JPS6141A - ノルトリプチリン誘導体およびコンジユゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明分野） ノルトリプチリンは、広く使用されている３環系抗う一
つ剤である。この薬剤の治療濃度範囲は、５０〜ｌ　７
５ｎｇ／Ｊである。用量か低いと４ｆ意な作用が得られ
ず、過量は生命をわびゃかづ′副作用を招く。過量は、
けいれん、昏睡、心臓性不整脈並びに散瞳および頻脈の
ような抗コリン作動性徴候を招くことがある。

薬剤の代謝速度ζｊ、個人、および薬剤に対する個人の
感受性により著しく異なることか判明した。

それ故、適当な用量レベルを確保するためには、血漿レ
ベルを監視して治療用量を釘持し得るようにしなければ
ならない。

用量レベルの監視に際しては、ノルトリプチリンの簡単
、正確、迅速な測定法であって、ノルトリプチリンレベ
ルについて誤まった値を与え得る他の薬剤およびノルト
リプチリン代謝産物からノルトリプチリンを識別し得る
方法の存在が望まれる。

（先行技術） ノルトリプチリンは、アミトリブチリンに極めて化学的
関連性が強い。生物体液中のアミトリブチリンに関する
既知の測定技術には、薄層クロマトグラフィー、気液ク
ロマトグラフィー（ＧＬＣ）、およびＧＬＣ−質量スペ
クトロメトリーを用いるものが含まれる。グリフオード
等、ジャーナル・オン・クロマトグラフィー（Ｊ　、　
Ｃｈｒｏｍ２）　　ｌ　０５巻１０７〜＋１３頁（１９
７５年）、グプタ等、クリニカル・バイオケミストリー
（ＣＩｉｎ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ。

）９巻２４７〜５１頁（１９７６年）、ナイベルクおよ
びマーテンラン、ジャーナル・オン・クロマトグラフ　
イー　（Ｊ　、　　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）　
　１４３巻４９１頁（１９７７年）、ワトソンおよびス
チュヮート、ジャーナル・オン・クロマトグラフィー（
Ｊ。

Ｃｈｒｏｍ２）　１３４巻１８２頁（１９７７年）、同
誌１３２巻１５５〜＋５９頁（１９７７年）参照。アミ
トリブチリンのラジオイムノアッセイは、アヘーヌ等、
ブリティッシュ・ジャーナル・オン・クリニカル・ファ
ーマコロジー（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｐｈａｒｍａｃ、　）　３巻５６１頁（１９７６年）、
ターナ−、ランセット０．ａｎｃｅｔ）　ｌ　３１６頁
、（１９７７年）、およびアヘーヌ等、ランセット（Ｌ
　ａｎｃｅＬ）　＋２１４頁（１９７７年）に報告され
ている。アヘーヌ等の同誌には、抗体産生用抗原の合成
が記載され、そこではノルトリプチリンをアミノブチレ
ンで置換した後カルボジイミドてうし血清アルブミンと
コンジュゲート（抱合）している。カウル等、ジャーナ
ル・オン・アナリティカル・トキンコロジー（Ｊ、　Ａ
ｎａｌ、　ＴＯＸ２）１巻２３６頁（１９７７年）に報
告された別の抗原コンジュゲート合成では、スクシニッ
ク基を用いてノルトリプチリンをうし血清アルブミンに
コンジュゲートしている。

生成する抗体は、多数の他の３環系薬削と顕著な交差反
応性を示すことが判明している。

米国特許第４２７５１６０号は、イミプラミン誘導体お
よびポリ（アミノ酸）コンジュゲートを記載している。

米国特許第４３０７２４５号は、抗原性蛋白質および酵
素に対するアミトリブヂリンコンジュゲ〜トを記載して
いる。米国特許第４２２０７２２号は、ハロアシル基を
用いた、ポリアミノ化合物に対するコンジュゲ−１・法
を記載している。米国特許第３４５８５７８号は、４−
アミノ−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾｌａ’ｄ
ｌシクロへブテン−５−オンを記載している。米国特許
第３８０３２３４号は、一般的開示として２および３−
ニトロ−１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ〜ジベンゾ［ａ、
ｄ］　シクロへブテン−５−オンを記載している。

［発明の要約］ この発明によると、蛋白性材料、特に抗原性および酵素
性ポリ（アミノ酸）とコンジュゲートするために３位を
官能化したノルトリプチリン誘導体の製造法が提供され
る。抗原性コンジュゲートは、イムノアッセイに用いる
抗体の産生に使用される。

酵素コンジュゲートは、イムノアッセイによるノルトリ
プチリン定量用の試薬として用いられる。

抗体および醇素コンジュゲ〜トは、血清および他の生理
学的液体中のノルトリプチリンを迅速かり正確に測定す
るために、キットの形に組合わせて用いられる。

［好ましい実施態様〕 この発明により提供される新規化合物は、抗原性または
酵素であるポリ（アミノ酸）に対してコンシュゲートで
きる官能基を３位にイｉ’　４−るノルトリブヂリン誘
導体である。抗原性コンジュゲートは、ノルトリプチリ
ンに対して特異的な抗体の産生用の免疫原として用いら
れる。抗体はイムノアッセイに用いられる。酵素コンジ
ュゲートは、ノルトリプチリンの定量用酵素アッセイに
おける試薬として用いられる。

主として、この発明の化合物は下記の式（１）で表わさ
れる。

［式中、ψおよびψ′は、−緒になって、酸素原子（オ
キソ）に対する二重結合またはＧで置換された炭素原子
に対する二重結合（すなわち、ψおよびψ′が−ＣＨ−
Ｇ）（ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原子、通常水
素以外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基であり、上
記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノ、好まし
くは第３級アミノである）を形成することができ、ここ
で、Ｇは（ＣＨｙ）ｚ　　Ｎ　　ＣＨｓ（すなわち、ψ
およびψ。

薯 が＝Ｃ１〜Ｉ　　（ＣＩ−１−）２　　Ｎ　　ＣＨ３）
であってもよく、ここでＪは水素原子、メチル、または
、非オキソがルボニル、通常炭素原子数２〜６、好まし
くは３〜４個のアルコキシカルボニルであって、これは
炭素原子３個以上が存在する場合、通常β置換分として
、原子番号１７〜３５のハロゲン原子、通常塩素原子を
０〜３個を含有してもよい］（こごにいう非オキソカル
ボニルは少なくとも１つのへテロ原子で置換されたカル
ボニル基をさす。適当な基としては、カルボン酸、エス
テル、アミド、酸ハロゲン化物、無水物が含まれる。

ψおよびψ′は、それぞれ別個になる場合、オキソ、通
常ヒドロキシ、および水素以外に４〜８個の原子、通常
水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基（ここで
、上記原子は炭素および窒素、通常４〜５個の炭素およ
び０からＩの窒素であり、窒素はアミノ、好ましくは第
３級アミノである）を表わすことができ、 Ｒは、結合手、または、水素以外の原子数１〜２０、好
ましくは水素以外の原子数４〜１５、さらに好ましくは
水素以外の原子数７〜１２の脂肪族連結基であり、上記
原子は炭素、窒素、カルコゲン（酸素および硫黄）であ
ってよく、この幕は水素以外の原子数１〜１５、好まし
くは水素以外の原子数３〜１２、さらに好ましくは水素
以外の原子数５〜１０の鎖、通常１−１０個、好ましく
は２〜６個の炭素、通常０〜５個、好ましくは１〜３個
の酸素（オキソカルボニル、非オキソカルボニルまたは
エーテル、特に非オキソカルボニルとして存在する）通
常０〜３個、好ましくは１〜２個の窒素（アミノとして
存在し、好ましくは１個の窒素が芳香核に連結する）お
よび通常０〜２個の硫黄原子（チオノまたはジスルフィ
ドとして存在する）を含み、ここで、上記それぞれの炭
素には、１個以下のへテロ原子が飽和結合により連結す
るものとし、 Ｙは、酸素原子、イミノ（Ｎ−Ｈ）または硫黄原子、好
ましくは酸素原子、 Ｚは、アミノ（ｒ＝０）、水素原子、炭素原子数■〜６
、通常炭素原子数１〜３のアルコキシ（硫黄類似体を含
む）（ここで、上記硫黄類似体Ｚは、Ｒと一緒になって
ジスルフィドを形成してもよい）または、抗原または酵
素であるポリ（アミノ酸）（ＦＡＡ）、 ｍは０または１であり、一般的には、ＺがＦＡＡ以外の
場合は１１ ｒは０またはｌであり、Ｚがアミノの場合は０、それ以
外の場合は１１ ｎはＺがＦＡＡ以外の場合１１それ以外の場合平均して
ｌとＺの分子量１５００、さらに普通には／１０００、
しばしば／１５００の間の数を表わし、一般的には、１
〜５００、好ましくは１〜１００（Ｚが抗原の場合）、
または１〜３０、さらに普通には２〜２０、好ましくは
２〜１６（Ｚが酵素の場合を表わす］ ｒか０、ｎが１である化合物は、式（１１）で表わされ
る。

