JPH0471492A - ヒトｆｋ５０６結合蛋白質をコードするｄｎａ - Google Patents
ヒトｆｋ５０６結合蛋白質をコードするｄｎａInfo
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- JPH0471492A JPH0471492A JP18323890A JP18323890A JPH0471492A JP H0471492 A JPH0471492 A JP H0471492A JP 18323890 A JP18323890 A JP 18323890A JP 18323890 A JP18323890 A JP 18323890A JP H0471492 A JPH0471492 A JP H0471492A
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- C12N9/90—Isomerases (5.)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、遺伝子工学の分野に係る。詳しくは、本発明
は、ヒトＦＫ５０６結合蛋白質をコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを組み込んで得られた発現ベクタ、及び該発現ベ
クターで形質転換された形質転換体に係る。
は、ヒトＦＫ５０６結合蛋白質をコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを組み込んで得られた発現ベクタ、及び該発現ベ
クターで形質転換された形質転換体に係る。
［従来の技術］
プロリンペプチド結合の異性化を触媒し、蛋白質の高次
構造形成を促進する酵素として、ペプチジルプロリルシ
ストランスイソメラーゼ（以下、ＰＰＩｒ＋ｅと略称す
る）が存在し、この酵素は免疫抑制剤サイクロスポリン
Ａと特異的に結合するサイクロフィリンと同一物質であ
ることが知られている（Ｔｘｋｘｈ＆ｓｉ、 Ｎ、
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７，４７３−４７５，１９８９
Ｌｘｎｇ、に、ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９． ２６８−
２７０．１９８７） 、また、この酵素は、変性させた
蛋白質、例えばリボヌクレアーゼＡ１リボヌクレアーゼ
Ｔ１、免疫グロブリン、シトクロームＣ１タイプ■コラ
ーゲンなどの高次構造の再構成を促進することができる
（Ｆｉｓｃｂｓ＋、 Ｇ、とＢｓｎ１．Ｈ，、Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉ、Ｂｉｏｐｂｙ＋、 ＡｃＮ８２８、 ３９
−４２．１９８５ ； Ｌｉｎ、 Ｌ、 −Ｎ、 ら
、 Ｂｉｏｃｈｉ１１Ｂｉｏｐｈ７ｓ、Ａｅｊｒ ９５
６．２５６−２６６、１９８９ ； Ｂ＊ｃｈｉｎｇｅ
＋、ＨＰ 、］、Ｂｉｏ１．Ｃｈ＊ｉ、 ２６２． １
７１４４−１７１４８．１９８７）。
構造形成を促進する酵素として、ペプチジルプロリルシ
ストランスイソメラーゼ（以下、ＰＰＩｒ＋ｅと略称す
る）が存在し、この酵素は免疫抑制剤サイクロスポリン
Ａと特異的に結合するサイクロフィリンと同一物質であ
ることが知られている（Ｔｘｋｘｈ＆ｓｉ、 Ｎ、
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３７，４７３−４７５，１９８９
Ｌｘｎｇ、に、ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２９． ２６８−
２７０．１９８７） 、また、この酵素は、変性させた
蛋白質、例えばリボヌクレアーゼＡ１リボヌクレアーゼ
Ｔ１、免疫グロブリン、シトクロームＣ１タイプ■コラ
ーゲンなどの高次構造の再構成を促進することができる
（Ｆｉｓｃｂｓ＋、 Ｇ、とＢｓｎ１．Ｈ，、Ｂｉｏｃ
ｈｉｍｉ、Ｂｉｏｐｂｙ＋、 ＡｃＮ８２８、 ３９
−４２．１９８５ ； Ｌｉｎ、 Ｌ、 −Ｎ、 ら
、 Ｂｉｏｃｈｉ１１Ｂｉｏｐｈ７ｓ、Ａｅｊｒ ９５
６．２５６−２６６、１９８９ ； Ｂ＊ｃｈｉｎｇｅ
＋、ＨＰ 、］、Ｂｉｏ１．Ｃｈ＊ｉ、 ２６２． １
７１４４−１７１４８．１９８７）。
免疫抑制剤サイクロスポリンＡによって、サイクロフィ
リンのＰＰＩ■ｅ活性が阻害されることから、サイクロ
スポリンＡの効果は、ＰＰＩｘｓ＋活性を阻害すること
によって、その基質となる蛋白質の活性発現が抑制され
るために起こると推定されるが、以下に述べるように、
その効果は多岐に及んでおり、サイクロフィリンが作用
する蛋白質は多数存在するものと考えられる。例えば、
免疫系細胞において、サイクロスポリンＡはヘルパーＴ
細胞を活性化するが、サイクロフィリンはＰＰ１ｓｓｅ
として、インターロイキン２遺伝子や他のリンフ才力イ
ン遺伝子の発現を活性化するある種の転写制御因子、例
えばＮＦＡＴＳＡＰ−３の活性発現に働いている（高橋
信弘ら、現代化学２２２．４０−４７．１９８９；Ｅａ
ｓｅｌ、 Ｅ、 Ａ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ２４６．１６
１７−１６２０．１９８９ ） 、また、サイクロスポ
リンＡの免疫細胞におけるγ−インターフェロン、イン
ターロイキン４、マクロファージ活性化因子、腫瘍憤死
因子などの産生、分泌の阻害に対しては、これらの蛋白
質合成のための転写、翻訳あるいは高次構造形成のいず
れかの過程にサイクロフィリンはＰＰｌ■ｅとして作用
している（高橋信弘、医学のあゆみ、１５１．４１３−
４１６． １９８９）ものと考えられる。
リンのＰＰＩ■ｅ活性が阻害されることから、サイクロ
スポリンＡの効果は、ＰＰＩｘｓ＋活性を阻害すること
によって、その基質となる蛋白質の活性発現が抑制され
るために起こると推定されるが、以下に述べるように、
その効果は多岐に及んでおり、サイクロフィリンが作用
する蛋白質は多数存在するものと考えられる。例えば、
免疫系細胞において、サイクロスポリンＡはヘルパーＴ
細胞を活性化するが、サイクロフィリンはＰＰ１ｓｓｅ
として、インターロイキン２遺伝子や他のリンフ才力イ
ン遺伝子の発現を活性化するある種の転写制御因子、例
えばＮＦＡＴＳＡＰ−３の活性発現に働いている（高橋
信弘ら、現代化学２２２．４０−４７．１９８９；Ｅａ
ｓｅｌ、 Ｅ、 Ａ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ２４６．１６
１７−１６２０．１９８９ ） 、また、サイクロスポ
リンＡの免疫細胞におけるγ−インターフェロン、イン
ターロイキン４、マクロファージ活性化因子、腫瘍憤死
因子などの産生、分泌の阻害に対しては、これらの蛋白
質合成のための転写、翻訳あるいは高次構造形成のいず
れかの過程にサイクロフィリンはＰＰｌ■ｅとして作用
している（高橋信弘、医学のあゆみ、１５１．４１３−
４１６． １９８９）ものと考えられる。
哺乳類において、サイクロフィリンは、一つの生物種に
対して一種類の蛋白質が同定されているのみであるが、
その染色体上にはサイクロフィリン様遺伝子をコードす
る数十コピーのＤＮＡ配列の存在が確認されており（Ｈ
ｘｅｎｄｌｅ＋、 Ｂ ら、ＥＭＢｏ。
対して一種類の蛋白質が同定されているのみであるが、
その染色体上にはサイクロフィリン様遺伝子をコードす
る数十コピーのＤＮＡ配列の存在が確認されており（Ｈ
ｘｅｎｄｌｅ＋、 Ｂ ら、ＥＭＢｏ。
１、６． ９４７−９５０．１９８７） 、また、酵母
および大腸菌において２種類のサイクロフィリン様蛋白
質が確認されている（特願平１〜１８４７３８および特
願平１−３４４７０５）ことから、哺乳類においても、
サイクロフィリン様蛋白質が多数存在するものと考えら
れる。この多様性が、作用する基質蛋白質の多様性に対
応しており、サイクロスポリンＡのもつ薬剤としての副
作用が生じる原因であると推察される。
および大腸菌において２種類のサイクロフィリン様蛋白
質が確認されている（特願平１〜１８４７３８および特
願平１−３４４７０５）ことから、哺乳類においても、
サイクロフィリン様蛋白質が多数存在するものと考えら
れる。この多様性が、作用する基質蛋白質の多様性に対
応しており、サイクロスポリンＡのもつ薬剤としての副
作用が生じる原因であると推察される。
免疫抑制剤サイクロスポリンＡと非常に類似の効果をも
つが、その化学構造が全く異なる免疫抑制剤としてＦＫ
５０６が知られている（Ｔｈｏｍｓｏｎ、 Ａ、 Ｗ、
。
つが、その化学構造が全く異なる免疫抑制剤としてＦＫ
５０６が知られている（Ｔｈｏｍｓｏｎ、 Ａ、 Ｗ、
。
ＩｍｍｕｎｏｌｏＨＴｏｄＢ、 １０．６−１１９８
９）。また、生体内において、ＦＫ５０６と特異的に結
合する蛋白質が存在しており、このＦＫ５０６結合蛋白
質はペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ活性
を有し、ＦＫ５０６の結合によってその活性が阻害され
ることも知られている（Ｓｉｓｋｉｅｒｋｘ、 Ｉ、
ｊ、ら、Ｎａｔｏｒｅ ３４１゜７５５−７５７．１９
８９ ； Ｈ！＋ｄｉｎｇ、 Ｍ、 Ｗ、ら、Ｎｘｔａ
ｒｃ ３４１，７５８７６０、 １９８９）。
９）。また、生体内において、ＦＫ５０６と特異的に結
合する蛋白質が存在しており、このＦＫ５０６結合蛋白
質はペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ活性
を有し、ＦＫ５０６の結合によってその活性が阻害され
ることも知られている（Ｓｉｓｋｉｅｒｋｘ、 Ｉ、
ｊ、ら、Ｎａｔｏｒｅ ３４１゜７５５−７５７．１９
８９ ； Ｈ！＋ｄｉｎｇ、 Ｍ、 Ｗ、ら、Ｎｘｔａ
ｒｃ ３４１，７５８７６０、 １９８９）。
化学構造が全く異なる免疫抑制剤が、共に、ＰＰＩｒ５
ｅ活性の阻害効果を有するという結果は、免疫抑制作用
がＰＰＩｘＩｅ活性の阻害を介して行われていることを
強く示唆しており、従って、ＰＰ１１！ｅ活性の阻害効
果をもつ物質は免疫抑制効果をもつと考えられる。
ｅ活性の阻害効果を有するという結果は、免疫抑制作用
がＰＰＩｘＩｅ活性の阻害を介して行われていることを
強く示唆しており、従って、ＰＰ１１！ｅ活性の阻害効
果をもつ物質は免疫抑制効果をもつと考えられる。
ＦＫ５０６結合蛋白質とサイクロフィリンとのＰＰ１ｍ
５ｅ活性に対する基質特異性の比較研究から、サイクロ
フィリンは相対的に広い基質特異性をもつのに対し、Ｆ
Ｋ５０６結合蛋白質はより狭い基質特異性を有する、即
ち、Ｆに５０６結合蛋白質の基質となる蛋白質はサイク
ロフィリンのそれとは異なり、かつ、サイクロフィリン
よりもより特異的に働いていることが示唆されている（
Ｈｘｒ＋１ｓｏｎ、Ｒ，に、 と５ｌｃｉｏ、Ｒ，Ｌ
、、Ｂｉｏｃｈ！ｍ１ｓｊｒ７２９． ３８１３−３８
１６．１９９０）。
５ｅ活性に対する基質特異性の比較研究から、サイクロ
フィリンは相対的に広い基質特異性をもつのに対し、Ｆ
Ｋ５０６結合蛋白質はより狭い基質特異性を有する、即
ち、Ｆに５０６結合蛋白質の基質となる蛋白質はサイク
ロフィリンのそれとは異なり、かつ、サイクロフィリン
よりもより特異的に働いていることが示唆されている（
Ｈｘｒ＋１ｓｏｎ、Ｒ，に、 と５ｌｃｉｏ、Ｒ，Ｌ
、、Ｂｉｏｃｈ！ｍ１ｓｊｒ７２９． ３８１３−３８
１６．１９９０）。
免疫抑制剤としては、免疫系細胞に選択性をもつ、特に
ヘルパーＴ細胞で働（ＰＰｌ５ｓｅ活性を特異的に阻害
できる物質が副作用の少ない薬剤として有効であると期
待でき、サイクロフィリンより狭い基質特異性を有する
ＦＫ５０６結合蛋白質の酵素活性阻害効果を目安として
、かかる副作用の少ない薬剤をスクリーニングすること
ができると考えられる。
ヘルパーＴ細胞で働（ＰＰｌ５ｓｅ活性を特異的に阻害
できる物質が副作用の少ない薬剤として有効であると期
待でき、サイクロフィリンより狭い基質特異性を有する
ＦＫ５０６結合蛋白質の酵素活性阻害効果を目安として
、かかる副作用の少ない薬剤をスクリーニングすること
ができると考えられる。
ＦＫ５０６結合蛋白質は、２つのグループによって単離
されているが、報告されている分子量は、１１．０００
ダルトン（５ｉｅｋｉｅ＋ｋｘ、 Ｉ、 Ｉ、ら、
Ｎｒｔｕｒｅ ３４１゜７５５−７５７１９８９）及び
１４，０００ダルトン（）Ｉｘｒｄｉｎｇ、Ｍ。
されているが、報告されている分子量は、１１．０００
ダルトン（５ｉｅｋｉｅ＋ｋｘ、 Ｉ、 Ｉ、ら、
Ｎｒｔｕｒｅ ３４１゜７５５−７５７１９８９）及び
１４，０００ダルトン（）Ｉｘｒｄｉｎｇ、Ｍ。
Ｗ、ら、 ５ａｌｕｔｅ ３４１．７５８−７６０．１
９８９）とくい違っている。また、後者の文献の中で、
