JPH0469397A - 新規ペプチド及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、下記構造を存する新規なペプチドを提供する
ものであり、アンギオテンシン変換酵素阻害剤等として
存用なペプチドに関する。

Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。

［従来の技術］ アノギオテノンノ変換酵素は、主として肺や血管内皮細
胞、腎近位尿細管に存在し、アンギオテンノンＩ（Ａｓ
ｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　−１ｉｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に作用して、アンギオテ
ノノノＩのＣ末端よりノベブチト（Ｈｉｓ９−Ｌｅｕ”
）を開裂遊離させ、強力な昇圧作用を有するアンギオテ
ンノン■を生成させる酵素である。また、この酵素は生
体内降圧物質であるプラジキニンを破壊し不活化する作
用も併有し、昇圧系に強力に関与している。

従来より、アンギオテンノン変換酵素の活性を阻害すれ
ば、降圧に働き、臨床的には高血圧症の予防、治療に有
効であると考えられている。

最近ではプロリン誘導体であるカプトプリルが合成され
、降圧活性が確認されて以来、種々のアンギオテンシン
変換酵素阻害物質の合成研究が盛んであり、又天然物か
らの取得も試みられているところである。

天然物由来のアンギオテンンン変換酵素阻害剤は食品あ
るいは食品原料から得られるので低毒性で安全性の高い
降圧剤となることか期待されるからである。

「発明が解決しようとする課題」 しかしながら、天然物中に見出されるアンギオテンシン
変換酵素阻害物質は極めてまれで、僅かにブラジル産や
日本産蛇毒より得られたテプロタイド（ノナペプチド５
Ｑ２０８８＋）等や、ストレプトミセス属に属する放線
菌の代謝産物ｌ５８３　（特開昭５８−１７７９２０号
公報）が知られているに過ぎない。また、天然物を酵素
処理して得られたアンギオテンンン変換酵素阻害物質と
しては、牛乳カゼインをトリプトンンにより分解して得
たペプチド類等が知られているが（特開昭５８−１０９
４２５号、同５９−４４３２３号、同５９−４４３２４
号、同６１−３６２２６号、同６１−３６２２７号）新
規な阻害物質の開発が望まれているところである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる課題を解決すべく天然物質で副作
用の少ないアンギオテンノン変換酵素阻害物質を鋭意探
索した結果、蛋白質特に魚肉、カツォブシを特定の酵素
で加水分解した組成物中にアンギオテンンン変換酵素阻
害活性を育する物質の存在をつきとめ、該物質がＬｅｕ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏを骨格とするペプチドであることを知
見し、本発明を完成した。

本発明のＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏを骨格とするペプチド
は文献未載の新規なペプチドであり、カツオブン等の蛋
白質をサーモライノンによって加水分解することによっ
て製造され、実用にあたっては組成物をそのまま用いて
も良く、あるいは必要に応して精製して使用される。更
にはペプチド合成の常套手段を適用して合成することに
よって製造することもできる。

上記でいうＬｅｕはロイ７ン、Ｌｙｓはリジン、Ｐｒｏ
はプロリンを意味し、かがるアミノ酸はいずれもし一体
である。

本発明のペプチドは蛋白質をサーモライツノで加水分解
すること７こよっても、ペプチド合成法でも取得てきる
。

蛋白質をサーモライノンで加水分解するには、蛋白質の
性状により処決は異なるか、難溶性の場合には熱水に蛋
白質を混合し強力な撹拌でホモジナイズし、所定量のサ
モライシンを加え温度ｌＯ〜８５℃程度で０１〜４８時
間反応を行う。

蛋白質としては、動物由来や微生物由来のもの等が任意
に用いられ、特に有用なものはカツオブノ、イワシ等の
魚類である。加水分解液中には本発明のペプチド以外に
、他のペプチドが存在してるか、これらは混合物のまま
で各種の用途に用いられても良く、又、本発明のペプチ
ドのみを単離して用いても差し支えない。

単離する場合は加水分解液を遠心分離等の公知の操作で
濾過する。その後抽出、濃縮、乾固などを適用した後、
あるいはせずしてそのまま、種々の吸着剤に対する吸着
親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性あるいは溶解度
の差、２種の混ざり合わない液相間における分配の差、
分子の大きさに基づく溶出速度の差、溶液からの析出性
あるいは析出速度の差などを利用する手段を適用して目
的物を単離するのが好ましい。これらの方法は必要に応
じて単独に用いられ、あるいは任意の順序に組合せ、ま
た反覆して適用される。

