニル（カルボキシ）、アルコキシカルボ
ニル（エステル）、カルボキシカルボニル（無水
物）、またはハロカルボニル（ハライド）［これは
ポリ（アミノ酸）とペプチド結合を形成するであ
ろう］であることができる。複合化された抗原
は、普通の方法で、クロラムフエニコールに対し
て特異的な抗体の生産に使用される。 本発明は、クロラムフエニコールの診断的イム
ノアツセイに使用するための試薬の調製に関す
る。詳しくは、クロラムフエニコールのベンゼン
基を、ポリ（アミノ酸）のアミノ基へ結合するた
めのカルボニル官能基（窒素イミノおよびイオウ
類似体を含む）を含有する側鎖で誘導化する。カ
ルボニル官能基は、通常ベンゼン基から、結合ま
たは結合原子、たとえば、カルコゲン（酸素また
はイオウ）または窒素、および少なくとも１個の
炭素原子および水素以外の12個以下、好ましくは
１〜８個、より好ましくは１〜５個の原子の結合
基により分離されている。結合基中に１個より多
い原子が存在する場合、原子は炭素、窒素、カル
コゲン（酸素またはイオウ）、通常炭素およびカ
ルコゲンであることができる。通常、結合基中に
１個以下の異種原子が存在する。異種原子は一般
に炭素へ結合しており、カルコゲンは通常飽和炭
素原子に結合しており、ここで異種原子は通常２
個の炭素の間隔を置いて位置する。カルボニル官
能基がオキソ−カルボニル（アルデヒドまたはケ
トン）であるとき、単一結合は通常ポリ（アミノ
酸）の存在するアミノ基との還元的アミノ化によ
り形成されるであろう。カルボニル官能基が非オ
キソ−カルボニルであるとき、ペプチド結合が通
常形成されるであろう。オキシカルボニル（カル
ボキシ）は、種々の方法で活性化させて、アミノ
基と反応させてペプチド結合を形成させる。 抗体の調製のため、クロラムフエニコール有導
体を抗原のポリ（アミノ酸）へ複合化
（conjugate）させ、次いでこれを抗体の生産のた
め脊椎動物、とくに家畜へ注入することができ
る。前もつて決定したスケジユールに基づいて反
復注入後、抗体を血清から収穫し、得られたまま
使用するか、あるいはさらに精製して問題の抗体
を濃縮することができる。 大部分について、本発明の化合物は次式を有す
るであろう： 式中、 Ｑは原子番号８〜16のカルコゲン（酸素または
イオウ）または窒素であり； ｐは０または１であり； Ｒは結合基、通常脂肪族の、少なくとも１個の
炭素原子および12個以下、通常約１〜５個、より
好ましくは１〜３個の水素以外の原子を鎖中に有
する結合基であり、ここで鎖中の原子は通常炭素
であるが、いくつかの炭素原子が存在するとき、
１以下の異種原子を含むことができ、ここで異種
原子は窒素または原子番号８〜16のカルコゲン
（酸素またはイオウ）であることができ、ここで
異種原子は、存在する場合、水素以外へ結合し、
かつカルコゲンは主として飽和炭素原子へ結合
し、ここで異種原子は通常２個の炭素原子だけ離
れており； Ｚは水素、ヒドロキシ、１〜６個、より通常１
〜３個の炭素原子のアルコキシ、水性媒質中でポ
リ（アミノ酸）とペプチド結合を形成できる活性
化基、たとえば、ｐ−ニトロフエニルエステルま
たはＮ−オキシスクシンイミドエステルまたはＹ
であり、ここでＹは分子量が少なくとも約2000、
より通常少なくとも約10000でありかつ10000000
以上であることができ、通常1000000以下であり、
抗原または酵素として機能するポリ（アミノ酸）
残基、たとえば、１以上のサブユニツト
（subunit）を有するタンパク質を含むポリペプチ
ドであり； ｍは０または１であり、ＺがＹ以外であるとき
１であり；そして ｎは少なくとも１であり、ＺがＹ以外であると
き、１であり、かつＺがＹであるとき、１とＹの
分子量を1000、通常2000、より通常3000で割つた
数との間の数であり、Ｙが抗原とて作用すると
き、ｎは一般に約１〜100、通常５〜80であり、
そしてＹが約30000〜300000の分子量の抗原であ
るとき、ｎは一般に約10〜100であり、そしてＹ
が酵素として機能とするとき、ｎは約１〜30、通
常約２〜20、より通常約２〜16である。 好ましいＲ基は、アルキレン、たとえば、メチ
レンまたはポリメチレン（これらは特に興味があ
る）、アルケニレン、アルキレンオキシアルキレ
ン（ここで異種原子はＱから少なくとも２個の炭
素原子により分離されている）、Ｎ−低級アルキ
ル（１〜３個の炭素原子）、アルキレンアミノア
ルキレン（ここで異種原子はＱから少なくとも２
個の炭素原子により分離されている）を包含す
る。 主として興味ある化合物は、ＺがＹでありかつ
抗原または酵素複合体類として使用され、Ｙがポ
リ（アミノ酸）でありかつ抗原または酵素として
機能する化合物である。これらの化合物は、大部
分、次式を有する： 式中、Ｑ、ｐ、Ｒおよびｍは上に定義した通り
であり； Y¹はポリ（アミノ酸）であり、抗原または酵
素として機能し、少なくとも約2000、より通常少
なくとも約10000でありかつ10000000までである
ことがで、一般に約600000を超えず、より通常約
300000を超えない分子量を有し； n¹は少なくとも１であり、通常一般に１より大