Ｈｓｒｄｉｎｇ らは、ウシ胸腺から単離した蛋白質の
アミノ末端側４０残基までのアミノ酸配列を決定し、サ
イクロフィリンと異なる蛋白質であるとしているが、Ｐ
Ｐｌ＋ｓｅとしての酵素活性部位等においてサイクロフ
ィリンと何らかの共通性があるかどうかについては不明
である。
９８９）とくい違っている。また、後者の文献の中で、
Ｈｓｒｄｉｎｇ らは、ウシ胸腺から単離した蛋白質の
アミノ末端側４０残基までのアミノ酸配列を決定し、サ
イクロフィリンと異なる蛋白質であるとしているが、Ｐ
Ｐｌ＋ｓｅとしての酵素活性部位等においてサイクロフ
ィリンと何らかの共通性があるかどうかについては不明
である。
［発明が解決しようとする問題点］
上述のように、ＦＫ５０６結合蛋白質はサイクロフィリ
ンと異なるＰＰＩ■ｅ活性を有しており、その生理学的
機能も多用であろうと考えられている。該蛋白質はその
ＰＰ１１ｓｅ活性の阻害を目安とした免疫抑制剤のスク
リーニングの手段として使用し得るだけでなく、ｉ！ｌ
マｉｌ＋ｏでの特定蛋白質の高次構造形成を促進する手
段として、また該蛋白質の基質特異性を調べるための研
究用試薬として重要視されている。しかしながら、これ
まで、該蛋白質は直接臓器から単離する以外には入手方
法が確立されていなかった。
ンと異なるＰＰＩ■ｅ活性を有しており、その生理学的
機能も多用であろうと考えられている。該蛋白質はその
ＰＰ１１ｓｅ活性の阻害を目安とした免疫抑制剤のスク
リーニングの手段として使用し得るだけでなく、ｉ！ｌ
マｉｌ＋ｏでの特定蛋白質の高次構造形成を促進する手
段として、また該蛋白質の基質特異性を調べるための研
究用試薬として重要視されている。しかしながら、これ
まで、該蛋白質は直接臓器から単離する以外には入手方
法が確立されていなかった。
このような状況下において、本発明の目的は、ＦＫ５０
６結合蛋白質に対応する遺伝子を単離することによって
、該蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、こ
のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を決定し、さ
らに、該蛋白質を遺伝子工学技術を用いて多量に製造す
るための手段、及び他の有用蛋白質の遺伝子と協調的に
発現させることにより、他の有用蛋白質を効率的に産生
させるための手段を提供することにある。
６結合蛋白質に対応する遺伝子を単離することによって
、該蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、こ
のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を決定し、さ
らに、該蛋白質を遺伝子工学技術を用いて多量に製造す
るための手段、及び他の有用蛋白質の遺伝子と協調的に
発現させることにより、他の有用蛋白質を効率的に産生
させるための手段を提供することにある。
［問題点を解決するための手段］
本発明の問題点は、ＦＫ５０６結合蛋白質の遺伝子をク
ローン化し、宿主に発現プラスミドとして組み込んだも
のを作製することによって解決される。
ローン化し、宿主に発現プラスミドとして組み込んだも
のを作製することによって解決される。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明は、第１図に示すアミノ酸配列によって表わされ
るヒトＦＫ５０６結合蛋白質をコードする塩基配列を包
含するＤＮＡを提供する。本発明ＤＮＡは以下のように
して調製される。
るヒトＦＫ５０６結合蛋白質をコードする塩基配列を包
含するＤＮＡを提供する。本発明ＤＮＡは以下のように
して調製される。
米国ＣＬＯＮＴＥＣ１１社のλｇｉｌｌをベクターとし
て作製されたヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、Ｈ
ｉｒｄｉｎｇら［Ｎ５ｊａｒｅ ３４１，７５８−７６
０（１９ｇ９）］により報告されたウシＦＫ５０６結合
蛋白質（以下、ＦＫＢＰと略称する）のアミノ酸配列（
３１番目の Ｇｉｎ〜３７番目の＾Ｉｐ）をもとに合成
したＤＮＡ配列をプローブとして用いたハイブリッド形
成によるスクリーニングを実施することによって、ヒト
ＦＫＢＰｃＤＮＡを含むクローンを単離した。
て作製されたヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、Ｈ
ｉｒｄｉｎｇら［Ｎ５ｊａｒｅ ３４１，７５８−７６
０（１９ｇ９）］により報告されたウシＦＫ５０６結合
蛋白質（以下、ＦＫＢＰと略称する）のアミノ酸配列（
３１番目の Ｇｉｎ〜３７番目の＾Ｉｐ）をもとに合成
したＤＮＡ配列をプローブとして用いたハイブリッド形
成によるスクリーニングを実施することによって、ヒト
ＦＫＢＰｃＤＮＡを含むクローンを単離した。
該クローンを溶菌し、得られたファージからファージＤ
ＮＡを回収し、これをＲＮｒｓｅＡを含有する緩衝液中
でＥｃｏＲＩと反応させた後、アガロースゲル電気泳動
、サザンブロッティング［５ＩｕｔｈｅｒｎＥ Ｉ、
Ｉ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、９８５０３−５１７（１９７
５）］を行ない、前記ハイブリッド形成と同一の条件下
でハイブリッド形成を実施した。得られたクローンは約
１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有し、グラスパウダー
法（Ｇｅ＋＋ｅＣ１ｅｘｎ”、 Ｂｌｏ−１０１社）に
より該アガロースからＤＮＡを分離、精製した。
ＮＡを回収し、これをＲＮｒｓｅＡを含有する緩衝液中
でＥｃｏＲＩと反応させた後、アガロースゲル電気泳動
、サザンブロッティング［５ＩｕｔｈｅｒｎＥ Ｉ、
Ｉ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、９８５０３−５１７（１９７
５）］を行ない、前記ハイブリッド形成と同一の条件下
でハイブリッド形成を実施した。得られたクローンは約
１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有し、グラスパウダー
法（Ｇｅ＋＋ｅＣ１ｅｘｎ”、 Ｂｌｏ−１０１社）に
より該アガロースからＤＮＡを分離、精製した。
上記１．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を、Ｔ４ ＤＮＮクリ
ガーゼ用いて、ＥｃｏＲＩ消化ｐＵｃＩ９ベクター内に
組み込み組換えプラスミドを作製した。該プラスミドを
、塩化カルシウム法［ＭｔｎｄＣｌ、Ｍ、 とＨｉｇ
ｈ、＾、、Ｊ、Ｍｏ１Ｂｉｏ１． ５３．１５９−１６
２（１９７９）］によって作製された感受性大腸菌１Ｍ
１０７株に移入し、アンピシリン耐性株を分離し、形質
転換体ｐＵＣ−ｂ−ＦＫＢＰを得た。プラスミドＤＮＡ
のミニプレバレージョンを常法（ＭＩＩｌｉＩｔ口ら、
Ｍｏ１ｅｃｏｌｓｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ＊ｂｏ＋
ｔｌｏｒ７ ＭＳＩＩＯＩＩ、１９８２ ）に従って実
施し、得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し
、アガロースゲル電気泳動を行なうことにより、１．５
ｋｂのＥｃｏＲＩ断片がＩＩＵＣベクターに挿入されて
いることを確認した。また、サザンブロッティングによ
り、この断片が前記プローブと結合することも確認され
た。
ガーゼ用いて、ＥｃｏＲＩ消化ｐＵｃＩ９ベクター内に
組み込み組換えプラスミドを作製した。該プラスミドを
、塩化カルシウム法［ＭｔｎｄＣｌ、Ｍ、 とＨｉｇ
ｈ、＾、、Ｊ、Ｍｏ１Ｂｉｏ１． ５３．１５９−１６
２（１９７９）］によって作製された感受性大腸菌１Ｍ
１０７株に移入し、アンピシリン耐性株を分離し、形質
転換体ｐＵＣ−ｂ−ＦＫＢＰを得た。プラスミドＤＮＡ
のミニプレバレージョンを常法（ＭＩＩｌｉＩｔ口ら、
Ｍｏ１ｅｃｏｌｓｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ＊ｂｏ＋
ｔｌｏｒ７ ＭＳＩＩＯＩＩ、１９８２ ）に従って実
施し、得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し
、アガロースゲル電気泳動を行なうことにより、１．５
ｋｂのＥｃｏＲＩ断片がＩＩＵＣベクターに挿入されて
いることを確認した。また、サザンブロッティングによ
り、この断片が前記プローブと結合することも確認され
た。
挿入ＤＮＡ中に存在するＨｉｎｃＵ制限酵素認識部位を
利用して、前記プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｃＵで二重消化し、生成した２つの約７５０ｂｐＤＮＡ
断片の夫々をＭｌａｍｐ系ファージＤＮＡに再度組み込
み、ジデオキシ法［５１ｎｌｅｒ、 Ｆ、、 Ｎ１ｅｋ
ｌｅｎ。
利用して、前記プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩとＨｉｎ
ｃＵで二重消化し、生成した２つの約７５０ｂｐＤＮＡ
断片の夫々をＭｌａｍｐ系ファージＤＮＡに再度組み込
み、ジデオキシ法［５１ｎｌｅｒ、 Ｆ、、 Ｎ１ｅｋ
ｌｅｎ。
Ｓ、およびＣｏｒｌｚｏｎ、＾、Ｒ，，Ｐｒｏｃ、Ｎｔ
ｌｌ＾ｃ！ｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７４、 ５４６３−５４
６７（１９７７）］によりヌクレオチド配列を決定し、
目的とするヒトＦＫＢＰをコードするｃＤＮ＾を同定し
た。
ｌｌ＾ｃ！ｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ７４、 ５４６３−５４
６７（１９７７）］によりヌクレオチド配列を決定し、
目的とするヒトＦＫＢＰをコードするｃＤＮ＾を同定し
た。
第１図に、上記のようにして得られた完全長のヒトＦＫ
ＢＰｅＤＮ＾のヌクレオチド配列及びそれから推定され
るヒトＦＫＢＰのアミノ酸配列を示す。この遺伝子の塩
基配列から推定されるアミノ酸配列から、この遺伝子は
１０８個のアミノ酸残基（’Ｍｅｔ Ｇ１７・・・・
・・・・・Ｌｅａ １０８Ｇｌｕ）から成る蛋白質をコ
ードしていると考えられる。このアミノ酸配列とＨｔｒ
ｄｉｎｇらが報告しているウシＦＫＢＰのＮ末端４０ア
ミノ酸残基の配列部分とが完全に一致することから判断
して、得られた遺伝子は、ヒトＦＫ８Ｐをコードする遺
伝子であることが明らかとなった。
ＢＰｅＤＮ＾のヌクレオチド配列及びそれから推定され
るヒトＦＫＢＰのアミノ酸配列を示す。この遺伝子の塩
基配列から推定されるアミノ酸配列から、この遺伝子は
１０８個のアミノ酸残基（’Ｍｅｔ Ｇ１７・・・・
・・・・・Ｌｅａ １０８Ｇｌｕ）から成る蛋白質をコ
ードしていると考えられる。このアミノ酸配列とＨｔｒ
ｄｉｎｇらが報告しているウシＦＫＢＰのＮ末端４０ア
ミノ酸残基の配列部分とが完全に一致することから判断
して、得られた遺伝子は、ヒトＦＫ８Ｐをコードする遺
伝子であることが明らかとなった。
従って、本発明は、第１図に示すアミノ酸配列によって
表わされるヒトＦＫ５０６結合蛋白質をコードする塩基
配列を包含するＤＮＡを提供するものであり、また本発
明の実施態様により、該蛋白質をコードする塩基配列と
して第１図の各アミノ酸に対応させて記載のコドンから
成る塩基配列（’ＡＴＧ ＧＧ＾・・・・・・・・・・
・・ＣＴＧ ＧＡ人３２４ ）を挙げることができるが
、もちろん各アミノ酸に対応する他のコドンから成る他
のいかなる塩基配列も本発明に包含される。
表わされるヒトＦＫ５０６結合蛋白質をコードする塩基
配列を包含するＤＮＡを提供するものであり、また本発
明の実施態様により、該蛋白質をコードする塩基配列と
して第１図の各アミノ酸に対応させて記載のコドンから
成る塩基配列（’ＡＴＧ ＧＧ＾・・・・・・・・・・
・・ＣＴＧ ＧＡ人３２４ ）を挙げることができるが
、もちろん各アミノ酸に対応する他のコドンから成る他
のいかなる塩基配列も本発明に包含される。
推定されたアミノ酸配列から、ヒトＦＫＢＰの分子量、
等重点を計算すると、分子量１１．９５１ダルトン、等
電点８．７１であり、これらの値は前記Ｈｚｒｄｉｎｇ
らの報告した分子量及び５ｉｅｋｉｅｒｋｘ らの報告
した等電点とよい一致が見られ、得られた遺伝子がＦに
ＢＰをコードしていることを更に強く支持している。
等重点を計算すると、分子量１１．９５１ダルトン、等
電点８．７１であり、これらの値は前記Ｈｚｒｄｉｎｇ
らの報告した分子量及び５ｉｅｋｉｅｒｋｘ らの報告
した等電点とよい一致が見られ、得られた遺伝子がＦに