本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる方法
、即ち液相法または固相法でペプチド結合の任意の位置
で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応
性カルホキノル基を有する原料と、他方のフラグメント
に相当する反応性アミノ基を有する原料とをカルボジイ
ミド法、活性エステル法等を用いて縮合させ、生成する
縮合物か保護基を有する場合、その保護基を除去させる
ことによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は
、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては
、例えばヘンノルオキノアルポニル、ｔ−プチルオキノ
力ルホニル、ｐ−ヒフェニルイソブロピロオキノ力ルホ
ニル、９−フルオレニルメチルオキノカルホニル等か挙
げられる。カルホキノル基の保護基としては例えばアル
キルエステル、ベンノルエステル等を影成し得る基が挙
げられるか、固相法の場合は、Ｃ末端のカルホキノル基
はクロルメチル樹脂、オキンメチル樹脂、Ｐ−アルコキ
ノヘンノルアルコール樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、カルボッイミド等の縮合剤の存在下にある
いはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性
エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合
はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。

更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される
。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロ
マトグラフィー、アフィニティーク口マトグラフィー等
が挙げられる。

本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投
与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口
投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は、化合物
の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異なるか
、通常１回０．００１−１０００Ｂ、好ましくハ０．０
１〜ｌ０ｍｇを１日当たり１〜３回である。本発明のペ
プチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形
で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において
常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用
いられる。具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニ
ット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、
蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸
アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム
、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキンメチルセル
ロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース
、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニ
ルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸
、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベ
ントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸
エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪
酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチ
ン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流
動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イ
オン界面活性剤、プロピレングリコール、水等が挙げら
れる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、ンロ
ツブ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼
付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は
常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用
時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であっ
てもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティン
グしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを
水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水
あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤
や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０℃％以上、
好ましくは０５〜７０％の割合で含有することができる
。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有
していてもよい。

［作　　用コ 本発明のペプチドは、新規なペプチドであり優れたアン
ギオテンノン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、
プラノキニン不活化抑制作用を示し、本態性高血圧、腎
性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、治療剤
、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用いられ
る血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少
、うっ血性心不全における病態の改善剤として有用であ
る。

［実施例］ 次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。

〔ペプチドの製造〕

（Ａ）カッオブノ５ｇに水４０ｍｌを加え充分ホモジナ
イズし、１００℃で１０分間煮沸後放置した。サーモラ
イシンを２０ｍｇ加え３７℃、ｐＨ７で３時間加水分解
反応を行った。冷却後遠心分離して濃縮し、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＯＤＳ−、ｐｈ−及びＣＮ−カラム
）により精製し、ペプチドを得た。

氷晶を気相プロティンシーケンサ−（アプライド　バイ
オシステムズ社製　４７７　Ａ型）を用いる自動エドマ
ン分解法を適用してアミノ酸配列を分析し、下記の構造
を得た。

Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨ 該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣ［ｎ−ブタノール、酢酸、ピリノン：水−１５゜
３：１０・＋２］ （ノリ力ゲルプレート、ニンヒドリン発色）Ｒｆ・０．
３１ ｍ、ｐ：１０１．２℃ 元素分析　Ｃ，、Ｈ，、Ｎ、Ｏ，・０．８Ｈ？Ｏとして
ＣＨＮ 計算値　５５，０５　９．１３　１５．１１測定値　５
５，１２　９．０７　　＋５．０８比旋光度［α］！“
：　（Ｃ＝０．５　　水）、−６３，４〔ペプチドの合
成〕 市販のＢｏｃ　（ブトキノカルボニル）　−Ｐ　ｒ　ｏ
　−０−Ｒｅｓｉｎ〔ベンノル樹脂（置換率０．３６ｍ
ｅｑ／ｇ）　〕０．８３９をバイオサーチ社のペプチド
合成装置ＳＡＭ２の反応槽に分取し、以下のように合成
を行った。

４５％トリフルオロ酢酸、２．５％アニソールを含む塩
化メチレン中、２５分間の反応により、Ｂｏｃ基を除去
したのち、塩化メチレンによる洗浄、１０％ジイソプロ
ピルエチルアミンを含む塩化メチレンによる中和、及び
塩化メチレンによる洗浄を行った。

これと５１の０　、４　Ｍ　Ｂｏｃ　−Ｌｙｓ（ＣＩ：
ｚ）　（リジン）のツメチルホルムアミド溶液、５＋ｎ
ｌの０．４Ｍノイソプロピルカルボジイミドの塩化メチ
レン溶液とを混合した後、反応槽に加え、室温にて２時
間撹拌反応させた。

得られた樹脂をツメチルホルムアミド、塩化メチレン、
１０％ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレン
、塩化メチレン更に塩化メチレン及びジメチルホルムア
ミドとの混合液で洗浄し、１３ｏｃ　−［、ｙｓ（ＣＩ
−ｚ）　−Ｐｒｏ樹脂を得た。引き続き同様のＢｏｃ基
の除去、Ｂｏｃとアミノ酸のカップリングを繰り返しＬ
ｅｕ　−Ｌｙｓ　（Ｃ１−ｚ）−Ｐｒｏ−樹脂を得た。