きく、かつY¹の分子量を1000、より通常2000で
割つた数を超えず、かつ少なくともY¹の分子量
を100000、より通常50000で割つた数であり、Y¹
が抗原として機能するとき、ｎは一般に約１〜
100、より通常約５〜80であり、そしてY¹が酵素
として機能するとき、ｎは通常約１〜30、より通
常２〜16である。 中間の分子量の抗原、すなわち、約20000〜
600000の範囲の分子量を有するものでは、抗原へ
結合したクロラムフエニコール基の数は一般に約
５〜100、より通常約20〜90であるが、低分子量
の抗原、すなわち、約2000〜10000の分子量のも
のでは、前記数は約１〜20、より通常２〜10であ
る。 上に示したように、カルボニル官能基、すなわ
ち、カルボニル基（ケト以外）およびオキシカル
ボニル基または他の置換カルボニル有導体が、ポ
リペプチドまたはタンパク質構造の一部分である
アミノ基へ結合している化合物は、特に興味があ
る。ポリペプチドおよびタンパク質の１つ群は抗
原性であるので、本発明のクロラムフエニコール
類似体をポリペプチドまたはタンパク質へ結合す
ることにより、得られる物質はクロラムフエニコ
ールに対する抗体を生成することができる。抗原
としても使用することができるが、通常そのまま
で使用されない、タンパク質のより狭い群は、免
疫検定系における検出体として使用される酵素で
ある。抗原として、不活性な酵素を使用できる。 ポリペプチド［一般に本発明においてポリ（ア
ミノ酸）と呼ぶ］は、通常約２〜100アミノ酸単
位を包含する（通常約12000より小さい分子量）。
これより大きいポリペプチドは任意にタンパク質
と呼ぶ。タンパク質は通常１〜20のサブユニツト
と呼ぶポリペプチド鎖から構成されており、それ
らのサブユニツトは共有結合または非共有結合に
より会合されている。サブユニツトは通常約100
〜300またはこれより大きいアミノ酸基（または
10000〜35000またはこれより大きい分子量）を有
する。本発明の目的に対して、ポリ（アミノ酸）
は、個々のポリペプチド単位、およびタンパク質
のサブユニツトであるポリペプチドを包含するこ
とを意図し、前記ポリペプチドはポリペプチド単
位のみから構成されているか、あるいはポリペプ
チド単位と他の官能基、たとえば、ヘモグロビン
またはチトクロムオキシダーゼにおけるような、
ポリフイリンとの組み合わせから構成されてい
る。 すでに示したように、クロラムフエニコール基
の数はポリ（アミノ酸）が酵素であるかあるいは
抗原であるかに依存して変化するであろう。クロ
ラムフエニコール基の最大の数は、溶解性、活性
などへの置換の効果により制限される。抗体の形
成のためには、クロラムフエニコールに対する抗
体が満足に収穫できるように十分な数のクロラム
フエニコール基が存在すべきである。そうでない
と、他の化合物に対する抗体に比較してクロラム
フエニコールに対する抗体の比率は望ましくない
ほどに低くなるであろう。モノクロナル抗体で
は、有用な抗体を分泌する合理的な数のハイブリ
ドーマを得るべきである。 考慮するタンパク質物質またはポリペプチドの
第１群は、抗原性ポリペプチドである。これら
は、アミノ基を介して、クロラムフエニコール類
似対のカルボニル官能基へ接合することができ
る。この生成物はクロラムフエニコールに対する
抗体の形成に使用することができる。 種々のタンパク質およびポリペプチドのタイプ
を、抗原生成質として使用できる。これらのタイ
プは、アルブミン類、血清タンパク質類、たとえ
ば、グロブリン、眼のレンズのタンパク質類、リ
ポタンパク質類などを包含する。タンパク質の例
はウシ血清アルブミン、キーホール笠具ヘモシア
ニン（Keyhole limpet hemocyanine）、卵アル
ブミン、ウシガンマ−グロブリンなどである。免
疫原性である小さい自然ポリペプチド、たとえ
ば、グラミシジン類を使用することもできる。
種々の合成ポリペプチド、たとえば、リジン、グ
ルタミン酸、フエニルアラニン、チロシンなどの
ポリマーを単独で、あるいは組み合わせて使用す
ることができる。ポリリジンまたはリジンとグル
タミン酸との組み合わせは、とくに興味がある。
合成ポリペプチドは、たとえば、リジンにより提
供される、アミノ基を十分な数で含有しなくては
ならない。 クロラムフエニコール類似体はカルボニル官能
基を介してヒドロキシル基またはメルカプト基
［それらはポリ（アミノ酸）中に存在する］へ結
合することができるが、大部分について結合はア
ミノ基に対して存在するであろう。したがつて、
これらの化合物をアミドと記載するが、エステル
およびチオエステルも存在しうる。アルデヒド有
導体を還元的アミノ化によりアミノへのみ結合し
て、アルキルアミン基を形成するであろう。 カルボニル変性クロラムフエニコールへの結合
のための遊離アミノ基を有するタンパク質中に存
在するアミノ酸は、リジン、Ｎ−末端アミノ酸な
どを包含する。ヒドロキシおよびメルカプタン含
有アミノ酸は、セリン、システイン、チロシンお
よびスレオニンを包含する。 タンパク質分子の第２群は、検出体
（detector）類である。これらは、カルボニル変
