JPH0469400A

JPH0469400A - グルコシルトランスフェラーゼ阻害性蛋白質デキストラン結合体

Info

Publication number: JPH0469400A
Application number: JP2181669A
Authority: JP
Inventors: Yamaji Nakano; 中野　山路; Osamu Hayashida; 治林田; Yasuhiro Hasegawa; 長谷川　安弘
Original assignee: GODO SHIYUSEI KK; Godo Shusei KK
Current assignee: GODO SHIYUSEI KK; Godo Shusei KK
Priority date: 1990-07-11
Filing date: 1990-07-11
Publication date: 1992-03-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１〉産業上の利用分野本発明は、う蝕病因菌であるストレプトコッカス・ミュ
ータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ
）の生産するグルコシルトランスフェラーゼ（以下　Ｇ
Ｔａｓｅと略称）に対する阻害物質、その製造方法、お
よびそれを有効成分とするう蝕子防剤に関する。（２）従来の技術口腔内でミュータンス菌は、スクロースから付着性・不
溶性グルカンを合成して、歯牙表面に細菌欝である歯垢
を形成する。この歯垢内での細菌による酸の産生により
、歯牙表面のエナメル質が脱灰されるため、う蝕となる
と考えられている。本発明者らは、カゼインなどの特定の蛋白質のメイラー
ド反応生成物（以下　ＭＲＰ　　と略称）が、ＧＴａｓ
ｅ阻害活性を有することを発見しくＡｇｒｉｃ、　　Ｂ
ｉｏｌ。Ｃｈｅｗｌ、　　ｖｏｌ、５２．　ｐ、３１６９（１９
８８）；　　１ｂｉｄ、　ｖｏｌ、５４ｐ、　１４１７
　（１９９０））、先に特許出願した　（特開昭６３ｆ
、８１８４）。一方、カゼインその他の蛋白質が、食品中に多量に存在
するときは、上記ＭＲＰのＧＴａｓｅの阻害活性は、そ
の効果が限定的となる。しかし、活性化されたデキストランを　ＭＲＰに共有結
合させることにより、この欠点は改善され、さらにＭＲ
Ｐ　　中の原料に由来する蛋白質部分に、デキストラン
分結合させることにより、別のＧＴａｓｅ阻害剤かえら
れ、これらについても特許出願した（特願平０１−１４
９７０４）。（３）発明が解決しようとする問題点デキストランを蛋白質に結合させるには、従来臭化シア
ン等の試薬を用いるため、製品の用途は一般的でなく、
廃液処理においても特殊な工程が必要であった。本発明者らは、デキストランを蛋白質に結合させるにあ
たり、製品の用途に対して制限を与えない方法を探索し
て、ＭＲＰ　　あるいはその原料となっている蛋白質を
デキストランと結合させ、前記問題点を克服し、あわせ
て　ＧＴａｓｅ阻害活性が食品中で、十分に発現する新
しい物質を得るべく、鋭意研究を重ねた。（４）問題点を解決するための手段デキストランの還元末端のアルデヒド基、または酸化処
理により新たに導入されたアルデヒド基に、等電点４〜
５の蛋白質、ないしその蛋白質に由来するＭＲＰ　（以
下、華に蛋白質のＭ　ＲＰとＱ称）を結合させることに
より、蛋白質・糖複合体である本発明の蛋白質デキスト
ラン結合体が得られる。ＧＴａｓｅは、デキストランと強い結合性があるが、デ
キストラン構造を導入された前記結合体も　ＧＴａｓｅ
