JPH0787789B2 - リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主 - Google Patents

リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主

Info

Publication number
JPH0787789B2
JPH0787789B2 JP61500637A JP50063786A JPH0787789B2 JP H0787789 B2 JPH0787789 B2 JP H0787789B2 JP 61500637 A JP61500637 A JP 61500637A JP 50063786 A JP50063786 A JP 50063786A JP H0787789 B2 JPH0787789 B2 JP H0787789B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
lipocortin
dna
sequence
human
sequences
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP61500637A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS62501679A (ja
Inventor
ピー ウオルナー，バーバラ
ブレイク ペピンスキー，アール
エル ガーウイン，ジエフリー
ジー シンドラー，ダニエル
ホアン，クオーセング
Original Assignee
バイオジェン インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/690,146 external-priority patent/US4879224A/en
Priority claimed from US06/712,376 external-priority patent/US4874743A/en
Application filed by バイオジェン インコーポレイテッド filed Critical バイオジェン インコーポレイテッド
Publication of JPS62501679A publication Critical patent/JPS62501679A/ja
Publication of JPH0787789B2 publication Critical patent/JPH0787789B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術的分野 本発明は、少なくとも１種のヒトリポコルチンを製造す
るためのDNA配列、組換DNA分子および方法に関するもの
である。リポコルチンはホスホリファーゼ抑制蛋白とも
呼ばれる。本出願人は米国特許出願第712,376号および
第690,146号明細書において、リポコルチンを意味する
ためにホスホリファーゼ抑制蛋白という用語を使用し
た。さらに詳細には、本発明は、少なくとも１種のヒト
リポコルチン様ポリペプチドをコードすることを特徴と
するDNA配列および組換DNA分子に関するものである。従
って、これら配列により形質転換された宿主を本発明の
方法に使用して、本発明のヒトリポコルチン様ポリペプ
チドを製造することができる。これらのポリペプチドは
抗炎症活性を有し、かつ関節炎、アレルギー症、皮膚
病、眼病および膠原病の治療に有用である。
発明の背景 アラキドン酸は、炎症反応に関与するたとえばプロスタ
グランジン、ヒドロキシ酸およびロイコトリンのような
化合物を合成する際の先駆体となる不飽和脂肪酸であ
る。これは、ホスホリパーゼA2活性によって膜の燐脂質
から放出される。たとえば、グルココルチコイドのよう
な抗炎症剤に反応して、ある種の細胞はインビトロにお
いてホスホリパーゼA2を抑制する能力を特徴とする蛋白
を放出する。従って、アラキドン酸の生成を抑制するこ
とにより、リポコルチンはプロスタグランジンおよびそ
の他の炎症性物質の合成を阻止し、かくして炎症を低下
させる〔F.ヒラタ等、「グルココルチコイドにより誘発
されたウサギ好中球におけるホスホリパーゼA2抑制蛋
白」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第77巻、第５号、第2533〜2536頁（198
0）〕。
今日まで、数種のホスホリパーゼA2抑制蛋白が研究され
ている。それらの１種（すなわち、リポモジュリン）は
分子量約40,000の蛋白として特性化されており、これは
恐らく細胞中のプロテアーゼにより分解されて分子量約
30,000および15,000の２種の小さい活性物質となる〔F.
ヒラタ等、「リポモジュリンに対する放射線免疫分析に
よる数種のホスホリパーゼ抑制蛋白の同定」、バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョン、第109巻、第１号、第223〜230頁（1982）〕、他
の実験的証明は、他の２種のホスホリパーゼA2抑制物
質、すなわちマクロコルチン（分子量約15,000）および
レノコルチン（それぞれ分子量約15,000および30,000の
２種類）も、たとえばリポモジュリンのような大型抑制
蛋白の分解生成物であり得ることを示唆している〔J.F.
クロイクス等、「レノコルチンの特性化および部分精
製：グルココルチコイドの抗ホスホリパーゼ様作用を生
ぜしめる腎細胞で生成される２種のポリペプチド」、ブ
リティッシュ・ジャーナル・ファーマコロジー、第79
巻、第313〜321頁（1983）;G.J.ブラックウェル等、
「マクロコルチン：グルココルチコイドの抗ホスホリパ
ーゼ作用を生ぜしめるポリペプチド」、ネイチャー、第
287巻、第147〜149頁（1980）〕。
リポモジュリンはウサギの好中球から、マクロコルチン
はラットのマクロファージから、またレノコルチンはラ
ットの腎髄質の間質細胞からそれぞれ単離されている
が、これら３種の蛋白は同様な生物学的活性を示し、同
様な分子量を有すると共に、リポモジュリンもしくはマ
クロコルチンに対するモノクローナル抗体との交差反応
性を示す。さらに、これらは全てグルココルチコイドに
よって誘発される。従って、これらのホスホリパーゼ抑
制蛋白、すなわちリポコルチンは互いに近縁であって、
ステロイド作用の一般的な物理学的メカニズムとして細
胞により生産されることが示唆されている〔B.ロスフー
ト等、「グルココルチコイド誘発の抗ホスホリパーゼ蛋
白、「ノコルチンの特性化」、バイオケミカル・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーション、第117
巻、第３号、第878〜884頁（1983）〕。
さらに、最近のデータが示すところでは、分子量15,000
のリポモジュリンの種類がイミューノジエンに反応して
リンパ球により産生されかつグリコシル化抑制因子とし
て作用し、IgE−結合因子のグリコシル化を阻止する共
にIgE反応の抑制をもたらす〔T.ウエデ等、「IgE−結合
因子の生物学的活性の変化:I.リポモジュリンの断片、
としてのグリコシル化抑制因子の同定」、ジャーナル・
イミューノロジー、第130巻、第２号、第878〜884頁（1
983）〕。
リポコルチンは、その抗炎症活性の結果、炎症経過を含
む障害の治療に有用である。この種の障害は関節炎、ア
レルギー症、皮膚病、眼病および膠原病を含む。さら
に、炎症を治療するこれら蛋白の使用は、現在の抗炎症
性化合物に伴う欠点をも回避する。
現在、抗炎症治療には２種類の化合物が使用されてい
る。すなわち、コルチコステロイドおよび非ステロイド
系の抗炎症剤である。コルチコステロイドは、一般にそ
の使用に伴う著しい副作用のため一般に嫌われている。
これらの副作用は高血圧、胃腸出血、筋肉弱化、白内障
および痙攣を含む。従って、非ステロイド系の抗炎症性
化合物が好ましい。しかしながら、これらの非ステロイ
ドも、たとえば胃および胎盤の生理、ならびに中枢神経
系および造血系に対する悪作用のような副作用をもたら
す。さらに、ほとんどの非ステロイド系抗炎症剤は、こ
れら物質を生成させるための２つの経路の一方のみ、す
なわちシクロオキシゲナーゼ経路またはリポオキシゲナ
ーゼ経路のいずれかに対するその作用により炎症性物質
の生成を阻害する。
これに対し、リポコルチンは上記両経路を介して炎症性
物質の生成を抑制する。さらに、リポコルチンはステロ
イド作用の唯一の媒体であるため、しばしばコルチコス
テロイドの使用に伴うような副作用を生じないと思われ
る。また、これらの抑制蛋白は細胞により生産される天
然媒体であるため、一般に多くの非ステロイド系抗炎症
剤に伴う副作用を示さないと思われる。
さらに、リポコルチンは、白血球の化学走性反応を阻止
することにより別の経路を介して炎症に作用する。pp60
srcおよびMT抗原、すなわちsrcペプチドおよびMTペプチ
ドに見られるチロシン燐酸化部位をコードする配列を持
ったある種のペプチドは、化学吸引剤によって刺戟され
るウサギ好中球の化学走性を阻止することが示されてい
る〔F.ヒラタ等、「Glu-Glu-Glu-Glu-Tyr-Pro-Met-Glu
およびLeu-Ile-Glu-Asp-Asn-Glu-Tyr-Thr-Ala-Arg-Gln-
Glyによる白血球化学走性の阻止」、バイオケミカル・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション、第
18巻、第632〜690頁（1984）〕。リポコルチンはそのア
ミノ酸配列内に同様な配列を有する（GluAsnGluGluGlnG
luTyr、残基数15〜21）。従って、リポコルチンは炎症
組織中への好中球および大食細胞の移動を抑制しまたは
阻止することによってこの配列を介し抗炎症作用を発揮
する。
しかしながら、現在まで、ヒトリポコルチンは細胞から
精製されていない。さらに、リポコルチンの精製方法が
開発されたとしても、多くの臨床および産業用途にこれ
らを著量で製造し得るとは思われない。従って、ヒトリ
ポコルチンを臨床上有用な量で生産し得る方法が、抗炎
症治療において極めて有利であろう。
発明の要点 本発明は、少なくとも１種のヒトリポコルチン様ポリペ
プチドをコードするDNA配列、ならびにこれらDNA配列に
より形質転換された宿主でこの種のポリペプチドを産生
させる方法を提供することにより上記の問題を解決す
る。
本発明のDNA配列は、λLCおよびλNLipo21-2のcDNA挿入
物、これらcDNA挿入物にハイブリッド化しかつ発現に際
しヒトリポコルチン様ポリペプチドをコードするDNA配
列、および前記DNA配列のいずれかにより発現に際しコ
ードされたポリペプチドを発現に際しコードするDNA配
列よりなる群から選択される。これらDNA配列を有する
組換DNA分子、これらにより形質転換された宿主、およ
びこれらにより発現に際しコードされるヒトリポコルチ
ン様ポリペプチドも本発明の一部である。
本発明のDNA配列、組換DNA分子、宿主および方法は関節
炎、アレルギー症、皮膚病、眼病および膠原病、ならび
に炎症経過を含むその他の病気を治療する際に使用する
ためのヒトリポコルチン様ポリペプチドの製造を可能に
する。
図面の簡単な説明 図１はラットのホスホリパーゼA2阻止蛋白の臭化シアノ
ゲン切断から得られた断片のアミノ酸配列を示し、 図２はラットのホスホリパーゼA2阻止蛋白のトリプシン
切断から得られた断片のアミノ酸配列を示し、 図３は本発明のリポコルチンDNA配列につきスクリーニ
ングするため使用した化学合成のオリゴヌクレオチドDN
A試料における４種の保存物を示し、 図４はヒトリポコルチンをコードするλLCのcDNA挿入物
のヌクレオチド配列を示し、さらにリポコルチン蛋白の
予想アミノ酸配列をも示し、アミノ酸配列の下に示した
数字（たとえば1,30および346）は遺伝子のコード化配
列に基づく蛋白の第１、第13および最後のアミノ酸を示
し、 図５は一実施例として本発明のDNA配列を発現させるた
めに使用したプラスミドpKK233.LIP.1の構成を概要とし
て示し、 図６は一実施例で本発明のDNA配列を発現させるために
使用したプラスミドpLiptrc155Aの構成を概要として示
し、 図7-9は本発明の一実施例に従ってヒトリポコルチンを
産生するためのプラスミドpBg120、すなわち酵母発現ベ
クターの作成を示し、 図10は粗製酵母溶解物のSDS−ポリアクリルアミドゲル
分析を示し、レーンａは本発明によりイー・コリで作成
した精製ヒトリポコルチンを含み、レーンｂはプラスミ
ドを持たない酵母からの抽出物を含み、レーンｄはpBg1
20を有する酵母からの抽出物を含み、レーンｃおよびｅ
はヒトリポコルチンをコードするDNA配列を持たない他
のプラスミドを含有する酵母からの抽出物を含み、 図11-13は本発明の一実施例によるヒトリポコルチンの
産生に関するプラスミドpSVL9109、すなわち哺乳動物発
現ベクターの構成を示し、 図14はプラスミン切断したヒトリポコルチン様ポリペプ
チドのSDS−ポリアクリルアミドゲル分析を示し、レー
ンa-fはプラスミンを添加してからそれぞれ0,5,10,20,4
0および120分後に採取した試料を示し、 図15はバイオゲルP-60カラムクロマトグラフィーによっ
て分画した後のヒトリポコルチン様ポリペプチドにおけ
るプラスミン断片のホスホリパーゼA2阻止活性を示し、 図16はヒトリポコルチン様ポリペプチドのトリプシン切
断から得られた断片のアミノ酸配列を示し、 図17はリポーＳおよびリポーＬのトリプシン切断から得
られた断片のアミノ酸配列を示し、 図18はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分
離した後のヒトリポコルチン様ポリペプチドにおけるエ