性クロラムフエニコールを複合化させることがで
きる酵素である。 酵素は通常約10000〜600000、通常約12000〜
150000、より通常約12000〜80000の範囲の分子量
を有するであろう。いくつかの酵素は、複数の酵
素のサブユニツトを有するであろう。酵素の分子
量についての説明は酵素全体の分子量を指すこと
を意図する。標識づけを特定にアミノ基に限定し
ないとき、平均少なくとも１／酵素のクロラムフ
エニコールが存在し、そして稀に30／酵素より多
い、通常20／酵素以下のクロラムフエニコールが
存在する。たとえば、リソチームでは、クロラム
フエニコール基の平均の数は約２〜５の範囲であ
ろう。グルコース−６−ホスフエートデヒドロゲ
ナーゼについては、平均の数は２〜20の範囲であ
ろう。 I.U.B、分類に従えば、問題の酵素は、次の通
りである：1.オキシドレダクターゼ、特に群1.1、
およびより特に1.1.1、および1.11、より特に、
1.11.1；および３。ヒドロラーゼ類、特に3.2、お
よびより特に3.2.1。種々の酵素、たとえば、ペ
プチダーゼ類、エステラーゼ類、アミダーゼ類、
ホスホリラーゼ類、カルボヒドラーゼ類、オキシ
ダーゼ類、たとえば、デヒドロゲナーゼ、レダク
ターゼ類などを使用できる。リソチーム、ペルオ
キシダーゼ、α−アミラーゼ、β−ガラククトシ
ダーゼ、デヒドロゲナーゼ類、とくにリンゴ酸塩
（malate）デヒドロゲナーゼおよびグルコース−
６−ホスフエートデヒドロゲナーゼ、アルカリ性
ホスフアターゼ、β−グルクロダーゼ、セルラー
ゼおよびホスホリパーゼのような酵素は、とくに
興味がある。 置換酵素は、大部分について、次の式を有する
であろう： 式中、Ｑ、ｐ、Ｒおよびｍは上に定義した通り
であり； Y²は活性部位以外で置換され、かつ結合前の
もとの活性の少なくとも30％、少なくとも50％を
有する酵素であり；そして n²は通常１〜30、より通常２〜20、好ましく２
〜14、より好ましくは１〜12であるが、一般に合
計のリジン基の平均約60に等しいかあるいはそれ
より少ない比率が酵素中に存在するが、小さい酵
素、たとえば、リソチームは存在するリジン基の
実質的にすべてが結合されている。 本発明において使用される種々のアミド生成物
を形成するとき、カルボン酸は通常活性化される
であろう。これはある数の方法で達成することが
できる。とくに興味ある２つの方法は、カーボジ
イミド、通常不活性極性溶媒、たとえば、ジメチ
ルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトニ
トリルまたはヘキサメチルホスホルアミド中にお
ける水溶性のジ脂肪族またはジシクロ脂肪族カー
ボジイミドとの反応である。この反応は種々の試
薬をおだやかな条件下に一緒にし、そして十分な
時間にわたつて反応させることによつて実施す
る。 他の方法は、水中においてアミン官能基をアシ
ル化するための使用できるカルボキシ変性クロラ
ムフエニコールのエステルを使用することであ
る。カルボキシに結合して水中で使用できる活性
化エステルを形成できる基の例は、ｐ−ニトルフ
エニルおよびＮ−スクシニミジルである。アルデ
ヒドの複合のためには、還元的アミノ化を極性の
通常水性媒質中で、還元剤としてシアノボロハイ
ドライドを使用して実施する。 本発明の複合した抗原に応答して調製される抗
体は、親薬剤（parent drug）、複合化した抗原、
抗原への複合化のために使用する化合物およびそ
の誘導体、およびクロラムフエニコール標識化合
物、たとえば、酵素複合体に対する強い特異的結
合を有する。 前に示したように、主題の酵素複合体類および
抗体類はイムノアツセイに使用される。本発明の
酵素複合体類は、米国特許第3817837号中に記載
される方法において特に有用である。効果的なイ
ムノアツセイを実施するとき、前述の免疫検定は
分光光度測定法であるので、分析物（analyte）
の問題の範囲内の分析物の濃度変化とともに信号
の実質的な変化が存在することが望ましい。こう
して、抗原性複合体は、酵素複合体と組み合わせ
て使用したとき、クロラムフエニコールの濃度の
変動に対して感受的に応答を生じなくてはならな
い。 さらに、抗原についてある数の考察が存在す
る。通常、ある数の動物を抗原で免疫化する。初
期の出血（bleed）は低い力価の低い結合親和性
を有する傾向があるが、比較的短い時間内に、力
価および親和性のあるプラトーに到達する。 さらに交差反応性が存在する。薬物を決定する
とき、観測される信号に影響を及ぼす他の薬物ま
たは自然に産出する化合物を望んではならない。
他の化合物が種々の程度で抗血清へ結合できると
き、他の化合物は信号へ実質的な影響を及ぼすこ
とがある。これは特に代謝物を用いるとき真実で
ある。代謝物は薬物前駆物質と同じ方法で活性で
はない。こうして、多くの場合において、抗原前
駆物質は、問題の分析物の代謝物へ有意に結合し
ない抗体を提供するように設計しなくてはならな
い。 本発明は、また、式 式中、 Ｑおよびｐは上に定義した通りであり； Ｒは１〜５個、通常１〜３個の炭素原子の飽和