ＢＰをコードしていることを更に強く支持している。
得られた塩基配列、全アミノ酸配列をデータベース（Ｇ
ｅｎ Ｂｌｎｋ、 ＥｉＪＢＬ、 ＤＤＢＩ）に登録さ
れている配列と夫々比較したが、相同性のある遺伝子及
び蛋白質を見い出すことはできなかった。更に、同じＰ
Ｐｌ！＋ｅ活性をもつサイクロフィリンの配列とも比較
したが、何ら相同性は存在しなかった。従って、サイク
ロフィリンとＦＫＢＰは、互いに全く関連性のない構造
を持っていることが明らかとなった。このことは、これ
ら２つのＰＰ１ｓ＋ｅが独立に異なった基質に働いてい
る可能性を示唆している。
ｅｎ Ｂｌｎｋ、 ＥｉＪＢＬ、 ＤＤＢＩ）に登録さ
れている配列と夫々比較したが、相同性のある遺伝子及
び蛋白質を見い出すことはできなかった。更に、同じＰ
Ｐｌ！＋ｅ活性をもつサイクロフィリンの配列とも比較
したが、何ら相同性は存在しなかった。従って、サイク
ロフィリンとＦＫＢＰは、互いに全く関連性のない構造
を持っていることが明らかとなった。このことは、これ
ら２つのＰＰ１ｓ＋ｅが独立に異なった基質に働いてい
る可能性を示唆している。
単離した遺伝子をプローブとして、ノーザン（Ｎｏｒｔ
ｈｅｒｎ）プロット法により各種臓器でのＦＫＢＰのｍ
ＲＮ＾の存在を調べたところ、用いた臓器、即ち肺、胎
盤、肝臓、脳、白血球の全てにおいて、量的な差はあっ
たが、該ｄＮ人が存在していた。それ故、ＦにＢＰは組
織特異的に存在しているとは考えにくい。サザンプロッ
ト法により、ヒト染色体上に存在する遺伝子の数を調べ
ると、サイクロフィリン遺伝子の場合２０コピ一以上の
ＤＮ人配列が存在していると考えられるのに対し、ＦＫ
ＢＰの遺伝子の場合１〜２コピーのＤＮＡ配列が検出さ
れただけであった。このことから、サイクロフィリンの
場合には分子種として多様性があるが、ＦＫＢＰの場合
にはほとんど多様性はなく、機能的にもＦＫＢＰの方が
極めて限定的な機能を有していると考えられる。
ｈｅｒｎ）プロット法により各種臓器でのＦＫＢＰのｍ
ＲＮ＾の存在を調べたところ、用いた臓器、即ち肺、胎
盤、肝臓、脳、白血球の全てにおいて、量的な差はあっ
たが、該ｄＮ人が存在していた。それ故、ＦにＢＰは組
織特異的に存在しているとは考えにくい。サザンプロッ
ト法により、ヒト染色体上に存在する遺伝子の数を調べ
ると、サイクロフィリン遺伝子の場合２０コピ一以上の
ＤＮ人配列が存在していると考えられるのに対し、ＦＫ
ＢＰの遺伝子の場合１〜２コピーのＤＮＡ配列が検出さ
れただけであった。このことから、サイクロフィリンの
場合には分子種として多様性があるが、ＦＫＢＰの場合
にはほとんど多様性はなく、機能的にもＦＫＢＰの方が
極めて限定的な機能を有していると考えられる。
更に、ＦＫＢＰの場合、分子種としての数が少ないと推
定されることに加え、そのＰＰ１ａ＋ｅとしての基質特
異性が非常に狭い（Ｈｓ＋ｒｉｓｏｎ、 Ｒ，Ｋ、
と５ｌｅｉｎ、ＲＬ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ＋ｌ＋７２９
． ３８１３−３８１６．１９９０）と考えられること
から、この蛋白質の作用する基質蛋白質の種類は比較的
限定されていると推定される。この作用する基質が組織
特異的に働く蛋白質である場合には、ＦＫＢＰの酵素活
性を阻害する物質は薬剤として比較的組織特異的な作用
をもつ可能性が高く、一方それが各組織に共通で普遍的
な蛋白質である場合には、酵素活性阻害物質は薬剤とし
て副作用が多いと考えられる。それ故、ＦＫＢＰを容易
に入手できるならば、該蛋白質はこれらのことを明らか
にする基質を探る強力な手段となり得るだけでなく、副
作用のない又は少ない免疫抑制剤等のＦＫＢＰ阻害物質
をスクリーニングする上で重要な役割を果し得るといえ
る。
定されることに加え、そのＰＰ１ａ＋ｅとしての基質特
異性が非常に狭い（Ｈｓ＋ｒｉｓｏｎ、 Ｒ，Ｋ、
と５ｌｅｉｎ、ＲＬ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ＋ｌ＋７２９
． ３８１３−３８１６．１９９０）と考えられること
から、この蛋白質の作用する基質蛋白質の種類は比較的
限定されていると推定される。この作用する基質が組織
特異的に働く蛋白質である場合には、ＦＫＢＰの酵素活
性を阻害する物質は薬剤として比較的組織特異的な作用
をもつ可能性が高く、一方それが各組織に共通で普遍的
な蛋白質である場合には、酵素活性阻害物質は薬剤とし
て副作用が多いと考えられる。それ故、ＦＫＢＰを容易
に入手できるならば、該蛋白質はこれらのことを明らか
にする基質を探る強力な手段となり得るだけでなく、副
作用のない又は少ない免疫抑制剤等のＦＫＢＰ阻害物質
をスクリーニングする上で重要な役割を果し得るといえ
る。
本発明はまた、プロモーターの下流であって且つターミ
ネータ−の上流に存在するベクター内のクローニング部
位に導入された、少なくとも第１図に記載のアミノ酸配
列によって示されるヒトＦＫ５０６結合蛋白質をコード
する塩基配列から成るＤＮＡを含む発現ベクターを提供
する。以下に、該ベクターの構築方法を説明するが、ベ
クターとしては、プラスミド及びファージ等の慣用ベク
ターを挙げることができる。また、プロモーターとして
は、大腸菌、ファージ、酵母菌をはじめとする真核生物
由来のもの等が挙げられ、例えばトリプトファン合成酵
素オペロン（＋ｒｐ ） 、ラクトースオペロン（１Ｉ
Ｃ） 、ラムダファージＰ 、Ｐ 。
ネータ−の上流に存在するベクター内のクローニング部
位に導入された、少なくとも第１図に記載のアミノ酸配
列によって示されるヒトＦＫ５０６結合蛋白質をコード
する塩基配列から成るＤＮＡを含む発現ベクターを提供
する。以下に、該ベクターの構築方法を説明するが、ベ
クターとしては、プラスミド及びファージ等の慣用ベク
ターを挙げることができる。また、プロモーターとして
は、大腸菌、ファージ、酵母菌をはじめとする真核生物
由来のもの等が挙げられ、例えばトリプトファン合成酵
素オペロン（＋ｒｐ ） 、ラクトースオペロン（１Ｉ
Ｃ） 、ラムダファージＰ 、Ｐ 。
Ｒ
グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ （
ＧＡＰＤ旧、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモータ
ー等がある。さらにまた、ターミネータ−としては、例
えばＧＡＰＤＨ遺伝子、ＡＤＨＩ遺伝子のターミネータ
−が挙げられる。
ＧＡＰＤ旧、アルコールデヒドロゲナーゼのプロモータ
ー等がある。さらにまた、ターミネータ−としては、例
えばＧＡＰＤＨ遺伝子、ＡＤＨＩ遺伝子のターミネータ
−が挙げられる。
上述のようにして得られたヒト）’ＫＢＰクローンは、
３′側部分にポリ＾配列を含んでいなかったため、先ず
ＦＫＢＰ構造遺伝子とヒトサイクロフィリンｃＤＮ人由
来のポリ＾配列を連結したプラスミドを第２図に示す手
順に従って構築した。
３′側部分にポリ＾配列を含んでいなかったため、先ず
ＦＫＢＰ構造遺伝子とヒトサイクロフィリンｃＤＮ人由
来のポリ＾配列を連結したプラスミドを第２図に示す手
順に従って構築した。
ＦＫＢＰｃＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣ−ｈ−ＦＫＢ
Ｐ ＤＮＡをＮｃｏ Ｉ消化し、次いでＫｌｅｏｏｖ
処理することにより、Ｎｃｏ Ｉ部位が平滑末端となっ
た３４０ｂｐ ＤＮＡ断片を、Ｇｅｎｔ Ｃ１ｅｘｎ”
により精製した。一方、ｐＵｃｌｇのＥｃｏＲＩ部位に
Ｘｈｏ Ｉ部位を導入したｐＵｃＩ８１クローニングベ
クターをＥｃｏＲＩとＳｍａ Ｉで二重消化し、更に
、Ｋｌｅｎｏｖ処理を行って平滑末端をもつベクターを
作製した。このベクターと前記の３４０ｂｐ Ｄｌｌ＾
断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下に連結して、組換
えプラスミドｐＵＣ−Ｘ−ＦＫＢＰを得た。
Ｐ ＤＮＡをＮｃｏ Ｉ消化し、次いでＫｌｅｏｏｖ
処理することにより、Ｎｃｏ Ｉ部位が平滑末端となっ
た３４０ｂｐ ＤＮＡ断片を、Ｇｅｎｔ Ｃ１ｅｘｎ”
により精製した。一方、ｐＵｃｌｇのＥｃｏＲＩ部位に
Ｘｈｏ Ｉ部位を導入したｐＵｃＩ８１クローニングベ
クターをＥｃｏＲＩとＳｍａ Ｉで二重消化し、更に
、Ｋｌｅｎｏｖ処理を行って平滑末端をもつベクターを
作製した。このベクターと前記の３４０ｂｐ Ｄｌｌ＾
断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下に連結して、組換
えプラスミドｐＵＣ−Ｘ−ＦＫＢＰを得た。
次に、ヒトＰＰＩｘ＋ｅを含むプラスミドｐＵｃ−ｈ−
ＰＰＩＤＮＡをＥｅｏＲＩとＰｓｉ Ｉで二重消化し
て、約１５０ｂｐのヒトＰＰ１ｘｓｅポリＡ配列を含有
するＤＮＡ断片を得、また、ｐＵＣ−Ｘ−ＦＫＢＰ Ｄ
ＮＡをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩｔ”二重消化することによ
り ２，６ｋｂのベクター断片として得た。これら３つ
のＤＮＡ断片を連結して王者が連結したプラスミドｐＵ
ｃ−Ｘ−ＦＫＢＰ−Ａを構築した。
ＰＰＩＤＮＡをＥｅｏＲＩとＰｓｉ Ｉで二重消化し
て、約１５０ｂｐのヒトＰＰ１ｘｓｅポリＡ配列を含有
するＤＮＡ断片を得、また、ｐＵＣ−Ｘ−ＦＫＢＰ Ｄ
ＮＡをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩｔ”二重消化することによ
り ２，６ｋｂのベクター断片として得た。これら３つ
のＤＮＡ断片を連結して王者が連結したプラスミドｐＵ
ｃ−Ｘ−ＦＫＢＰ−Ａを構築した。
更に、天然のＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター領域を含
むプラスミド（ｐＧＫＮ１３−ＮｅｏＣ−ＡＴＥ；特願
平１−３２８２６４号公報参照）をＸｈｏ ＩとＢ！
ＩＩＩＨ工テ二重消化し、得られた大フラグメントをヒ
ト血清アルブミンｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐ Ｉ
ＤＢ−ＡＤＨ−Ｈ３＾−Ａ（特開平２−１１７３８４号
公報参照） （Ｄ Ｘｈｏ Ｉ ／ ＢｘｍＨＩ 二重
消化物の小さい方のフラグメント（Ｉ（ＳＡｃＤ Ｎ
Ａを含む）と連結させて作製したｐｌＤＢ−ＧＡＰ−Ｈ
３Ａ−Ａ ＤＮＡを５ＩＩｌａＩとＸｈｏ Ｉで二重消
化して、ＩＳＡ遺伝子の除かれた発現ベクターを得た。
むプラスミド（ｐＧＫＮ１３−ＮｅｏＣ−ＡＴＥ；特願
平１−３２８２６４号公報参照）をＸｈｏ ＩとＢ！
ＩＩＩＨ工テ二重消化し、得られた大フラグメントをヒ
ト血清アルブミンｃＤＮＡを含む発現プラスミドｐ Ｉ
ＤＢ−ＡＤＨ−Ｈ３＾−Ａ（特開平２−１１７３８４号
公報参照） （Ｄ Ｘｈｏ Ｉ ／ ＢｘｍＨＩ 二重
消化物の小さい方のフラグメント（Ｉ（ＳＡｃＤ Ｎ
Ａを含む）と連結させて作製したｐｌＤＢ−ＧＡＰ−Ｈ
３Ａ−Ａ ＤＮＡを５ＩＩｌａＩとＸｈｏ Ｉで二重消
化して、ＩＳＡ遺伝子の除かれた発現ベクターを得た。
一方、ｐＵＣ−Ｘ−ＦＫＢＰ人を順次ｔｌｉｎｄｍ消化
、Ｋｌｅｎｏｖ処理及びＸｈｏ Ｉ消化して、ＦＫＢＰ
とポリ人配列を含む５７０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。夫
々のＤＮＡ断片を連結してヒトＦＫＢＰを発現産生させ
るための発現プラスミドＬＩＤＢ−ＧＡＰＦＫＢＰ−Ａ
を作製した（第３図参照）。図示された発現プラスミド
の構造から分かるように、ヒトＦＫＢＰをコードするＤ
ＮＡ断片はＧＡＰＤＨプロモーターの下流側であって且
つＡＤＨＩターミネータ−の上流側に導入される。該発
現プラスミドｐｌＤＢ−ＧＡＰ−ＦＫＢＰ−人は、これ
を大腸菌）１８１０１株に移入して得られた形質転換株
■ＢＩＯＩ／ｐＩＤＢ−ＧＡＰ−ｈ−ＦＫＢＰとして寄
託された（平成２年６月２７日付寄託、微工研菌寄第１
１５５１１ 号； ＦＥＲＭ Ｐ−１１５５８）。
、Ｋｌｅｎｏｖ処理及びＸｈｏ Ｉ消化して、ＦＫＢＰ
とポリ人配列を含む５７０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。夫
々のＤＮＡ断片を連結してヒトＦＫＢＰを発現産生させ
るための発現プラスミドＬＩＤＢ−ＧＡＰＦＫＢＰ−Ａ
を作製した（第３図参照）。図示された発現プラスミド
の構造から分かるように、ヒトＦＫＢＰをコードするＤ
ＮＡ断片はＧＡＰＤＨプロモーターの下流側であって且
つＡＤＨＩターミネータ−の上流側に導入される。該発
現プラスミドｐｌＤＢ−ＧＡＰ−ＦＫＢＰ−人は、これ
を大腸菌）１８１０１株に移入して得られた形質転換株
■ＢＩＯＩ／ｐＩＤＢ−ＧＡＰ−ｈ−ＦＫＢＰとして寄