　　に対する親和性が強化され、カゼインその他の蛋白
質を　多量に含む食品中でも、ＧＴａｓｅ阻害活性が十
分発現できるようになった。本発明の物質を調製するには、蛋白質原料として、等電
点４〜５付近のもの、例えばカゼインまたはアルブミン
類、その派生物、あるいはそれらのＭＲＰが望ましい。また、前記以外の糖鎖の付属した蛋白質も、本発明に用
いる、デキストラン等のアルデヒド基との反応に支障が
ない限り、利用可能である。本発明に使用するデキストランとしては、分子量が１，
０００〜２．０００．０００のものが利用できるが、例
えば、ファルマシア社製の　デキストランＴ−１０が、
好適である。これらのデキストランは、そのまま、あるいは部分的に
酸化してアルデヒド基を導入（）゛アルテ゛ヒト。・テ゛キス＋ラン〉してから、温和な条件下で蛋白質と
反応させる。ついで、この反応液をゲル濾過して、未反応のデキスト
ランあるいはジアルデヒド・デキストランを除去するこ
とにより精製される。ＧＴａｓｅ　阻害活性の測定は、福島らの方法　（ＩＲ
Ｃ３Ｍｅｄ、　　Ｓｃｉ、、　　ｖｏｌ、１３．　　ｐ
、５０１（１９７６））により、ミュータンス菌（Ｓ、
　　ａ＋ｕｔａｎｓ　Ｂ−１３）の培養Ｐ液から調製さ
れた　ＧＴａｓｅ　　を使用し、古賀らの方法　（Ｉｎ
ｆｅｃｔ、　　＆Ｉｍｍｕｎ、　　ｖｏｌ、２８．　　
Ｐ、８８２（１９８２＞）に従って測定した。またＭＲＰは、小林らの方法（Ａｇｒｉｃ、　　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｗ。ｖｏｌ、５２　　Ｐｊ１６９（１９８８））　　により
調製したものを使用した。（５）実施例以下、本発明の物質およびその製法、ＧＴａｓｅ　阻害
効果、本発明の物質を配合したう蝕子防剤の、ミュータ
ンス菌に対する歯垢形成防止効果の詳細を、実施例によ
り説明する。〈実施例１〉Ｔａｍらの方法（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、、ｖｏｌ、７３ｐ、　２１２８　（１
９７６））に従って、ＩＯ！；のデキストランＴ−１０
溶液１０ｍ１に、１２５≦過ヨウ素酸ナトリウム溶液１
＋＋ｌを加えて、４℃の暗所で　１２時間反応させた後
、亜硫酸水素ナトリウムを、溶液の色が当初の褐色から
透明に変わるまで加える。得られた溶液を透析し、０３Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐ
Ｈ９，５）に溶解した３５≦力ゼイン溶液分、２０ｍ１
加えて４℃で１２時間反応させる。反応後、ｐＨ３〜５　にして遠心し、沈殿する未反応の
カゼインを除き、さらにＢｉｏ−Ｇｅｔ　　Ａ　Ｏ，５
ｍでゲル濾過し、ボイドボリュウムの位置にある、活性
画分を回収し、未反応の蛋白質およびジアルデヒド・デ
キストランを除去した。得られた活性画分の紫外線および赤外線吸収スペクトル
は、それぞれ、第１図ｃ、第２図＆のとおりであり、組
成は、蛋白誓約８０％、糖約２０〜から成っていた。その１．０ｇｇ（蛋白誓約０．８μｇ）は、１６時間で
ｌｌｌ１ｇの付着性・不溶性グルカンを合成する　ＧＴ
ａｓｅを５０り阻−書し、高濃度のカゼイン存在下（５
００ｇｇ／ｍｌ）においても、カゼイン非存在時の、約
９０５−の阻害活性を発現した（第３図）。〈実施例２〉実施例１と同様にして調製した、１．　Ｏｇのジアルデ
ヒド・デキストランと、０．６ｇのαＳ−カゼインＭＲ
Ｐを、０．２Ｍ炭酸水素＋　ｔ　ｆ、　’ｌム緩衝液（
ｐＨ９，５＞中で反応させた０反応生成物は、反応液の
ｐＨを　３．５にして未反応のＭＲＰを沈澱除去してか