ラスターゼ断片のホスホリパーゼA2阻止活性を示し、 図19はe-1,e-4およびe-5のトリプシン切断によって得ら
れた断片のアミノ酸配列を示し、 図20は組換DNA技術により生物学上活性なリポコルチン
様ポリペプチド断片を産生させるため本発明の方法によ
り使用した変異オリゴヌクレオチドを示し、 図21はメチオニンが位置する配列に沿った部位を数字に
よって示したリポコルチンアミノ酸配列の略線図であ
り、括弧内の数字はメチオニンを導入して本発明による
断片を生成させ得る部位を示し、本発明の数種の断片お
よびその分子量を線図の下に示し、 図22はリポ−８から抽出された未処理および臭化シアノ
ゲン処理したヒトリポコルチン様ポリペプチドの26Kd断
片を示すSDS−ポリアクリルアミドゲル分析を示し、 図23はモノＳ高解像陽イオン交換クロマトグラフィーに
より分画した後の280nmにおけるリポコルチン（ピーク
Ｉ）およびＮ−リポコルチン（ピークII）の吸光経過を
パネルＡで示し、パネルＢは本発明の溶出リポコルチン
およびＮ−リポコルチンのホスホリパーゼA2阻止活性を
阻止％として示し、 図24は本発明の方法により分離されたリポコルチンおよ
びＮ−リポコルチン蛋白のトリプシン分解マップを示
し、 図25は本発明のＮ−リポコルチンのトリプシン分解マッ
プを示すと共に、このマップのピークとこれらピークに
含まれるペプチド断片のアミノ酸配列との関係を示し、 図26は本発明のＮ−リポコルチンDNA配列につきスクリ
ーニングするために使用した化学合成のオリゴヌクレオ
チドDNA試料の４種の保存物を示し、 図27はpNLip1のcDNA挿入物のヌクレオチド配列を示し、 図28は本発明のリポコルチンおよびＮ−リポコルチンcD
NA配列におけるヌクレオチド配列を比較し、図における
「Ｘ」は遺伝子のコード化配列の末端および３′非コー
ド化配列の開始を示している。
発明の詳細な説明 本発明を充分理解し得るよう、以下詳細に説明する。
説明において次の用語を使用する： ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸と窒素含有
複素環式塩基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマー単
位。この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭
素）を介して糖部分に結合される。塩基と糖との組合せ
をヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基を特
徴とする。４種のDNA塩基はアデニン（「Ａ」）、グア
ニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のRNAはＡ、Ｇ、Ｃおよびウラ
シル（「Ｕ」）である。
DNA配列：隣接するペントースの３′炭素と５′炭素と
の間のホスホジエステル結合により互いに連結されたヌ
クレオチドの線状配列である。
コドン:mRNAを介し、アミノ酸、翻訳開始信号または翻
訳停止信号をコードする３種のヌクレオチド（トリプレ
ット）のDNA配列であって、たとえばヌクレオチドトリ
プレットTTA、TTG、CTT、CTC、CTAおよびCTGはアミノ
酸、ロイシン（「Leu」）をコードし、TAG、TAAおよびT
GAは翻訳停止信号でありかつATGは翻訳開始信号であ
る。
読枠:mRNAをアミノ酸配列に翻訳する際のコドンの群で
あって翻訳の際に適切な読枠を維持せねばならず、たと
えばDNA配列GCTGGTTGTAAGは３個の読枠もしくは相とし
て表わすことができ、そのそれぞれは次の異なるアミノ
酸配列を与える：GCT GGT TGT AAG‐‐Ala-Gly-Cys-Lys G CTG GTT GTA AG--Leu-Val-Val GC TGG TTG TAA G--Trp-Leu−（停止） ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシ基との間でペプチド結合により互いに結合された
アミノ酸の線状列である。
ペプチターゼ：ペプチド結合を加水分解する酵素であ
る。
ゲノム：細胞もしくはウイルスの全DNAであって、特に
物質のポリペプチドをコードする構造遺伝子、ならびに
オペレータ、プロモータおよびたとえばシャイン−ダル
ガルノ配列のような配列を含むリボソーム結合性および
相互作用性配列を含む。
遺伝子：メッセンジャーRNA（「mRNA」）の雛型を介し
特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコードす
るDNA配列である。
転写：遺伝子もしくはDNA配列からmRNAを産生する過程
である。
翻訳:mRNAからポリペプチドを産生する過程である。
発現:DNA配列もしくは遺伝子の作用を受けてポリペプチ
ドを産生する過程であり、これは転写と翻訳との組合せ
である。
プラスミド：完全「レプリコン」からなる非染色体二重
鎖DNA配列であって、このプラスミドは宿主細胞内で複
製される。プラスミドが単細胞生物内に存在すると、こ
の生物の特徴はプラスミドのDNAの結果として変化しあ
るいは形質転換される。たとえば、テトラサイクリン耐
性(TetR)に関する遺伝子を有するプラスミドは、テトラ
サイクリンに対し感受性であった細胞をこれに耐性の細
胞に形質転換させる。プラスミドにより形質転換された
細胞を「形質転換体」と呼ぶ。
ファージもしくはバクテリオファージ：細菌性ウイルス
であって、その多くは蛋白エンベロプもしくはコート中
にカプセル化されたDNA配列よりなっている（「カプシ
ド」）。
コスミド：バクテリオファージλの凝集末端（「co
s」）部位を有するプラスミドである。これらコスミド
はcos部位が存在するためλコート蛋白中に導入され
て、適当な宿主に感染させるべく使用することができ
る。異質DNAの大型断片に対するその容量によりコスミ
ドはクローン化ベヒクルとして有用である。
クローン化ベヒクル：宿主細胞内で複製することがで
き、たとえば複製コート蛋白の産生のようなDNAの本質
的な生物学的機能の喪失あるいはプロモータもしくは結
合部位の喪失を伴うことなくDNA配列を決定可能に切断
しうる１個または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を
特徴とし、かつたとえばテトラサイクリン耐性もしくは
アンピシリン耐性などの形質転換細胞の同定に使用する
のに適した標識を有するプラスミド、ファージDNAまた
はその他のDNA配列であり、クローン化ベヒクルはしば
しばベクターと呼ばれる。
クローン化：無性増殖によって１種の生物もしくは配列
から誘導される生物もしくはDNA配列の集団を得る過程
である。
組換DNA分子すなわちハイブリッドDNA:互いに末端結合
してある種の宿主細胞に感染しかつそこに維持される能
力を有する種々異なるゲノムからのDNA断片よりなる分
子である。
発現制御配列：遺伝子に作用結合された際これら遺伝子
の発現を制御するヌクレオチドの配列である。これらは
lac系、trp系、tac系、trc系、ファージλの主オペレー
タおよびプロモータ領域、fdコート蛋白の制御領域、SV
40の初期および後期プロモータ、ポリオーマから誘導さ
れたプロモータ、アデノウイルスおよび猿ウイルス、３
−ホスホグリセレートキナーゼもしくはその他の糖分解
酵素のプロモータ、酵母酸ホスファターゼのプロモー
タ、たとえばpho5、酵母α−結合ファクタのプロモー
タ、ならびに原核もしくは真核細胞およびそのウイルス
の遺伝子の発現を制御することが知られたその他の配
列、あるいはその組合せを包含する。哺乳動物細胞につ
いては、遺伝子をジヒドロホレートレダクターゼをコー
ドする遺伝子に結合したSV40早期領域に対するような真
核プロモータに結合させて、シナハムスター卵細胞で選
択増殖させることにより、活性転写した真核遺伝子の多
数のコピーを有する細胞ラインを生成させることができ
る。
リポコルチン様ポリペプチド：リポコルチンの生物学的
もしくは免疫学的活性を示すポリペプチドであり、この
ポリペプチドは原リポコルチンのアミノ酸の他にさらに
アミノ酸を含み、あるいは原リポコルチンのアミノ酸全
部を含まなくてもよい。さらに、これはＮ−末端メチオ
ニンを含むことができる。リポコルチンは、ホスホリパ
ーゼ阻止蛋白とも呼ばれる。
本発明はヒトリポコルチン様ポリペプチドをコードする
DNA配列および組換DNA分子、ならびにこれらポリペプチ
ドの産生方法に関するものである。
本発明のDNA配列を分離しかつクローン化するには各種
の選択およびDNAクローン化技術を潜在的に使用しうる
であろうが、本発明の一実施例においてはラットのホス
ホリパーゼA2阻止蛋白に基づく選択技術を採用した。従
って、ラットの腹腔内滲出細胞の細胞外上澄液からラッ
トのホスホリパーゼA2阻止蛋白を精製し、この蛋白の各
種断片のアミノ酸配列を決定した。これら蛋白配列に基
づき、最小のヌクレオチド縮重を有する精製ラット蛋白
のこれら領域に対応する数種の対応オリゴヌクレオチド
DNA試料を合成した。次いで、これら試料を使用して、
ファージクローン化ベクター中に挿入されたヒト大食細
胞cDNA配列を含有するイー・コリ菌体からなるヒトcDNA
保存物をスクリーニングした。
スクリーニングするため、プラークハイブリッド化スク
リーニング分析を用いてオリゴヌクレオチド試料をヒト
cDNA保存物にハイブリッド化し、かつこれら多数の試料
にハイブリッド化するクローンを選択した。選択したヒ
トcDNA挿入物を分離しかつプラスミド中へサブクローン
化した後、そのヌクレオチド配列を決定し、これらを精
製ラットリポコルチンのペプチドから得られたアミノ酸
配列と比較した。この比較の結果、分離された全クロー
ンのヌクレオチド配列は精製されたラットリポコルチン
のアミノ酸配列に対し顕著な類似性を有するアミノ酸配
列をコードすることが判明した（図１および図２と図４
との比較）。分離したクローンの少なくとも１種はヒト
リポコルチンをコードする全長配列を有することを確認
した。
本発明のcDNA配列は、発現制御配列に作用結合して、各
種の哺乳動物またはその他の真核もしくは原核宿主細胞
で使用して、これらによりコードされるヒトリポコルチ
ン様ポリペプチドを産生することができる。たとえば、
37Kdヒトリポコルチンを産生する高レベルの発現ベクタ
ーを作成した。
さらに、本発明cDNA配列は、リポコルチン様ポリペプチ
ドをコードする他の配列に対するヒトcDNA保存物をスク
リーニングするにも有用である。さらに、本発明のcDNA
配列は、ヒトゲノムDNA保存物をスクリーニングして、
リポコルチン様ポリペプチドをコードするヒトゲノムDN
A配列を選択する試料としても有用である。これらのゲ
ノム配列は、本発明の上記cDNA配列と同様に、これらに
よりコードされる、リポコルチン様ポリペプチドを産生
するにも有用である。ゲノム配列は、哺乳動物細胞を形
質転換させてヒトリポコルチン様ポリペプチドを産生す
るのに特に有用である。
本発明の第２実施例によれば、ヒト胎盤からヒトリポコ
ルチン様ポリペプチドを分離し、このポリペプチドを本
発明の37Kd組換リポコルチンに対する構造類似性、すな
わちアミノ酸同族性を示す。さらに、この蛋白はホスホ
リパーゼA2阻止活性をも示す。この蛋白をＮ−リポコル
チンと称する。リポコルチンおよびＮ−リポコルチン
は、トリプシン地図化により化学的に規定されたそれぞ
れ別の蛋白である。Ｎ−リポコルチンの各断片のアミノ
酸配列を決定し、これら配列に基づき対応のオリゴヌク
レオチドDNA試料を合成した。これら試料を使用して、
ファージクローン化ベクター中に挿入されたヒト胎盤cD
NA配列を有するイー・コリ菌体からなるヒトcDNA保存物
をスクリーニングした。これら試料にハイブリッド化す
る数種のクローンを分離した。これらクローンの１種の
cDNA挿入物をプラスミド中へ導入した後、このcDNA挿入
物のヌクレオチド配列を決定した。これはＮ−リポコル
チンの一部をコードする。
このcDNA配列は、Ｎ−リポコルチン様ポリペプチドをコ
ードする他の配列に対するヒトcDNA保存物をスクリーニ
ングするための試料として有用である。たとえば、この
cDNA挿入物を使用して、Ｎ−リポコルチンをコードする
全長配列につき本発明のヒト胎盤cDNA保存物をスクリー
ニングすることができる。あるいは、本発明の部分Ｎ−
リポコルチンcDNA配列を得るために使用したオリゴヌク
レオチド試料は、Ｎ−リポコルチンをコードする全長配
列につき胎盤保存物を再スクリーニングするための試料
としても有用である。さらに、得られたＮ−リポコルチ
ンcDNA配列、あるいはここに開示した試料を使用して、
当業界の標準技術により再編成したＮ−リポコルチン遺
伝子および全長遺伝子の他の部分を単離することもでき
る。さらに、cDNA配列の試料を、全長コード配列を合成
するためのプライマとして使用することもできる。
さらに本発明のＮ−リポコルチンcDNA配列は、ヒトゲノ
ムDNA保存物をスクリーニングしてＮ−リポコルチン様
ポリペプチドをコードするヒトゲノムDNAを選択するた
めの試料としても有用である。これらゲノム配列は、Ｎ
−リポコルチンcDNA配列と同様に、これら配列で形質転
換された宿主においてＮ−リポコルチン様ポリペプチド
を産生させるにも有用である。
本発明の他の具体例は、リポコルチン蛋白の活性部位を
より良く特定化することができかつ最適な治療価値を有
する分子の設計を可能にするような生物学上活性なヒト
リポコルチン様ポリペプチド断片の製造にも関するもの
である。従って、本発明のリポコルチン様ポリペプチド
を各種のプロテアーゼで処理して、これら断片を生成さ
せた。さらに、組換DNA技術により、これらの生物学上
活性な断片を生成させた。本発明の方法により産生され