［式中、ψａおよびψａ′は、−緒になって、酸素原子
（オキソ）に対する二重結合、またはψａおよびψａ′
は、それぞれ別個に、オキソ、および水素以外に４〜９
個の原子、通常水素以外に５〜６ｎ−１の原子を有する
脂肪族の基（ここで、」−記原子は炭素および窒素であ
り、通常炭素ｊ皇子数４〜５、および窒素原子数０〜Ｉ
てあり、窒素はアミノ、好ましくは第３級アミノである
）を表わすことができ、 Ｚｏ　はアミノである。］ ｍが０、ｒおよびｎが１であるこれらの化合物は、一般
に式（ＩＩＩ）で表わされる。

［式中、ψｂおよびψｂ゛は、−緒になって、Ｇで置換
された炭素原子に対する二重結合（ずなわち、ψｂおよ
びψｂ゛が−Ｃ−Ｇ）（ここで、Ｇは水素以外に４〜８
個の原子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪
族の基であり、上記原子は炭素および窒素であり、窒素
はアミノ、好ましくは第３級アミノである）を形成する
ことができ、ここで、 Ｇは−（ＣＨ２）２　　Ｎ　　ＣＨ３（すなわち、ψお
よび、Ｔ ψ′が−Ｃ（ＣＨ３）ｚ　　Ｎ　　ＣＨａ）であっても
よく、ここて、■は水素原子、メチル、または非オキソ
カルボニル、通常炭素原子数２〜６、好ま１．とは３〜
４個のアルコキシカルボニルであって、これは炭素原子
：う個以上が存在する場合、通常β置換分として、原子
番号１７〜３５のハロケン原ｒ・、通常塩素原子を０〜
３個を含有してし、に＜、Ｒ１は−Ｎ　ＨＣＣＨｔ　　
Ｓ−１ ２１は水素、または炭素原子数約１〜６個、好ましくは
炭素原子数１〜３個のアルキルチオである］ Ｚ２が水素原子であり、Ｒ１と一緒になってチオールを
形成する場合、化合物は塩、例えば酢酸塩として安定化
するができる。

Ｚがポリ（アミノ酸）である場合、多くの場合好ましく
は化合物は式（ｍで示されるものである。

［式中、Ｒ７はＭ　（Ｑ、　）ａＴＳ　Ｄであり、ここ
てＤは例えば Ｍはアミノ、 ＱはＣ−Ｗ、ここで、Ｗは酸素原子、イミノ（Ｎ−Ｈ）
、または硫黄原子、特に酸素原子であり、ａは０または
１、 ＴおよびＴｏは炭素原子数１〜４個、好ましくは炭素原
子数１〜２個の連結基であり、好ましくは脂肪族、さら
に好ましくはアルキレン、特にメヂレンであり、ａが０
のとき、Ｔは少なくとも二個の炭素を有するものとし、 ＹおよびＹ゛は独立して酸素原子、イミノ（Ｎ−Ｈ）ま
たは硫黄、好ましくは酸素であり、Ａはイミノ、 ｋは０または１、 ｐは０または１、好ましくは１１ ｍ２はＯまたは１１好ましくは１、 ｎ２は少なくとも１、および通例１より大きく、Ｚ３が
抗原性であるとき、ｎ２は一般に少なくとも２であり、
平均してＺ３の分子ｆｉ１５００より大きくなく、通常
Ｚ″の分子量／１０００より大きくなく、好ましくはＺ
３の分子量／＋５００より大きくなく、一般に約２〜５
００の広い範囲の数であり、Ｚ３が酵素のとき、ｎ２は
少なくとも１であり、普通３０より大きくなく、さらに
一般的には約２〜２０の間で、好ましくは約２〜１６の
間の数であり、 Ｚ３はポリ（アミノ酸）であり、その分子量は約５００
０から分子量の上限はないが、通常１００００より少な
くなく、約６５００００よりも大きくない数である］分
子量の範囲は、通常抗原または酵素の何れが関係するか
によって異なり、抗原の場合的５０００〜１０７、通常
的２０　（１００〜６５００００、さらに普通には約２
５０００〜２５００００の分子量であり、酵素の場合一
般に約１００００〜６０００００．さらに普通には１０
０００〜３０００００の分子量である。通常コンジュゲ
ート基は分子量５０００００につき少なくとも約１個、
さらに普通には分子！＋５００００につき少なくとも１
個存在する。中間分子量の抗原（３５０００〜１０００
０００）の場合、コンジュゲート基の数は通常的２〜２
５０であり、さらに一般的には１０〜１００である。低
分子量の抗原（３５０００以下）については、コンジュ
ゲート基の数は一般的に約２〜１０の範囲にあり、通常
２〜５の間である。］ この発明の好ましい化合物は下式で示される。

［式中、ｐ　、　ｍ　２、およびｎは前記の意味、ｌ）
　Ａ　Ａは前に定義したポリ（アミノ酸）を表わ４」種
々のタイプの蛋白質をポリ（アミノ酸）としての抗原性
物質として使用することができる。これらのタイプには
、アルブミン、血清蛋白質、例えばグロブリン、眼球レ
ンズ蛋白質、リボプロアイン等を含む。蛋白質の具体例
としては、うし血清アルブミン、ひざらかい（Ｋｅｙｈ
ｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、卵オボアルブミ
ン、うしγ−グロブリン等がある。また、これらの代り
に、合成ポリ（アミノ酸）であって利用できるアミノ基
、例えばリジンを充分な数だけもつものを製造できる。

酵素は、結果について望まれる速度およびノルトリプチ
リンを測定すべき生理学的流体に応して広範囲に変える
ことができる。酵素の選択をＩ　ＵＢ（国際生化学連合
）の分類に基づいて述べると、主として、クラスｌのオ
キシドレダクターゼおよびクラス３のヒドラーゼである
。、特にクラスｌにおいて興味のある酵素は、クラス１
．１のデヒドロゲナーゼ、さらにはクラス１．１．、Ｉ
、１．１．３ｉよび１．１．９９のもの、およびクラス
１．１　＋のペルオキシダーゼである。ヒドロラーゼで
は、特にクラス３．１のもの、さらに３．１．３のもの
、およびクラス３．２のもの、さらに３．２．１のもの
である。

デヒドロゲナーゼの例には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
、グルコース−６＝燐酸デヒドロゲナーゼ、および乳酸
デヒドロゲナーゼが含まれる。オキシダーゼの例は、グ
ルコースオキシダーゼである。ペルオキシダーゼや例は
、西洋わさび（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダ
ーゼである。ヒドロラーゼの例は、アルカリ性ホスファ
ターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ダルコシダーゼお
よびリソチームである。

特に好ましいのは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤ）またはそのホスフェート（ＮＡＤＰ）、
特に前者をコファクターとするものである。最も好まし
い酵素は、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼであ
る。

コンジュゲート酵素は、抗（）、ルトリプチリン）で飽
和されたとき少なくとも４０％、通常少なくとも約６０
％阻害されているのが望ましく、−・方、コンジュゲー
トの不活性化は天然品の８０％以ド、好ましくは６０％
以下である。