脂肪族結合基であり； Y³は水素、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子
のアルコキシ、または水性媒質中でアミドを形成
できる活性化エステル基であり、ｍは１であり；
そして n³は１である、 の化合物を包含する。 一般に、本発明は、また、式（Ｖ）′ 式中、 X′は離脱性基、たとえば、基Ｘであり、ここ
でＸは原子番号17〜35のハロゲンである、 の化合物を、式（Ｖ）″ Ｈ−QpR（CO）mH （Ｖ）″ 式中、 Ｑ、ｐ、Ｒおよびｍは式（Ｉ）において定義し
たとおりである、 の化合物と反応させることからなるＺがＹ以外で
ある式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。 適当な反応条件は、この明細書中の実施例に例
示されているような、このような反応において普
通に用いられているものである。 詳しくは、次の化合物を本発明の前述の化合物
の製造に使用することができる： 式中、 Ｘは原子番号17〜35のハロゲン原子であり；そ
して Ｊはニトロ、アミノであり、炭素置換アミノを
包含する。 上の化合物の製造において、クロラムフエニコ
ールを用いて開始し、クロラムフエニコールを還
元剤、たとえば、ナトリウムジチオナイトで処理
することにより、ニトロ基をアミノ基に転化す
る。還元剤の使用量は、このような転化を実施す
るために十分な量である。得られる生成物はハロ
ゲン原子、たとえば、臭素を芳香族環中に、
Mitchell.et al.、J.Org.Chem.、44：4733（1979）
の手順に従い、導入することにより官能化するこ
とができ、ここでハロゲン原子の導入に十分な量
および条件もとに、上のアミノ類似体をＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド中においてＮ−ブロモスク
シンイミドで処理する。ハロゲン原子の導入後、
アミノ基をOpgenorth、et al.、Liebigs Ann.
Chem.、1333−1347（1974）に従う鋼−サンドマ
イヤー（Copper−Sandmeyer）反応によりニト
ロ基に転化する。クロラムフエニコールの酸−塩
基に対する不安定性のため、上の変換の反応条件
はおだやかであるべきである。したがつて、上の
ブロモアミノ類似体をそのジアゾニウム塩に普通
の方法で転化し、そしてアミノ基をニトロ基に転
化するために十分な条件下で過剰の鋼−亜硝酸ナ
トリウムで処理し、３−ブロモクロラムフエニコ
ールを得る。 実 験 次の実施例は、例示を目的とし、本発明を限定
するものでなない。 すべての温度は、特記しないかぎり、セ氏であ
る。百分率および部は、特記しないかぎり、重量
により、ただし液体の混合物は容量による。使用
する略号は、次の通りである：THF−テトロラ
ヒドロフラン；tlc−薄層クロマトグラフイー；
ｈ−時間；MeOH−メタノール；DCC−ジシク
ロヘキシカーボジイミド；MHS−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド；HOAc−酢酸；EDAC−エチ
ルジメチルアミノプロピルカーボジイミド；
DMF−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；BSA−
ウシ血清アルブミン；BgG−ウシガンマグロブ
リン；G6PDH−グルコース−６−ホスフエート
デヒドログナーゼ；NAD−ニコチンアミドアデ
ニンヌクレオチド。 実施例 １−（3′−プロモ−4′−ニトロフエニル）−２−
ジクロロアセタミド−１，３−プロパンジオー
ル、（“３−ブロモクロラムフエニコール”）の
製造 Ａ １−（ｐ−アミノフエニル）−２−ジクロロア
セタミド−１，３−プロパンジオールの製造。
クロラムフエニコール（Sigma、Ｃ−0378）
（20ｇ、62ミリモル）およびメタノールmlを
1000ml容の丸底フラスコに入れた。窒素をこの
溶液に泡立てて導入する間、氷水（100ml）を
転化した。この反応混合物を沈殿させ、追加の
メタノール（600ml）を添加した。温度を０〜
10℃に30分の反応時間にわたつて保持した。 上の懸濁液に、固体のナトリウムジチオナイ
ト（32.9ｇ、186ミリモル）をそのままで添加
し、そして炭酸ナトリウム（150ml、５％）を
PHが7.0に到達するまで添加した。 この反応混合物を30分間かきまぜ、氷水
（250ml）中に注ぎ、５％のNa₂CO₃で塩基性
（PH＝８）とし、酢酸エチル（３×500ml）で抽
出し、洗浄（ブライン）（２×50ml）し、乾燥
（Na₂SO₄）し、そして真空濃縮して、3.53ｇ
（19.4％）の淡黄色の固体を得た。Nmr
（CD₃OD）δ7.5−6.63（ｑ，４）、6.28（ｓ，１）、
4.80（ｄ，１，Ｊ＝３Hz）、4.05（ｑ，１）、3.8−
3.35（ｍ，２）、融点＝124−129℃（分解）、tlc
−Rf＝0.4（CH₂Cl₂／MeOH／NH₄OH、84／
12／４、ｖ／ｖ／ｖで溶離）［α］_D＝−2.68゜（ｃ
＝0.87 EtOH）。 Ｂ １−（3′−ブロモ−4′−アミノフエニル）−２
−ジクロロアセタミド−１，３−プロパンジオ