たヒトリポコルチン様ポリペプチドは、抗炎症剤として
あるいは抗炎症方法および治療に有用である。たとえ
ば、これらの組成物は、炎症を減少させるのに医薬上有
効な量の本発明によるリポコルチン様ポリペプチドと医
薬上許容しうるキャリヤとから構成することができる。
この種の治療は、一般に医薬上許容しうる方法でこれら
組成物により患者を処置する方法からなっている。
方法および材料 広範な種類の宿主／クローン化ベヒクル組合せ物を、本
発明により作成したヒトリポコルチン様ポリペプチドDN
A配列をクローン化しまたは発現する際に使用すること
ができる。たとえば、有用なクローン化もしくは発現ベ
ヒクルは染色体、非染色体および合成のDNA配列の断
片、たとえば各種公知のSV40の誘導体ならびに公知の細
菌性プラスミド、たとえばcolE1、pCR1、pBR322、pMB9
およびその誘導体を含むイー・コリからのプラスミド；
広範な宿主範囲のプラスミド、たとえばRP4、ファージD
NA（たとえば、ファージλの多数の誘導体、たとえばNM
989）；ならびにその他のDNAファージ、たとえばM13お
よびフィラメント状一本鎖DNAファージ、ならびにプラ
スミドとファージDNAとの組合せから誘導された、たと
えばファージDNAあるいはその他の発現制御配列または
たとえば２μプラスミドもしくはその誘導体のような酵
母プラスミドを使用すべく改善したプラスミドなどのフ
ァージDNAで構成することができる。
それぞれ特異性のクローン化もしくは発現ベヒクルにお
いて、各種の部位を選択して本発明のヒトリポコルチン
様ポリペプチドDNA配列を挿入することができる。一般
に、これらの部位は、これらを切断しかつ当業者によく
知られた制限エンドヌクレアーゼによって命名される。
DNA配列をこれらの部位に挿入して組換DNA分子を形成さ
せる各種の方法も周知されている。これらは、たとえば
dG-dCもしくはdA-dT末端処理、直接結合、エキソヌクレ
アーゼおよびポリメラーゼ結合した修復反応に続く結
合、あるいはDNAポリメラーゼおよび適当な一本鎖雛型
によるDNAストランドの延長に続く結合を包含する。勿
論、本発明に有用なクローン化もしくは発現ベヒクル
は、選択DNA断片を挿入するための制限エンドヌクレア
ーゼ部位を必要としないことを了解すべきである。むし
ろ、ベヒクルは他の手段によって断片に結合することが
できる。
さらに、各種の発現制御配列を選択して、本発明のDNA
配列を発現させることができる。これらの発現制御配列
は、たとえば、lac系、β−ラクタマーゼ系、trp系、ta
c系、trc系、ファージλの主オペレータおよびプロモー
タ領域、fdコート蛋白の制御領域、３−ホスホグリセレ
ートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモータ、
酸ホスファターゼのプロモータ（たとえば、Pho5）、酵
母α−結合因子のプロモータ、哺乳動物細胞のプロモー
タ（たとえば、SV40早期プロモータ）、アデノウイルス
の後期プロモータおよびメタロチオニンプロモータ、な
らびに原核もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝
子およびその各種組合せの発現を制御することが知られ
たその他の配列を包含する。哺乳動物細胞においては、
さらに遺伝子をジヒドロフォレートデダクターゼに対す
るものへ結合しかつ宿主支那ハムスター卵細胞に対する
選択を行って、発現単位を増幅することもできる。
本発明のDNA配列を発現させるには、これらDNA配列を発
現ベクターにおける上記発現制御配列の１つもしくはそ
れ以上に作用結合させる。選択したヒトリポコルチンDN
A配列がクローン化ベヒクル中に挿入される前または後
に行いうるこの種の作用結合は、発現制御配列がDNA配
列の発現を制御しかつ促進することを可能にする。
ベクターもしくは発現ベヒクル、および特に選択DNA断
片および本発明に使用する発現制御配列を挿入するため
にここで選択した部位は、各種の因子、たとえば特定の
制限酵素に感受性の部位の個数、発現すべき蛋白の大き
さ、たとえばベクター配列に対する開始および停止コド
ンの位置などの発現特性および当業者に知られたその他
の因子によって決定される。特定のリポコルチン配列に
対するベクター、発現制御配列および挿入部位の選択は
これら因子の調和によって決定され、必ずしも全ての選
択が所定の場合に同等に有効であるとは限らない。
さらに、クローン化もしくは発現ベヒクルの選択部位に
挿入される本発明のリポコルチン様ポリペプチドをコー
ドするDNA配列は、所望リポコルチンをコードする実際
の遺伝子の一部でないヌクレオチドを含むことができ、
あるいはこの蛋白に対する全遺伝子の断片のみを含むこ
ともできることが了解されよう。どのDNA配列を使用し
ても形質転換宿主がリポコルチン様ポリペプチドを産生
されることだけが必要である。たとえば、本発明のリポ
コルチン関連DNA配列を本発明の発現ベクターにおける
同じ読枠中で融合させて、少なくとも１種の真核もしく
は原核キャリヤ蛋白をコードするDNA配列または少なく
とも１種の真核もしくは原核信号配列をコードするDNA
配列、またはその組合せの少なくとも一部とすることが
できる。この種の構成は所望のリポコルチン関連DNA配
列の発現を促進し、精製を向上させ、あるいは分泌を可
能にし、好ましくは宿主細胞からのリポコルチン様ポリ
ペプチドの成熟を可能にする。あるいは、リポコルチン
関連DNA配列はATG開始コドンを単独であるいは他のコド
ンと組合せて含むこともでき、成熟天然リポコルチン様
ポリペプチドの第１アミノ酸をコードする配列に直接融
合させることができる。この種の構成は、たとえば本発
明の一部であるメチオニルもしくはその他のペプチジル
−リポコルチン様ポリペプチドの産生を可能にする。こ
のＮ−末端メチオニンもしくはペプチドを次いで細胞内
または細胞外で各種の公知方法により切断することがで
き、あるいはこのポリペプチドを本発明の抗炎症組成物
および方法にペプチドへ結合したメチオニンと共に使用
することもできる。
本発明のリポコルチン様ポリペプチドをコードする配列
を含んだクローン化ベヒクルまたは発現ベクターを本発
明により使用して適当な宿主を形質転換させ、DNA配列
によりコードされるリポコルチン様ポリペプチドを宿主
が発現するのを可能にする。
有用なクローン化もしくは発現宿主は、たとえば、イー
・コリW31101Q、イー・コリJA221、イー・コリC600、イ
ー・コリED8767、イー・コリDH1、イー・コリLE392、イ
ー・コリHB101、イー・コリX1776、イー・コリX2282、
イー・コリMRCIなどのイー・コリの菌株、ならびにシュ
ードモナス、バチルスおよびストレプトミセス、酵母な
らびにその他の真菌類の菌株、動物宿主、たとえばCHO
細胞もしくはネズミ細胞、その他の動物（ヒトを含む）
宿主、培養中の植物細胞、あるいはその他の宿主を包含
する。
適する宿主の選択は、当業界で知られた多くの因子によ
って管理される。これらは、たとえば選択ベクターに対
する適合性、ハイブリッドプラスミドによりコードされ
た蛋白の毒性、宿主細胞の酵素による蛋白分解に対する
所望蛋白の感受性、宿主細胞蛋白によって発現される精
製の際に除去困難な蛋白の汚染もしくは結合、所望蛋白
の回収の容易さ、発現特性、生物安全性およびコストな
どを包含する。必ずしも全ての宿主ベクターの組合せが
特定の組換DNA分子のクローン化もしくは発現に対し同
等に有効でありうるとは限らないことを理解した上で、
これら因子を調和させねばならない。
ヒトリポコルチン様ポリペプチド（これらの宿主にて本
発明にしたがい作成したもの）は、ポリペプチドを融合
蛋白の形態（たとえば原核、真核または組合せＮ−末端
断片に結合して分泌を指示し、安定性を向上し、精製を
向上させ、あるいはＮ−末端断片の可能な切断を向上さ
せる）、リポコルチン様ポリペプチドの先駆体の形態
（たとえば、リポコルチン様ポリペプチド信号配列また
はその他の真核もしくは原核信号配列の全部または一部
で開始する）、成熟リポコルチン様ポリペプチドの形
態、あるいはmet−リポコルチン様ポリペプチドの形態
を含むことができる。
本発明によるポリペプチドの特に有用な一形態あるいは
その少なくとも１種の先駆体は、容易に切断されるアミ
ノ酸あるいはアミノ末端に結合した一連のアミノ酸を有
する成熟リポコルチン様ポリペプチドである。この種の
構造は、成熟リポコルチンに存在しえない開始信号を必
要とする適当な宿主で蛋白を合成し、次いで余分のアミ
ノ酸をインビボもしくはインビトロで切断して成熟リポ
コルチン様ポリペプチドを産生することを可能にする。
この種の方法は当業界に現存する（たとえば米国特許第
4,332,892号、第4,338,397号および第4,425,437号参
照）。さらに、これらポリペプチドを他の天然リポコル
チンと同様にグリコシル化し、または脱グリコシル化
し、或いは天然リポコルチンとは異なるグリコシル化パ
ターンにすることもできる。この種のグリコシル化は宿
主細胞によって生じ、或いは特性のリポコルチンを得る
よう選択した発現後の処理によっても生ずる。
さらに、本発明のポリペプチドは、プロテアーゼでの処
理により或いはリポコルチン様ポリペプチドをコードす
るDNA配列の断片の発現により、リポコルチン様ポリペ
プチドから誘導された生物学上活性なポリペプチド断片
をも包含する。さらに、本発明のポリペプチドは、本発
明のDNA配列におけるコドンの幾つかまたは全部につき
異なるコドンを特徴とするDNA配列により発現に際しコ
ードされるリポコルチン様ポリペプチドをも包含する。
これらの置換コドンは、置換されたコドンによりコード
されるものと同一のアミノ酸をコードすることもできる
が、高収量でポリペプチドを生成する。或いはアミノ酸
置換またはより長いもしくはより短いリポコルチン様ポ
リペプチドをもたらすコドンの１つの置換または組合せ
によって、その性質を有益に変化させることもできる
（たとえば安定性を増大させ、溶解性を増大させ、また
は治療活性を増大させる）。
本発明を一層よく理解しうるよう以下実施例を示す。こ
れらの実施例は単に例示の目的であって、本発明の範囲
を決して限定するものと解釈すべきでない。
実施例 A.ラットのホスホリパーゼA2阻止蛋白の精製 雄ウイスター種のラット（200〜250kg）に、0.9％NaCl
におけるグルココルチコイド，デキサメタゾン燐酸（1.
25mg/kgラット）0.1mlを皮下注射して、ホスホリパーゼ
A2阻止蛋白の産生を誘発させた。次いで、これらのラッ
トを注射してから１時間後にユーサセートの心臓内注射
によって殺し、かつ腹腔を10mlの燐酸緩衝塩水（50mM K
H2PO4（pH7.3）、ZU/mlのヘパリンを含有する150mMのNa
Cl、および50μＭのフェニルメチルスルホニルフルオラ
イド）で洗浄した。最高速度30分のインターナショナル
遠心分離器での遠心分離により細胞およびその他の粒状
物質の洗浄液を清澄させた後、上澄液を合してリポコル
チンにつき分析し、その際この上澄液と豚膵臓ホスホリ
パーゼA2の存在下におけるオートクレーブ処理されたイ
ー・コリ膜からの標識オレイン酸の放出抑制を測定し
た。
これを次のようにインビトロ分析にかけた：腹腔内滲出
上澄液からの試料200μｌを1.5mlのエッペンドルフ管に
おいて50μｌの0.7Mトリス−HCl（pH8.0）、60mM CaCl2
緩衝液と氷上にて混合した。次いで、50μｌの希釈豚膵
臓ホスホリパーゼA2（カタログNo.P9139、シグマ・ケミ
カルス社）を添加しかつ混合し、そしてこの溶液を氷上
で１時間培養した。2.5mg/mlの牛血清アルブミン（BS
A）を含有する緩衝液（70mMトリス−HCl（pH8.0）、6mM
CaCl2）中へのホスホリパーゼA2懸濁物の希釈は、ホス
ホリパーゼとBSAとの最終濃度がそれぞれ100μg/50μｌ
および125μg/50μｌとなるように行った。次いで、基
質としてのオートクレーブ処理したH3−オレイン酸標識
イー・コリ25μｌを加え、かつ混合物を６℃で８分間培
養した（温度および培養時間は両者とも使用するイー・
コリの各バッチに応じて決定せねばならない）。
基質H3−オレイン酸標識イー・コリは次のように作成し
た：イー・コリの１晩培養物をトリプトン培地（１％バ
クトトリプトン、0.5％NaCl）中で増殖させ、これを新
たなブロスで1:20に希釈し、かつクレット計で菌体増殖
を監視した。読みが40になった際（すなわち、細胞が良
好に増殖している際）、ブリイジ35（ポリエチレン−23
−エーテル、シグマ・ケミカルス社、水中の10％溶液）
の1:100希釈物およびH3−オレイン酸（9,10-H3‐〔Ｎ〕
−オレイン酸、ニュー・イングランド・ヌクレア社）の
1:200希釈物を10mCi/mlにて添加した。５時間後、細胞
増殖が停止した際、懸濁物を120℃にて20分間オートク
レーブ処理し、かつフラスコを４℃にて１晩保存した。
次いで、SS34ロータにて４℃で16,000rpmの速度で30分
間遠心分離することによりバクテリヤをペレット化さ
せ、かつ遊離したペレットを１本のチューブにまとめ
た。バクテリヤを４回或いは上澄液におけるカウント数
が低くなるまで懸濁緩衝液（0.7Mトリス−HCl（pH8.
0）、10mM CaCl2）＋0.1％BSAで洗浄した。このバクテ
リヤを、0.2％窒化ナトリウムを含有する懸濁緩衝液中
で４℃にて貯蔵した。典型的には、20mCiのH3−オレイ
ン酸で標識した培養物400mlを作成した。これにより標
識バクテリヤにおける約７×108cpm、すなわち約10％の
投入カウント数が得られた。分析の各時点において、10
0,000cpmを使用し、これを25μｌの容積で加えた。使用
する直前にその１部を先ず200mMトリス−HCl（pH8.