託された（平成２年６月２７日付寄託、微工研菌寄第１
１５５１１ 号； ＦＥＲＭ Ｐ−１１５５８）。
本発明は更に、宿主を、上記の本発明発現プラスミドで
形質転換して得られる形質転換体を提供する。
形質転換して得られる形質転換体を提供する。
本発明の形質転換体の作製は、橋本英明と木材光のＫＵ
Ｒ法［発酵と工業、 ４３，６３０−６３７（１９８５
）］の改良法により、前記発現プラスミドｐｊＤＢ−Ｇ
ＡＰ−ＦＫＢＰ−Ａを宿主内に移入することによって実
施される。
Ｒ法［発酵と工業、 ４３，６３０−６３７（１９８５
）］の改良法により、前記発現プラスミドｐｊＤＢ−Ｇ
ＡＰ−ＦＫＢＰ−Ａを宿主内に移入することによって実
施される。
宿主としては、大腸菌９枯草菌、酵母等のこの業界で慣
用の微生物が挙げられる。
用の微生物が挙げられる。
該形質転換体を任意の培地中で培養し、目的とする組換
え蛋白質を産生蓄積せしめることにより、組換えヒトＦ
Ｋ５０６結合蛋白質を得ることができる。
え蛋白質を産生蓄積せしめることにより、組換えヒトＦ
Ｋ５０６結合蛋白質を得ることができる。
発現生成物の検出は、培養菌体を集菌し、加熱溶菌させ
た試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分
析することによって行い、ゲル上約１４キロダルトン付
近にヒトＦＫＢＰによる有意なバンドが確認された。発
現生成物は、菌体を破砕後、慣用の精製手段、例えばゲ
ルろ過、イオン交換クロマトグラフィー アフィニティ
クロマトグラフイーなどの種々のクロマトグラフィー法
の組み合わせ等により実質的に精製された形で単離回収
することができる。本発明により、遺伝子工学的にヒト
ＦＫＢＰを製造供給することが可能となる。
た試料をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分
析することによって行い、ゲル上約１４キロダルトン付
近にヒトＦＫＢＰによる有意なバンドが確認された。発
現生成物は、菌体を破砕後、慣用の精製手段、例えばゲ
ルろ過、イオン交換クロマトグラフィー アフィニティ
クロマトグラフイーなどの種々のクロマトグラフィー法
の組み合わせ等により実質的に精製された形で単離回収
することができる。本発明により、遺伝子工学的にヒト
ＦＫＢＰを製造供給することが可能となる。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが
、本発明のその要旨を変えない限り以下の実施例によっ
て限定されるものではない。
、本発明のその要旨を変えない限り以下の実施例によっ
て限定されるものではない。
実験例１ ヒトＦＫＢＰ遺伝子のクローニングヒトＦＫ
ＢＰｃＤＮＡを含むクローンを得るために、米国ＣＬＯ
ＮＴＥＣＩＩ社のλｇｔｌｌをベクターとして作製され
たヒトＴ細胞ｅＤＮＡライブラリーを用いた。
ＢＰｃＤＮＡを含むクローンを得るために、米国ＣＬＯ
ＮＴＥＣＩＩ社のλｇｔｌｌをベクターとして作製され
たヒトＴ細胞ｅＤＮＡライブラリーを用いた。
λｇｔ１１組換え体ファージ ｌＸｌ０’ ｐｌｕを大
腸菌Ｙ１０９０株の一晩培養液［ＬＢ培地（１％トリプ
トン。
腸菌Ｙ１０９０株の一晩培養液［ＬＢ培地（１％トリプ
トン。
０５％酵母エキス、０．５％ＮｘＣＩ） ＋ ０．２％
マルトース］の細胞５０四に加え、３７℃で２０分間反
応させた後、 ３ｍｌのＬ−Ｔｏｐ−アガＯ−ス（ＬＢ
培地＋ ０７％アガロース）と共に直径９０ｏｍのし一
プレート（ＬＢ培地；１．５％寒天） ４枚にまいた。
マルトース］の細胞５０四に加え、３７℃で２０分間反
応させた後、 ３ｍｌのＬ−Ｔｏｐ−アガＯ−ス（ＬＢ
培地＋ ０７％アガロース）と共に直径９０ｏｍのし一
プレート（ＬＢ培地；１．５％寒天） ４枚にまいた。
これらのプレートを３７℃で一晩培養しプラークを形成
させた後、４℃で１時間保存した。組換え体ファージを
メンブランフィルタ−（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、 Ｉ（７
ｂｏｎｄ−Ｎ）に移し、０．５Ｎ Ｎ１０Ｈ，ＩＭ Ｎ
ｔＣｌを浸した３１ＪＭ口紙（Ｗｈｉｔｌｎｌｎ社）上
に５分間置き、さらに０．５１Ｊ Ｔ＋１ｓ−）１ｃ（
ｐＨ７，２）、 １．５１１１ ＮＩＣ＋を浸した口紙
上に５分間静置した。 ２ｘＳＳＣ（２０ＸＳＳＣＩＬ
３Ｍ ＮｘＣｌ ０．３Ｍクエン酸三ナトリウムから成
る）溶液でフィルターを洗い、風乾させた後、サランラ
ップで包み、ＵＶ照射することによりファージＤＮＡを
フィルターに固定した。そのフィルターを３２Ｐ放射性
同位元素で標識した合成オリゴヌクレオチド（比活性≧
１１０７ｃｐ／Ｉ１ｇＤＮＡ）をプローブとして用いて
スクリーニングした［ ＢｅｎｔｏｎとＤｘｖｉｔ ５
ｃｉｅｎｃｅ１９６ １８０−１８２（１９７？）］。
させた後、４℃で１時間保存した。組換え体ファージを
メンブランフィルタ−（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、 Ｉ（７
ｂｏｎｄ−Ｎ）に移し、０．５Ｎ Ｎ１０Ｈ，ＩＭ Ｎ
ｔＣｌを浸した３１ＪＭ口紙（Ｗｈｉｔｌｎｌｎ社）上
に５分間置き、さらに０．５１Ｊ Ｔ＋１ｓ−）１ｃ（
ｐＨ７，２）、 １．５１１１ ＮＩＣ＋を浸した口紙
上に５分間静置した。 ２ｘＳＳＣ（２０ＸＳＳＣＩＬ
３Ｍ ＮｘＣｌ ０．３Ｍクエン酸三ナトリウムから成
る）溶液でフィルターを洗い、風乾させた後、サランラ
ップで包み、ＵＶ照射することによりファージＤＮＡを
フィルターに固定した。そのフィルターを３２Ｐ放射性
同位元素で標識した合成オリゴヌクレオチド（比活性≧
１１０７ｃｐ／Ｉ１ｇＤＮＡ）をプローブとして用いて
スクリーニングした［ ＢｅｎｔｏｎとＤｘｖｉｔ ５
ｃｉｅｎｃｅ１９６ １８０−１８２（１９７？）］。
プローブとして、ウシＦＫＢＰ ｌｌｌｘｒｄｉｎｇら
、 Ｎａｔｕｒｅ３４＋、 ７５８−７６０（１９８
９）］のアミノ酸配列の３１番目グルタミン酸から３７
番目アスパラギン酸に対応するプローブＤＮＡ５’−Ｇ
Ａ（人／Ｇ） ＧＡ（Ｔ／Ｃ） ＧＧ （Ｇ／＾／Ｔ／
Ｃ）Ａ＾（Ａ／Ｇ）人＾（＾／Ｇ） ＴＴ （Ｔ／Ｃ）
ＧＡ−３’をＣａ＋１ｈｅｒ＋ ら［Ｍ！口ｅｕｃｅ
ｉ、 Ｍ、 Ｄ、とＣａｒｕｌｈｅ＋ｓ ！Ｊ、Ｈ，Ｔ
ｅｔｔｇｈｅｄｒｏｎＬｅ口ｅｚ ２１． ７１９ （
１９８０）コにより開発されたホスホアミダイト法を応
用した自動ＤＮＡ合成機（＾ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ＋ｙ
＋ｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）を用いて合成し、合成りＮ
Ａ鎖（２１ｐｍｏｌ）を５０ｍＭ Ｔ＋１ｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ７，６）、 ｌ０ｍＭ ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチ
オスレイトール１００ μｃｉ ［Ｔ ＰＩ ＾Ｔ
Ｐ （３０００Ｃｉ／ｍｍｏ１．Ａｍｅｚｈｉｍ社）及
び１２単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）
を含有する溶液５０μｓ中で３７℃６０分間処理するこ
とにより、５′端をリン酸化標識した。
、 Ｎａｔｕｒｅ３４＋、 ７５８−７６０（１９８
９）］のアミノ酸配列の３１番目グルタミン酸から３７
番目アスパラギン酸に対応するプローブＤＮＡ５’−Ｇ
Ａ（人／Ｇ） ＧＡ（Ｔ／Ｃ） ＧＧ （Ｇ／＾／Ｔ／
Ｃ）Ａ＾（Ａ／Ｇ）人＾（＾／Ｇ） ＴＴ （Ｔ／Ｃ）
ＧＡ−３’をＣａ＋１ｈｅｒ＋ ら［Ｍ！口ｅｕｃｅ
ｉ、 Ｍ、 Ｄ、とＣａｒｕｌｈｅ＋ｓ ！Ｊ、Ｈ，Ｔ
ｅｔｔｇｈｅｄｒｏｎＬｅ口ｅｚ ２１． ７１９ （
１９８０）コにより開発されたホスホアミダイト法を応
用した自動ＤＮＡ合成機（＾ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ＋ｙ
＋ｔｅｍｓモデル３８０Ｂ）を用いて合成し、合成りＮ
Ａ鎖（２１ｐｍｏｌ）を５０ｍＭ Ｔ＋１ｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ７，６）、 ｌ０ｍＭ ＭｇＣｌ２．５ｍＭジチ
オスレイトール１００ μｃｉ ［Ｔ ＰＩ ＾Ｔ
Ｐ （３０００Ｃｉ／ｍｍｏ１．Ａｍｅｚｈｉｍ社）及
び１２単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）
を含有する溶液５０μｓ中で３７℃６０分間処理するこ
とにより、５′端をリン酸化標識した。
５ｘＳＳＣ，５Ｘデンハルト溶液（１００Ｘデンハルト
溶液は２％ウシ血清アルブミン、２％フィコール、２％
ポリビニルピロリドン）、０．５％ＳＤＳ、 ５ＯＮ
／ ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ及び１１０６
ｃｐ／ｍｌプローブＤＮＡを含む溶液を用い、３７℃で
１６時間フィルターのハイブリダイゼーションを行った
。そのフィルターを２ｘＳＳＣ、３７℃で洗浄し、Ｘ線
フィルム（Ｋｏｄｓｋ社、 ＸＡＲ−５）に−７０℃
で１０時間露光させた。
溶液は２％ウシ血清アルブミン、２％フィコール、２％
ポリビニルピロリドン）、０．５％ＳＤＳ、 ５ＯＮ
／ ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ及び１１０６
ｃｐ／ｍｌプローブＤＮＡを含む溶液を用い、３７℃で
１６時間フィルターのハイブリダイゼーションを行った
。そのフィルターを２ｘＳＳＣ、３７℃で洗浄し、Ｘ線
フィルム（Ｋｏｄｓｋ社、 ＸＡＲ−５）に−７０℃
で１０時間露光させた。
現像後、陽性のシグナルを与えたプラーク ２個をパス
ツールピペットの先端で掻き取り、 １０ＧＪＩｉの
ＴＭ液［１０ｍＭ Ｔ＋１ｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５
）、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ２］に懸濁し、室温に２０
分間静置させた。懸濁液０５鱈を１ ｍｌのＴＭ液で希
釈し、そのうち ５〃を前述の方法で大腸菌Ｙ１０９０
株に感染させ、し−プレート上にまき、プラークを形成
させた。形成されたプラークは再度上記のようにプラー
クハイブリダイゼーションを行い単一プラークからなる
陽性クローンを得た。陽性クローンをパスツールピペッ
トの先で掻き取り、５０蔗のＹ１０９０細胞に加えて３
７℃で２０分間静置した後、 ｌ０ｍＭ ＭｇＳＯ４を
含む２ｍｌのＬＢ培地に加え、３７℃で６時間振盪培養
した。クロロホルムを１００ｍ加え、ポルテックスミキ
サーにかけて完全に溶菌させ、５０００ｒｐｍで５分間
遠心し、上清を得た。この上清中に１０１０オーダーの
ファージが含まれていた。この上清８００／Ｊｉに １
００ＪＬｌの５Ｍ ＮａＣｌを加えてよく混ぜ、−２０
℃で２０分間静置した。１５に＋ｐｍで５分間遠心し、
得られた沈澱を５００成の７０％エタノールで洗い、２
００／ＪのＴＥ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉａ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）、 １ｍＭ ＥＤＴ＾コに溶解させた。Ｉ
ｇ （６０Ｉｌｎ ｉ ｌ／ １１１！ ）のＤＮａｘ
ｅ Ｉ （宝酒造）と２４の １ＭＭｇｃ１２を加え、
３７℃にて３０分間反応させ、＋００１Ｊ１のＴＥ飽和
フェノールを加え、ポルテックスミキサーで処理した。
ツールピペットの先端で掻き取り、 １０ＧＪＩｉの
ＴＭ液［１０ｍＭ Ｔ＋１ｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５
）、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ２］に懸濁し、室温に２０
分間静置させた。懸濁液０５鱈を１ ｍｌのＴＭ液で希
釈し、そのうち ５〃を前述の方法で大腸菌Ｙ１０９０
株に感染させ、し−プレート上にまき、プラークを形成
させた。形成されたプラークは再度上記のようにプラー
クハイブリダイゼーションを行い単一プラークからなる
陽性クローンを得た。陽性クローンをパスツールピペッ
トの先で掻き取り、５０蔗のＹ１０９０細胞に加えて３
７℃で２０分間静置した後、 ｌ０ｍＭ ＭｇＳＯ４を
含む２ｍｌのＬＢ培地に加え、３７℃で６時間振盪培養
した。クロロホルムを１００ｍ加え、ポルテックスミキ
サーにかけて完全に溶菌させ、５０００ｒｐｍで５分間
遠心し、上清を得た。この上清中に１０１０オーダーの