ールの製造。100mlのＮ，Ｎ−ジメチルホルム
アミド中の１−（ｐ−アミノフエニル）−２−ジ
クロロアセタミド−１，３−プロパンジオール
（6.8ｇ）の溶液に、室温において窒素のもと
に、100mlのDMF中のＮ−ブロモスクシンイミ
ド（4.1ｇ）の溶液を10分の期間にわたつて添
加した。反応容器を、反応を通じて光への暴露
に対した保護した。得られる暗赤色溶液を室温
でかきまぜた。２時間後、完全な反応がtlc板
（シリカゲルの板、10％のMeOH／CH₂Cl₂、生
成物Rf 0.45）上に観察され、次いで得られる
反応生成物を250mlの氷水中注ぎ、ジクロロメ
タンで抽出した。有機抽出液をNa₂SO₄で乾燥
し、40℃において真空蒸発乾固して赤色油を得
た。 粗製赤色油を、MeOH／CH₂Cl₂中に溶解し、
フラツシユクロマトグラフイーのシリカゲル
（約10ｇ）へ添加し、この懸濁液を蒸発させ、
1.5時間真空乾燥し、そして得られる粉末をシ
リカゲルのカラム（フラツシユクロマトグラフ
イー、８ｇ、Baker Chemical Co.）上へ導入
した。次いでカラムを１：１の酢酸エチル／ヘ
キサンを正の窒素圧のもとで溶離した。反応生
成物に相当する分画を合わせ、蒸発させて7.9
ｇの生成物（91％）を得た。分析：
C₁₁H₁₃N₂Cl₂Bro₃についての計算値：Ｃ、
35.56；Ｈ、3.49；Ｎ、7.53；Cl、19.09；Br、
21.48；実測値；Ｃ、35.32；Ｈ、3.74；Ｎ、
7.43；Cl、19.38；Br、21.29。 Ｃ １−（3′−ブロモー4′−アミノフエニル）−２
−ジクロロアセタミド−１，３−プロパンジオ
ールの製造。 エタノール中（24ml）中の上の１−（4′−ア
ミノフエニル−3′−ブロモ）−２−ジクロロア
セタミド−１，３−プロパンジオールの溶液
に、窒素のもとに０℃において、フルオロホウ
酸（Eastman Chemical Co.、５ml、水中49
％）を添加し、次いで1.7ml水中の亜硝酸ナト
リウム（１ｇ）の溶液を添加した。得られる赤
色溶液を室温において窒素雰囲気のもとにかき
まぜた。１時間後、完全な溶解がtlc（シリカゲ
ル、10％のMeOH／CH₂Cl₂、出発物質の完全
な消失）上に観察された。 得られる懸濁液を蒸発器により蒸発乾固さ
せ、オレンジ色固体を約50mlのエーテルを用い
て粉砕し、次いで蒸発乾固させた。このように
して得られた固体を室温において一夜真空乾燥
し、そしてそれ以上精製しないで直接使用し
た。 Ｄ 上から得られた粗製ジアゾニウム塩を、160
mlの水中に溶かし、４つの部分に分け、次いで
ドライアイス浴を用いて凍結させて保持した。
ジアゾニウム塩の各部分を使用前解凍し（25
℃）、次いで滴下漏斗を通して0.5時間にわたつ
て4000mlの水中の鋼（14.4ｇ）、亜硝酸ナトリ
ウム（110ｇ）の懸濁液中に添加した。試薬の
添加は合計約２時間を要し、そして得られた緑
味褐色懸濁液を室温においてさらに２時間かき
まぜた。完全な溶解はtlc（シリカゲル、10％の
MeOH／CH₂Cl₂、出発物質Rf0.43、生成物
Rf0.48）上に観察された。 この懸濁液を濾過し、無機沈殿物を集め、酢
酸エチルで洗浄した。次いで濾液の全体を酢酸
エチルで抽出し、有機層を合わせ、硫酸ナトリ
ウムで乾燥した。溶媒を蒸発させると、褐色残
留物が得られ、これをフラツシユクロマトグラ
フイーにより精製した。精製：粗生成物を酢酸
エチル中に溶かし、これに約６ｇのシリカゲル
（フラツシユクロマトグラフイー用 Bakerシ
リカゲル）を添加した。得られる懸濁液を蒸発
乾固し、約60ｇのシリカゲル（フラツシユクロ
マトグラフイー用Baker Chemical Co.シリカ
ゲル）を含有するカラム上に配置し、１：１酢
酸エチル／ヘキサンで溶離した。分画を集め、
純粋な試料（3.0ｇ）の“３−ブロモクロラム
フエニコール”が得られた。融点＝119−124
℃；ｍ／ｅ［ｍ＋NH₄］⁺420；
C₁₁H₁₃N₂O₅BrCl₂についての計算値：Ｃ、
32.84；Ｈ、2.74；Ｎ、6.97；Br、19.88；Cl、
17.66；実測値：Ｃ、33.00；Ｈ、2.89；Ｎ、
6.78；Br、19.91；Cl、17.88。 実施例 １−（3′−カルボキシメチレンチオ−4′−ニト
ロフエニル）−２−ジクロロアセタミド−１，
３−プロパンジオール（“クロラムフエニコー
ルメルカプト酢酸”）の製造 メルカプト酢酸（400μ）を、５℃において
窒素のもとに、DMF（11.6ml）中の水素化ナトリ
ウム（554mg、50％油中）の懸濁液に10分にわた
り添加した。15分後、DMF（15ml）中の１−
（3′−ブロモ4′−アミノフエニル）−２−ジクロロ
アセタミド−１，３−プロパンジオール（2.3ｇ、
5.77ミリモル）の溶液へ添加した。５℃において
90分後、反応生成物および出発物質の両者はtlc
（シリカゲル、0.1：１：９酢酸／MeOH／
CH₂Cl₂）上に示された。 暗褐色の反応生成物を減圧下に蒸発乾固し（40
℃）、次いで残留物を少量のMeOH／H₂O中に懸
濁させ、酢酸をPH５まで添加した。次いで、この