0）、12mM EDTA（氷上に30分間放置）で洗浄し、次いで
25mMトリス−HCl（pH8.0）で洗浄した。
基質（オートクレーブ処理した標識イー・コリ）を阻止
剤およびホスホリパーゼA2と共に短時間培養した後、反
応を100μｌの2N塩酸を各チューブに添加し、次いで100
μｌの20mg/mlの脱脂BSA（99％アルビミン、シグマ・ケ
ミカルス社）を添加して直ちに停止させた。チューブを
振とうしかつ氷上で30分間培養した。この手順は、特定
の膜からリパーゼ切断した生成物を抽出するのに重要で
ある。
次いで、イー・コリをエッペンドルフ遠心分離器におい
て10,000gで５分間ペレット化させ、水溶液に適合した
シンチレーションカクテル4mlにおいて各上澄液250μｌ
を計数した。この分析において、試料＋イー・コリ基質
を添加ホスホリパーゼの存在下および不存在下で培養し
た内部比較を用いて反復試験した。このインビトロ分析
は、腹腔内滲出液がホスホリパーゼ阻止活性を有するこ
とを示した。
上記腹腔内滲出上澄液からリポコルチンを精製するた
め、先ず最初にこの上澄液ヘプロテアーゼ阻止剤を添加
した。これらは典型的にはアプロチニン（20μg/ml）と
大豆トリプシン抑制剤（20μg/ml）とEGTA（エチレング
リコール−ビス−（アミノエチルエーテル）−N,N′−
テトラ酢酸）（0.5mM）を含んだ。滲出液を37℃にて0.1
U/ml牛腸内アルカリホスファターゼの存在下で１時間培
養し、かつこれをアミコン装置（PM10膜）により最終蛋
白濃度5mg/mlまで限外瀘過により２倍濃縮した。次い
で、上澄液を20mMトリス−HCl（pH8.1）の40容量に対し
４℃にて１晩透析し、かつDE52イオン交換カラムクロマ
トグラフィー（ワットマン社、カラム寸法：直径1cm×1
7cm）にかけた。使用前にDE52樹脂を25mMトリス−HCl
（pH8.1）で平衡化させた。流過したフラクションを集
め、これらをアミコン限外瀘過装置（PM10膜）によりさ
らに25倍濃縮した。次いで、この濃縮物を25mMトリス−
HClにおけるゲル瀘過カラム（P150樹脂）（カラム寸
法：直径2.5cm×40cm）にかけ、このカラムフラクショ
ンを蛋白につき監視し、その際280nmにおける吸光値と
上記のホスホリパーゼ阻止活性分析とを用いた。35〜4
0,000分子量におけるピーク活性を検出した。
これらの高活性フラクションを凍結乾燥し、0.2％SDSを
含有する25mMのトリス−HCl（pH6.8）で透析し、かつ調
製用SDS−ポリアクリルアミドゲル（主ゲル:15％アクリ
ルアミド、0.08％メチレンビスアクリルアミド；積層ゲ
ル:7.6％アクリルアミド、0.21％メチレンビスアクリル
アミド）を用いて分析した。このゲル分析は４つの主た
る蛋白帯を与えた。ウエスタン・ブロット技術の変法
〔H.トウビン等、「ポリアクリルアミドゲルからニトロ
セルロース紙への蛋白の電気泳動」、プロシーディング
・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第76
巻、第4350-4354頁（1979）〕にしたがい西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ抗体の結合物を用いて免疫反応物質を可
視化させ、これら４種の主たるバンドの１個のみが蛇静
脈リポコルチンに対し作成した中和抗体と交差反応する
ことを突き止めた。したがって、このゲルの領域を切除
し、電気溶出させかつ含有される蛋白を20％トリクロル
酢酸で沈澱させ、そして蛋白を10,000gでの20分間の遠
心分離によってペレット化させた。ペレットを5mlの−2
0℃アセトンで２回洗浄した後（各洗浄に続いて遠心分
離工程を行った）、ペレットを減圧下で乾燥させた。
次いで、蛋白を臭化シアノゲンまたはトリプシンのいず
れかで切断した。臭化シアノゲン切断を用いる場合、約
100μｇの蛋白を含有するペレットを200mg/mlの臭化シ
アノゲンにより暗所中で0.5mlの70％蟻酸の存在下に25
℃にて16時間切断した。次いで、反応混合物を水で15倍
希釈し、かつこれを凍結乾燥した。トリプシン切断を用
いる場合は、先ずペレットを0.1MのNH3HCO3と0.1mM CaC
l2に再懸濁し、この混合物をイオド酢酸でカルボキシメ
チル化し、次いでトリプシンと共に37℃にて24時間培養
した。この培養期間中、トリプシンを０時点にて全蛋白
の最終濃度1.5％になるまで、４時間後に2.5％かつ19時
間後に3.5％になるまで３回添加した。
これらの切断断片を高圧液体クロマトグラフィーによっ
て前記切断物から分離し、その際臭化シアノゲン切断生
成物についてはC8カラム（ブラウンリーRP-3）を使用
し、またトリプシン切断生成物についてはC18カラム
（スペクトラフィジックス社）を用い、いずれの場合に
も0.1％トリフルオロ酢酸における０〜75％のアセトン
トリルの濃度勾配を用いて結合断片を溶出させた。次い
でピークフラクションを、気相配列決定装置（アプライ
ド・ビオシステムス社、470A）を用いて配列分析にかけ
た。PIPH−アミノ酸を、５μｍシアノカラム（ハイパー
シル）にて高圧液体クロマトグラフィーにより分離し、
その際0.02M酢酸ナトリウム（pH5.7）における15〜55％
のアセトニトリル対メタノール（4:1）の濃度勾配を使
用した。
図１は、精製したラットリポコルチンの臭化シアノゲン
切断により精製された断片のアミノ酸配列を示してい
る。６個の主たるピークのうち３個のみが独特の配列を
与えた（CNBr1,2および３）。これらの配列を図１の下
に示す。残余のピークのうち２個（CNBr5および６）は
断片の混合物を含有し、したがって配列決定することが
できず、またピーク４は人工カラムであって、これから
は蛋白が検出されなかった。
図２はトリプシン切断からの断片のアミノ酸配列を示し
ている。トリプシン切断は40個以上のピークを与えた
が、そのうち９個のフラクションのみのアミノ酸配列を
図２に示す。ピークが２種以上のペプチドを含有する場
合、適当なフラクションを第２のクロマトグラフ工程に
かけた。T22aおよびT22bは、ピーク22の２種の成分から
得られた配列であり、これらを分離させ、その際ピーク
22を同じカラムであるが中性pHにて再クロマトグラフに
かけた。
B.リポコルチン蛋白配列のためのオリゴヌクレオチドDN
A試料の合成 ラットリポコルチンの各種領域におけるアミノ酸配列を
決定した後（図１および図２参照）、これら蛋白配列の
幾つかをコードする対応オリゴヌクレオチドDNA試料の
４種の保存物を化学合成した（図３参照）。図３に示し
た４種の保存物を合成するよう決断した理由は、これら
が最小の核酸縮重を有するラットリポコルチンの領域に
対応するからである。各アミノ酸配列につき、全ての可
能なコドンに相補的な試料の混合物を合成した。さら
に、試料がアミノ酸配列をコードするDNA配列に相補的
となるよう（すなわち試料が対応するよう）合成して、
これらの試料によりmRNA並びにDNAにおける対応の配列
を識別しうるようにした。ラットリポコルチンの４種の
選択領域におけるアミノ酸配列は、並びにこれらをコー
ドする全ての可能なヌクレオチドコドン組合せを図３に
示す。コード化縮重は次のように示される:N＝C,T,Aも
しくはG;R＝ＡもしくはG;Y＝ＣもしくはT;かつＨ＝A,C
もしくはＴ。
図２のトリプシン切断断片T22aおよびT24における配列
から得られた２種の試料の保存物は、それぞれ48および
256倍の縮合を有する20量体である。他の２種の試料保
存物は、それぞれ64および128倍の縮重を有する17量体
である。これら試料においてさらに縮重を低下させるた
め、各保存物をサブ保存物に作成し、たとえばT22aの48
倍縮重20量体を16の３種のサブ保存物に作成しかつ他の
試料を４種のサブ保存物に合成した。各保存物における
試料を、〔γ〕‐P32‐ATPおよびT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼによってP32で末端標識した。
これらの合成試料が実際にヒト配列を識別するかどうか
を試験するため、T24の４種のサブ保存物をヒト大食細
胞ラインU937からのポリ(A)+mRNAを含有する遺伝子スク
リーンフィルタにハイブリッド化させ、前記細胞ライン
U937はノーザンブロット技術により10-7MのPMA〔４β−
ホルボール12βミリステート13α−アセテート〕および
10-5のデキサメタゾンで誘発させたものである〔H.レー
ラッハ等、バイオケミストリー、第10巻、第4743-4751
頁（1971）〕。T24のサブ保存物２および３はmRNAにハ
イブリッド化し、これらは自動放射線分析に際し1800塩
基対帯として検出された。
C.ヒトcDNA保存物の作成およびスクリーニング ヒト大食細胞ラインU937から分離したポリ(A)+mRNAより
ヒトcDNA保存物を作成した。このcDNA配列をλgt10中へ
挿入し、かつイー・コリC600hfl細胞で増殖させた。
1.ヒトU937細胞からのRNAの抽出 ヒト大食細胞U937細胞をデキサメタゾン(10-5M)および
ホルボールエステル(10-7M)と一緒に培養して誘発さ
せ、かつ1.2×109個の細胞を含有するペレットを48mlの
溶解緩衝液（0.2Mトリス−HCl（pH8.0）、0.1M LiCl、2
5mM EDTA、１％SDS）＋5mMバナジル錯体（ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリース社）中へ回動により再懸濁させ
た。24mlのフェノールを添加しかつ５分間回動して細胞
を溶解させた。溶解混合物に24mlのクロロホルムを添加
し、次いで10分間振とうした。臨床用遠心分離器で室温
にて10分間遠心分離することにより、有機相と水相とを
分離した。水相をフェノール対クロロホルム（1:1）で
２回再抽出し、次いでクロロホルムだけで２回抽出し
た。次いで、0.3M酢酸ナトリウム中にて−20℃で核酸を
１晩エタノール沈澱させ、そして核酸をソルバールRC2B
型遠心分離器（SS34ロータ）により14Krpmで４℃にて20
分間ペースト化させた。これらペレットを5mlの0.3M酢
酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、かつ核酸を再び上記と
同様にエタノール沈澱させた。最終ペレットを300μｌ
のH2O中に再懸濁し、かつこれを−20℃で保存した。こ
のRNA調製物を、オリゴ（dT）セルロースカラム（PLバ
イオケミカルス社）に通してポリ(A)+RNAにつき濃縮し
た。
2.U937cDNA−λgt10保存物の作成 cDNAの合成 上記のように分離した20μｇのポリ(A)+mRNAからcDNAを
合成した。ポリ(A)+mRNAをH2O中で500μg/mlまで希釈
し、65℃まで３分間加熱し、ドライアイス−プロパノー
ル浴中で急速冷却し、次いでこれを解凍させた。次い
で、RNAを0.1Mトリス−HCl（pH8.3、42℃）と0.01M MgC
l2と0.01M DTTと1mM dCTPと1mM dGTPと1mM dTTPと0.5mM
dATPと100μCi α−P32‐ATP（3000Ci/ミリモル、ア
メルシャム社もしくはニュー・イングランド・ヌクレア
社）と20μｇオリゴ(dT)12-18（PL−バイオケミカルス
社）と0.03M β−メルカプトエタノールと5mMバナジル
リボヌクレオシド錯体（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リース社）と169U AMV逆転写酵素（生化学・アメリカ
社）とで構成された反応混合物に加えた。反応混合物の
最終容積を200μｌにした。この混合物を室温で２分間
かつ44℃で６時間培養した。反応を1/10容積の0.5M Na2
EDTA（pH8.0）の添加によって停止させた。
この反応混合物を0.15M NaOHに調整し、かつ混合物を37
℃にて12時間培養し、次いで1/10容積の1Mトリス−HCl
（pH8.0）およびHClで中和した。これをフェノール対ク
ロロホルム飽和したTE緩衝液（10mMトリス−HCl（pH7.
0）および1mM Na2EDTA）で抽出した。水相を0.01M（pH
7.4）、0.4M NaCl、0.01M Na2EDTA、0.05％SDS中にセフ
ァデックスG150の７×25cm床を含有する5mlの無菌プラ
スチックピペットによってクロマトグラフにかけた。末
端を含まない先端ピークを集め、cDNAを2.5容積の95％
エタノールで−20℃にて沈澱させた。この反応は１μｇ
の一本鎖cDNAを与えた。
二重鎖の合成 一本鎖cDNAを200μｌ（最終容量）の0.1Mヘペス（pH6.
9）、0.01M MgCl2、0.0025M DTT、0.07M KCl、1mM dXTP
および75Uクレノー断片DNAポリメラーゼ１（ベーリンガ
ーマンハイム社）に再懸濁させ、かつ反応混合物を14℃
にて21時間培養した。Na2EDTA（pH8.0）を0.0125Mまで
添加して反応を停止させ、フェノール：クロロホルムで
最初のcDNA工程におけると同様に抽出し、水相を0.01M
トリス−HCl（pH7.4）、0.1M NaCl、0.01M Na2EDTA、0.
05％SDSにてG150カラムでクロマトグラフにかけた。再
び、末端を含まない放射性ピークを集め、DNAをエタノ
ール沈澱させた。
次いで、42U逆転写酸素で得られたDNAを50μｌの0.1Mト
リス−HCl（pH8.3）、0.01M MgCl2、0.01M DTT、0.1M K
Cl、1mM dXTP、0.03M β−メルカプトエタノールにて3
7℃で１時間培養して、二重鎖の合成を完結させた。反
応を停止させ、かつ上記と同様に処理した。
二重鎖合成の際に形成されたヘアピンループを次のよう
に切断した：ペレットを50μｌの0.03M酢酸ナトリウム
（pH4.5）、0.3M NaCl、0.003M ZnCl2に再溶解させ、か
つこれを100UのS1ヌクレアーゼ（シグマ社）により室温
で30分処理した。EDTAの添加によって反応を停止させ、
上記と同様に処理した。S1処理後の収量は900ngのdsDNA
であった。
S1ヌクレアーゼ切断の後に平滑末端を確保するため、DN
Aを0.01Mトリス−HCl（pH7.4）、0.01M MgCl2、1mM DT
T、0.05M NaCl、80μM dXTPおよび60μｌの12.5Uクレノ
ーにて14℃で90分間処理し、50:50のフェノール対クロ
ロホルムで抽出し、かつDNAを0.01Mトリス−HCl（pH7.