この発明の化合物は、下記の方法により製造される。方
法は、式（ＸＶ） の化合物で始まり、この化合物を還元して式（ＸＶＩ）
（式中、ψおよびψ′は前記の意味） を得る。還元は当技術で公知の方法によって行なう。適
当な方法は、例えば接触水素化または亜ノヂオナイトと
の反応である。

次いで、ψおよびψ′が一緒になって酸素原子に対する
二重結合（オキソ）を形成する化合物（ＸＶＩ）を、グ
リニヤール試薬と反応させて、式（ＸＶＩ）においてψ
およびψ′がそれぞれ別個にオキソ（通常ヒドロキシ）
および水素以外に４〜８個の原子を有する脂肪族の基（
上記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノである
）の化合物を得る。

クリ二ヤール反応は、当業界で公知の適当な方法にした
がって行なう。例えば、グリニヤール試薬Ｘ−Ｍｇ−Ｇ
’　［ここで、Ｘは原子番号１７〜３５のハロゲン（好
ましくは塩素または臭素）、Ｇｏは水素以外に４〜８個
（通常５〜６個）の原子を有する脂肪族の基（この原子
は炭素および窒素であり、窒素はアミノ、好ましくは第
３級アミノであって、基は通常３−ジメチルアミノプロ
ピルである）］を用いる。

次に、上記化合物を脱水して、式（ＸＶＩ）においてψ
およびψ′が−・緒になってＧで置換された炭素原子に
対する二重結合（すなわち、ψおよびψ。

が＝ＣＨ−Ｇ）［ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原
子を有する脂肪族の基（−１，記原子は炭素および窒素
であり、窒素はアミノであろ）１を形成する化合物を得
る。脱水は常法に、にり行なう。適当な脱水剤としては
、例えばパラトル」、ンスルホン酸またはトリフルオロ
酢酸が含まれる。

上記の工程により、式（１）においてψおよびψ。

が前記の意味であり、ｒおよびｍが０、ｎが１、Ｚがア
ミノの化合物が得られる。

式（ＸＶＩ）の化合物を、さらに反応性誘導体Ｈ−Ｒ−
（Ｃ）＋ｎ’−Ｚ″ ［ここで、ＲＳＹおよびｍは前記の意味、Ｚ″は水素原
子、または炭素原子数１〜６のアルコキシ（その硫黄類
似体を含む）であるコで処理して、式（１′）において
ψおよびψ′、Ｒ，Ｙ並びにｍは０ｔｉ記の意味であり
、ｒがｌＳｎが１．７が水素原子、または炭素原子数１
〜６のアルコキン（その硫黄類似体を含む）の化合物を
得る。この工程の適当な反応条件は当業界で公知である
。反応性誘導体は、活性エステルのような適当な活性基
、例えば非オキソカルボニルを活性化してアミノ基と結
合させるエステル基、好ましくはＮ−ヒドロキシスフノ
ンイミジルにより、アミノ基に結合される。

次いで、この発明のコンジュゲートを、式（１°）の化
合物とポリ（アミノ酸）のカップリングにより作る。適
当な活性化ポリ（アミノ酸）に対するコンジュゲ−１・
化（抱合）は、当業界で公知の方法、例えば（Ｉ゛）の
スルフヒドリル基におけるカップリングにより行なう。

ポリ（アミノ酸）の活性化もまた、常法により、例えば
ハロゲン原子またはオレフィン結合の存在を利用して行
なう。

式（ｘｖｌ）においてψおよびψ′が一緒になって酸素
原子に対する二重結合（オキソ）を形成する中間体は、
３−ニトロペンゾスベロンであり、公知化合物ジベンゾ
スベロンをニトロ化することにより製造される。３−ニ
トロペンゾスベロンは、グリニヤール試薬（好適には前
記のもの）と反応させることにより、式（ＸＤにおいて
ψおよびψ′がそれぞれ別個のオキシ（通常ヒドロキシ
）および水素以外に４〜８個の原子を有する脂肪族の塙
（」、記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノで
ある）である化合物に変換する。生成する化合物は、次
いで（前記のように）脱水して、式（ＸＶ）においてψ
およびψ′が一緒になってＧで置換された炭素原子に対
する二重結合（すなわち、ψおよびψ′が−ＣＨ−Ｇ）
［ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原子を有する脂肪
族の基（上記原子は炭素お、ｊ：び窒素であり、窒素は
アミノである月を得る。前記のように、これら式（ＸＶ
）の化合物は、何れも（前記のような方法による）ニト
ロ基がらアミノ基への還元により式（ＸＶＩ）の化合物
に変換することができる。

この発明の化合物の合成経路をド記反応式で示すが、こ
れは説明のためのものであって限定するものではない。

反応式　１ ％式％（） シスおよりトランス異性体 シスおよりトラシス異性体 Ｈ （Ｃｌ”ＬＬ ａ）例えば無水酢酸のような無水媒質中、例えばＨＮ　
Ｏ９のようなニトロ化剤による ｂ）　　Ｈ，および触媒 Ｃ）亜ジチオン酸金属、通常亜ジチオン酸すｌ、リウム ｄ）　　Ｘ−Ｍｇ−Ｇ’　　ｆココテ、Ｘは原ｒＪ号１
７〜３５のハロゲン（好ましくは塩素または臭素）、は
水素以外に４〜８個（通常５〜６個）の原子を有ずろ脂
肪族の基（この原子は炭素および窒素であり、窒素はア
ミノ、好ましくは第３級アミノであり、通常３−ジメチ
ルアミノプロピルである）］ ｅ）例えばパラトルエンスルホン酸またはトリフルオロ
酢酸のような脱水剤 ｆ）Ｌ（Ｑ）ａＦ’　［ここで、Ｑおよびａは前記の意
りは非オキソカルボニルをアミノ基に結合するエステル
性活性基（好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
）、Ｆｌは鎖中に水素以外に４〜１０個の原子を有する
基（この原子は炭素および硫黄であり、少なくとも１個
の炭素は非オキソカルボニルに結合し、硫黄はジヂオエ
ーテルであり、通常ＦＩはＴ−８−ＩＣＩ−１，てあっ
て、Ｔは前記の意味であり、好ましくはＦｌはＣＨｔ−
６−８−ＣＨ３である）］ ｇ）、、Ｘ−Ｊ’　（ここで、Ｘは前記の意味、Ｊｌは
Ｊと同し意味。但しＪ−水素原子を除く）ｈ）還元剤、
通常原子番号２２〜３０の金属、好ましくは亜鉛、およ
び酸、通常酢酸 ｉ）　　　　　　　Ｙ’　　　　　　ＹＩＩ　　　　　
　　　　　　ＩＩ Ｘ　　ＣＨ２（Ｃ（Ａ）ｋＴ’）ｐ　Ｃ−Ｚ’　（ここ
で、Ｘ、Ｙ’、Ａ、に、Ｔ’、ｐ、　ＹおよびＺ３は前
記の意味） この発明の化合物の製造に際しては、ノベンゾスベロン
ｍ）を、好ましくは当阻のニトロ化剤で処理して、３−
ニトロジベンゾスベロン（Ｖｌ＋）を得る。化合物ｍｌ
）の還元は、接触水素化または亜ジチオン酸（塩）によ
り行ない、化合物（Ｗｉｌｌ）を得る。化合物（Ｗｉｌ
ｌ）とグリニヤール試薬の反応により化合物（１ｘ）を
得、これを脱水して化合物（Ｘ）とする。化合物（ＸＩ
）は、化合物（Ｘ）と、アミノ茫に結合する活性エステ
ルを混合づ−ろことにより得られる。化合物（ＸＩ）を
緩和なアルカリ性条（−１下で脱メチルして化合物（Ｘ
１１）とし、これを還元して第２級アミン（Ｘｌｌ＋）
を得る。化合物（Ｘｌｌ＋）のポリ（アミノ酸）コンジ
ュゲート（Ｘｍ＋；ｌ：、化合物（Ｘｌｌ＋）と、その
スルフヒドリル基に結合する適当な話性化ポリ（アミノ
酸）コンジュゲート、例えばハロゲン原子またはオレフ
ィン結合により活性化されたものを結合さＵることによ
り製造される。