ファージが含まれていた。この上清８００／Ｊｉに １
００ＪＬｌの５Ｍ ＮａＣｌを加えてよく混ぜ、−２０
℃で２０分間静置した。１５に＋ｐｍで５分間遠心し、
得られた沈澱を５００成の７０％エタノールで洗い、２
００／ＪのＴＥ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉａ−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ８，０）、 １ｍＭ ＥＤＴ＾コに溶解させた。Ｉ
ｇ （６０Ｉｌｎ ｉ ｌ／ １１１！ ）のＤＮａｘ
ｅ Ｉ （宝酒造）と２４の １ＭＭｇｃ１２を加え、
３７℃にて３０分間反応させ、＋００１Ｊ１のＴＥ飽和
フェノールを加え、ポルテックスミキサーで処理した。
１２に＋ｐｍで５分間遠心し、水層をさらにフェノール
／クロロホルム（１：１ ）で１回抽出し、得られた水
層に２０／１１ｆ２の ３Ｍ酢酸ナトリウム（、Ｉ（５
，２）及び５００成のエタノールを加え、遠心してＤＮ
Ａを沈澱させた。その沈澱を７０％エタノールで洗浄し
た後、減圧乾燥させ、５０１１ｆ！のＴＥに溶解した。
／クロロホルム（１：１ ）で１回抽出し、得られた水
層に２０／１１ｆ２の ３Ｍ酢酸ナトリウム（、Ｉ（５
，２）及び５００成のエタノールを加え、遠心してＤＮ
Ａを沈澱させた。その沈澱を７０％エタノールで洗浄し
た後、減圧乾燥させ、５０１１ｆ！のＴＥに溶解した。
この操作で１埒相当のファージＤＮＡが得られた。得ら
れた溶液２０ＩＪｉに２．５屑の１０倍濃度のＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液［０，５１ＮＩＣ１，ＬＭ Ｔｔロー）ＩＣＩ
（ｐＨ７，５）、 ７０ｍＭ ＭｇＣｌ２］を加
え、 １／Ｉｆ（２０単位）のＥｃｏＲＩ にッポンジ
ーン）と １誠のｌＯ■／ｍ１のＲＮａ＋ｅ Ａ（Ｓ’
ｉｇ１社）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応後
、０．７％アガロースゲル電気泳動を行い、サザンプロ
ット法［５ａｌｈｅ＋ｎ Ｅ、 ＬＭｏｌ。
れた溶液２０ＩＪｉに２．５屑の１０倍濃度のＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液［０，５１ＮＩＣ１，ＬＭ Ｔｔロー）ＩＣＩ
（ｐＨ７，５）、 ７０ｍＭ ＭｇＣｌ２］を加
え、 １／Ｉｆ（２０単位）のＥｃｏＲＩ にッポンジ
ーン）と １誠のｌＯ■／ｍ１のＲＮａ＋ｅ Ａ（Ｓ’
ｉｇ１社）を加え、３７℃で１時間反応させた。反応後
、０．７％アガロースゲル電気泳動を行い、サザンプロ
ット法［５ａｌｈｅ＋ｎ Ｅ、 ＬＭｏｌ。
Ｂｉｏ、 ９８．５０３−５１７ （１９７５）コに従
って、ＤＮＡバンドをＨ７ｂｏｎｄフィルターにプロテ
ィングさせた。ＤＮＡの結合したフィルターを用いてプ
ラークハイプリゼーションと同一の条件でハイブリゼー
ションを行った。こうして得られたクローンは各々約１
．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有し、グラスパウダー法（
Ｇｅｎｅ Ｃ１ｅａｎ”、Ｂｌｏ−１０１社）によりＤ
ＮＡをアガロースから分離精製し、９ＵＣ１９ベクター
にサブクローニングした。
って、ＤＮＡバンドをＨ７ｂｏｎｄフィルターにプロテ
ィングさせた。ＤＮＡの結合したフィルターを用いてプ
ラークハイプリゼーションと同一の条件でハイブリゼー
ションを行った。こうして得られたクローンは各々約１
．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を有し、グラスパウダー法（
Ｇｅｎｅ Ｃ１ｅａｎ”、Ｂｌｏ−１０１社）によりＤ
ＮＡをアガロースから分離精製し、９ＵＣ１９ベクター
にサブクローニングした。
ＥｃｏＲＩで消化したｐＵｃ１９ベクター（３０ｎｇ）
と回収された １．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（２０ｎｇ
）とを ２，８単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）
を含む総量３０成の反応溶液［６６＋ｎＭ Ｔｒｉ＋−
）ＩＣＩ（ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭ ＭｇＣｌ２゜
１０ｍＭジチオスレイトール、 １ｍＭ ＡＴＰコ中で
、１６℃、４時間処理し、両者が連結した組換えプラス
ミドを得た。この反応液のｌｏｄを宿主菌の大腸菌１Ｍ
１０７株を形質転換するのに用いた。形質転換に用いる
感受性大腸菌は、塩化カルシウム法［Ｍｇｎｄｅｌ。
と回収された １．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（２０ｎｇ
）とを ２，８単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）
を含む総量３０成の反応溶液［６６＋ｎＭ Ｔｒｉ＋−
）ＩＣＩ（ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭ ＭｇＣｌ２゜
１０ｍＭジチオスレイトール、 １ｍＭ ＡＴＰコ中で
、１６℃、４時間処理し、両者が連結した組換えプラス
ミドを得た。この反応液のｌｏｄを宿主菌の大腸菌１Ｍ
１０７株を形質転換するのに用いた。形質転換に用いる
感受性大腸菌は、塩化カルシウム法［Ｍｇｎｄｅｌ。
Ｍ、とＨｉｇｘ、Ａ、、Ｉ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ５
３． １５９−１６２ （１９７０）］により作製され
る。具体的には、大腸菌３Ｍ１０７株の一晩培養液（Ｌ
Ｂ培地）を同じ培地で希釈し、ＯＤ が０．６にな
るまで３７℃で振盪培養し、１．５ｍｌを５に＋ｐｍで
５分間遠心して集菌した。これを７５０成の５０ｍＭ
Ｃ１Ｃ１２に懸濁し、氷上に２０分間放置した後、遠心
により集菌した。得られた菌体１００ ｇの５０ｍＭ
Ｃ＊Ｃ１２に再懸濁し、前記のＤＮＡリガーゼ反応液を
加え、氷上に４０分間放置した。
３． １５９−１６２ （１９７０）］により作製され
る。具体的には、大腸菌３Ｍ１０７株の一晩培養液（Ｌ
Ｂ培地）を同じ培地で希釈し、ＯＤ が０．６にな
るまで３７℃で振盪培養し、１．５ｍｌを５に＋ｐｍで
５分間遠心して集菌した。これを７５０成の５０ｍＭ
Ｃ１Ｃ１２に懸濁し、氷上に２０分間放置した後、遠心
により集菌した。得られた菌体１００ ｇの５０ｍＭ
Ｃ＊Ｃ１２に再懸濁し、前記のＤＮＡリガーゼ反応液を
加え、氷上に４０分間放置した。
４２℃で１分間保温した後、１ ｍｌのＬＢ培地を加え
、３７℃で３０分間保温した。このうち ０．１ｍｌを
Ｘ−Ｇａプレート（１５５埒／ｍ１５−ブロモー４−ク
ロロ＝３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
８０１１９ ／ ｍｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド、２ Ｅ１９ ／ ｍｌアンビシンを含
むし一プレート）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。
、３７℃で３０分間保温した。このうち ０．１ｍｌを
Ｘ−Ｇａプレート（１５５埒／ｍ１５−ブロモー４−ク
ロロ＝３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
８０１１９ ／ ｍｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド、２ Ｅ１９ ／ ｍｌアンビシンを含
むし一プレート）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。
プレート上に生じたコロニーのうち白色を呈するコロニ
を選抜し、菌体を一白金耳とり、２５／４？ ／ ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ培地に移し、−晩培養液を調製
した。１．５ｍｌの一晩培養液を遠心して集菌し、プラ
スミドＤＮＡのミニプレバレーシランを常法（Ｍｔｎｉ
ｇｔｉｔら、 Ｍｏ１ｅｃｏｌ＊＋ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌｘｂｏ＋ｘｔｏｒ７Ｍｘｎｕａｌ、 １９８
２）により行った。得られたプラスミドＤＮＡを、Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、１．
５ＫｂのＥｃｏＲＩ断片がｐＵＣベクタミノ酸残基から
なる蛋白質をコードしていると考−に挿入されているこ
とを確めた（ ｐＵｃ−ｈ−ＦＫＢＰ）。
を選抜し、菌体を一白金耳とり、２５／４？ ／ ｍｌ
アンピシリンを含むＬＢ培地に移し、−晩培養液を調製
した。１．５ｍｌの一晩培養液を遠心して集菌し、プラ
スミドＤＮＡのミニプレバレーシランを常法（Ｍｔｎｉ
ｇｔｉｔら、 Ｍｏ１ｅｃｏｌ＊＋ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌｘｂｏ＋ｘｔｏｒ７Ｍｘｎｕａｌ、 １９８
２）により行った。得られたプラスミドＤＮＡを、Ｅｃ
ｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、１．
５ＫｂのＥｃｏＲＩ断片がｐＵＣベクタミノ酸残基から
なる蛋白質をコードしていると考−に挿入されているこ
とを確めた（ ｐＵｃ−ｈ−ＦＫＢＰ）。
さらに、サザンプロット法により、この断片がプローブ
と結合することも確認した。
と結合することも確認した。
この挿入ＤＮＡ中に存在する旧ｎｃＩ［制限酵素認識部
位を利用し、１埒プラスミドＤＮＡを溶液２５ｕｆｌ
［５０ｍＭ ＮｘＣｌ！ 、 ｌ００ｍＭ Ｔｒｉｃ−
８０！ （ＩＩＨ？、５）、７１ＭｇＣ２２，２０単
位のＥｃｏＲＩにツボンジーン）、ＩＯ単位の旧ｎｅｌ
Ｉ にッポンジーン）］中で３７℃６０分二重消化し、
生ずる約７５０ｂｐ ＤＮＡ断片２つをそれぞれＭ１３
ｃｐ系ファージＤＮＡに再度組込み、ジデオキシ法［Ｓ
ｘｎｇｃｒ、Ｆ、 Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ及びＣｏｔｌ＋
ｏｎ、ＡＲ，Ｐｒｏｅ、Ｌｔｌ、Ａｅ＊ｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 ７４． ５４６３〜５４６１（１９７７
）］によって、ヌクレオチド配列を決定し、目的とする
ヒトＦＫＢＰをコードするｃＤＮＡを同定した（第１図
）。この遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列
から、この遺伝子は、１０８個のアえられる。
位を利用し、１埒プラスミドＤＮＡを溶液２５ｕｆｌ
［５０ｍＭ ＮｘＣｌ！ 、 ｌ００ｍＭ Ｔｒｉｃ−
８０！ （ＩＩＨ？、５）、７１ＭｇＣ２２，２０単
位のＥｃｏＲＩにツボンジーン）、ＩＯ単位の旧ｎｅｌ
Ｉ にッポンジーン）］中で３７℃６０分二重消化し、
生ずる約７５０ｂｐ ＤＮＡ断片２つをそれぞれＭ１３
ｃｐ系ファージＤＮＡに再度組込み、ジデオキシ法［Ｓ
ｘｎｇｃｒ、Ｆ、 Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ及びＣｏｔｌ＋
ｏｎ、ＡＲ，Ｐｒｏｅ、Ｌｔｌ、Ａｅ＊ｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 ７４． ５４６３〜５４６１（１９７７
）］によって、ヌクレオチド配列を決定し、目的とする
ヒトＦＫＢＰをコードするｃＤＮＡを同定した（第１図
）。この遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列
から、この遺伝子は、１０８個のアえられる。
実験例２ ヒトサイクロフィリン ｃＤ Ｎ Ａのクロ
ーニング ヒトサイクロフィリンｃＤＮＡを含むクローンを得るた
め、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のλｇｔｌｌをベクターと
して作製されたヒトＴ細胞ｃＤＮ＾ライブラリーを用い
た。λｇｔｌ１組換え体ファージを大腸菌Ｙ１０９０株
を宿主として感染させ、形質転換プラークＩ Ｘ １０
’個をＬ−プレート上に形成させ、組換えＤＮＡをメン
ブランフィルタ−（＾ｍｅ＋ｓｈｚｍ社、Ｈ７ｂｏｎｄ
−Ｎ）に移した後、３２Ｐ放射性同位元素で標識したブ
タＰＰＩｘｔｅ ｃＤＮＤＮＡ子（比活性≧１１０８ｃ
ｐ／埒）をプローブとして用いスクリーニングした［Ｂ