4）、0.1M NaCl、0.01M EDTA、0.05％SDSにてG50スピン
カラム（1ml注射器）でクロマトグラフにかけた。
次いで、dsDNAをメチル化し、その際DNAを最終容積30μ
ｌの0.1Mトリス−HCl（pH8.0）、0.01M Na2EDTA、24μg
BSA、0.005M DTT、30μM S−アデノシルメチオニンお
よび5UEcoRIメチラーゼにより37℃で20分間処理した。
反応物を70℃まで10分間加熱し、冷却し、50:50のフェ
ノール対クロロホルムで抽出し、かつ上記と同様にG50
スピンカラムでクロマトグラフにかけた。
900ngのcDNAを次の条件により燐酸化EcoRIリンカ（ニュ
ー・イングランド・ビオラブス社）に結合させた:0.05M
トリス−HCl（pH7.8）、0.01M MgCl2、0.02M DTT、1mM
ATP、50μg/ml BSA、0.5μｇリンカ、300U T4 DNAリガ
ーゼ、最終容積7.5μｌ、14℃にて32時間。
反応物を0.1Mトリス−HCl（pH7.5）、0.05M NaCl、5mM
MgCl2、100μg/ml BSA、125UEcoRI（ニュー・イングラ
ンド・ビオラブス社）に調整し、混合物を37℃にて２時
間培養し、50:50のフェノール対クロロホルムで抽出
し、かつこのDNAを上記と同様にG50スピンカラムでクロ
マトグラフにかけた。
cDNAを100μｌの0.01Mトリス−HCl（pH7.5）、0.1M NaC
l、1mM EDTAに再溶解し、かつ同じ緩衝液で激しく洗浄
した（結果阻止剤を除去するため）１×50cmのビオゲル
A50（ビオラド社）カラムにてクロマトグラフにかけ
た。フラクションの１部をTBE緩衝液（0.089Mトリス−H
Cl、0.089M硼酸及び2.5mM Na2 EDTA）における１％アガ
ロースゲルで処理し、乾燥させかつ−70℃に１晩露出し
た。500塩基対より大きいフラクションを全て集め、DNA
をエタノール沈澱させて、EcoRI切断されたλgt10クロ
ーン化ベクター中へクローン化させた。寸法分画カラム
により126ngのcDNAを得、その平均寸法は約1500bpであ
った。
保存物の作成 ５μｇのEcoRI切断したλgt10を20ngのcDNAおよびT4DNA
リガーゼ緩衝液と共に42℃にて15分間培養してcas部位
を融合させ、次いでエッペンドルフ遠心分離器で５秒間
遠心分離しかつATPを1mMまで添加すると共に、2400U T4
DNAリガーゼ（ニュー・イングランド・ビオラブス社）
を最終容積50μｌまで加えた〔ヒュン・ヤングおよびデ
ービス、「λgt10およびλgt11におけるcDNA保存物の作
成およびスクリーニング」、DNAクローニング：実際的
方法（D.グローバー編集）。IRLプレス社（オックスフ
ォード1984）〕。結合物を14℃にて１晩培養した。λgt
10cDNA結合混合物をアメルシャムパッケージ混合物〔ア
メルシャム・パッケージング・プロトコール〕を用いて
ファージ粒子中へ挿入し、かつ0.5mlのSM緩衝液（100mM
NaCl、10mM MgSO4、50mMトリス−HCl（pH7.5）および
0.01％ゼラチン）で希釈した。
次いで、イー・コリC600hfl細胞にこれらのファージ粒
子を感染させて１×107の独立した組換体のcDNA保存物
を作成した〔T.マニアチス等、モレキュラ・クローニン
グ、第235頁（コールド・スプリング・ハーバー198
2）〕。
保存物を移植しかつ増殖させるため、1mlの細胞および2
50μｌのパッケージ混合物を室温で15分間培養し、LB＋
MgSO4トップアガロースで50℃にて50mlまで希釈し、か
つLB Mg Nuncプレートに移植した。これは２×105プレ
ートのプラーク密度を示した。これらのプレートを、プ
ラークがほぼ接触するまで37℃にて約８時間培養した。
これらプレートに50mlの冷SM緩衝液（0.01Mトリス−HCl
（pH7.5）、0.01M MgCl2、0.1mM Na2EDTA）を満たし、
かつジャイロ・ロータリー振とう機にて４℃で１晩溶出
させた。溶出液を250ml瓶に集め、ソルバールGSA型ロー
タにて6Kで10分間遠心分離した。上澄液を同容積の冷20
％PEG4000-2M NaClにて氷中で３時間処理し、かつこれ
らファージをRC-3Bソルバール型遠心分離器にてH4000ロ
ータで4Kにて30分間遠心分離することによりペレット化
させた。ファージペレットを充分に排液し、60mlSM中に
再懸濁させかつSS34ロータで10,000rpmにて遠心分離す
ることにより残骸を除去した。上澄液をこの上澄液10ml
に7gのCsClを添加して3.5M CsClに調整した。70.1ベッ
クマン型ロータで50,000rpmにて15℃で18時間遠心分離
することによりファージ帯を得た。これらのファージ帯
を集めかつ４℃にて保存物として蓄えた。得られたタイ
ターは2.2×1013PFU/mlであった。
保存物のスクリーニング 標識したオリゴヌクレオチド試料（すなわち保存物２お
よび３）を用いてリポコルチン配列につき保存物をスク
リーニングし、その際ウーのプラークハイブリッド化ス
クリーニング技術を用いた〔S.L.C.ウー、「組換ファー
ジスクリーニングのための敏感かつ迅速な方法」、メソ
ッズ・イン・エンチモロジー、第68巻、第389-396頁
（アカデミック・プレス社1979）〕。
Ｌブロスおよび0.2％マルトースにおけるC600hfl細胞の
１晩培養物をペレット化し、かつ同容積のSM緩衝液に再
懸濁した。0.9mlの細胞に２×105ファージ粒子を室温に
て15分間予備吸着させた。懸濁液をLB＋10mM MgSO4およ
び0.7％アガロースにて55℃で50mlまで希釈し、これをL
B Mg Nuncプレートに移植した。この種のプレート10枚
をスクリーニングした。これらプレートを、プラークが
ほぼ接触するまで37℃にて約８時間培養した。次いで、
プレートを４℃にて１時間冷却してアガロースを硬化さ
せた。遺伝子スクリーン＋フィルタをイー・コリC600hf
lの１晩培養細胞の1:10希釈物に室温で10分間予備浸漬
して、イー・コリ菌体の表層により各フィルタを覆っ
た。次いで、プラーク保存物プレートからのλファージ
粒子をこれらのバクテリヤ被覆したフィルタへ次のよう
に移した： フィルタを組換プラークを有するプレート上へ５分間載
置し、次いで持上げかつこれらフィルタをLB＋10mM MgS
O4で直立させたプラーク含有のプレートと共に37℃にて
５時間培養した。
次いで、これらのフィルタを0.5N NaOHのプールに５分
間載せて溶菌し、次いで1Mトリス−HCl（pH7.0）で中和
し、1Mトリス−HCl（pH7.0）中に浸漬し、かつ菌体の残
骸を除去した。
これらフィルタを0.2％ポリビニル−ピロリドン（M.W.4
0,000）、0.2％フィコール（M.W.40,000）、0.2％牛血
清アルブミン、0.05Mトリス−HCl（pH7.5）、1M塩化ナ
トリウム、0.1％ピロ燐酸ナトリウム、１％SDS、10％硫
酸デキストリン（M.W.500,000）および変性鮭の精子DNA
（≧100μg/ml）においてオリゴヌクレオチド試料２お
よび３に対し業者の指示にしたがってハイブリッド化さ
せた（ニュー・イングランド・ヌクレア社によるプラー
クスクリーニング膜に対する指示）。自動放射線分析に
よってハイブリッド化λ−cDNA配列を検出した。
この技術により、20個の陽性プラークを釣上げかつ同じ
試料を用いて低密度で再スクリーニングした。
これらクローンのDNAを分離し、EcoRIで切断し、かつこ
れらをラットのリポコルチン試料の４種の保存物とハイ
ブリッド化し、その際サウザンブロット技術を用いた
〔E.M.サウザン、「ゲル電気泳動により分離したDNA断
片における特定配列の検出」、ジャーナル・モレキュラ
・バイオロジー、第98巻、第503-518頁（1975）〕。２
種のクローン、すなわちλ9-111およびλ4-211は、T24
試料だけでなくT22aおよびT29試料にもハイブリッド化
した挿入cDNAを含有した。
これらファージのDNAをEcoRIで制御し、かつcDNA挿入物
を分離した。クローン9-111をEcoRIで制限することによ
り1400塩基対の断片を得る一方、クローン4-211の制御
により３種のEcoRI断片、すなわち長さ1300,300および7
5塩基対を得た。これら断片の幾つかをプラスミドpUC13
中へサブクローン化して組換プラスミドpL9/20（9-11
1）、pL4/10大型（4-211,1300bp）およびpL4/10小型（4
-211,300bp）を得た。次いで、これらプラスミドをマキ
サム及びギルバートの方法によって配列決定した〔A.M.
マキサムおよびW.ギルバート、「DNAの新規な配列決定
方法」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・
サイエンス・USA、第74巻、第560-564頁（1977）〕。こ
の配列決定分析は、これらクローンが精製ラットリポコ
ルチンのアミノ酸配列に一致するが、殆どの５′配列が
欠失していると思われるヌクレオチド配列を含有するこ
とを示した。
pL9/20の480塩基対EcoRI‐BglII断片を試料として使用
することにより、U937/λgt10保存物を再スクリーニン
グした。陽性の72種を分離しかつ低密度で再スクリーニ
ングすることにより、部分的にプラークを精製した。こ
れら陽性物のそれぞれのDNAをHhaIで切断し、かつサウ
ザンブロット技術〔E.M.サウザン、上記〕により分析
し、その際試料として30オリゴヌクレオチド配列（リポ
16）を使用した。リポ16は、図４に示した配列の塩基対
81-111で始まる配列に相当する。これらクローンのうち
14種は陽性信号を示し、かつこれらをゲノム配列決定に
よりさらに分析し〔G.チャーチおよびW.ギルバート、プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス
・USA、第81巻、第1991頁（1984）〕、その際DNAをMspI
で切断すると共にリポ16を試料として使用した。７種の
クローンλL110,λL106,λL112,λLC,λLH,λLNおよび
λLDDがリポ16試料の配列に対し81塩基対の配列５′を
含んでいた。
これらのクローンは、363アミノ酸をコードしうる中断
してない開放読枠を有するcDNA配列を有する（図４参
照）。リポコルチンに対する開始ATGコドンは、図４の
ヌクレオチド52〜54に位置するATGであると思われる。
しかしながら、図４に示したクローンのDNA配列は、天
然リポコルチンのＮ−末端におけるアミノ酸をコードす
る１個もしくはそれ以上のコードを欠失していると思わ
れる。これらの潜在的な欠失コドンは、必要に応じ慣用
のハイブリッド化条件を用いてゲノムDNAおよびcDNAの
保存物からこれらのクローン、より好ましくはこれらク
ローンの５′末端の部分を試料として用いることにより
分離することができる。次いで、全長クローンを慣用の
結合技術およびリポコルチンコード化クローンを用いて
作成することができる。
図４のλLCはリポコルチン用の全長遺伝子を有すること
が確認された。λLCcDNAにおけるヌクレオチド52-54のA
TG（図４）が最初の読枠内のメチオニンコドンであり、
したがって開始メチオンであることを確認するため、プ
ライマ延長によってリポコルチンmRNAの５′配列を決定
した。λLCの配列10-37に同族の27オリゴヌクレオチド
（リポ18）をP32‐（γ）‐ATPで標識し、かつヒト胎盤
ポリ(A)+RNAにハイブリッド化させた。プライマとして
のこのオリゴヌクレオチドとAMV逆転写酵素とを用い
て、リポコルチンmRNAの殆どの５′末端における60塩基
対断片を転写した。この断片をゲル精製し、かつマキサ
ムおよびギルバートの配列決定技術（上記）によって配
列決定した。得られた配列は、λLCの配列１〜37に同族
の37塩基対を示すと共に、リポコルチンmRNAの５′末端
を示すさらに23個のヌクレオチドを示した。
mRNAが実際に22に示したプライマ延長よりも長く、しか
も５′末端と間違えるような逆転写酵素の強力な停止信
号となる可能性を排除するため、mRNAの正確な寸法を決
定した。λLCの配列94〜128に対し同族のオリゴヌクレ
オチド（リポ17）を、胎盤ポリ(A)+RNAにハイブリッド
化させかつRNAアーゼＨで切断した。RNAアーゼＨはRNA
をDNAとのハイブリッドにおいてのみ切断し、したがっ
て明確な切断部をmRNA中へリポ17がハイブリッド化した
部位に導入する。次いで、RNAを配列決定用ゲルで分離
し、遺伝子スクリーンでブロットし、かつP32標識した
リポ18で処理した。これによりリポコルチンmRNAの５′
末端の正確な寸法を決定することができ、これはプライ
マ延長により得られた寸法に一致した。
本発明のcDNA配列をさらに利用してヒトゲノムコスミド
もしくはファージ保存物をスクーニングし、ヒトリポコ
ルチン様ポリペプチドをコードするヒトゲノム配列を分
離することもできる。たとえば、プラスミドpL9/20のEc
oRI断片を用いて部分HaeIII‐AluIヒト肝臓保存物をス
クリーニングし（R.ローン等、「クローン化したヒトDN
Aの保存物からの結合δおよびβグロビン遺伝子の分離
および特性化」、セル、第15巻、第1157-1174頁（197
8））かつ陽性クローンを得た。これはNcoI‐PstI−切
断pKK233-2〔E.アマン等、「大腸菌におけるクローン化
遺伝子の制御発現に有用なハイブリッドTrp-Lacプロモ
ータ」、ジーン、第25巻、第167-178頁（1983）〕とBgl
II‐PstI並びにNciI‐BglII断片をpL9/20から用いる３
部分の結合により作成した（図５）（プラスミドpL9/2
0）。
これらのヒトcDNAおよびゲノム配列を使用して、当業界
で周知された技術により真核および原核宿主細胞を形質
転換させ、臨床的かつ産業的に有用な量でヒトリポコル
チン様ポリペプチドを産生させることができる。
さらに、本発明のcDNA配列は別のスライス物から得られ
る大型種類のmRNAに含有されることも了解すべきであ
る。この種のmRNAは、成熟蛋白の他にリポコルチンに対
する信号配列をコードする。
D.イー・コリにおけるリポコルチン蛋白の発現 プラスミドpKK233.LIP.1（これはリポコルチンコード化
領域の部分配列を有する）は、図４に示したpCU13のEco
RI部位に挿入されたλLCのcDNA挿入物におけるヌクレオ
チド67-1376のDNA配列を含有する。
この結合およびその後のイー・コリ菌株HB101 IQへの形
質転換によって得られた形質転換体を、Ｌブロスとアン
ピシリンとを含有するマイクロ測定穴部に入れて、１晩
増殖させた。次いで、１晩培養物をＬブロス寒天とアン
ピシリンとのプレートにおけるニトロセルロースフィル
タの上に４反復で複製させ、37℃にて約４時間培養し
た。次いで、これらニトロセルロースをIPTG（10μg/m
l）を含有するＬブロスプレートに移して0,30,60もしく
は120分間培養し、次いでリゾチーム−洗剤で処理し
て、コロニーを溶菌させ、かつ最後にラットのリポコル
チンに対して作成した交差反応血清を用いてウエスタン
ブロット分析を行った。さらに、これら形質転換体をプ
ラスミド制限地図によって分析した。全てのウエスタン
分析の陽性コロニーは、予想制限断片を有するプラスミ
ドを含有した。陽性コロニーからのイー・コリの調製物
をさらにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分析した。これら調製物をラットのリポコルチンに対す
る抗体を用いてウエスタンブロット分析することによ
り、分子量31,000の切断蛋白を検出した。
さらに、全長ヒトリポコルチンを産生させるためのイー
・コリにおける各種の発現ベクターを作成した。全ては