上記方法を用いると、ノルトリプチリンと抗原性または
酵素性ポリ（アミノ酸）とのコンジュゲートを製造する
ことができる。合成後にノルトリプチリンの構造が存在
し、近縁化合物との区別をもたらす上記構造要素の存在
により、ノルトリプチリンを類似構造の化合物から識別
できる抗体の産生が可能となる。抗原性化合物は、抗体
製造の常法にしたがって、広範囲のを椎動物に注射する
ことがてきる。通常動物から定期的に採血し、後続採血
は力価および特異性の向上を示すが、最高値に達した後
力価と特異性が減少する。この発明により製造した抗体
は、上記ノルトリプチリンに特異的な抗原性および酵素
性コンジュゲートと結合する能力を有し、アミトリブチ
リンおよびイミプラミンのようなノルトリプチリン近縁
化合物および代謝物から識別することかできる。

前述のように、この発明により製造した抗体および酵素
試薬は、ノルトリブチリノ定０１用イムノアッセイに用
いるに特に適する。ポモンニアス酵素イムノアッセイと
しての上記イノ、ノアツセイの実施法は、米国特許第３
８１７８３７ｑに記載されている。この方法は、酵素コ
ンジコゲ−１・、（例えばクロマトグラフィー分離によ
り代謝物除去処理した）ノルトリプチリンの含有が疑わ
れる未知試料、およびノルトリプチリンの抗体を、水性
緩衝媒質中、約１０〜５０℃、通常約２０〜４０℃の温
度範囲で混合し、その酵素活性を既知はのノルトリプチ
リンを含むアッセイ媒質の酵素活性と比較定量すること
を含むものである。

［実施例］ 以下に示す実施例は、この発明を説明するものであって
、これを限定するものではない。

温度は特記しない限りセ氏で示す。液体の部および％は
容量で示し、他は重量で示す。丁記の略号を用いる。

ｔ４ｃ・・・薄層クロマトグラフィー ＣＦ・・ゲＪレジ濾過 ｆＲ・・・赤外線吸収スペクトル ＣＤ（４，・・重クロロホルム Ｐｍｒ・・プロトン磁気共鳴スペクトルＭＨｚ・・・メ
ガヘルツ １’ＭＳ・・・トリメチルシラン ＭＳ・・・質量スペクトル １］・・・時間 Ｎ　ＨＳ・・・Ｎ−ヒドロキシスクランイミドＤＭＦ　
　・ジメチルホルムアミド ＩうＤＣＩ・・１−エヂルー３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド塩酸塩 １３　Ｓ　Ａ・・・うし血清アルブミンＲ８Ａ・・家兎
血清アルブミン ＢｇＧ　　・・・うしガンマグロブリンＧ−６−Ｐ　Ｄ
　Ｈ・・グルコース−６＝燐酸デヒドロゲナーゼ Ｇ−６−ＰＮａ・・・グルコース−６−燐酸ナトリウム
塩 ＋３　Ｌ　Ｇ・・ベータラクトグロブリン実施例１ ３−ニトロシヘンゾスベロンの製造 白色発煙硝酸（９０％、６．ＩＪ、０，１３モル）に無
水酢酸（１５ｍ児２）を室温で徐々に加えた。得られた
温溶液（３０°）を２５°に冷却し、ジベンゾスベロン
（２０，８，ｇ、０１１モル、アルドリッチ・ケミカル
社製）と無水酢酸２５Ｊの溶液に３時間内に滴下した。

添加後少量をとり、水に入れ、ジクロロメタンに分配し
た。ｔｌｃは３　ニトロンベンゾスベロン、移動性の高
い物質お上ひ出発原料の存在を示した。次いで、反応混
合物を氷水２リツトルに加え、油状生成物を３１１分間
撹拌した。生成する水層を傾斜して捨て、底の油状残渣
をジクロロメタンに溶かし、飽和重炭酸水素ナトリウム
溶液および食塩水で洗浄した。有機層をＭｇ５Ｏ，で乾
燥し、濃縮して淡黄色油状物を得、これを温エーテルに
溶かし、ヘキサノを濁るまで加えて結晶化した。得られ
る澄明溶液を一夜冷却（０℃）して淡黄色固体の３−ニ
トロノベンゾスベロン　６５ｇ（収率２６％）を得た３
、氷晶の［ｊ２．ｃ・は主生成物と微量の不純物を示１
．た。水晶は精製什ずに用いた。

元素分析＋　ＣＩ、Ｉ−１１１，Ｎ　Ｏ３計算値　Ｃ７
１，，１５、Ｈ４，３５、Ｈ５，，５３実測値　Ｃ６９
，４２、Ｈ４、３，４、Ｈ５８５実施例２ ３−アミノジベンゾスベロンの製造 テトラヒドロフラン（８００ｍｌ）、イソプロパツール
（８００ｍりおよびりん酸緩衝液［ｐＨ６，５，１，６
リツトル。１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ。

（０，１モル）と２７．８ｍｌのｌＮ−ＮａＯＨを混合
し、生成した溶液を２リツトルに希釈することにより製
造１の混合液と実施例１で得られた３−二トロジベンゾ
スベロン（２７，２ｇ、０．１０７モル）からなるけん
だく液に、亜ジチオン酸ナトリウム（２２０ｇ　、イー
ストマン・オーガニック・）１ミカルズ製）を５分間に
４つたり加えた。固体は可溶性になり、１５分後１４ｃ
は反応完結を示した。次いで、得られる澄明溶液を酢酸
エチルで完全に抽出し、６機層を飽和ＮａＣ９溶液で洗
浄し、ＮａｔＳＯａで乾燥した。溶媒を濃縮して得られ
た黄色粗生成物をシリカゲルカラノ＼り［＋７トタラフ
イーに付し、エーテル／ヘキサンＩ　、−ζ溶解して、
純粋な黄色３−アミノジベンゾスベロン８．７ｇ　（収
率３６％）を得た。

実施例３ ３−アミノ−５−（３−ジメチルアミノプロピル）−５
−ヒドロキシ−１０，１ｍ−ノヒド（７ジベンゾ［ｂ　
、　ｅ］ジクロロブタトリエンの製造ａ、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルプ口ピルク【Ｊライドの製造 約１００ｍ１の水に溶かしたＮ、Ｎ　　ジメチルプロピ
ルクロライド塩酸塩（Ｉ　ＯＯｇ　、アルドリッチ・ケ
ミカル社製）溶液にｐＩＩ約１１〜１２となるまで１０
％ＮａＯＨを加えてアルカリ性にしたー。

次いで、生成する二層溶液をエニーチルで抽出し、エー
テル抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥した。１気圧−１・簡単
な蒸留装置を用いてエーテルを蒸留し、生成する液体を
４５°（圧力６０　ｍｍｍｍ１ｌで蒸留してＮ。

Ｎ−ジメチルプロピルクロライドの無色液体５４．５ｇ
　を得ノこ。

ｂ、グリニー型−１１反応： １．２−ノゾロモエタン（ジェイ・ティ〜・ペイカー・
ケミカル社）数滴を、テトラヒドロフラン（５３ｍｆ、
乾燥し、ベンゾフェノンのナトリウム塩で新たに蒸留）
中のマグネシウム屑（１３ｇ。