ら、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　　Ａ５ｍでゲル濾過して、ボイド
ボリュウムの位１にある活性画分を回収した。未反応のジアルデヒド・デキストランを除去した、精製
活性画分の紫外線および赤外線吸収スペクトルは、それ
ぞれ、第１図ｃ、第２図Ｃのとおりであり、組成は、約
８５％の蛋白質と約１５％の糖を含んでいた。また、実施例１と同様に、１６時間で１ｍｇの付着性・
不溶性グルカンを合成するＧＴａｓ　ｅを、５０う；阻
害するのに必要な活性画分の量、は、カゼイン非存在下
で０．０５５ｇｇ（蛋白質　０．０４７ｇｇ）、カゼイ
ン存在下（５００ｇｇ／ａ＋１）では、０．ｆ、μｇ（
蛋白質０．０９４ｇｇ）であった（第４図）。〈実施例３〉３００ｍｇのａｓ−カゼイン、および３．　ＯＱＯｍｇ
のデキストランＴ−１０を、０．２Ｍ炭酸水素テ）ＩＩ
ウム緩衝液３０ｍ１に溶解し、３７℃に約１週間放置し
て反応させた。反応液を実施例１に準じて、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ａｌｆ、
．５ｍでゲルー過し、活性画分を得た。得られた活性画分の紫外線および赤外線吸収スペクトル
は、それぞれ、第１図す、第２図すのとおりであり、組
成は、約７いの蛋白質と、約３帖の糖と含んでいた。また、カゼインの存在（５００ｇｇ／＋ｌ）　　および
非存在下で、ともに約０．３６μｇで、実施例１のＧＴ
ａｓｅを５０−阻害したく第５図）。〈実施例４〉実施例３に準じて、カゼインＭＲＰ　（１０ｍｇ／■ｌ
）とデキストランＴ−１０（１００■ｇ／履ｌ）を含む
　０．２Ｍ炭酸水素チ１リウムＩ！衝液を、３７℃で１
週間放置して反応させ、反応液を実施例２に準じてＢｌ
ｏ−Ｇｅ１　Ａ　５ｍでゲルヂ過して得られる活性画分
の紫外線および赤外線吸収スペクトルは、それぞれ、第
１図ｄ、第２図ｄのとおりであり、組成は、約８０：塩
の蛋白質と約２０％の糖を含んでいた。また、実施例１で用いたＧＴａｓ　ｅを、５０％阻害す
るのに必要な活性画分の量は、カゼインの非存在下で、
０．０７４μｇ、カゼイン存在下（５００μｇ／ｍｌ）
では、０．２１μｇであった（第５図）。〈実施例５〉う蝕病因菌である　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕ
ｔａｎｓ　群に属する菌株　（Ｉｎｇｂｒｉｔｔ、　　
Ｇ５−５．　　ＰＳ−１４，ＭＴ６２６５゜ＭＴ８１４
８．　６７１５）を、スクロースｌｈｇ／ｍｌを含むプ
レインハート・インヒユージョン培地に、実施例１〜４
で得られた各デキストラン結合体を、０．５ｍｇ／ｍｌ
添加して培養し、３７℃、１６時間後における、菌体付
着率に及ぼす効果について試験した。（８付着菌体量＋非付着菌体量）として、算出した。その結果、第１表に示すとおり、いずれの菌体にＥ　ｔ
、でも、有意な付着阻害が認められた。（６）発明の効果本発明により、特定の蛋白質あるいはそのＭＲＰと、デ
キストランまたはジアルデヒド・デキストランを、その
アルデヒド基を用いて結合させることにより、新規な　
ＧＴａｓｅ阻害物質が提供され、かつその製造方法およ
びそれを有効成分とするう蝕子防剤の提供が可能となっ
た。【以下余白】

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の物質の紫外線吸収スペクトルである
。　ａはカゼイン・ジアルデヒドデキストラン結合体、
ｂはカゼイン・デキストラン結合体、ＣはカゼインＭＲ