褐色溶液を８枚の厚い層の板（１：20：79酢酸／
MeOH／CH₂Cl₂）上で精製した。帯を１：
2MeOH：CH₂Cl₂で溶離することにより回収し、
そして660mgの黄色固体の“クロラムフエニコー
ルメルカプト酢酸”を得た。 黄色固体の“クロラムフエニコールメルカプト
酢酸”を、次のようにして、シラン化シリカゲル
のカラムでさらに精製した：50％の水性メタノー
ル（２ml）中の“クロラムフエニコールメルカプ
ト酢酸”をシリカゲル（シラン化、予備洗浄、２
ｇ）と混合し、生ずる懸濁液を蒸発乾固し、次い
で真空下に３時間室温において蒸発乾固した。次
いで、黄色残留物を、シラン化シリカゲルを含有
するカラムへ適用し、それぞれ、50mlのジクロロ
メタン、２％のMeOH／CH₂Cl₂、６％の
MeOH／CH₂Cl₂で溶離し、次いで所望生成物が
溶出されるまで15％のMeOH／CH₂Cl₂で溶離し
た。所望生成物を含有する分画を合わせ、蒸発さ
せると、80mgのオレンジ褐色の生成物の“クロラ
ムフエニコールメルカプト酢酸”が得られた。
［α］_D＝−8.2゜、ｃ＝５mg／ml。 実施例 (A) 次いで、“クロラムフエニコールメルカプト酢
酸”をβ−アラニンと反応させて、ペプチド架
橋： −Ｓ−CH₂CO−NHCH₂CH₂COOHをもつ対
応する化合物、すなわち、“クロラムフエニコー
ルメルカプトアセチルβ−アラニン”が得られ
た。 NMR：（300MHz）NMR（MEOH−D₄）、
2.42ppm（Ｍ、2H）（NCH₂CH₂COOH）、（カルボ
キシルに対して次のＨ、3.50ppm（Ｍ、2H）、
（NCH₂CH₂COOH）、（Ｎに対して次のＨ）、
3.67ppm（2H）（SCH₂C（０））、（イオウに対して
次のＨ）、4.20ppm（Ｍ、1H）、（NCH）、5.15ppm
（Ｄ、Ｊ＝3HZ、1H）（HCOH）、（アルコールに
対して次のＨ）、6.3ppm（Ｓ、1H）（CHCL₂）、
（塩素に対して次のＨ）、7.41ppm（Ｄ、1H）、
7.5ppm（Ｓ、1H）、8.15ppm（Ｄ、1H） 実施例 BgGの１−（3′−カルボキシメチレンチオ−
4′−ニトロフエニル）−２−ジクロロアセタミ
ド−１，３−プロパンジオール複合体の製造 Ａ “クロラムフエニコールメルカプト酢酸”の
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製
造。 0.5mlのDMF中の実施例からのクロラムフ
エニコールメルカプト酢酸（18mg、0.043ミリ
モル）の溶液に、粉末状のEDCI（9.2mg、0.048
ミリモル）およびNHS（６mg、0.052ミリモル）
を５℃において窒素のもとに添加した。18時間
後、反応はtlc（シリカゲル、10％のMeOH／
CH₂Cl₂、クロラムフエニコールメルカプト酢
酸のNHSエステル、Rf0.26、出発物質、
Rf008）により完結したことがわかつた。 Ｂ BgGへのクロムフエニコールメルカプト酢
酸の複合化 クロラムフエニコールメルカプト酢酸の
NHSエステル（実施例Ａに従つて0.9mlの
DMF中の35mg［0.048ミリモル］の酸、EDCI
［16.38mg］、およびNHS［12mg］から調製）を、
０℃において20mlのリン酸塩緩衝液中のウシガ
ンマグロブリン（300mg）の溶液へ、PHを8.5に
絶えず調整しながら1.5時間にわたつて添加し
た。次いで、得られる黄色溶液を５℃に一夜放
置した。次いで、この溶液をセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−50に通過させた（リン酸塩緩
衝液、PH8.5、0.05モルで溶離した）。タンパク
質の分画を合わせ、４×４のNH₄OH₄OH／
H₂O（PH7.5）に対して５℃において透析した。
次いで、複合体を凍結乾燥すると、ハプテン番
号（hapten number）33のタンパク質複合体
（310mg）が得られた。 実施例 (A) 同様な方法で、クロラムフエニコールメルカプ
ト酢酸をキーホール笠具へモシアニン（keyhole
limpet hemocyanin）で複合させた。 実施例 BSAの１−（3′−カルボキシメチレンチオ−
4′−ニトロフエニル）−２−ジクロロアセタミ
ド−１，３−プロパンジオール複合体の製造 クロラムフエニコールメルカプト酢酸のNHS
エステル（上の実施例Ａに従つてDMF中の30
mgの酸から調製）を、０℃において7.5mlのリン
酸塩緩衝液（PH8.5、0.05モル）および0.8mlの
DMF中のBSA（100mg）の溶液へ、PHを8.5に絶え
ず調整しながら40分間にわたつて添加した。次い
で、得られる混合物を５℃に72時間放置した。 得られる複合体を０℃および5Kにおいて10分
間遠心し、次いで上澄みをセフアデツクスＧ−50
に通過させ、リン酸塩緩衝液（PH8.5、0.05モル）
で溶離した。次いで複合体をPH７（NH₄OH／
H₂O、４×４）において２日間透析し、次い
で凍結乾燥すると、ハプテン番号16の98mgのタン
パク質が得られた。 実施例 G6PDHの１−（3′−カルボキシメチレンチオ−
4′−ニトロフエニル）−２−ジクロロアセタミ