０．５４モル）に窒素気流下加えた。この屑をガラス製
ロッドを用いて粉砕し、気体の放出を認めた後、Ｎ’、
Ｎ−ジメチルプロピルクロライド（３２４ｇ、０．’２
７モル）とテトラヒドロフラン（１５０ｍｉ＞からなる
溶液を滴下した。この滴下をしている間溶液を十分に加
熱して穏やかな還流を維持した。還流下１時間撹拌後、
褐色の反応混合物を室温になるまで冷却し、乾燥テトラ
ヒドロフラン（２２０ｍ／）に溶かした実施例２で得ら
れた３−アミノジベンゾスベロン（１２，４ｇ、０．０
５６モル）を加えた。生成する褐色生成物を半時間室温
で撹拌しておき、飽和塩化アンモニウム（２００ｍ、２
）を用いて注意深く冷却した。生成する黄色残留物を酢
酸エチルで抽出した。有機相を飽和ＮａＮＣＯ３および
食塩水で洗浄し、乾燥しくＮａｔＳ０４）、濃縮して３
−アミノ−５−（３−ジメチルアミノプロピル）−５−
ヒドロキノ−１０，１１−ジヒドロジベンゾ［ｂ　、　
ｅｌ　ンク［１ヘプタトリエンの黄色油状物（１７，２
ｇ）を得た。

実施例４ ３−アミノアミトリブチリンの製造 トリフルオロ酢酸（２９，６ｍ児、０．１７５モル）を
、実施例３で得られた３−アミノ−５−（３−ジメチル
アミノプロピル）−５−ヒドロキシ−１０゜１１−ジヒ
ドロジベンゾ［ｂ　、ｅｌ　ソクロへブタトリエン（１
７，１ｇ、０．０５５モル）とジクロロメタン（３００
ｍｊｉｊ）からなる溶液に加えた。生成する暗褐色の溶
液を１８時間還流した。少量の反応混合物のｔＪｌｃは
反応がまだ完結していないことを示した。したがって、
１）−１−ルヱシスルホン酸−水化物（１０，５ｇ、０
．０５５モル）を加えて一夜撹拌した。１８時間後反応
の完結か認められた。反応生成物を冷却し、エーテルで
希釈し、濃アンモニア（２２ｍｌ）を用いてアルカリ性
とし、次いで、酢酸エチルで抽出した。溶媒を濃縮する
と、２つの主成分およびより高いＲｆ値を膏する不純物
をいくらか含何する泡状生成物が得られた。

プレパラティブＨＰＩ、Ｃ（高速液体クロマトグラフィ
ー）［シリカゲルカラム、ＮＨ３：　ＭｅＯＨ：Ｃ１（
ｔｃ、Ｍ２１０．２４　　：　３　：　９７（容量比）
］を用いて試料を精製した。

フラクションを集め、屈折率および分析ｔｆｌｃ（ノリ
力ゲルプレート、０．０８’：　　Ｉ　　ニア、／ＮＨ
３：ＭｅＯＨ：　Ｃ’１４　ｔ　Ｃ１１２）を用いて分
析した。等しいＲｆ値を有するフラクションを合わせて
濃縮し、　６．８ｇのノス〜３−アミノアミトリブチリ
ンＣＲｆ　Ｏ’、０８）および３．６ｇのトランス−３
−アミノアミトリブチリン（Ｒｆｏ、１５）を得た。

２段階にわたる３−アミノジベンゾスベロンからの生成
物の全収量は　１０．４ｇ　（収率６４％）である。

元素分析：　Ｃ２ｏＨ２４Ｎ　ｖ　・１　／　２　Ｈｔ
。

計算値　Ｃ７９，７３、Ｈ８，３１，Ｈ９，３０実測値
　Ｃ７９，５３、Ｈ７，９９、Ｈ８８９実施例５ Ｎ’−（メチルジチオアセチル）−ｊウ−アミノアミト
リブチリンの製造 メチルノチオ酢酸のＮ、ＨＳエステル（２，９ｇ、１３
．８ミリモル）を、テトラヒドロフラン（８０ｍｆｌ、
ナトリウムベン゛ブフェル−ｉ・から新ノニ（こ乾燥蒸
留）およびジクロロメタン（２（ＩＪ、モレキュラーソ
ーブ３Ａ上で乾燥）の混合物と実施例４で得られたシス
−３−アミノアミトリプヂリン（２，７ｇ、９．３モル
）からなる溶液に加えた。生成溶液を室温で撹拌し続Ｉ
Ｊた。４　ｎ後、ｔ４ｃは反応の完結を示した。生成す
る淡黄色溶液を回転エバポレータ上で濃縮乾固し、残留
物を逆相ノリカゲルカラムクロマトグラフィ−［シラン
化されたシリカゲル６０を３００ｇ含有１に付し、３％
ＭｅＯＨ／ＣＩ（ｚｃＬ　（１，４リツトル）、次いで
５％ＭｅＯ＋−＋／　ＣＨ２Ｃｆｌｖ　（６００ｍｆｌ
２）で溶離した。溶媒を濃縮後、Ｎ”（メチルジチオア
セチル）−３−アミノアミトリブチリンを含イＪｉ）る
淡黄色泡状生成物４．３ｇが得られた。生成物を１００
ｍ見のＣＨ２Ｃ児、に溶解し、トリニーｆ・シアミン１
ｍ児を加えた、有機層を飽和ＮａＣ９で洗浄し、Ｎａｘ
ｓｏ４で乾燥し、濃縮して、Ｎｏ−メチル（ジチオアセ
チル）−３−アミノアミトリブチリンの泡状生成物３３
ｇ（収率８６％）を得た。

実施例６ Ｎ（β、β、β−トリクロロエトキンカルボニル）−Ｎ
−メチル（ジチオアセチル）−３−アミノノルトリプチ
リンの製造 クロロぎ酸トリクロロエチル（９，６Ｊ、７０ミリモル
）を室温で窒素雰囲気下、実施例５で得られたＮ’−（
ジチオアセチル）−３−アミノアミトリブチリン（３ｇ
、７ミリモル）とジクロロメタン（１２０Ｊ、モレキュ
ラーシーブ３Ａ上で乾燥）からなる溶液に滴下し、次い
で１５分内にトリエチルアミン（９，７ｍｉ、、７０ミ
リモル）を加えた。

微温反応混合物を水浴を用いて冷却し、次に室温で３．
５時間放置した。分析ンリカゲルプレートにで観察した
ところ反応は完結した。生成する黄色溶液を濃縮乾固し
た。エーテル（［０ＯＩＩＩＲ，）を加えた。生成した
白色沈殿物を濾過し、次いで工−チルで洗浄した。エー
テル炉液を集めて濃縮して褐色油状物を得、これをシリ
カゲルクロマトグラフィーに付した。フラクションを＋
４ｃにより分析した。生成物はＵＶ発色団を示４−か不
純物はＵＶ吸収をせず、■、チャンバー内で展開すると
より高いＲｆ値の位置に褐色スポットを示すため、ＵＶ
および工、の両者を用いて上記フラクションを検査した
。フラクションを合わ且てＮ　（β。

β、β−トリクロロエトキシカルボニール）−３−アミ
ノ−Ｎｏ−（メチルジチオアセデル）ノルトリプチリン
を白色泡状生成物と１．て得た（３．２ｇ。

収率７７％）。不純物を次の反応においてメチルジチオ
アセデル誘導体の還元的開裂を防げるため、不純物を含
有するフラクションは再びクロマトグラフィーに付すか
捨てた。カラムク［ツマトゲラフイー後の試料は、正し
い構造を示した。

元素分析：　ＣｔｓＨｔｔＮｚＯａＣｊｌ＋Ｓｔ計算値
　Ｃ５２，３１，Ｈ４，７１，Ｈ４，，８８（４１８，
５７、ＳＩｌ、１６ 実測値　Ｃ５２，４１、Ｈ４，８５、Ｈ４，７３（４１
８，１４、ＳｌＯ，８４ 実施例７ ３−アミノ−Ｎ’−（メチカプトアセチル）ノルトリプ
チリンの製造 メルカプト誘導体の処理に用いて全溶液を少なくとも１
０分間室温で各溶液にアルゴン気泡を通すことに上り脱
気した。

活性化亜鉛末（１，５ｇ）を室温で窒素気流下、実施例
６で得られたＮ−（β、β、β−トリクロロエトキシカ
ルボニル）−３−アミノ−Ｎｏ−（メチルジチオアセデ
ル）ノルトリプチリン（５００ｍｇ。