Ｐ・ジアルデヒドデキストラン結合体、ｄはカゼインＭ
ＲＰ・デキストラン結合体のものである。第２図は、本発明の物質の赤外線吸収スペクトルである
。　ａはカゼイン・ジアルデヒドデキストラン結合体、
ｂはカゼイン・デキストラン結合体、ＣはカゼインＭＲ
Ｐ・ジアルデヒドデキストラン結合体、ｄはカゼインＭ
ＲＰ・デキストラン結合体のものである。第３図は、本発明の物質の　ＧＴａｓ　ｅ阻害作用を示
す０図中曲線１．２は、それぞれカゼイン非存在下およ
び存在下（５００μｇ／ｍｌ）におけるカゼイン・ジア
ルデヒドデキストラン結合体の阻害作用、また曲線３．
４は、それぞれカゼイン非存在下および存在下（５００
μｇ／ｌ）における　カゼインＭＲＰ・ジアルデヒドデ
キストラン結合体の阻害作用である。第４１２１は、本発明の物質の　ＧＴａｓｅ阻害作用を
示す。図中曲線１．２は、それぞれカゼイン非存在下お
よび存在下（５００μｇ／＋ａｌ）におけるカゼイン・
デキストラン結合体の阻害作用、また曲線３．４は、そ
れぞれカゼイン非存在下　および存在下（５００μｇ／
＊ｌ）におけるカゼインＭＲＰ・デキストラン結合体の
阻害作用である。以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）等電点がｐＨ４〜５付近である蛋白質、あるいは
そのメイラード反応生成物に、分子量が１，０００〜２
，０００，０００であるデキストラン、または酸化処理
によりアルデヒド基含量を増加させたデキストランを結
合させて得られ、以下の物理化学的性質を有するグルコ
シルトランスフェラーゼ阻害性蛋白質デキストラン結合
体。ａ、分子量：５万以上（ＳＤＳ電気泳動法）ｂ、等電点：ｐＨ４．０付近ｃ、蛋白質および糖含量：蛋白質：３０〜９１（ｗ／ｗ）％糖：９〜７０（ｗ／ｗ）％ｄ、溶解性：水に易溶、メタノール、エタノール、アセ
トン、クロロホルム、酢酸エチルに不溶。ｅ、呈色反応：ビュレット反応、キサントプロテイン反
応、フォリン反応、フェノール硫酸反応の何れも陽性。ｆ、作用：グルコシルトランスフェラーゼによる、スク
ロースを基質として付着性・不溶性グルカンを合成する
反応を阻害する。ｇ、ｐＨ安定性：ｐＨ２〜９、３０℃で３０日間安定。ｈ、熱安定性：１２０℃、１５分の熱処理に対して安定
。ｉ、化学処理に対する安定性：希薄な酸化剤（過ヨウ素
酸等）および希薄な還元剤（亜硫酸、ほう酸水素ナトリ
ウム等）による処理に対して安定。ｊ、融点：明確な融点を示さない。ｋ、酸性・塩基性の区別：水溶液は微弱な酸性を示す。ｌ、物質の色：淡黄色ないし淡褐色。ｍ、紫外線吸収スペクトル：第１図（ａ、ｂ、ｃ、また
はｄ）のとおり。ｎ、赤外線吸収スペクトル：第２図（ａ、ｂ、ｃ、また
はｄ）のとおり。
（２）等電点がｐＨ４〜５付近である蛋白質、あるいは
そのメイラード反応生成物に、デキストランまたは酸化
処理によりアルデヒド基含量を増加させたデキストラン
を結合させて、特許請求の範囲第１項に記載の物理化学
的性質を有する、グルコシルトランスフェラーゼ阻害性
蛋白質デキストラン結合体を生成せしめ、該物質を反応
液より採取することを特徴とする、グルコシルトランス
フェラーゼ阻害性蛋白質デキストラン結合体の製造方法
。
（３）等電点がｐＨ４〜５付近である蛋白質、あるいは
そのメイラード反応生成物に、デキストランまたは酸化
処理によりアルデヒド基含量を増加させたデキストラン
を結合させて得られ、特許請求の範囲第１項に記載の物
理化学的性質を有する、グルコシルトランスフェラーゼ
阻害性蛋白質デキストラン結合体を有効成分とするう蝕
予防剤。