ｅｎｔｏｎとＤｘｗｉｓ、５ｃｉｅｎｃｅ １９６．
１８０〜１１１２ （１９７７） コ 。
ーニング ヒトサイクロフィリンｃＤＮＡを含むクローンを得るた
め、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のλｇｔｌｌをベクターと
して作製されたヒトＴ細胞ｃＤＮ＾ライブラリーを用い
た。λｇｔｌ１組換え体ファージを大腸菌Ｙ１０９０株
を宿主として感染させ、形質転換プラークＩ Ｘ １０
’個をＬ−プレート上に形成させ、組換えＤＮＡをメン
ブランフィルタ−（＾ｍｅ＋ｓｈｚｍ社、Ｈ７ｂｏｎｄ
−Ｎ）に移した後、３２Ｐ放射性同位元素で標識したブ
タＰＰＩｘｔｅ ｃＤＮＤＮＡ子（比活性≧１１０８ｃ
ｐ／埒）をプローブとして用いスクリーニングした［Ｂ
ｅｎｔｏｎとＤｘｗｉｓ、５ｃｉｅｎｃｅ １９６．
１８０〜１１１２ （１９７７） コ 。
プローブは、特願平１−１８４７３８ （平成元年７月
１９日出願）に示したブタＰＰｌｌ５ｅ遺伝子の Ｅｃ
ｏＲＩ・ＰＩＩ Ｉ断片を、ランダム・プライムドＤ
ＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ＋社）を用
い、メーカーマニュアルに従いＤＮＡ標識を行って調製
した。
１９日出願）に示したブタＰＰｌｌ５ｅ遺伝子の Ｅｃ
ｏＲＩ・ＰＩＩ Ｉ断片を、ランダム・プライムドＤ
ＮＡラベリングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ＋社）を用
い、メーカーマニュアルに従いＤＮＡ標識を行って調製
した。
ハイブリダイゼーション反応は、４ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ。
５×デンハルト溶液、０．５％Ｓ Ｄ Ｓ １５０ｉ１
９／ ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ及び１１０
６ｃｐ／ｍｌのプローブＤＮＡを含む溶液中で、６５℃
にて１６時間行い、洗浄はＱ、１ｘｓｓｃを用いて６５
℃で行い、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄｘｋ社、ＷＡＲ−５）
に−７０℃にて１０時間露光させた。現像後、陽性のシ
グナルを与えたプラークについて、ハイブリダイゼーシ
ョンを繰り返すことにより単一プラークからなる陽性ク
ローンを得た。
９／ ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡ及び１１０
６ｃｐ／ｍｌのプローブＤＮＡを含む溶液中で、６５℃
にて１６時間行い、洗浄はＱ、１ｘｓｓｃを用いて６５
℃で行い、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄｘｋ社、ＷＡＲ−５）
に−７０℃にて１０時間露光させた。現像後、陽性のシ
グナルを与えたプラークについて、ハイブリダイゼーシ
ョンを繰り返すことにより単一プラークからなる陽性ク
ローンを得た。
そのクローンからファージＤＮＡを調製［ＢＩｓｔｌｎ
ｅｒら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２０２．１２７９〜１２
８４（１９７８）コし、ｌｌｌ９ＩフアージＤＮＡを溶
液２５ｍ ［５０ｍＭ ＮＩＣｊ！ 。
ｅｒら、 ５ｃｉｅｎｃｅ ２０２．１２７９〜１２
８４（１９７８）コし、ｌｌｌ９ＩフアージＤＮＡを溶
液２５ｍ ［５０ｍＭ ＮＩＣｊ！ 。
１００ｍＭ Ｔ＋１ｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、
７ｍＭ Ｍｇａ！２．２０単位のＥｅｏＲＩ にッポ
ンジーン）］中で３７℃６０分間処理することにより消
化し、消化物のサザンプロットをプローブとハイブリダ
イズさせた［ ５ｏｕｌｈｅ＋ｎ、 Ｅ。
７ｍＭ Ｍｇａ！２．２０単位のＥｅｏＲＩ にッポ
ンジーン）］中で３７℃６０分間処理することにより消
化し、消化物のサザンプロットをプローブとハイブリダ
イズさせた［ ５ｏｕｌｈｅ＋ｎ、 Ｅ。
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、９８． ５０３〜５１７ （
１９７５）コ。ハイブリダイズしたＥｃｏＲ１断片は約
７５０ｂ９であり、グラスパウダー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌ
ｅｓｎＴＭ、Ｂｌｏ−１０１社）によりＤＮＡをアガロ
ースから回収し、ｐＵｃＩ９ベクターにサブクローニン
グした。
１９７５）コ。ハイブリダイズしたＥｃｏＲ１断片は約
７５０ｂ９であり、グラスパウダー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌ
ｅｓｎＴＭ、Ｂｌｏ−１０１社）によりＤＮＡをアガロ
ースから回収し、ｐＵｃＩ９ベクターにサブクローニン
グした。
ＥｅｏＲＩで消化したｐＵｃ１９ベクター（３０ｎｇ）
と回収された８００ｂｐ ＥｃｏＲＩ断片（２０ｎｇ）
とを、２．８単位の７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を含
む合計３０成の反応液［６６ｍＭ Ｔ＋ローＨＣｌ１（
ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭ’ｇａ！２． １０ｍＭジ
チオスレイトール、 １ ｍＭ ＡＴＰ］中で１６℃
にて４時間処理し、両者が連結した組換えプラスミドを
得た。この反応液ｌａ／ｉｉ２を用いて大腸菌ＪＭ１０
７株を形質転換させ、Ｘ−Ｇ＊ｌプレート上にまき、コ
ロニーを形成させた。白色を呈するコロニーを選択し、
２５ ｕ９／ ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培
地に接種し、３７℃で一晩培養した。
と回収された８００ｂｐ ＥｃｏＲＩ断片（２０ｎｇ）
とを、２．８単位の７４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を含
む合計３０成の反応液［６６ｍＭ Ｔ＋ローＨＣｌ１（
ｐＨ７，６）、 ６．６ｍＭ’ｇａ！２． １０ｍＭジ
チオスレイトール、 １ ｍＭ ＡＴＰ］中で１６℃
にて４時間処理し、両者が連結した組換えプラスミドを
得た。この反応液ｌａ／ｉｉ２を用いて大腸菌ＪＭ１０
７株を形質転換させ、Ｘ−Ｇ＊ｌプレート上にまき、コ
ロニーを形成させた。白色を呈するコロニーを選択し、
２５ ｕ９／ ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培
地に接種し、３７℃で一晩培養した。
１．５ｍｌの一晩培養液から遠心により細胞を集め、そ
れらの細胞からミニプレバレージョン法によりＤＮＡを
調製し、ＥＣ０ＲＩ による切断の後、アガロースゲル
電気泳動を行い、適切な挿入ＤＮＡを含む組換えプラス
ミドｐＵｃ−ｈ−ＰＰＩを得た。
れらの細胞からミニプレバレージョン法によりＤＮＡを
調製し、ＥＣ０ＲＩ による切断の後、アガロースゲル
電気泳動を行い、適切な挿入ＤＮＡを含む組換えプラス
ミドｐＵｃ−ｈ−ＰＰＩを得た。
この挿入ＤＮＡ中に存在するｐＨｒＩｆＩｌｔｌＮ酵素
認識部位を利用し、１ｑプラスミドＤＮＡを溶液２５ｍ
［５０１ｂＭ ｔｈｃＲ、１００ｄ Ｔ＋ｉ＋−ＨＣ
ｊ！ （ｐＨ７，５）、 ７ｍＭＭｇＣｌ２２．２０単
位のＥｃｏＲＩ にッポンジーン）、２０単位のｐ＋＋
Ｉにッポンジーン）］中で、３７℃にて６０分分間型消
化し、生ずる約６００ｂｐと１５０ｂｐのＤＮＡ断片を
Ｍ１３ＩＩｐ系ファージＤＮＡにそれぞれ組込み、ジデ
オキシ法［Ｓ＊ｎｇｅ＋、Ｆ、 Ｎｉｃ日ｔｎ、Ｓ、
及びＣｏｒｌ＋ｏｎ Ａ、Ｒ，Ｐ「ｏｃ、Ｎｇｔｌ、＾
ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ 、 ７４５４６３〜５４６７
（１９７７） ］によってヌクレオチド配列を決定し
た。ヒトサイクロフィリンのｃＤＮＡ配列は、すテニ決
定されており［Ｈｔｅｎｄｌｅ＋、 Ｂら、ＥＮＢＯ
ｌ６９４７〜９５０ （１９８７）］ 、今回得られた
クローンのヌクレオチド配列とも完全に一致した。
認識部位を利用し、１ｑプラスミドＤＮＡを溶液２５ｍ
［５０１ｂＭ ｔｈｃＲ、１００ｄ Ｔ＋ｉ＋−ＨＣ
ｊ！ （ｐＨ７，５）、 ７ｍＭＭｇＣｌ２２．２０単
位のＥｃｏＲＩ にッポンジーン）、２０単位のｐ＋＋
Ｉにッポンジーン）］中で、３７℃にて６０分分間型消
化し、生ずる約６００ｂｐと１５０ｂｐのＤＮＡ断片を
Ｍ１３ＩＩｐ系ファージＤＮＡにそれぞれ組込み、ジデ
オキシ法［Ｓ＊ｎｇｅ＋、Ｆ、 Ｎｉｃ日ｔｎ、Ｓ、
及びＣｏｒｌ＋ｏｎ Ａ、Ｒ，Ｐ「ｏｃ、Ｎｇｔｌ、＾
ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ 、 ７４５４６３〜５４６７
（１９７７） ］によってヌクレオチド配列を決定し
た。ヒトサイクロフィリンのｃＤＮＡ配列は、すテニ決
定されており［Ｈｔｅｎｄｌｅ＋、 Ｂら、ＥＮＢＯ
ｌ６９４７〜９５０ （１９８７）］ 、今回得られた
クローンのヌクレオチド配列とも完全に一致した。
実験例３ 酵母菌でのヒトＦＫＢＰ発現プラスミドの構
築 ＦＫＢＰ ｃＤＮ＾を含むプラスミドｐＵＣ−ｈ−ＦＫ
ＢＰ ｌ／ｉ ＤＮＡを、反応液２ＤＨ「１００ｍＭ
ＮｘＣ［！、 ６ｍＭ ＴｒローＨＣｆｌ（ｐＨ７，５
）、 ６ｍＭ ＭｇＧ！ 、 ６単位のＮｃａｌ
にッポンジーン）］中で３７℃、１時間消化し、その反
応液にＴ Ｅ ８０ｍを加え、７０℃で５分間熱処理し
た後、１／ｊｊ！のＩｍＭ ｄｌＴＰ （ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰを各々１ｍＭ含む）
と２単位のＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｖフラグメ
ント（宝酒造）を加え、３７℃で３０分間保温した。ア
ガロースゲル電気泳動を行い、Ｎｅ。
築 ＦＫＢＰ ｃＤＮ＾を含むプラスミドｐＵＣ−ｈ−ＦＫ
ＢＰ ｌ／ｉ ＤＮＡを、反応液２ＤＨ「１００ｍＭ
ＮｘＣ［！、 ６ｍＭ ＴｒローＨＣｆｌ（ｐＨ７，５
）、 ６ｍＭ ＭｇＧ！ 、 ６単位のＮｃａｌ
にッポンジーン）］中で３７℃、１時間消化し、その反
応液にＴ Ｅ ８０ｍを加え、７０℃で５分間熱処理し
た後、１／ｊｊ！のＩｍＭ ｄｌＴＰ （ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＴＴＰを各々１ｍＭ含む）
と２単位のＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｖフラグメ
ント（宝酒造）を加え、３７℃で３０分間保温した。ア
ガロースゲル電気泳動を行い、Ｎｅ。
部位が平滑末端となった３４０ｂ、 ＤＮＡ断片をＧ！
ｎｅＣ１ｅｘｎにより、精製した。また、ｐＵｃｌｌｌ
のＥｃｏＲＩ部位にＸｈｏ１部位を導入したｐ［Ｉｃ１
８！クローニングベクター１４を２０度反応液［２０ｆ
ｆ１Ｍ ＫＣＲ，ｌｏｍＭＴ＋１ｓ−ＨＩＪ！ （ｐ
Ｈ８，０）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２． ２０単位のＥｃｏ
ＲＩにッポンジーン）、１０単位のＳｍｘｌ （宝酒造
）］中で３７℃、１時間二重消化し、４０ｍＭ Ｔ＋ｉ
＋−ＨＣＪ（ｐＨ７，５）を２０４加えて、７０℃で５
分間熱処理した後、上記と同様にＫｌｅｎｏｖ処理を行
い、平滑末端をもつベクターを作製した。このベクター
（３０ｎｇ）と先に述べたＦＫＢＰを含むＤＮＡ断片（
２０ｎｇ）を２．８単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
）を含む合計３０４の連結反応溶液［６６ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆ！ （ｐ）１７．６）、 ６．６ＲＩＭ
Ｍｇ（１！２． ｌｏｍＭ ジチオスレイトール、
１ ｍＭ ＡＴＰ］中で１６℃、１０時間処理し、両
者が連結した組換えプラスミドｐＵＣ−ＸＪ’ＫＢＰヲ
ｆｌ ｆ＝。
ｎｅＣ１ｅｘｎにより、精製した。また、ｐＵｃｌｌｌ
のＥｃｏＲＩ部位にＸｈｏ１部位を導入したｐ［Ｉｃ１
８！クローニングベクター１４を２０度反応液［２０ｆ
ｆ１Ｍ ＫＣＲ，ｌｏｍＭＴ＋１ｓ−ＨＩＪ！ （ｐ
Ｈ８，０）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２． ２０単位のＥｃｏ
ＲＩにッポンジーン）、１０単位のＳｍｘｌ （宝酒造
）］中で３７℃、１時間二重消化し、４０ｍＭ Ｔ＋ｉ