図４に示した配列において最初のメチオニンから出発す
る完全な構成である。上記の手順により、ラットのリポ
コルチンに対し作成した抗血清を用いて切断蛋白につき
発現を確認した。
たとえば、図６はプラスミドpLiptrc155A、すなわちプ
ラスミドpKK233-2から得られたtrc発現ベクターを示し
ている〔E.アマン等、上記〕。このpLiptrc155Aはハイ
ブリッドプロモータを有し、これはlacからの−10領域
とtrpからの−35領域とを有する。さらに、これは5S RN
A T1T2ターミネータとアンピシリン耐性を付与するβ−
ラクタマーゼ遺伝子とを含有する。
pLiptrc155Aは次のように作成した：プラスミドpKK233-
2をNcoIおよびHindIIIで制限して線状断片を得た。プラ
スミドpL9/20をHindIIIで部分切断し、次いでEcoRIで完
全切断し、次いで、1090断片をアガロースゲル電気泳動
によって分離した。次いで、これら２種の断片を完全切
断し、かつ開始ATGコドンを有するNcoI‐EcoRIリンカお
よびヒトリポコルチンcDNAにおけるEcoRI部位に対する
５個のアミノ酸５′をコードする配列の存在下で結合さ
せた。
次いで、得られたpLiptrc155A発現ベクターを用いてイ
ー・コリ菌株JA221およびW3110IQを形質転換させ、かつ
形質転換した菌株を1mM IPTGと35μg/mlアンピシリンと
を含有するLB培地中で４時間増殖させて発現を誘発させ
た。形質転換宿主細胞の粗製溶解物をSDSポリアクリル
アミドゲル分析にかけると、見掛け分子量37Kdの１個の
新たな蛋白帯を示した。pLiptrc155Aで形質転換されて
ない菌株或いはこのプラスミドで形質転換しているが蛋
白の産生につき制御された菌株からの比較抽出物は、こ
の37Kd蛋白を示さなかった。たとえば、JA221宿主をpLi
ptrc155Aで形質転換させると、37Kd蛋白が全蛋白のほぼ
２％になることが判明した。
ヒトリポコルチンを発現することをさらに証明するた
め、同じ溶解物をさらにラットのリポコルチンに対して
発生した抗体を用いてウエスタンブロット分析にかけ
た。37Kd蛋白のみがラットの蛋白に対する抗体に免疫反
応性を示した。さらに、ウエスタンブロット分析によ
り、U937細胞からの天然ヒトリポコルチン（抗ラット蛋
白抗体に対し免疫反応性により検出される）は、寸法に
おいて発現した37Kd蛋白とほぼ同じであり、ゲルの同じ
位置に帯を有することを示した。
最後に、発現した蛋白の少量をSDSポリアクリルアミド
ゲルから電気溶出させ、かつＮ−末端配列分析にかけ
た。得られたアミノ酸配列は、図４のλLCcDNAの予想ア
ミノ酸配列と一致した。
発現されたヒトリポコルチンは、上記実施例Ａで記載し
たインビトロの分析において外来性のホスホリパーゼA2
を阻止した。この阻止を、先ず粗製溶解物を用いかつ後
に発現蛋白の一層精製された調製物を用いて検出した。
フランス圧力セルで作成した粗製溶解物の可溶性フラク
ションをホスホリパーゼ阻止活性につき分析した際、下
記表１に示す結果が得られた。阻止活性は、プラスミド
pLiptrc155Aを含有するイー・コリ溶菌物には検出され
たが、このプラスミドを含有しないイー・コリからの溶
菌物には活性が検出されなかった。ゲル分析により決定
した際、これら２種の抽出物における唯一の差は阻止性
フラクションに37Kd蛋白が存在することであった。この
37Kd蛋白は溶菌物における全蛋白の１％未満であること
を突き止めた。さらに、音波処理した溶菌物を分析した
際、同じ結果が得られた。
阻止活性は可溶性の溶菌物に直接検出されたが、イー・
コリにおける37Kd蛋白の大部分は不溶性であり、したが
って菌体をフランスプレスで溶菌させた後に低速度遠心
分離により除去された。この不溶性蛋白をグアニジン塩
酸塩で粒状物質から抽出し、1M尿素に対し透析し、次い
で、ホスホリパーゼ阻止活性につき分析した。この分析
の結果を下記表２に示す。透析物は1ml当り約200Uの阻
止活性を有した（1Uは15ngのA2を阻止する）。この活性
が蛋白の結果であり、たとえば脂質のような抽出物中の
他の成分によるものでないことを確認するため、表２で
使用した溶菌物25μｌをトリプシンと共に培養した。下
記表３に示すように、阻止活性は極めてトリプシン感受
性であった。
表１ 粗製イー・コリ溶菌物におけるホスホリパーゼ阻
止活性 プラスミドpLiptrc155Aを含有するまたは含有しないイ
ー・コリのW3110IQ菌株の培養物をIPTGで誘発させ、か
つフランス加圧セルで溶菌させた。10,000gにて20分間
遠心分離することにより粒状物質を除去した。可溶性フ
ラクションをホスホリパーゼ阻止活性につき分析した。
示した数値は、50μｌの抽出物を豚膵臓ホスホリパーゼ
A2の100ngによって分析した数回の分析の平均値であ
る。
試 料 阻止％ A2のみ ０ A2＋イー・コリ，プラスミドなし ０ A2＋イー・コリ，trcプラスミドを含有 24 表２ 部分精製した阻止剤の投与量反応曲線 pLiptrc155Aで形質転換させたJA221菌体から回収した不
溶性調製物（上記の溶菌処理を用いる）を25mM酢酸ナト
リウム（pH6.0）における6Mグアニジン塩酸塩に露出さ
せた。粒状物質を遠心分離（100,000g、１時間）によっ
て除去した。ヒト37Kd蛋白が極めて濃縮された抽出蛋白
を、25mM酢酸ナトリウム（pH6.0）において1M尿素に対
し透析し、次いでホスホリパーゼA2阻止活性につき分析
した。
分析した抽出物μｌ 阻止％ 0 ０ 3 12 10 26 30 58 表３ 阻止剤のトリプシン感受性 表２に示した部分精製調製物をトリプシンに対し室温で
15分間露出し、次いで100ngの豚膵臓ホスホリパーゼA2
を用いて分析した。使用した条件下において、トリプシ
ン処理はホスホリパーゼA2活性を変化させなかった。各
試料につき25μｌの阻止剤を分析した。
試 料 トリプシンμg/ml 阻止％ A2のみ 0 0 A2＋阻止剤 0 54 A2＋阻止剤 1 3 A2＋阻止剤 3 4 pLiptrc155Aの他に、本発明の他の高レベルの発現ベク
ターを作成した。たとえば、プラスミドpLipPLT4Aを次
のように作成した：プラスミドpPLT4HTNF〔ワルター・
ファイエルスからの寄贈物、このプラスミドは1984年12
月27日付けでDSM No.3175としてドイッチェ・ザンムル
ング・ホン・ミクロオルガニスメン・ゲッチンゲン、西
ドイツ国に寄託したプラスミドと同一であり、かつイー
・コリ菌株C600の範囲内で寄託され、pBR322-pL-T4-hTN
Fと命名された〕を制限酵素ClaIおよびHindIIIで切断し
て線状断片を得た。プラスミドpL9/20をHindIIIで部分
切断し、次いでEcoRIにより完全切断し、次いで1350bp
断片をアガロースゲルから分離した。これら２種の断片
を、開始ATGを含有するClaI‐EcoRIリンカおよびリポコ
ルチンcDNAにおけるEcoRI部位に対する５個のアミノ酸
５′をコードする配列の存在下で結合させた。得られた
発現ベクターにおいて、PLプロモータはPL,T4およびリ
ポコルチンmRNAの配列を含むハイブリッドmRNAの転写を
指示する。このmRNAの翻訳はヒトリポコルチンコード化
配列の最初のATGから始まり、37Kd蛋白を生ずる。第２
のテトラサイクリン耐性のプラスミドpLipPLT4を作成
し、その際pBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子をpLip
PLT4AのScaI部位に挿入した。
イー・コリ菌株MC1061およびC600pCi857をpLipTLT4Aで
形質転換させ、かつSDSポリアクリルアミド電気泳動お
よびウエスタンブロット分析によって上記と同様に発現
を決定した。イー・コリ抽出物は、ラットのリポコルチ
ンに対する抗体と反応する37Kd蛋白を示した。
E.酵母におけるヒトリポコルチン蛋白の発現 更に、酵母においてヒトリポコルチンを産生させるため
の発現ベクターを作成した。図７〜９はpBg120の作成を
示し、これは酵母菌体を形質転換させるために使用する
と、抗ラットリポコルチン抗体を用いるウエスタンブロ
ット分析により検出されるようにヒトリポコルチンを発
現する。
pBg120は次のように作成した： プラスミドpLXV-1はイー・コリプラスミドpBR322および
酵母プラスミド２μDNAからのDNA複製のオリジンを含有
する。したがって、これはイー・コリおよび酵母の両者
で複製することができる（J.アーンスト、私的通信）。
プラスミドpLXV-1からBamHI部位を除去し、その際BamHI
で切断し、S1ヌクレアーゼにより37℃にて30分間処理
し、かつT4DNAリガーゼによって再環化させた（図
７）。イー・コリJA221を結合混合物で形質転換させ、
かつプラスミドpLXV-1-BamHI-で分離した。
活性遺伝子のATG開始コドンをpLXV-1で再編成するた
め、pLXV-1-BamHI-をEcoRIおよびHindIIIで切断した。
活性プロモータを有する大きい方の断片を分離した。こ
の断片をBamHI末端およびHindIIIリンカと２個の合成リ
ンカ（リンカ９および10）とを有するヒトα１抗トリプ
シン遺伝子を含有するDNA断片と結合させた。BamHIおよ
びHindIII制限部位をプラスミド中へ挿入するにはα１
抗トリプシンDNA断片のみを使用した。α１抗トリプシ
ンをコードする２個の制限部位間におけるDNA配列を次
いで切除し、リポコルチンDNA配列で置換した。プラス
ミドにこの制限部位を与えるために使用した特定配列は
不適切であり、任意のDNA配列をα１抗トリプシンDNAの
代わりに使用することができるであろう。リンカ９は２
種の配列AATTAACAATGGAAおよびAATTAACCATGGAGの混合物
であり、リンカ10はGATCCTCCATGGTTおよびGATCTTCCATTG
TTの混合物である。リンカ９および10の両者はEcoRIお
よびBamHI付着性末端を有し、リンカ９はNcoI制限部位
とATG開始コドンとを有する。この結合は、EcoRIおよび
BamHI制限部位の喪失をもたらした。イー・コリJA221を
この結合混合物で形質転換させ、かつアンピシリン耐性
およびカナマイシン耐性につき選別して、KamR遺伝子内
に位置するHindIII部位の再生を確保した。得られたプ
ラスミドをpAPNと呼ぶ。
図８は酵母発現ベクター中へのヒトリポコルチンをコー
ドするDNA配列の挿入を示している。ヒトリポコルチン
配列を２つの部分にクローン化した。第１に、Ｎ末端領
域を酵母アクチン発現制御配列の背後に挿入して作用結
合させた。プラスミドpTrp321（R.デボス等、「ヒトイ
ンタロイキン2cDNAの分子クローン化およびイー・コリ
におけるその発現」、ヌクレイック・アシッド・リサー
チ、第II巻、第4307-4323頁（1983））をClaIおよびHin
dIIIで切断し、大きい方の断片を作成したpL9/20 1090
−リンカ断片に結合させた（上記、第34頁）。
上記のようにヒトリポコルチンの発現につきスクリーニ
ングしてプラスミドpTrplipを分離した。
次いで、pAPNをNcoIで切断しかつ酵母アクチン発現制御
配列を有する小さい方の断片を分離した。この断片を、
NcoIで線状化したpTrp-lipに結合させた。このプラスミ
ドをptrp-lip-apn-ncoと呼ぶ。ptrp-lip-apn-ncoをHind
IIIで切断し、酵母アクチン発現制御配列とヒトリポコ
ルチンのＮ末端領域に対応するDNA配列とを有する断片
を分離した。この断片をpAPNの大きい方のHindIII断片
に結合させ、プラスミドpBg114を作成した。
ヒトリポコルチンの残余のＣ−末端断片に対応するDNA
配列をpL9/20の800bp BglII‐BamHI断片から得た（上
記）、（図９）。pL9/20をBglIIおよびBamHIで切断し、
800bp断片を電気溶出させた。この断片を、BglIIで切断
されているpBg114に結合させた。アクチン発現制御配列
に作用結合したヒトリポコルチンをコードするDNA配列
を含むプラスミドpBg120を分離した。
pBg120で形質転換させた酵母の抽出物において、37Kd蛋
白を検出し、これは形質転換されていない酵母菌体或い
はヒトリポコルチン遺伝子を含有しないプラスミドで形
質転換させた酵母菌体には見られない。この蛋白は、SD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動においてイー・コ
リで産生されたヒト37Kd蛋白に正確に一致した（図1
0）。
酵母においてヒト37Kd蛋白は、可溶性蛋白として産生さ
れる。これは全菌体蛋白の約４％に相当する。組換蛋白
を含有する酵母培養物を20,000psiにてフランス加圧セ
ルで溶菌させ、かつ粒状物質を遠心分離（10,000g、10m
in）にて除去し、阻止活性の約80％が可溶性フラクショ
ン中に回収された。阻止活性の分布はSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル分析に基づくヒト蛋白の分布に正確に相関
する。酵母で産生された組換蛋白は、封鎖アミノ末端を
有する。
F.哺乳動物細胞におけるヒトリポコルチン蛋白の発現 さらに、哺乳動物宿主においてヒトリポコルチンを産生
させるため、発現ベクターを作成した。図11-13はpSVL9
109の作成を示し、これはCaPO4方法〔F.グラハム等、ジ
ャーナル・バイロロジー、第52巻、第455-456頁（197
3）〕によりcasおよびCHO宿主細胞中に移植すると、抗
ラットのリポコルチン抗体を用いるウエスタンブロット
分析により検出されるようにヒトリポコルチンを発現し
た。移植してない細胞では見られない37Kd免疫反応性蛋
白を検出し、このことはベクターがヒト阻止蛋白を産生
したことを示している。pSVL9109を次のように作成し
た： 図11に示したように、プラスミドpSV2gpt〔R.ムリガン
等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス・USA、第78巻、第2072-2076頁（1981）〕をPvuI
IおよびHindIIIで切断し、SV40の早期プロモータを含有
する340bp断片を分離し、これを予めEcoRIで切断したpA
T153に挿入し、S1処理し、次いでHindIIIで切断した。
得られたプラスミドpAT.SV2はプロモータを含有した。
次いで、このプラスミドをHindIIIおよびBamHIで切断し
た。この部位へ小型ｔスプライス部位を含有する配列を
クローン化した。この配列を他のプラスミドpTPA119か
ら分離し、その際HindIIIおよびBamHIで切断した。3Kb
挿入物はヒト組織プラスミノーゲン活性化剤をコードす
るDNA配列を小型ｔスプライス部位と共に含有した。こ
の配列は、1984年８月21日付けでATCC No.39808として
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロッ
クビル・メリーランド州に寄託したpTPA25 HindIII‐Ba
mHI断片に見られるものと同等である。HindIII‐BamHI
3Kb断片をpAT.SV2に結合してプラスミドpAT.SV2.TPAを
生成させた。このベクターはSV40早期プロモータに続い
てHindIII部位とSV40小型ｔスプライス信号とを有し、
その前にBglII部位を有する。
次いで、ヒトリポコルチン用のコード化配列をpAT.SV2.
TPAに挿入した。EcoRIおよびHindIII末端を有する29bp
のオリゴヌクレオチドを合成した（図12参照）。このオ
リゴヌクレオチドは、ヒトリポコルチンの最初の６個の
アミノ酸をコードする配列を含む。この配列をpUC9〔J.