０．８７ミリモル）と氷酢酸（ｌＯＩＩｌｉ２）からな
る溶液に加えた。２％ＨＣ，［１００ｍｆｌで４〜５分
間十分に洗浄することにより亜鉛末を活性化し、次いで
濾過し、亜鉛粉末を水、エチルアルコール、アセトンお
よび乾燥エーテルで洗浄した。次いで、この粉末を室温
で減圧下−夜乾燥し、次に還元に用いた。反応混合物を
室温で一夜撹拌したままにした。２２時間後、反応混合
物を濾過し、約４０ｄの水で洗浄し、濾過を水浴中で冷
却した。白色沈殿（ＲｆＯ，９５，１１４ｍｇ）が生成
し、これを１去して捨て、炉液をＩＯＪのエ　チル／ヘ
キサン（１：　　Ｉ）で２回抽出するか、または、副産
物を完全に除去した。次いで、生成Ａ°ろ水溶液を総１
１２００ｍｆのジクロロメタンで抽出し、６機溶液を食
塩水で洗浄し、Ｎａ、ＳＯ４で乾燥した。

溶媒を濃縮して３−アミノ−Ｎ’−（メルカプトアセチ
ル）ノルトリプチリン酢酸塩の澄明な粘稠性油状物（１
０４ｍｇ、収率２９％、ｌ「０．３１）を得た。

生成物は、１日以内のうちに室温で減圧下に分　解する
のが認められた。しかしながら、酸性条件下、例えば酢
酸塩の場合生成物はより安定することがわかった。３−
アミノ−Ｎ’−（メルカプトアセチル）ノルトリプチリ
ン酢酸塩を窒素またはアルゴン雰囲気下でたくわえ、ド
ライアイス温度で保った。

実施例８ ３−アミノ−Ｎ’−（メルカプトアセチル）ノルトリプ
チリンおよびブロモアセチルグリシルＢｇＧのコンジュ
ゲートの製造 ａ、ブ【ＪモアセヂルグリシンのＮＨＳエステルの製造 粉末状ｔｕ］ｓ、（Ｉｇ２）およびＥＤＣＩ　　（Ｉｇ
。

’５．２ミリモル）を、０°で窒素雰囲気下ブロモアセ
チルグリシン（ＩｇＳｍｐ、１１４〜１１５°）とＤＭ
ＦＩＯＪからなる溶液に加えた。次いで、生成する澄明
溶液を５°で１８時間後まで撹拌し続け、Ｎ　ＨＳエス
テルを単離せずに直接用いた。

ｂ、ブロモアセチルグリシンとＢｇＧの結合ブロモアセ
デルグリシンのＮＨＳエステル（６ｍ児のＤＭＦ中５０
０ｍｇ、前記と同様に製造）を、０°で３０分内にりん
酸緩衝液（１００ｍｉ、、　ｐＨ９，０，０５Ｍ）とＤ
ＭＦ（５ｍ児）の混合液に溶かしたＢｇＧ　（１，５ｇ
）の澄明溶液に滴下した。ＮＨ８溶液を加えるＯ７１の
ＢｇＧ溶液のｐＨは８てあった。ＮＨ８溶液を添加後１
）Ｈは６．３まで下がった。次いでｐＨを６．８に調節
した。生成する混合物を５°で一夜撹拌し続けた。１８
時間後、このコンジュゲートを４×４リツトルのりん酸
緩衝液（０，０１２５Ｍ、ｐｔ１６．８）および２×１
１リットル（０，０５Ｍ、ｐｒ−ｒ６．８）に対して透
（斤した。

このコンジュゲ−１・を１５０Ｊ、まど吊釈し、さらに
結合させるために貯留した３、ごの蛋白質コノシュゲー
トの濃度をＵＶにより測定すると５）５８ｎ＋ｇ／ｍｌ
てあった。

ｃ、３−アミノ−Ｎ”−（メルカプトアセデル）ノルト
リプチリンとブロモ）２セヂルグリノルＢｇＧの結合 実施例７で製造した３−アミノ　Ｎ’　　（メルカプト
アセデル）ノルトリプチリンアセテ−１−（１’１　Ｍ
Ｐｌ　、７５ｍ兇＋１１３５ｍｇ　）を、前述のように
製造したブロモアセチルグリシルＢｇＧ溶液（２１２ｍ
ｇ）を０．１モルのりん酸緩衝液（ｐＨ７、窒素により
予め脱気）３０Ｊに溶かしたしのに加えた。、生成する
不澄明溶液を５°で７０時間窒素気流計に置いた。次い
で、乳液を、４リットルのＮ　Ｈ４（１）ＨＨｚＯｌＩ
）Ｉ−１９，２ＸＩリツトルの８Ｍ尿素、１リツトルの
４Ｍ尿素、ｌリンドルの２Ｍ尿２）；および次に５ｘ４
リツトルのＮＩＩ’＋０１１　１１，０１ｐＨ９に対し
て透析した。コンジュゲートのｐ　Ｉ−１を１５％Ｎ　
Ｈ、ＯＨを用いて１０に調節し、１０分間３にで遠心分
離した。上清を凍結乾燥してハブテン番号４６のコンジ
ュゲート（２０５ｍｇ）を得ノこ。

実施例９ ３−アミノ−Ｎ’−（メルカプトアセデル）ノルトリプ
チリンおよびブロモアセチルグリツルＢＳＡのコンジュ
ゲートの製造 ａ、ブロモアセチルグリシンのＢＳＡのコンジュゲ−１
・の製造 ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステル（５００ｍｇ
）を６　ｍｆｌのＤＭＦに溶かしたものを、３０分内に
０°でＢＳＡ（１，５ｇ）とりん酸緩衝液（ｐｒ−ｒ９
０．０．０５Ｍ、ＪｏＯｍｊｉｊ）おるびＤＭＦ（６Ｊ
）からなる澄明溶液に滴下した。ＮＨＳエステルを加え
る］１ｔのＢ　Ｓ　Ａ溶液のｐｌ（は約８０であった。

Ｎｌｌ５エステルを添加後はｐＨは５〜６までドかった
。反応混合物のｐＨ（５，８６）を　６８に調節し、５
°て一夜撹拌した。次いて、生成するコンジュゲートと
３ｘ４リツＩ・ルのりん酸緩衝液（０，０１２５Ｍ５ｐ
Ｈ６，８）お、１−び２×４リツトルのりん酸緩衝液（
０，０５Ｍ、ｐｌ＋６．８）に対して透析（７た。コン
ジュゲ−１・を１５０Ｊに希釈し、さらに結合させるた
めに貯留１７だ。蛋白質コンジュゲートの濃度をＵＶに
より測定すると８　、８　ｍｇ蛋白質／ｍ児溶液であ−
た。

ｂ　３−アミノ−Ｎ”（メルカプトアセチル）ノルトリ
プチリンとブ［ｌモ）２セチルグリノルＢＳＡの結合 ＤＭＦ３　ｍｆｌに溶かした３−アミノ−Ｎｏ−（メル
カプトアセチル）ノルトリプチリン遊離塩基（６５ｍｇ
、実施例７と同様にして製造）を、りん酸緩衝液（４１
Ｊ、ｐＨ７）おにびＤＭＦ（８Ｊ）の混合液に前述のよ
うに製造されたブロモアセチルグリツルＢ　Ｓ　Ａ（２
５０ｍｇ）を溶かし７にらの１−結合に用いられた溶液
は窒素ガスで飽和した１に加えた。次いで、生成する混
合物を全部で７２時間５°て窒素雰囲気下撹拌し、Ｎｉ
１４（’）Ｈ／Ｈ３Ｏ（１０Ｘ４１）に対して完全に透
析した３１次いて、コンジュゲートを凍結乾燥して蛋白
質１９４ｍｇを得た（ハプテン番号２４）。