＋−ＨＣＪ（ｐＨ７，５）を２０４加えて、７０℃で５
分間熱処理した後、上記と同様にＫｌｅｎｏｖ処理を行
い、平滑末端をもつベクターを作製した。このベクター
（３０ｎｇ）と先に述べたＦＫＢＰを含むＤＮＡ断片（
２０ｎｇ）を２．８単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造
）を含む合計３０４の連結反応溶液［６６ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆ！ （ｐ）１７．６）、 ６．６ＲＩＭ
Ｍｇ（１！２． ｌｏｍＭ ジチオスレイトール、
１ ｍＭ ＡＴＰ］中で１６℃、１０時間処理し、両
者が連結した組換えプラスミドｐＵＣ−ＸＪ’ＫＢＰヲ
ｆｌ ｆ＝。
そして、ヒトサイクロフィリンｃＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＵＣ−ｂ−ＰＰＩ １／ｊ９ ＤＮＡを用い、Ｅ
ｃｏＲＩ反応ｇｊ１２０成［５［１１１１Ｍ ＮｘＣｊ
！ 、 １００ｍＭ Ｔ＋１ｓ−ＨＣｆ （ｐＨ７，５
）７ｆｆ１Ｍ Ｍｇ（１）２．２０単位のεｃｏｌｌｌ
］に２Ｄ単位のＰｓｌｌにッポンジーン）１成を加え
、３７℃１時間反応し、約１５０ｂｐのヒトサイクロフ
ィリンポリＡ配列を含むＤＮＡ断片を得、ｐＵＣ−Ｘ４
に８Ｐカラハ、１席ＤＮＡを用い、２０度のＥｃｏＲＩ
反応液に１２単位のＸｈｏｌ （宝酒造）と２０単位の
Ｐ ｓｌ Ｉをそれぞれ１埒ずつ加え、３７℃１時間二
重消化し、３７０ｂｐのｌ’ＫＢＰ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を得た。クローニングベクターハｐＨｃ１８Ｘノ２
００ｎｇ ＤＮＡ ヲＥｃｏＲ１反応ｉｆｆ１２０ｍに
１２単位のｘｌｌｏＩＩＩＪｉと加え、３７℃１時間反
応し、２．６ｋｂのベクター断片を得た。これら３つの
ＤＮＡ断片を、上記の連結反応を行い、三者が連結した
プラスミドｐＵｃ−１−ＦＫＢＰ−人を構築した（第２
図参照）。天然のＧＡＰＤＩ（のプロモーター領域を含
むプラスミド（ｐＧＸＮ１３−ＮｅｏＣ−＾ＴＥ 、
特願平１−３２８６２４参照）をＩｈｏｌとＢＩＩＨＩ
で二重消化し、得られた大きいフラグメントをヒト血清
アルブミンｃＤＮ＾を含む発現プラスミドｐｌＤＢ−Ａ
ＤＨ−Ｈ３人−人（特願平２−１１７３８４参照）のＸ
ｈｏｌ／ＢａｍＨ１二重消化物の小さい方のフラグメン
ト（Ｈ３ＡｃＤＮＡを含む）と連結させて作製したｐＪ
ＤＢ−ＧＡＰ−１（ＳＡ−人のＤＮＡ１埒を反応液２０
成［２０ｍＭ ｘＧ！、１０ｍＭ Ｔｈ１ｓ−ＨＣＦ
（ｐＨ８，０）、７ｍＭ ＭｇＣ［！２゜ＩＯ単位のＳ
ｍａｌ、 １２単位のＸｈｏｌコ中で、３７℃１時間
かけて二重消化し、Ｈ８Ａ遺伝子の除かれた発現ベクタ
ーを得た。ｐＵｃ−Ｘ−ＦＫＢＰ−人からは、１埒ＤＮ
Ａを用い反応液２０１１ｆ！［５０ｍＭ ＮａＣｊ！
、 １０ｈＭ Ｔｈ１ｓ −ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５
）、 ７ｍＭ ＭｇＧ！ ２．１０単位のＨｉｏｄｌＩ
［（宝酒造）］中で、３７℃１時間反応し、水３０威を
加えて７０℃で５分間熱処理をした。その反応液にＫｌ
ｅｎｏｖ処理を行い、再度熱処理し、ＩＭＮａＱ！を５
成と１２単位のＸｈｏｌ Ｉ薦を加えて、３７℃１時間
反応させ、ＦＫＢＰとポリＡ配列を含む５７０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片を上述したよう
に連結反応を行い、酵母菌での発現プラスミドｐＪＤＢ
−ＧＡＰ−ＦＫＢＰ−八を作製した（第３図参照）。
ドｐＵＣ−ｂ−ＰＰＩ １／ｊ９ ＤＮＡを用い、Ｅ
ｃｏＲＩ反応ｇｊ１２０成［５［１１１１Ｍ ＮｘＣｊ
！ 、 １００ｍＭ Ｔ＋１ｓ−ＨＣｆ （ｐＨ７，５
）７ｆｆ１Ｍ Ｍｇ（１）２．２０単位のεｃｏｌｌｌ
］に２Ｄ単位のＰｓｌｌにッポンジーン）１成を加え
、３７℃１時間反応し、約１５０ｂｐのヒトサイクロフ
ィリンポリＡ配列を含むＤＮＡ断片を得、ｐＵＣ−Ｘ４
に８Ｐカラハ、１席ＤＮＡを用い、２０度のＥｃｏＲＩ
反応液に１２単位のＸｈｏｌ （宝酒造）と２０単位の
Ｐ ｓｌ Ｉをそれぞれ１埒ずつ加え、３７℃１時間二
重消化し、３７０ｂｐのｌ’ＫＢＰ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を得た。クローニングベクターハｐＨｃ１８Ｘノ２
００ｎｇ ＤＮＡ ヲＥｃｏＲ１反応ｉｆｆ１２０ｍに
１２単位のｘｌｌｏＩＩＩＪｉと加え、３７℃１時間反
応し、２．６ｋｂのベクター断片を得た。これら３つの
ＤＮＡ断片を、上記の連結反応を行い、三者が連結した
プラスミドｐＵｃ−１−ＦＫＢＰ−人を構築した（第２
図参照）。天然のＧＡＰＤＩ（のプロモーター領域を含
むプラスミド（ｐＧＸＮ１３−ＮｅｏＣ−＾ＴＥ 、
特願平１−３２８６２４参照）をＩｈｏｌとＢＩＩＨＩ
で二重消化し、得られた大きいフラグメントをヒト血清
アルブミンｃＤＮ＾を含む発現プラスミドｐｌＤＢ−Ａ
ＤＨ−Ｈ３人−人（特願平２−１１７３８４参照）のＸ
ｈｏｌ／ＢａｍＨ１二重消化物の小さい方のフラグメン
ト（Ｈ３ＡｃＤＮＡを含む）と連結させて作製したｐＪ
ＤＢ−ＧＡＰ−１（ＳＡ−人のＤＮＡ１埒を反応液２０
成［２０ｍＭ ｘＧ！、１０ｍＭ Ｔｈ１ｓ−ＨＣＦ
（ｐＨ８，０）、７ｍＭ ＭｇＣ［！２゜ＩＯ単位のＳ
ｍａｌ、 １２単位のＸｈｏｌコ中で、３７℃１時間
かけて二重消化し、Ｈ８Ａ遺伝子の除かれた発現ベクタ
ーを得た。ｐＵｃ−Ｘ−ＦＫＢＰ−人からは、１埒ＤＮ
Ａを用い反応液２０１１ｆ！［５０ｍＭ ＮａＣｊ！
、 １０ｈＭ Ｔｈ１ｓ −ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５
）、 ７ｍＭ ＭｇＧ！ ２．１０単位のＨｉｏｄｌＩ
［（宝酒造）］中で、３７℃１時間反応し、水３０威を
加えて７０℃で５分間熱処理をした。その反応液にＫｌ
ｅｎｏｖ処理を行い、再度熱処理し、ＩＭＮａＱ！を５
成と１２単位のＸｈｏｌ Ｉ薦を加えて、３７℃１時間
反応させ、ＦＫＢＰとポリＡ配列を含む５７０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。それぞれのＤＮＡ断片を上述したよう
に連結反応を行い、酵母菌での発現プラスミドｐＪＤＢ
−ＧＡＰ−ＦＫＢＰ−八を作製した（第３図参照）。
実験例４ 発現プラスミドによる酵母宿主の形質転換
ヒトＦＫＢＰ発現プラスミドｐＪＤＢ−ＧＡＰ−ＦにＢ
Ｐ−人；こよる酵母菌の形質転換は、橋本英明、木材光
のＫＵＲ法［発酵と工業、４３．６３０〜６３７ （１
９８５） ］を改変した方法により行った。まずＹＰＤ
培地［１％酵母エキス （Ｄｉｌｃｏ）、２％バクトペ
プトン （Ｄｉｌｃｏ）、２％グルコース］５０ｍ１ｌ
こＡＨ２２株（Ｍ人ＴＩ、 ｌｅｕ ２−３、ｌｅｕ
２−１１２、ｈｉｓ ４−５１９、ｃｘｎｌ）のＹＰＤ
培地による一晩培養液１ ｍｌを加え、３０℃で６００
ｎｉでの吸光度が０．５に達するまで培養した。これを
４℃で２０００ ＋ｐｍ、 ５分間の遠心で集菌し、菌
体を５ｍｌの０． ＩＭ Ｌｉ５ＣＮに懸濁した。次に
そのうちの １．５ｍ１を分取して２００Ｇ ＋ｐ３５
分間の遠心で集菌し、菌体をｌＯ誠の２Ｍ Ｌｉ５ＣＮ
、 ４６誠の５０％ポリエチレングリコール４０００に
再懸濁し、そこに１０ｐ１のＤＮＡ溶液（５−１０鱈の
ＤＮＡを含む）を加えて、３０℃で一晩保温した。この
懸濁液に５０μｓの滅菌蒸留水を加えて、ポルテックス
ミキサーにてゆるく振盪した後、２０ＧＯｒｐｍ、 ５
分間遠心して集菌し、菌体を１００μｓの滅菌蒸留水に
再懸濁し、選択用の寒天培地［ＳＤ培地： ２ Ｑ Ａ
Ｉ９／ ｍｌヒスチジン塩酸塩、０．６７％アミノ酸非
含有イーストニトロゲンベース（Ｄｉｌｃｏ） ２
％グルコースに２％の寒天を加えたもの］にまいた。３
０℃で数日培養した後、生じたコロニーを５ ｍｌのＳ
Ｄ培地に接種し３０℃で４８時間培養して、ヒトＦＫＢ
Ｐの発現について５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）により調べた。
Ｐ−人；こよる酵母菌の形質転換は、橋本英明、木材光
のＫＵＲ法［発酵と工業、４３．６３０〜６３７ （１
９８５） ］を改変した方法により行った。まずＹＰＤ
培地［１％酵母エキス （Ｄｉｌｃｏ）、２％バクトペ
プトン （Ｄｉｌｃｏ）、２％グルコース］５０ｍ１ｌ
こＡＨ２２株（Ｍ人ＴＩ、 ｌｅｕ ２−３、ｌｅｕ
２−１１２、ｈｉｓ ４−５１９、ｃｘｎｌ）のＹＰＤ
培地による一晩培養液１ ｍｌを加え、３０℃で６００
ｎｉでの吸光度が０．５に達するまで培養した。これを
４℃で２０００ ＋ｐｍ、 ５分間の遠心で集菌し、菌
体を５ｍｌの０． ＩＭ Ｌｉ５ＣＮに懸濁した。次に
そのうちの １．５ｍ１を分取して２００Ｇ ＋ｐ３５
分間の遠心で集菌し、菌体をｌＯ誠の２Ｍ Ｌｉ５ＣＮ
、 ４６誠の５０％ポリエチレングリコール４０００に
再懸濁し、そこに１０ｐ１のＤＮＡ溶液（５−１０鱈の
ＤＮＡを含む）を加えて、３０℃で一晩保温した。この
懸濁液に５０μｓの滅菌蒸留水を加えて、ポルテックス
ミキサーにてゆるく振盪した後、２０ＧＯｒｐｍ、 ５
分間遠心して集菌し、菌体を１００μｓの滅菌蒸留水に
再懸濁し、選択用の寒天培地［ＳＤ培地： ２ Ｑ Ａ
Ｉ９／ ｍｌヒスチジン塩酸塩、０．６７％アミノ酸非
含有イーストニトロゲンベース（Ｄｉｌｃｏ） ２
％グルコースに２％の寒天を加えたもの］にまいた。３
０℃で数日培養した後、生じたコロニーを５ ｍｌのＳ
Ｄ培地に接種し３０℃で４８時間培養して、ヒトＦＫＢ
Ｐの発現について５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＥ）により調べた。
実験例５ 形質転換体によるヒトＦＫＢＰの発現ＳＤ培
地での形質転換体４８時間培養液１ ｍｌを５０００
ｒｐｍ、 ５分間遠心して集菌し、菌体を３０屑の５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液、（２％ＳＤＳ、 ５％２−
メルカプトエタノール、７％グリセロール、０、 （１
Ｇ６２５％ブロムフェノールブルー ０．０６２５ＭＴ
「口＝ｌ（Ｃ１緩衝液ｐｉ（６，８）に懸濁し、１００
℃で１０分間煮沸した。この試料ＩＯ誠を分離ゲル濃度
１５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより電気泳
動［Ｌｘｅ＋＋ｍｌｉの方法： Ｌｔｕ＋ｅ２７？、
６８Ｇ （１９７Ｇ）コした後、クマシーブリリアント
ブルー（ＣＢＢ）により染色し、約１４キロダルトン付
近にヒトＦＫ［ＩＰと考えられる有意なバンドを検出し
た。
地での形質転換体４８時間培養液１ ｍｌを５０００
ｒｐｍ、 ５分間遠心して集菌し、菌体を３０屑の５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液、（２％ＳＤＳ、 ５％２−
メルカプトエタノール、７％グリセロール、０、 （１
Ｇ６２５％ブロムフェノールブルー ０．０６２５ＭＴ
「口＝ｌ（Ｃ１緩衝液ｐｉ（６，８）に懸濁し、１００
℃で１０分間煮沸した。この試料ＩＯ誠を分離ゲル濃度
１５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにより電気泳
動［Ｌｘｅ＋＋ｍｌｉの方法： Ｌｔｕ＋ｅ２７？、
６８Ｇ （１９７Ｇ）コした後、クマシーブリリアント
ブルー（ＣＢＢ）により染色し、約１４キロダルトン付
近にヒトＦＫ［ＩＰと考えられる有意なバンドを検出し
た。
［発明の効果コ
ＦＫ５０６結合蛋白質の微生物による大量生産法が確立
されたことにより、免疫抑制剤のスクリーニングのため
のＰＰＩｘｓｅ酵素活性をもつ該蛋白質の安定供給を可
能にした。またこれにより、サイクロフィリンの基質蛋
白質とは異なった基質蛋白質の高次構造形成に対する促
進効果が期待できるため、この効果を利用した不活性型
蛋白質の活性化への利用等が考えられる。
されたことにより、免疫抑制剤のスクリーニングのため
のＰＰＩｘｓｅ酵素活性をもつ該蛋白質の安定供給を可
能にした。またこれにより、サイクロフィリンの基質蛋
白質とは異なった基質蛋白質の高次構造形成に対する促
進効果が期待できるため、この効果を利用した不活性型
蛋白質の活性化への利用等が考えられる。
第１図は、完全長のヒトＦＫ５０６結合蛋白質ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列及びそれから推定されるヒトＦＫ５
０６結合蛋白質のアミノ酸配列を示し、第２図は、ヒト
ＦＫ５０６結合蛋白質をコードするＤＮＡ断片を組み込
んだプラスミドｐｔｌｃ−Ｘ−ＦＫＢＰ−＾の構築方法