ビィエイラ等、ジーン、第19巻、第259-268頁（198
2）〕にクローン化させ、このpUC9は予めEcoRIおよびHi
ndIIIで切断してpLPO900を生成させたものである。この
プラスミドをEcoRIで切断し、かつ牛アルカリホスファ
ターゼで処理した。次いで、ヒトリポコルチン用のコー
ド化領域に相当するpL9/20からの1.3Kb EcoRI断片をpLP
O900にクローン化した。得られたプラスミドpLPO905は
上流にHindIII部位を有するヒトリポコルチン用の全コ
ード化領域を有する（図12参照）。これは、遺伝子がpA
T.SV2.TPAのSV40プロモータ背後にクローン化するのに
適している。
図13は、ヒトリポコルチン用の遺伝子をpAT.SV2.TPA中
に挿入して本発明の哺乳動物発現ベクターを生成させる
ことを示している。ヒトリポコルチン配列を発現ベクタ
ー中に２つの部分でクローン化させた。先ず最初に、Ｎ
−末端領域をSV40プロモータの背後に挿入し、次いでＣ
−末端領域を加えた。このプラスミドpLPO905をHindIII
およびBglIIで切断し、かつヒトリポコルチンのＮ−末
端領域を有する560bp断片を分離した。pAT.SV2.TPAをHi
ndIIIおよびBglIIで切断し、かつベクターを含有する5K
b断片を分離し、これはTPA配列をもたなかった。このHi
ndIII‐BglIIベクター中へ、ヒトリポコルチンのＮ−末
端領域を有する560bpのHindIII‐BglII断片を挿入して
プラスミドpLPO908を得た。
ヒトリポコルチンのＣ−末端領域は、pL9/20の800bp Bg
lII‐BamHI断片の内部に見られる。したがって、pL9/20
をBglIIおよびBamHIで切断し、次いで800bp断片を電気
溶出させた。この断片を、予めBglIIで切断したプラス
ミドpLPO908中へ結合し、牛アルカリホスファターゼで
処理した。このプラスミドpSVL9109を分離した。このプ
ラスミドはSV40早期プロモータの下流に全ヒトリポコル
チンコード化配列を有し、それに続いてSV40の小型ｔス
プライス信号を有した。プラスミドpSVL9109を使用し
て、上記と同様にcasおよびCHO宿主を形質転換させた。
かくして、本発明のDNA配列を用い、ヒトリポコルチン
を生物学上活性な形態で発現する高レベルの発現ベクタ
ーを作成した。
ここに記載した方法で作成された組換DNA配列は、イン
ビトロ・インターナショナル・インコーポレーション、
アン・アーバー、ミシガンの培養物託機関に寄託した培
養物で例示される。この培養物は1985年１月９日付けで
寄託し、次のように同定されている。
λLC:IVI No.10042 ここに記載した方法で作成された微生物は、それぞれ19
85年３月12日および1985年８月14日付けで上記寄託機関
に寄託された培養物で例示され、次のように同定されて
いる： イー・コリW3110IQ（pLiptrc155A）:IVI No.10046 S.セレビシェ331-17A（pBg120）:IVI No.10088 G.生物学上活性なヒトリポコルチン様ポリペプチド断片
の産生 ホスホリパーゼ阻止活性を示し、分子量37,000のヒトリ
ポコルチンよりも小さいポリペプチド断片の産生が極め
て望ましい。それより小さいポリペプチドは、たとえば
静脈内注射でなく経皮灌流によって標的細胞へ容易に供
給される。さらに、小さいポリペプチドは37Kd蛋白より
も安定な構造を有する。たとえば、37Kd蛋白のＮ−末端
は疎水性アミノ酸の１群を有し、これは分子間凝集物を
形成させる一方、Ｃ−末端は適当でないジスルフィルド
結合を形成しうる４個のシルティンを有する（図４参
照）。したがって、大きい蛋白のＮ−末端およびＣ−末
端の除去は、蛋白を高濃度で産生させる際構造上の異質
性を防止することができる。さらに、生物学上活性な断
片の分離はリポコルチン分子の活性部位の特性化をより
良好にすると共に、最適な治療価値を有する断片の設計
を可能にする。
本発明のこの局面にしたがって親分子からポリペプチド
断片を生成させるために各種の方法を使用しうるが、こ
こではヒトリポコルチン様ポリペプチドを下記の実施例
にしたがって制限プロテアーゼ切断にかけるよう選択し
た。先ず最初に、各プロテアーゼにつき切断条件を最適
化して、発生する断片を一般に10個以内の少数となし、
したがって容易に単離することができる。最適条件は一
般に次の因子によって決定される：（１）使用するプロ
テアーゼの種類；（２）標的蛋白の物理状態、すなわち
変性もしくは非変性条件；（３）切断に要する時間；
（４）温度；（５）使用するプロテアーゼの量；および
（６）pH。
37Kdリポコルチン様ポリペプチドを切断するため、２種
の異なるプロテアーゼを使用した。第１の種類はペプチ
ド結合を非特異的に加水分解する。この種類は、エラス
ターゼおよびプロテナーゼ、Ｋプロテアーゼによって代
表される。プロテアーゼプラスミンおよびスロンビンで
代表される第２の種類は、特定のペプチド結合を加水分
解する。この第２の種類は、恐らくアミノ酸配列と切断
部位の周囲の構造の両者によって標的蛋白を識別する。
さらに、トリプシン、すなわち第３の種類のプロテアー
ゼを使用して、活性ペプチド断片のＣ−末端の位置決定
を行った（下記に説明）。トリプシンは特定のアミノ酸
におけるペプチド結合を加水分解する。この種の他のプ
ロテアーゼは、キモトリプシンおよびV8プロテアーゼを
包含する。生物学的活性を有する断片を得ることが望ま
しいため、非変性条件下で切断を行なった。
1.組換ヒトリポコルチンからのプラスミン切断断片の産
生分離および特性化 プラスミン切断のための条件を最適化させるため、イー
・コリ産生させたヒトリポコルチン様ポリペプチドの１
部（100μｇ）を100mlの0.2Mトリス−HCl（pH8.0）、5m
M EDTAと0.1mg牛血清アルブミン/mlの溶液で10μｌ（１
μg/μｌ）のプラスミン（カルビオヘム社）と共に室温
で培養した。異なる時間間隔で15μｌを抜取り、８％SD
Sを含有する緩衝液５μｌを添加し、次いでこれらの部
分を５分間煮沸することにより反応を停止させた。各時
点における切断混合物をSDS−ゲル電気泳動によって分
析した。図14に示した結果は、培養１時間後に、殆ど全
部の蛋白が分子量33,000の断片まで切断されたことを示
す。この33K断片は、より長時間の培養、或いは増加量
のプラスミンの存在下のいずれにおいても切断に対し耐
性であった。
上記の切断条件を用いて、500μｇのヒトリポコルチン
様ポリペプチドを75μｇのプラスミンと共に１時間培養
した。反応をプロテアーゼ阻止アプロチニン（シグマ
社）250KIUによって停止させた。切断試料を、0.2Mトリ
ス−HCl（pH7.5）、5mM EDTA、0.1％牛血清アルブミン
により４℃で平衡化させたバイオゲルP-60カムラ（1.0
×50cm）に装填した。1.1mlのフラクションを集めた。2
80nmにて監視した断片の溶出経過は２つの蛋白ピークを
示した（図15）。各ピークからのフラクションの１部を
高圧液体クロマトグラフィーおよびSDSゲル電気泳動に
よって分析した。これらの結果は、ピークＩが分子量3
3,000の断片を有し（リポ−Ｌと呼ぶ）、かつピークII
が分子量4,000の断片（リポ−Ｓと呼ぶ）を有すること
を示した。
バイオゲルP-60カラムクロマトグラフィーのフラクショ
ンをホスホリパーゼA2阻止活性につき上記と同様に分析
した。活性の大部分はピークＩに関連した（図15）。少
量の阻止活性がピークIIに検出されたが、この活性は断
片濃度に依存せず、恐らく膜に対する断片の非特異的結
合によって引起こされたものと思われる。
さらに、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって0.1
％トリフルオロ酢酸における０〜75％のアセトニトリル
の濃度勾配により２種の切断生成物を分離し、その際C4
カラムクロマトグラフィー（ビダック社）を用いた。リ
ポ−Ｓを38％アセトニトリルで溶出させ、かつリポ−Ｌ
を48％アセトニトリルで溶出させた。
気相配列決定装置（アプライド・バイオシステムス470
A）を用いて、順次のエドマン減成によりリポ−Ｌ（33
K;ピークＩ）のＮ−末端アミノ酸を決定した。PTH−ア
ミノ酸を５μｍのシアノカラム（ハイパーシル社）で高
圧液体クロマトグラフィーにより分析し、その際0.02M
酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.7）にて15〜55％のアセト
ニトリル対メタノール（4:1）の濃度勾配を用いた。リ
ポ−ＬのＮ−末端アミノ酸配列がH2N‐Gly-Gly-Pro-Gly
-Ser-Ala-Valであることを確認した。リポ−ＬのＮ−末
端グリシンは37K蛋白のGly-301に対応する。
断片のＣ−末端アミノ酸配列を決定するため、37Kラッ
トのリポコルチンのトリプシン分解ペプチド地図（図1
6）を、各断片につき作成したトリプシン分解ペプチド
地図と比較した。20μｌの37Kリポコルチン様ポリペプ
チド（40μｇ）を0.2Mトリス−HCl（pH8.0）、5mM EDT
A、0.1mg牛血清アルブミン/mlにて0.2mlの0.1M NH4HCO3
＋1mM CaCl2で希釈した。次いで、この混合物をトリプ
シンと共に37℃で24時間培養した。この培養期間中、ト
リプシンを３つの時点で加えた。すなわち、０時間に0.
5μｇ、４時間後に、0.25μｇかつ19時間後に0.25μ
ｇ。反応混合物へ90％蟻酸10μｌを添加して切断を停止
させた。同一の条件を用いてプラスミン断片を切断した
が、だたし先ず最初に高圧液体クロマトグラフィーから
精製した断片をスピードバック濃縮装置（サバント社）
で乾燥し、かつ残渣を0.1M NH4HCO3および1mM CaCl2中
に溶解させた。
トリプシン分解断片を逆相高圧液体クロマトグラフィー
によりC18カラム（スペクトラフィジックス社）にて0.1
％トリフルオロ酢酸中で０〜75％のアセトニトリルの濃
度勾配により解離させた。次いで、各ピークフラクショ
ンのアミノ酸配列を決定した。先ず最初に、6N HCl中で
ペプチドを24時間加水分解しかつベックマン6300アミノ
酸分析器にて組成を決定することにより、各ピークのア
ミノ酸組成を確認した。観察された組成を37Kポリペプ
チドからの全ての可能な断片の配列データに基づき予想
組成と比較し、各ピークを同定した。さらに、配列分析
によってピークの幾つかにおけるアミノ酸配列を直接に
決定した。
断片リポ−Ｌ（図17のＢ）の地図を37Kポリペプチド
（図16）の地図と比較することにより、生物学上活性な
リポ−Ｌ断片が37Kポリペプチドと同じＣ−末端アミノ
酸配列を有すると結論した。したがって、このデータは
Ｎ−末端配列データと組合せればリポ−Ｌが37Kポリペ
プチドのアミノ酸残基No.30〜No.346を含有することを
示す。断片リポ−Ｓ（図17のＡ）のペプチド地図を37K
ポリペプチドの地図と比較することにより、リポ−Ｓが
37K蛋白のアミノ酸残基No.1〜No.29を有すると結論され
た。
2.組換ヒトリポコルチンからのエラスターゼ切断断片の
産生、分離および特性化 50μｌの37Kヒトリポコルチン様ポリペプチド（75μ
ｇ）、0.2Mトリス−HCl（pH8.0）、5mM EDTA、0.1mg牛
血清アルブミン/mlを2.5μｇ（10mM酢酸アンモニウム中
１μg/μｌ、pH6.0）のエラスターゼ（シグマ社）で室
温にて処理した。切断生成物を異なる時間間隔で上記と
同様に分析して、エラスターゼ切断に対する条件を最適
化した。これらの結果は、20分間の培養が10K〜33Kの範
囲の分子量を有する断片を生成したことを示した。
150μｇの37Kポリペプチドを５μｇのエラスターゼと共
に上記したような最適条件下で培養し、切断したポリペ
プチドをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た〔D.A.ハガーおよびR.R.ブルゲス、アナリチカル・バ
イオケミストリー、第109巻、第76-86頁（1980）〕。こ
のゲルを0.25M KCl、2mM DTT中に４℃で５〜10分間浸漬
することにより、ポリペプチドのバンドを可視化させ
た。次いで、ポリペプチドのバンドを切除し、ゲルスラ
イス物からKClを除去し、その際各スライス物を2mM DTT
を含有する脱イオン化水中で室温にて10分間浸漬した。
これらの断片を次いで室温にてゲルから２時間溶出さ
せ、その際0.1％SDS、0.2Mトリス−HCl（pH7.5）、5mM
EDTA、5mM DTT、0.01％牛血清アルブミンの溶液を使用
した。次いで、断片を含有する溶液を氷冷したアセトン
の溶液と−70℃にて混合し、かつ−70℃にて30分間培養
した。10,000rpm（SS34ロータ）にて４℃で10分間遠心
分離することにより沈澱物を集め、氷冷した80％アセト
ンおよび0.2Mトリス−HCl（pH7.5）と5mM DTTとを含有
する20％緩衝液で１回洗浄した。遠心分離により沈澱物
を集め、これを減圧下で５〜30分間乾燥させた。次い
で、乾燥した粉末を0.2Mトリス−HCl（pH7.9）、2mM DT
T、5mM EDTA、0.1牛血清アルブミンにおける6Mグアニジ
ン塩酸塩に20分間で溶解させた。次いで、この溶液に
「再編成（renaturation）」緩衝液（20％グリセリンお
よび80％0.2Mトリス−HCl（pH7.9）、2mM DTT、5mM EDT
A、0.1％牛血清アルブミン）を加えた。次いで、この溶
液を４℃にて１晩静置させた。次いで、上記したように
ホスホリパーゼA2阻止活性につき分析した。SDS−ゲル
断片の活性を図18に示す。断片e-1,e-2,e-3,e-4およびe
-5はそれぞれ分子量33K,30K,27K,20Kおよび18Kを有し、
ホスホリパーゼA2阻止活性を示した。
次いで、調製用SDS−ゲル電気泳動によって主たる活性
断片（図18のe-1,e-4およびe-5）を精製した。ゲルを0.