実施例１０ Ｉ・ランス−３−アミノ−Ｎ’−（メルカプトアセチル
）ノルトリプチリンおよびブロモアセデルグリシルＧ−
６−ＰＤＨのコンジュゲートの製造ａ、ブロモアセチル
グリシン（ＢＡＧ）およびに　−６−Ｐ　Ｄ　Ｈの製造 米国特許第４，２２０，７２２号明細書第１８〜１９段
に開示された手順にしたがい、前記ＢＡＧ／Ｇ−６−Ｐ
Ｉ月１結合体を製造した（この公報を引用して説明の一
部とする）。この結合体を４リットルのトリス緩衝液に
対して透析したが保存剤は用いない（０，０５％アジ化
物、００５％チメラソール１゛旧ｍｃｒａｓｏｌ　）。

こうして６．１　　ｍｆｌ中、結合体１３．８ｍｇを得
た。

ｂ２）ランス−３−アミノ−Ｎｏ−（メルカプトアセデ
ル）ノルトリプチリンとブロモアセチルグリノルＧ　−
６−Ｐ　Ｄ　Ｉ（のコンジュゲート 実施例７で得たトランス−３−アミノ−Ｎ’−（メルカ
プトアセチル）ノルトリプチリン１９ｍｇと氷酢酸５０
μ！を含有するＤＭＦｏ、５ｍｇ、からなる溶液を製造
した。この溶液（１２５μりをアルゴンを用いて脱余し
、前に透析さ４コ２）こＢ　Ａ　Ｇ　／　０−６−ＰＤ
Ｈ６，１ｍｆｌに加えノこ。生成する混合物を４°で３
．５時間撹拌し、次いで遠心分離した。上清をセフ７デ
ツクス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ　）Ｇ　−５０カラム上ク
ロマトグラフイりこ付し、祉白質含ａフラクションを集
めた。生成物は８４％不活性化され４０％抑制可能であ
った。

実施例１．１ Ｇ　−６−Ｐ　Ｄ　Ｈおよび５−（３−Ｎ−メチルアミ
ノプロピル）ｉｏ、１１−ジヒドロ−１０−チオアセト
アミド−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ　、　ｒ］アゼピンのコン
ジュゲートの製造 ａ、０．０５５Ｍトリス緩衝液（１）Ｈ８，０）８ｍｇ
。

を用いて４°でブロモアセチルグリシンお上びＧ−６−
ＰＤＨ（６１ｍｇ）のコンジュゲートを製造し、ｃ−ｅ
−ｐ　（Ｎａ２）塩およびＮ　Ａ　Ｄ　Ｈのそれぞれ３
２０ｍｇを加えて溶解させた。この溶液に、前記実施例
１Ｏのように製造した０、５Ｍブロモアセチルグリシル
Ｎ　ＨＳエステルＤＭＦ溶液を撹拌しながら徐々に加え
て酵素の不活性度を６５％とした。この溶液を１８時間
トリス緩衝液（０，０５５Ｍ、ｐＨ８，０，４０００ｍ
ｉ２）に対して透析した。

ｂ　、５−（３−Ｎ−メチルアミノプロピル）−１０，
１，１−ジヒドロ−１Ｏ−チオアセトアミド−５’Ｈ−
ジベンゾ［ｂＪ］アゼピンとブロモアセチルグリシルＧ
−６−ＰＤＨのコンジュゲート 実施例５で得たハプテン原料（６３ｍｇ）を脱気ＤＭＦ
　　１．５　ｍｌ中で再構成させた。実施例９で得た全
ての透析された原料をフラスコ内に入れ、４°まで冷却
し、アルゴン気流下２時間脱気した。

ハプテン対酵素比率約９５になるまでこのハプテンを撹
拌しながら徐々に加えた。抗ＤＭＩ抗体に対する抑制率
は４５〜５０％であった。次いで、Ｇ−６胤Ｐ　Ｄ　Ｉ
−１コンジユゲートをＧ５０カラム上４°で保存剤を含
むトリス緩衝液（０，０５５Ｍ。

ｐｉ−１８，０）を用いて脱塩した。

実施例１２ ノルトリプチリンアッセイ この発明に従って製造された化合物の６効性を明らかに
するため、実施例８のコンジュゲートノこ対応して従来
方法で製造された抗体および実施例１１で製造された酵
素コンジュゲートをいくつかのノルトリプチリンアッセ
イで用いた。アッセイを行なう際、フローセルのついた
ザーモキコヘットと共にギルフォード・ステイグ−１−
（Ｇ　１ｌｒｏｒｄＳｔａｚａｒ）商標］分光光度計を
用いた。全量数を３４０ｍｎで測定した。アッセイで用
いる試剤として次の溶液を製造した。

緩衝液： ０．０５５Ｍトリス−ＨＣ克　ｐＨ８，１（ＲＴ）実施
例１１ｂで得た酵素コンジュゲー用−緩衝液 ０．９％ＮａＣｌ１’、Ｆ １．０％ＢＬＧ、Ｉ）Ｈ８，ｌ０ｔＴ）アッセイ媒質に
おいて７００〜Ｉ　Ｏ（１０に等Ｌ７いΔＯＤの最大割
合を与えるのに十分な実施例１１による酵素コンジュゲ
ート アッセイ緩衝液 緩衝液 ０５％ＮａＣ，ｅ １．００％［ｖ／ｖ、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ
　−１９０、ｐｌ−ｉ８．１　　（ＲＴ）、］抗体試薬 緩衝液 ０．１％ＢＬＧ Ｇ−６−Ｐ（Ｎａ）　　Ｏ，Ｉ９８Ｍ ＮＡＤ　　Ｏ，＋　２Ｍ５ｐＨ５（ＲＴ）アッセイに最
適な抗ノルトリプチリン（実施例９のコンジュゲートを
用いてひつじ中で製造された抗体） ％は全てｗ／ｖ　ｓ　ｇ／ｍ児 アッセイを実施するために用いる実験計画は次のとおり
であった。

まず最初に試料を処理して代謝産物を除去した。

１００ｍｇのＣ−２カラムを約１　ｒａｉｌのメタノ−
ル、次に約Ｉ　　Ｊの水で洗浄した。試料（５００μり
をカラムの頂部に置いた。減圧装置を底につけてカラム
を減圧した。得られた溶離剤を捨て、カラムを７０％　
０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨＬ２）、３０％アセトニ
トリルおよび５　ｍｔｖｔヘブタンスルシス〜トからな
る溶液９００μ兇で洗浄した。再びカラムを真空状態に
し、溶離剤を捨てた。次に、カラムを、５０％アセトニ
トリル、２５％メタノールおよび２５％５ミリモルＫ　
ｖ’ｆｌ　Ｐ　Ｏ４、ｐｉ−１７からなる溶液５００μ
児と接触させた。溶離剤を集め、アッセイ工程で用いた
。

上記試料１５マイクロリツトル（μＲ，）を希釈器に導
入した。この試料を２５０マイクロリツトルのアッセイ
緩衝液と共に１ミリリットルのり［ｌ−ン（Ｃｒｏａｎ
）カップへ投入した。このクローンカップ中にアッセイ
緩衝液２５０μ克と共に抗体試薬１１５μ克を導入し、
次に酵素試薬１５　Ｉｔ　ｆｌとアッセイ緩衝液２５０
μ！を加えた。酵素添加後直しに、試料全体をフローセ
ルに吸引した。１０秒後最初の水数を読み取り、５０秒
おいて２番目の水数を読み取った。結果は吸収ｘ２．６
６７　の差として記録した。

ノルトリプチリンの 試料濃度（ｎｇ／ｍｉ２）　　　　　　ΔＯＤ５０　　
　　　　　、　　　７６１ １７５　　　　　　　　　　．８５０ このアッセイは血しょうのような生物学的流体における
ノルトリプチリンを測定する高感度かつ正確な方法を提
供する。この発明はノルトリプチリンに対して特異的な
試剤を提供するものであり、ノルトリプチリンの濃度変
化に伴なう酵素活性の変化の実質的範囲をもたらすもの
である。この方泡は速やかに行なえるものてあり、実験
計画は単純で、比較的技術者が誘発する誤差が少ないも
のであり、酵素アッセイと実質的に同様に行なうことが
できる。