ド−１，３−プロパンジオール複合体の製造 実施例におけるように調製した１−（3′−カ
ルボキシメチレンチオ−4′−アミノフエニル）−
２−ジクロロアセタミド−１，３−プロパンジオ
ールを、乾燥条件下に秤量して、乾燥セイヨウナ
シ形フラスコに入れた。次いで、120μのDMF
をフラスコに添加して内容物を可溶化した。次
に、２mgのNHSおよび2.6mgのEDACを、窒素で
フラツシユした後、フラスコへ添加した。さらに
窒素でフラツシユした後、フラスコおよび内容物
を５℃に20時間保持した。この溶液の20μを、
0.5mlの0.055モルのTris緩衝液、PH８、中の3.8mg
のG6PDH（Beckman Co.、Fullerton、CA）お
よび60mgのグルコース−６−ホスフエート二ナト
リウム塩［G6P（Na₂）、Sigma Coa、］を含有す
る溶液へ、４℃においてゆつくり添加した。酵素
の活性がもとの65〜75％に低下したとき、反応混
合物を19×1.9cmのセフアデツクスＧ−50
（Pharmacia、Piscataway、N.G、）のクロマト
グラフイーにかけ、0.05％のアジ化ナトリウムお
よび0.005％のチメロサールを含有する0.005モル
のTris緩衝液、PH８で３ml／分の流速で溶離し
た。約１mlの分画を集め、高い酵素活性を含有す
るそれらの分画（通常17〜24、合計の体積＝７
ml）を１−（3′−カルボキシメチレンチオ−4′−
アミノフエニル）−２−ジクロロアセタミド−１，
３−プロパンジオールのG6PDH複合体としてプ
ールした。 実施例 上で調製した組成物をクロラムフエニコールの
検定に使用した。検定に次の試薬を使用した： 表 緩衝液：0.055モルのTris−HCl、PH8.1（RT）、
0.05％のNaN₃、0.005％のチメロサール 検定緩衝液：緩衝液、0.5％のNaCl、0.01％
（ｖ／ｖ）のトロトン（Triton）Ｘ−100、PH
8.1（RT） 試薬Ａ：緩衝液、1.0％のRSA、0.066モルのG6P
（Na₂）、0.04モルのNAD、PH５（RT） 応答に対して最適化された抗クロラムフエニ
コール 試薬Ｂ：緩衝液、0.9％のNaCl、1.0％のRSA、
0.032モルのG6P（Na₂）、PH6.2、700△ODNO最
高速度を与えるために十分な酵素 プロトコール（protocol：50μの試料を希釈
器（diluter）中に吸引し、250μの検定緩衝液
とともに１mlのクロアン（Croan）カツプ中に分
配した。希釈した試料の50μのアリコートを吸
引し、250μの部分の検定緩衝液とともに第２
クロアン・カツプ中に分配した。第２クロアン・
カツプ中に、50μの抗体試薬を250μの部分の
検定緩衝液とともに導入し、次いで50μの酵素
試薬および250μの検定緩衝液を添加した。酵
素の添加直後、試料全体を流れセル（cell）中に
吸引して入れた。15秒後、第１の読みを取り、次
いで第２の読みを30秒の間隔で取つた。結果を吸
収の差×2.667として報告する。 ２頭のヒツジを実施例に従う抗原で免疫化し
た。Ｃ出血（bleed）において生産された抗血清
（4580および4583）を、最適な検定の応答
（optimal assay response）（O.D）および有効力
価（effective titer）について試験した。最適な
検定の応答は、2.5μｇ／mlまたは40μｇ／mlのク
ロラムフエニルコールのカリブレーター
（calibrator）の間のO.D.単位における最適な分
離である。この応答は、上に記載したプロトコー
ルに従つて得ることができる標準曲線の最良の範
囲を示す。最適な検定の応答が大きいほど、正確
さおよび精度か優れる。有効力価は、最適な検定
の応答を与えるために、要求される抗血清の量／
検定である。力価が高いほど、抗血清の要求され
る量は少なく、検定の生産コストは安価になり、
検定媒質中に導入される異質物質は少なくなる。 上の手順を、実施例に従う抗原および１頭の
ヒツジを使用して反復して抗血清412を得た。 ３種の抗血清の結果を下表に報告する。

【表】 酵素−複合体の不活性化百分率は、阻害の終点
に依存して65〜75％であつた。 交差反応性をクロラムフエニコールの代謝物質
（それらのいずれも活性ではなかつた）ならびに
他の薬物に対して測定した。クロラムフエニコー
ルの５種の既知の代謝物質、すなわち、１−ｐ−
ニトロフエニル−２−アミノ−１，３−プロパン
ジオール；１−ｐ−アミノフエニル−２−ジヒド
ロキシアセタミド−１，３−プロパンジオール；
１−ｐ−アミノフエニル−２−アミノ−１，３−
プロパンジオール；１−ｐ−ニトロフエニル−２
−ジヒドロキシアセタミド−１，３−プロパンジ
オール、および１−ｐ−アセタミドフエニル−２
−ジクロロアセタミド−１，３−プロパンジオー
ルのうちで、いずれの代謝物質も有意の活性を示
さなかつた。前記活性は、15μｇ／mlの対照中に
加えた（spiked into）とき、15μｇ／mlの対照の
濃度の130％（すなわち、19.5μｇ／ml）に等しい
検定における応答を与える化合物の濃度として定
義され、第２化合物の交差反応性の濃度は2μ