該樹脂を２００１１の１０％アニソールを含むフッ化水
素中で０℃、１時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離さ
せた。フッ化水素を減圧留去し、残渣を３０％酢酸で抽
出し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカ
ラム（ＣｏｓＩｌｏｓｉｌ　　５Ｃ＋ｓ）による逆相ク
ロマトグラフィーにより精製し、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−ＯＨ（収量６０膳９）を得た。

本島を前記と同一のプロテインンーケンサーにより分析
した結果、上記の組成であることか判明した。

該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

尚、ＴＬＣの溶媒は以下すべて前記と同一である。

Ｒｆ：０３１ 元素分析　Ｃ１７Ｈ５，Ｎ４０４・０．４Ｈ，Ｏとして
ＣＨＮ 計算値　５６，１４　９．０９　１５．４＋測定値　５
５，１１　９．０２　　＋５．３５比旋光度［α］”、
（Ｃ＝０．５　　水）、−６３，４又、目的とするペプ
チドのアミノ酸欅に応じて反応薬剤を変更した以外は上
記の合成例に準じてＨ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｎ−Ｍｅ　ｔ−ＯＨを合成した。

該ペプチドの物性値はつぎのとうりである。

ＴＬＣ Ｒｆ：０．３４ ｍ、ｐ：１２０．５６Ｃ 元素分析　Ｃ，、Ｈ，ｌｌＮ、０８Ｓ・０．６Ｈ２０と
してＣＨＮ 計算値　５０．９０　７．７５　１３．７０測定値　５
０．８４　７．７０　１３．６２比旋光度［α］ｔＤ’
；（Ｃ＝０．５　　水）；−１４２，０実施例１〜２ （アンギオテンノン変換酵素阻害活性の測定）アンギオ
テンノン変換酵素阻害活性の測定は、ＣｈｅｕｎｇとＣ
ｕ５ｔ＋ｍａｎの方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈ
ａｒａｍａｃｏｌｏｇｙ　２０１６３７（１９７１））
に準じて以下の方法で行った。

酵素基質：　Ｂｚ　（ベンジル）　−Ｇｌｙ−［１ｉｓ
−Ｌｅｕ（８６ｇ＋９を水８ｍｌとリン酸緩衝液８１に
溶解した溶液） 酵　素：うさぎの肺のアセトンパウダー（ノグマ社製）
（１９を５００１Ｍのリン酸緩衝液１０ＩＲ１中で粉砕
した後、遠心分離した上澄液） 上記の酵素基質を１００μＱ１酵素溶液を１２μｇ及び
本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５
０μＱとした後、３７℃で３０分間反応を行った。

反応はｌＮ−ＨＣｌ　　２５０μｇを用いて終了させた
。

反応終了液に酢酸エチル１．５１１Ｉｌを入れＶ　ｏｒ
ｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。

酢酸エチル層から１．Ｏｍｌをとり出して、酢酸エチル
を留去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し
、抽出された馬尿酸の紫外吸収２２８ｎｍの値（ＯＤｚ
ｔｓ）を測定した。

阻害率は阻害剤なして反応したときの０Ｄｔｔｓを１０
０％とし、反応時間０分のときのＯＤ　ｔｔｅを０％と
して求め阻害率５０％の時の阻害剤（本発明のペプチド
）の濃度ＩＣ５ｏ（μＭ）で活性を表示した。

結果を第１表に示す。

又、参考例として本発明以外の阻害剤についても測定を
行ったので、第１表に合わせて示す。

第１表 手続補正 平成３年２月８日 （注）ｌｌｅ；イソロイシン ＰｒＯ゛プσリン Ｍｅｔ　；メチオニン Ｌｙｓ　　リノン Ａｓｎ　；アスパラギン ［効　　果］ 本発明ではアンギオテンシン変換酵素阻害剤として有用
な、新規なペプチドか得られる。

１、事件の表示 平成２年特許願第１７９８４４号 ２、発明の名称 新規ペプチド、それを製造する方法及び用途３、補正を
する者 事件との関係　特許出願人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ骨格をもつ新規ペプチド。 ２、蛋白質をサーモライシンで加水分解することを特徴
   とするＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ骨格をもつ新規ペプチド
   を製造する方法。 ３、蛋白質として魚肉を使用する請求項２記載の製造法
   。 ４、蛋白質としてカツオブシを使用する請求項２記載の
   製造法。 ５、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ骨格をもつペプチドを有効
   成分とするアンギオテンシン変換酵素阻害剤。