ｎ：Ｉ述の発明について、明確さと理解しやすさを目的
として例証および実施例を通して詳しく記述しどきノー
が、明らかに本明細書の特許請求の範囲内において変更
または修正を行なうことができるしのである。

特許出願人　ンンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ψおよびψ′は、一緒になって、酸素原子（オ
   キソ）に対する二重結合またはＧで置換された炭素原子
   に対する二重結合（ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の
   原子を有する脂肪族の基であり、上記原子は炭素および
   窒素であり、窒素はアミノである）を形成するか、また
   は ψおよびψ′は、それぞれ別個に、オキシおよび水素以
   外に４〜８個の原子を有する脂肪族の基（ここで、上記
   原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノである）を
   表わすことができ、 Ｒは、結合手、または炭素、窒素およびカルコゲン（酸
   素および硫黄）を含む水素以外の原子数１〜２０の脂肪
   族連結基、 Ｙは、酸素原子、イミノ（Ｎ−Ｈ）または硫黄原子、 Ｚは、アミノ（ｒ＝Ｏ）、水素原子、炭素原子数１〜６
   のアルコキシ（その硫黄類似体を含む）またはポリ（ア
   ミノ酸）、 ｍは０または１、 ｒは０または１であり、Ｚがアミノの場合は０、それ以
   外の場合は１、 ｎは、Ｚがポリ（アミノ酸）以外の場合１、それ以外の
   場合平均して１とＺの分子量／５００の間の数を表わす
   ］ で示される化合物。
2. （２）ψおよびψ′が一緒になって酸素に対する二重結
   合を形成し、Ｚがアミノである、特許請求の範囲第１項
   記載の化合物。
3. （３）ψおよびψ′が一緒になってＧで置換された炭素
   原子に対する二重結合を形成し、ここでＧは−（ＣＨ＿
   ２）＿２−Ｎ−ＣＨ＿３であり、Ｊは水素原子、メチル
   、または、原子番号１７〜３５のハロゲン原子０〜３個
   を含有してもよい炭素原子数２〜６個のアルコキシカル
   ボニルである、特許請求の範囲第１項記載の化合物。
4. （４）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＾２は▲数式、化学式、表等があります▼、 ここで、Ｍはアミノ、 ＱはＣ＝Ｗ（Ｗは酸素、イミノ（Ｎ−Ｈ）または硫黄）
   、 ＴおよびＴ′は炭素原子数１〜４の連結基、ＹおよびＹ
   ′は、独立して、酸素原子、イミノ（Ｎ−Ｈ）または硫
   黄原子、 Ａはアミノ、 ａ、ｋ、ｐおよびｍ＾２は、それぞれ、０または１、ｎ
   ＾２は少なくとも１であり平均してＺ＾３の分子量／５
   ００より大きくない数、 Ｚ＾３はポリ（アミノ酸）を表わす］ で示される化合物。
5. （５）Ｒ＾２が▲数式、化学式、表等があります▼、 Ｙが酸素原子である、特許請求の範囲第４項記載の化合
   物。
6. （６）Ｚ＾３が抗原性である、特許請求の範囲第４項記
   載の化合物。
7. （７）Ｚ＾３がうし血清アルブミンである、特許請求の
   範囲第４項記載の化合物。
8. （８）Ｚ＾３がうしガンマグロブリンである、特許請求
   の範囲第４項記載の化合物。
9. （９）Ｚ＾３がひざらがいヘモシアニンである、特許請
   求の範囲第４項記載の化合物。
10. （１０）Ｚ＾３が酵素である、特許請求の範囲第４項記
    載の化合物。
11. （１１）Ｚ＾３がグルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
    ゼである、特許請求の範囲第４項記載の化合物。
12. （１２）Ｚ＾３が抗原性である特許請求の範囲第４項記
    載の化合物、Ｚ＾３が酵素である特許請求の範囲第４項
    記載の化合物、およびノルトリプチリンに結合する、Ｚ
    ＾３が抗原性である特許請求の範囲第４項記載の化合物
    に応答して生産された抗体。
13. （１３）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ψｂおよびψｂ′は、一緒になって、Ｇで置換
    された炭素原子に対する二重結合（ここで、Ｇは水素以
    外に４〜８個の原子を有する脂肪族の基であり、上記原
    子は炭素および窒素であり、窒素はアミノである）を形
    成し、 Ｒ＾１は▲数式、化学式、表等があります▼ Ｚ＾２は、水素、または炭素原子数約１〜６のアルキル
    で置換されたチオを表わす］ で示される化合物。
14. （１４）Ｇが▲数式、化学式、表等があります▼であり
    、Ｊはメチル、または炭素原子数２〜６のアルコキシカ
    ルボニルである、特許請求の範囲第１２項記載の化合物
    。
15. （１５）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ψａおよびψａ′は、一緒になって、酸素原子
    （オキソ）に対する二重結合を形成するか、またψａお
    よびψａ′は、別個に、オキシおよび水素以外に４〜８
    個の原子を有する脂肪族の基（ここで、上記原子は炭素
    および窒素であり、窒素はアミノである）を表わすこと
    ができ、 Ｚ＾１はアミノを表わす］ で示される化合物。
16. （１６）ノルトリプチリンを含有する疑のある試料中の
    ノルトリプチリンの存在を測定する方法において、 （ａ）水性媒質中で試料を（１）Ｚ＾３が抗原性である
    特許請求の範囲第４項記載の化合物に応答して生産され
    た抗体および（２）Ｚ＾３が酵素である特許請求の範囲
    第４項記載の化合物と混合し、 （ｂ）混合物の酵素活性を測定し、 （ｃ）上記酵素活性を既知量のノルトリプチリンを含む
    アッセイ媒質の酵素活性と比較することによりノルトリ
    プチリンの存在を測定すること、からなる方法。
17. （１７）ノルトリプチリンの測定用酵素イムノアッセイ
    法において、（１）Ｚ＾３が酵素である特許請求の範囲
    第４項記載の化合物に応答して生産された抗体および（
    ２）Ｚ＾３が酵素である特許請求の範囲第４項記載の化
    合物を使用することからなる、改良法。
18. （１８）特許請求の範囲第１項記載の化合物の製造法に
    おいて、 （ａ）式（ＸＶ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＶ） で示される化合物を還元して、式（ＸVI） ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸVI） （式中、ψおよびψ′は特許請求の範囲第１項記載の意
    味） で示される化合物を得るか、または （ｂ）式（ＸVI）においてψおよびψ′が一緒になって
    酸素原子（オキソ）に対する二重結合を形成する化合物
    を、グリニヤール試薬と反応させて、式（ＸVI）におい
    てψおよびψ′がそれぞれ別個にオキシおよび水素以外
    に４〜８個の原子を有する脂肪族の基（ここで、上記原
    子は炭素および窒素であり、窒素はアミノである）を表
    わす化合物を得るが、または （ｃ）上記（ｂ）項の化合物を脱水して、式（ＸVI）に
    おいてψおよびψ′が一緒になってＧで置換された炭素
    原子に対する二重結合（ここで、Ｇは水素以外に４〜８
    個の原子を有する脂肪族の基であり、上記原子は炭素お
    よび窒素であり、窒素はアミノである）を形成する化合
    物を得るか、 または（ｄ）式（ＸVI）で示される化合物を、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ、Ｙおよびｍは前記の意味、Ｚ″は水素原子
    、または炭素原子数１〜６のアルコキシ（その硫黄類似
    体を含む）を表わす］ で示される反応性誘導体で処理して、式（ I ′）［式
    中、ψおよびψ′、Ｒ、Ｙ並びにｍは前記の意味、ｒは
    １、ｎは１、Ｚは水素原子、または炭素原子数１〜６の
    アルコキシ（その硫黄類似体を含む）を表わす］ で示される化合物を得るか、または （ｅ）式（ I ′）で示される化合物をポリ（アミノ酸
    ）とカップリングして式（ I ）で示されるコンジュゲ
    ート化合物を得ること、 からなる方法。
19. （１９）イムノアッセイに用いるものである、特許請求
    の範囲第１項記載の化合物。