ｇ／mlであつた。クロラムフエニコールスクシネ
ート塩のみは、多少の交差反応性を示した。上の
検定と親試料の用いるHPLCとの間の比較の独立
の研究（これは２つの技術間のすぐれた相関関係
の統計を示した）に基づいて、クロラムフエニコ
ールを精確に定量するための主題の検定へ交差反
応性の影響は最小であると信じられる。 本発明の組成物は、クロラムフエニコールを密
接に関係する代謝物質から区別する、クロラムフ
エニコールについての感受的に精確な検定を提供
する試薬である。抗原の複合体は、クロラムフエ
ニコールに対して高い親和性および高い力価を有
する抗体類を効率よく生産する。抗体類と酵素複
合体類と組み合わせは、血清中のクロラムフエニ
コールの精確なかつ急速な検定を与える。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 式中、 Ｑは原子番号８〜16のカルコゲンまたは窒素で
   あり； ｐは０または１であり； Ｒは少なくとも１個の炭素原子および12個以下
   の水素以外の原子の結合基であり； Ｚは水素、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子の
   アルコキシ、水性媒質中でアミドを形成しうる活
   性化エステルを形成する基、または抗原性である
   かもしくは酵素であるポリ（アミノ酸）であり； ｍはＺがポリ（アミノ酸）であるとき０または
   １であり、そうでないとき１であり；そして ｎはＺがポリ（アミノ酸）以外であるとき１で
   あり、そうでないとき１とＺの分子量を1000で割
   つた数との間の数である、 の化合物。 ２ Ｒが１〜５個の炭素原子のポリメチレンであ
   る特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３ Ｑがイオウであり、ｐが１であり、Ｒが１個
   の炭素原子であり、そしてｍが１である特許請求
   の範囲第２項記載の化合物。 ４ Ｑが原子番号８〜16のカルコゲンまたは窒素
   であり； ｐが０または１であり； Ｒが１〜６個の炭素原子の飽和脂肪族結合基で
   あり； Ｚがポリ（アミノ酸）であり； ｍが０または１であり；そして ｎが１とＺの分子量を2000で割つた数との間の
   数である、 特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ５ Ｑがイオウであり、ｐが１であり、Ｒが１個
   の炭素原子であり、そしてｍが１である特許請求
   の範囲第４項記載の化合物。 ６ Ｑが原子番号８〜16のカルコゲンまたは窒素
   であり； ｐが０または１であり； Ｒが少なくとも１個の炭素原子および12個以下
   の水素以外の原子の結合基であり； Ｚが活性部位以外において置換されかつ結合以
   前のもとの活性の少なくとも30％を有する酵素で
   あるポリ（アミノ酸）であり； ｍが０または１であり；そして ｎが１〜30である 特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ７ Ｑが原子番号８〜16のカルコゲンまたは窒素
   であり； ｐが０または１であり； Ｒが１〜８個の炭素原子の飽和脂肪族結合基で
   あり； Ｚが水素、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子の
   アルコキシ、または水性媒質中でアミドを形成し
   うる活性化エステルを形成する基であり； ｍが１であり；そして ｎが１である 特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ８ Ｑがイオウであり、ｐが１であり、Ｒがメチ
   レンであり、ｎが１であり、そしてＺがヒドロキ
   シである特許請求の範囲第７項記載の化合物。 ９ 式 式中、 Ｑは原子番号８〜16のカルコゲンまたは窒素で
   あり； ｐは０または１であり； Ｒは少なくとも１個の炭素原子および12個以下
   の水素以外の原子の結合基であり； Ｚは水素、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子の
   アルコキシ、水性媒質中でアミドを形成しうる活
   性化エステルを形成する基、または抗原性である
   かもしくは酵素であるポリ（アミノ酸）であり； ｍはＺがポリ（アミノ酸）であるとき０または
   １であり、そうでないとき１であり； そして ｎはＺがポリ（アミノ酸）以外であるとき１で
   あり、そうでないとき１とＺの分子量を1000で割
   つた数との間の数である、 の化合物を製造するにあたり、式（Ｖ）′ 式中、 X′は離脱性基である、 の化合物を、式（Ｖ）″ Ｈ−QpR（CO）mH （Ｖ）″ 式中、 Ｑ、ｐ、Ｒおよびｍは上記において定義したと
   おりである、 の化合物またはその反応性誘導体と反応させる
   か、あるいはＺがポリ（アミノ酸）以外である式
   （Ｉ）の化合物を、抗原のポリ（アミノ酸）また
   は酵素のポリ（アミノ酸）と複合化させることを
   特徴とする前記の式（Ｉ）の化合物の製造方法。