を示し、第３図は、発現プラミドｐｌＤＢ−Ｇ人＋’−
ＦＫＢＰ−人の作製方法を示す。 代４人づｔ］星士 、１反 井 淳 第１ εｃｏＲＩ −６０−３０ＧＡＡＴＴＣ
Ｇ［ｉＧＣＣＱＣＣＧＣＣＡＧ［ｉ ＴＣＧＣＴＧＴＴ
ＧＧ ＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＧＴＣＧＣＧＣＣＧＣ
ＣＣＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＱ丁ＣＣＧ ＣＣＧＣＣ
ＧＣＣＡＴＧ 四人 ＧＴ［ｉ ＣＡＧ ＧＴＧ
Ｇ＾＾ ＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡ ＧＧ＾Ｍ＠ｔ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇ１．
ｕ 丁ｈｒ Ｉｌｔ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙＧＡＣＧＱ［ｌ ＣＧＣＡＣＣ１丁ＣＣＣＣＡＡＧ
ＣＧＣＧＧＣＣＡＱ ＡＣＣＴＧＣＧＴＧ Ｑ
丁Ｃｉ ＣＡＣＴＡＣ＾ｓｐ Ｇｌｙ ＾４丁ｈ
ｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｙｓ ＾ｒｇ Ｇｌ
、ｙ Ｉｌ＋ｌｎ 丁ｈｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｔ Ｈｉｓ 丁ｙｒＡＣＣＧＧＧ ＡＴＣ
Ｃｎ Ｇ＾＾ ６＾ＴＧＱ＾ ＾＾Ｃ＾＾＾ Ｔ丁丁
ＯＡＴ ＴＣＣＴＣＣＣＧＧ ＧＡＣＡＧＡＴｈ
ｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ＾
ｒｇ＾ｓｐ＾ｒｇＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴｎＡＡＧＴＴＴ
ＡＴＣＣ丁＾ＧＧＣ＾＾ＱＣＡ［１ＱＡＧ［１ＴＧＡＴ
ＣＣＧＡＧＧＣ＾ｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｌｙ
ｓ Ｐｈｅ Ｍａｔ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ＾ｒｇＧｌνＴＧＧ Ｇ＾＾
ＧＡＡ ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＣＣＣＡＧ ＡＴＧ ＡＱ
Ｔ ＧＴＧ ＧＧＴ ＣＡＧ ＡＧ＾ＣＣＣ＾＾Ａ （
：Ｔ［１Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｍａｌ＾Ｉ
ｓ Ｇｉｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ａｒｔ＾Ｉａ Ｌｙｓ Ｌ＋１ｕＡＣ丁 Ａ丁Ａ
ＴＣ丁 ＣＣＡ ＧＡＴ 丁＾了 ＧＣＣＴＡ丁
００丁 ＧＣＣＡＣＴ Ｇ［ｉＧ ＣＡＣＣＣＡ
ＧＧＣＡＴＣＴｈｒ Ｉｌｅ Ｓ＠ｒ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ
＾１ａ 丁ｈｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ ＩｌｅＡＴＣＣＣＡ ＣＣＡ ＣＡＴ
ＧＣＣＡＣＴ Ｃ丁ＣＱ丁ＣｎＣＱＡＴ ＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＴＡ ＡＡＡ ＣＴＧ
ｌｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｈ１ｓ＾Ｉｓ Ｔｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｐｈ＠＾ｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＬｅｕＧＡＡ Ｔ［ｉＡ ＣＡ
ＧＱＡＡＴＧＧＣＣＴ ＣＣＴＣＣＣＴＴＡＧ
ＣＴＣＣＣＴＧＴ丁ＣＴ丁ＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧ
ＡＧＣＧＡ１ｕ ＴＣＴＧＧＴＣＣＣＴ ＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴ Ｇ
ＣＡＣＡＴＧＡＧＴ ＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧ ＣＴ
ＴＴＴＣＣＴＧＡ 丁Ｇ丁ＴＣＣＡＣ丁ＣＣＡＣ丁Ｔ
ＴＧＴＡＴ ＡＣＡＣＡ丁ＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＡ
Ａ ＴＧＴＧＴＴＣＴＧＴ ＣＡＣＴＣＡＧＣＴＴ Ｔ
ＧＣＴＴＣＣＧＡＣ５］０
５４０＾ＡＣＣ丁ＣＡＡＧＴ ＴＡＴＴ
ＣＡＴ’ｒｒ丁 ＡＴＴＴＴＧＴ丁ＴＴ ＣＡ丁丁Ｔ
ＴＧＧＧＧ 丁ＧＡＡＧＡＴＴＣＡ ＧＴＴＴＣＣ
ＧＴＣＴＴＴＴＧＧＡＴＡＴ＾・［１ＧＴｒＴＣＣＡ＾
丁 Ｔ＾＾ＧＴＡＣＡＴＧ ＧＴＣ＾＾ＧＴＡＴＴ
＾＾ＣＡＧＣＡＣ＾＾ ＧＴＧＧ丁＾ＧＧＴＴ６９０
７２０
５ｓｐｌ＾＾ＣＡＴＴＡＧＡＡ ＴＡＧＧ＾＾丁ＴＧ
Ｇ ＴＧＴＴＧＧＧＧＧＧ ＧＧＧＧＴＴＴＧＣ＾
＾Ｇ＾＾Ｔ＾丁ＴＴＴ ＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴ７５
０７δＯ ■工ＴＧＧ＾ＴＧ＾＾ ＾ＴＴｒＴＴＡＴＣＴ ＡＴ
ＴＡＴＡＴＡＴＴ ＾＾＾ＣＡＴＴＣ丁Ｔ ＧＣＴ
ＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣ＾＾＾ＧＣＣ＾８１０
、 ８４０Ｔ＾ＧＣＡＧ
ＡＴＴＴ ＧＡＧＧＣＧＣＴにＴ ＴＧＡＧＧ＾ＣＴＧ
＾＾ＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＡ（ｉＴＴＧＡ（ｉＡ６＾Ｔ
ＧＴＣＴ’ｒＴＧＧＧＴ丁＾＾＾ＴＴ＾＾ ＾＾ＧＣＣ
ＣＴＡＣＣＴＡＡＡＡＣＴＧＡＧ ＧＴＧＧＧ［１Ａ
ＴＧＧ ＧＧＡＧＡ［；ＣＣＴＴ 丁ＧＣＣＴＣＣ
ＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＴ
ＴＡＡＡＣＣＣＴＣ丁 ＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡ ＧＴ
ＡＧＡ丁ＣＡＴＧ ＴＴＣＡＣＴＧＣ＾＾ＴＯＣＴＧ
ＯＡＣＡＣ丁＾ＣＡ匹丁ＡＴＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧ
ＣＣＡＧＣ＾ＧＧＧＡ ＣＣＴＣ丁ｑ＾＾ＧＣＣＴ
ＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴ丁Ｔ丁ＴＴｒ 丁ＴＴＴＴ
ＣＡＴＣＣＴＧ丁ＧＧＴ丁丁ＴＴ ＣＴ＾＾ＴＧＧＡ
ＣＴ ＴＴＣＡＧＧ＾＾ＴＴ ＴＴＧ丁＾＾ＴＣＴ
ＣＡＴ＾＾ＣＴＴＴＣＣ＾＾ＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＣ
ＣＣＴＡＡＡ ＴＣＴＴ＾＾Ｇ＾＾ＣＴ丁■＾＾丁Ｔ
ＧＡＣＡＧＴ丁丁Ｃ＾＾ＴＴＧ＾＾ＧＧＴＧＣＴＧＴＴ
丁Ｇ１＾［；ＡＣＴＴ＾＾ＣＡＣＣＣＡＧＴＧ＾＾＾Ｑ
ＣＣＣＡｆ；ＣＣＡＴＣＡＴＧＡＣ＾＾＾ＴＣＣＴＴＧ
＾＾ＴＧＴＴＣＴＣＴ ＴＡＡＧ＾＾＾＾ＴＧ Ａ
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ＴＣＴＣＣＴ ＧＴ丁Ｔ丁Ｔ丁Ｃ＾Ｔ１２００
１：１２０（ｉｃＴ
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ＣＴ匹ＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡ（ｉＣＣＣＣ丁Ｔ
ＣＴＣＡＣＣｌコ５０
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０６結合蛋白質のアミノ酸配列を示し、第２図は、ヒト
ＦＫ５０６結合蛋白質をコードするＤＮＡ断片を組み込
んだプラスミドｐｔｌｃ−Ｘ−ＦＫＢＰ−＾の構築方法
を示し、第３図は、発現プラミドｐｌＤＢ−Ｇ人＋’−
ＦＫＢＰ−人の作製方法を示す。 代４人づｔ］星士 、１反 井 淳 第１ εｃｏＲＩ −６０−３０ＧＡＡＴＴＣ
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ｒｇ＾ｓｐ＾ｒｇＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴｎＡＡＧＴＴＴ
ＡＴＣＣ丁＾ＧＧＣ＾＾ＱＣＡ［１ＱＡＧ［１ＴＧＡＴ
ＣＣＧＡＧＧＣ＾ｓｎ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｌｙ
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ＧＧＣＡＴＣＴｈｒ Ｉｌｅ Ｓ＠ｒ Ｐｒｏ
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ＧＣＣＡＣＴ Ｃ丁ＣＱ丁ＣｎＣＱＡＴ ＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ＧＴＴ ＣＴＡ ＡＡＡ ＣＴＧ
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ＧＱＡＡＴＧＧＣＣＴ ＣＣＴＣＣＣＴＴＡＧ
ＣＴＣＣＣＴＧＴ丁ＣＴ丁ＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧ
ＡＧＣＧＡ１ｕ ＴＣＴＧＧＴＣＣＣＴ ＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴ Ｇ
ＣＡＣＡＴＧＡＧＴ ＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧ ＣＴ
ＴＴＴＣＣＴＧＡ 丁Ｇ丁ＴＣＣＡＣ丁ＣＣＡＣ丁Ｔ
ＴＧＴＡＴ ＡＣＡＣＡ丁ＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＧＡ
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ＧＣＴＴＣＣＧＡＣ５］０
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ＴＡＴＡＴＡＴＴ ＾＾＾ＣＡＴＴＣ丁Ｔ ＧＣＴ
ＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣ＾＾＾ＧＣＣ＾８１０
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ＡＴＴＴ ＧＡＧＧＣＧＣＴにＴ ＴＧＡＧＧ＾ＣＴＧ
＾＾ＴＴＡＣＴＣＴＣＣＡＡ（ｉＴＴＧＡ（ｉＡ６＾Ｔ
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ＴＧＧ ＧＧＡＧＡ［；ＣＣＴＴ 丁ＧＣＣＴＣＣ
ＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＴ
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Claims (6)
- （１）下記に示すアミノ酸配列によって表わされるヒト
ＦＫ５０６結合蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 【遺伝子配列があります。】 - （２）前記塩基配列が下記に示す配列から成ることを特
徴とする請求項１記載のＤＮＡ。【遺伝子配列がありま
す。】 - （３）プロモーターの下流であって且つターミネーター
の上流に存在するベクター内のクローニング部位に導入
された、請求項１又は２に記載のＤＮＡを含む発現ベク
ター。 - （４）ベクターがプラスミドである請求項３に記載の発
現ベクター。 - （５）宿主を、請求項３又は４に記載の発現ベクターで
形質転換して得られる形質転換体。 - （６）宿主が酵母又は大腸菌である請求項５に記載の形
質転換体。
Priority Applications (4)
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| JP18323890A JP2982908B2 (ja) | 1990-07-11 | 1990-07-11 | ヒトｆｋ５０６結合蛋白質をコードするｄｎａ |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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