25M HClに浸漬してポリペプチド帯を可視化させ、かつ
生物学上活性なポリペプチド帯を切除した。標準技術
〔M.W.ハンカピラー、E.ルヤン、F.オストラダーおよび
L.E.フード、メソッズ・エンチモロジー、第91巻、第22
7-236頁（1983）〕を用いて断片を電気溶出させた。
e-1,e-4およびe-5のＮ−末端およびＣ−末端アミノ酸配
列を決定した。精製した断片は全て同一のＮ−末端アミ
ノ酸配列を示した：H2N‐Gly-Gly-Pro-Gly-Ser-Ala-Val
-Ser-Pro-Tyr。このＮ−末端グリシンは37K蛋白のGly-3
0に対応する。
図19は、これらの精製断片のトリプシン分解ペプチド地
図を示している。これらの地図を37K蛋白の地図（図1
6）と比較し、18Kのe-5断片がトリプシン分解断片Ala-L
eu-Tyr-Glu-Ala-Gly-Glu-Arg（37K蛋白の残基No.205-21
2）を欠如しかつすべての断片がこのペプチドを越えて
いることが判明した。このことは、切断がこのペプチド
の前で生じたことを示唆している。ペプチド地図は断片
Asn-Ala-Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Lys（37K蛋白の残基No.1
78-185）を含有する。したがって、この断片のＣ−末端
は37K蛋白のLys-185とArg-212との間に位置する。同様
に、20Kのe-4断片のペプチド地図は、18K断片に見られ
るすべての断片とさらにペプチドAla-Leu-Tyr-Glu-Ala-
Gly-Glu-Arg-Arg-Lys（37K蛋白の残基No.205-214）とを
含有する。したがって、この断片のＣ−末端は37K蛋白
のLys-214とArg-228との間に存在する。33Kのe-1断片の
Ｃ−末端は、37K蛋白のLys-337とAsn-346との間に位置
する。
かくして、37Kリポコルチン様ポリペプチドにおける少
なくとも３種の生物学上活性なペプチド断片を分離し
た。これら３種の断片は全て、37KポリペプチドのGly30
で始まりかつ37K分子に沿って異なる点で終端する同一
のＮ−末端を有する。これら３種のものは、全て全寸法
のリポコルチン様ポリペプチドのホスホリパーゼA2阻止
活性を示す。
イー・コリで産生させたヒトリポコルチン様ポリペプチ
ドからポリペプチド断片を生成させるため上記方法を使
用したが、これらの分子は各種の他の方法によって生成
させうることが了解されよう。たとえば、この種の分子
は、ここで用いたものとは異なるプロテアーゼにより或
いはペプチド結合を切断しもしくは合成する薬剤によっ
て生成させることもできる。さらに、これらの分子は、
これらの断片をコードする切断DNA配列の発現によって
も生成させることができる。しかしながら、この方法は
各断片につき異なる精製手順を必要とし、かつしばしば
発現ベクター中で不安定なDNA配列を生ぜしめる。
H.組換DNA技術による生物学上活性なヒトリポコルチン
様ポリペプチド断片の生成 組換DNA技術によりリポコルチン様ポリペプチド断片を
発生させる方法は、リポコルチンをコードするDNA配列
中へ、DNA配列をポリペプチドとして発現する際にポリ
ペプチドを切断しうる（たとえば、化学的もしくは蛋白
分解的に）部位を生ぜしめるコドンを導入することであ
る。これらのコドンは、たとえば、誘発または挿入など
の当業界で知られた各種の技術によってDNA中へ導入す
ることができる。たとえば、変化したリポコルチン様ポ
リペプチドを宿主細胞により産生させ、未変化の全長ポ
リペプチドと同様に精製し、かつ切断して所望の断片を
生ぜしめる。この手法により本発明のリポコルチンDNA
配列を変化させて、インビトロにて切断した際ホスホリ
パーゼA2阻止活性を示すリポコルチン様ポリペプチド断
片を生成するような変化したポリペプチドを産生させ
た。
本発明の１具体例によれば、リポコルチンのDNA配列を
改変させてメチオニンコドンをこの配列中に導入するこ
とにより、変化したリポコルチン様ポリペプチドをコー
ドするDNA配列を作成した。宿主細胞にてこの配列を発
現させる際、特定アミノ酸がメチオニンまたは挿入メチ
オニンによってポリペプチド配列に沿った特定部位で置
換されている変化したリポコルチン様ポリペプチドを産
生させた。ポリペプチドをメチオニン残基において特異
的に切断する臭化シアノゲンによってこれらの改変ポリ
ペプチドを処理すれば、ホスホリパーゼA2阻止活性を有
するリポコルチン様ポリペプチド断片が得られる。
天然ヒトリポコルチン蛋白は、上記例Ｇ（２）に記載し
たような生物学上活性なエラスターゼ断片内に含有され
るメチオニン残基をアミノ酸56及び127部位に２個のみ
に有することを認めた。リポコルチン様ポリペプチドを
臭化シアノゲンで切断するとポリペプチドが不活化され
かつこれによって全ゆる断片が生成されるので、これら
メチオニンの一方または両方が蛋白の生物学的活性に必
要であると推定した。したがって、臭化シアノゲン処理
により活性リポコルチン様ポリペプチド断片を生成させ
る予備段階は、リポコルチン蛋白の生物学的活性を破壊
することなく他のアミノ酸によってこれら２個のメチオ
ニンを置換することを必要とする。したがって、メチオ
ニン56および127をロイシン残基で置換し、かつ臭化シ
アノゲンの処理に際し生物学的活性なポリペプチド断片
を得た。
リポコルチンをコードするDNA配列の誘発によってメチ
オニン56および127を次のように置換した：リポコルチ
ンをコードするDNA配列を含んだプラスミドpLiptrc155A
を制限酵素PvuIで制限して、線状化pLiptrc155A分子を
生成させた。さらに、プラスミドpKK233-2を制限酵素Nc
oI及びHindIIIで制限し、リポコルチンをコードするDNA
配列の両側でプラスミドを切断した（これらプラスミド
の作成に関する例Ｄおよび図６参照）。変性させかつ再
融合させた際、これら２種の制限プラスミドの混合物は
約1300塩基対の一本鎖領域にリポコルチンをコードする
DNA配列をもった離間したヘテロデュプレックスを与え
た。変位オリゴヌクレオチドリポ60及び61を５′末端で
燐酸化し、かつ前記ヘテロデュプレックス混合物へ320
倍の過剰で加えた。リポ60および61はリポコルチンDNA
配列の１部に近似するDNA配列を有するが、特定のヌク
レオチド変化を有して、オリゴヌクレオチド配列の発現
によりそれぞれロイシン残基を有するリポコルチンのme
t127およびmet56の置換をもたらす（図20）。したがっ
て、これらのオリゴヌクレオチドは、ヘテロデュプレッ
クス分子の一本鎖領域にハイブリッド化する。ヘテロデ
ュプレックス分子におけるDNAギャップにDNAポリメラー
ゼＩのクレノー断片を充填し、このDNAをT4ポリヌクレ
オチドキナーゼで結合させた〔モリナガ等、バイオテク
ノロジー、第２巻、第636-639頁（1984）〕。イー・コ
リ菌株JA221をこのDNAで形質転換させ、宿主細胞をLB−
アンピシリンプレートで培養して形質転換体を選択し
た。
P32標識したオリゴヌクレオチドリポ60及び61とのハイ
ブリッド化による改変リポコルチンDNA配列を有するこ
れらコロニーにつき、形質転換体を次のようにスクリー
ニングした：コロニーをニトロセルロースフィルタに移
しかつフィルタのコロニーを新たなLB−アンピシリンプ
レートに載置した。このプレートを37℃で４時間培養し
た。次いで、フィルタをアンピシリンとクロラムフェニ
コール（250μg/ml）を含有する新たなLBプレートへ移
し、かつこのプレートを37℃にて１晩培養した。コロニ
ーを0.5M NaOH-1.5M NaClで溶菌させ、かつ溶菌物を0.5
Mトリス−HCl（pH7.7）‐1.5M NaClで２回中和した。こ
れらフィルタを減圧オーブン中で80℃にて２時間焼成
し、200mlの６×SSPE（0.9M NaCl、90mM燐酸ナトリウ
ム、6mMナトリウムEDTA、pH7.0）、0.5％SDS、100μg/m
l tRNA及び５×デンハルト溶液において55℃で振とうし
ながら数時間予備ハイブリッド化した。次いで、これら
フィルタを10pモルのP32標識したオリゴヌクレオチドを
含有する予備ハイブリッド化混合物200ml中で55℃にて
１晩ハイブリッド化させた。フィルタを６×SSPEで洗浄
し、かつ自動放射線分析によってハイブリッド化を検出
した〔T.マニアシス等、上記〕。
この手順によって多数の陽性クローンを分離した。これ
らクローンの１種（リポ８と呼ぶ）を増殖させ、かつそ
のプラスミドDNA（pLipo8と呼ぶ）を抽出し、マキサム
及びギルバートの技術（上記）によって配列決定した。
この配列決定分析は、所望のヌクレオチド置換、すなわ
ちロイシンをコードするコドンによるmet56および127を
コードするDNAコドンの置換が達成されたことを示し
た。
さらに、リポ８から発現蛋白を抽出し、かつこの調製物
を70％蟻酸における3mg/mlの臭化シアノゲンで処理して
リポコルチン様ポリペプチド断片を生成させた。この粗
製断片混合物を、上記のインビトロ分析によりホスホリ
パーゼA2阻止活性につき試験した。野性型のリポコルチ
ンは臭化シアノゲンによる１時間の処理で失活された
が、断片混合物は、４時間の処理後に活性を示した。次
いで、SBS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て、この混合物から26Kdポリペプチド断片を分離し（図
21および図22）、この断片を上記例Ｇ（２）に記載した
ように再編した。この精製された断片をホスホリパーゼ
A2活性につきインビトロ分析で試験し、この大きい方の
リポ８の断片が生物学的活性を示すことを突き止めた。
得られたリポコルチン様ポリペプチド断片の生物学的活
性に影響を及ぼすことなくmet56および127を置換しうる
可能性を示した後、リポコルチン蛋白の他のアミノ酸残
基をリポコルチン蛋白のアミノ酸配列における各種の部
位でメチオンまたは挿入メチオンで置換することができ
た。このようにして、生物学的活性を有する新たなリポ
コルチンの切断断片を分離した。たとえば、上記した手
法により、リポコルチンのアミノ酸配列における残基10
9のロイシンをメチオニンで置換した。変異オリゴヌク
レオチドリポ68（図20参照）をプラスミドpKK233-2及び
pLipo8（これはリポ60および61のヌクレオチド変化以外
は図６のpLiptrc155Aと同一である）の制限によって生
じたヘテロデュプレックスにハイブリッド化させた。か
くして、形質転換体リポ11を得、これは所望のヌクレオ
チド変化を有してLeu109をメチオニンで置換する。pLip
o11DNAをこの形質転換体から抽出し、その配列決定は所
望のヌクレオチド変化が達成されていることを示した。
次いで、クローンLipo11を培養増殖させ、発現蛋白を抽
出しかつ臭化シアノゲンで処理して断片を生成させた。
処理蛋白抽出物のSDS−ポリアクリルアミドゲル瀘過に
よって14.6Kdポリペプチド断片を分離し（図21参照）
〔ビオラド・カタログ／プライス・リストＫ、第37頁
（1985）〕、この断片を生物学的活性につきインビトロ
分析で分析した。この分析は、リポ11断片がホスホリパ
ーゼA2阻止活性を有することを示した。
同様に、オリゴヌクレオチドリポ78（図20参照）を使用
して、Leu198をメチオンで置換する所望のヌクレオチド
改変をもった形質転換体リポ15を生成させた。臭化シア
ノゲンによる抽出した発現蛋白の切断に続きSDS−ポリ
アクリルアミドゲル瀘過を行って、20.7Kポリペプチド
断片を精製し（図21参照）、次いでこれを生物学的活性
につき分析した。この分析は、リポ15断片がホスホリパ
ーゼA2阻止活性を有することを示した。
代案として、メチオニンをリポコルチンアミノ酸配列中
へ残基169の個所で挿入し、その際、合成オリゴヌクレ
オチドをリポコルチンDNA配列の制限部位に挿入して、
この部位にメチオニン用のコドンを生成させる。pLipo8
をBglIIで制限しかつこの部位にオリゴヌクレオチドリ
ポ75および76（図20参照）をT4リガーゼによって結合さ
せた。これらの相補的オリゴヌクレオチドは、プラスミ
ド中へ挿入するためのBglII部位の凝集性末端に対し相
補的な付着性末端をもって作成された。イー・コリTA22
1菌体をこの結合混合物へ形質転換させ、かつ形質転換
体をLB−アンピシリンプレートでの増殖によって選択し
た。これら形質転換体を、制限地図によって挿入オリゴ
ヌクレオチドの正確な方向性を有するコロニーにつきス
クリーニングした。この種の１つのコロニー（リポ９と
呼ぶ）を培養増殖させ、その発現蛋白を抽出した。粗製
蛋白抽出物を臭化シアノゲンで処理し、かつSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけた。17.7Kdポリペプ
チド断片が生成され、他のアミノ酸がこの配列中に挿入
され、その際切断された合成オリゴヌクレオチドを挿入
させた（図21参照）。
かくして、組換DNA技術を用いて少なくとも３種の生物
学上活性なリポコルチン様ポリペプチド断片を分離し
た：すなわちリポ８の26Kd断片と、リポ11の14.6Kd断片
と、リポ15の20.7Kd断片とである。しかしながら、上記
の手法により他のリポコルチン様ポリペプチド断片を生
成させうることも了解すべきである（たとえば、リポコ
ルチンアミノ酸配列に沿ったメチオニンによる他のアミ
ノ酸の置換）。さらに、リポコルチン様断片は、リポコ
ルチンをコードするDNA配列を変化させてメチオニン以
外のアミノ酸を導入しもしくは、挿入し、変化したポリ
ペプチドを生成させて製造することもできる。次いで、
このポリペプチドを適当な酵素または薬品で切断して、
生物学上活性な断片を得ることができる（たとえば、シ
スティンを挿入しかつ蛋白をNTCB、すなわち２−ニトロ
−５−チオシアノ安息香酸で切断することもできる）。
Ｎ−リポコルチンをコードするDNA配列の分離 さらに、Ｎ−リポコルチン、すなわちホスホリパーゼA2
阻止活性を示し、かつ本発明により、製造される37Kdリ
ポコルチンと同族のアミノ酸を有するヒトリポコルチン
様ポリペプチドの１部をコードするヌクレオチド配列を
得た。
I.ヒト胎盤からのリポコルチンおよびＮ−リポコルチン
の精製 新鮮な胎盤を出産直後に氷上に載せ、６時間以内に次の
ように処理した：胎盤の表皮を除去し、立方体に切断し
かつ組織を氷冷したPBS（50mM Na2HPO4、pH7.2、150mM
NaCl）および５％蔗糖で300mlずつ10回変えて、組織が
桃色となりかつ洗浄液によってもはやヘモグロビンが放
出されなくなるまで洗浄した。この洗浄した胎盤は約35
0gであった。
30gの胎盤組織を150mlの抽出用緩衝液（25mMトリス−HC
l（pH7.7）、5mM EDTA、0.1mg/mlアプロチン、0.1mg/ml
大豆トリプシン阻止剤および40μＭペプスタチンＡ）で
洗浄し、次いでこの組織を100mlの同じ緩衝液に懸濁さ
せた。調製物をポリトロンによって氷上で５〜７分間破
壊し、ホモゲナイズ物をSS34ロータにて10,000rpmで４
℃にて15分間遠心分離した。上澄液をデカントし、ポリ
トロンでさらに100mlの抽出用緩衝液中にてペレットを
破壊し、懸濁物を再び10,000rpmで15分間遠心分離し
た。両抽出物の上澄液を合しかつ処理した。
最初に25mMトリス−HCl（pH7.7）で平衡化させた80mlカ
ラム（DE52、ワットマン・リミテッド社、カラム寸法：
直径2.5×16cm）にてDEAE−セルロースクロマトグラフ
ィーにかけた。流化した調製物をアミコンPM10膜での限
外瀘過により15mlまで濃縮した。次いで、濃縮した調製
物をSS34ロータにて18,000gで15分間遠心分離した。濃
縮物の見掛イオン強度は、限外瀘過からの流過物の電導
度を測定して概算した。この数値に基づき、濃縮物を水
で希釈して25mMトリス−HCl（pH7.7）と等しい見掛イオ
ン強度にした（10mlの水を加えた）。次いで、この調製
物を40mlカラムにて第２のDEAE−セルロース工程にか
け、さらにDEAE流過物を200ml P150カラム（カラム寸
法：直径2.5cm×40cm）にてゲル瀘過クロマトグラフィ
ーにより分画し、これも25mMトリス−HCl（pH7.7）にお
いて行なった。この溶出物の5mlフラクションを集め、
その１部を上記例Ａに記載したインビトロ分析によりホ
スホリパーゼ阻止活性につき分析した。この分析によれ
ば、溶出物は阻止活性を有する単一の幅広ピークを有
し、これはゲル瀘過により測定して40Kの見掛分子量を
有した。さらに、溶出物の１部をSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって特性化した。このゲル分析
は、溶出物における阻止活性が35Kdにおける主たる蛋白
帯に相当することを示した。ウエスタン・ブロット分析
は、35Kdバンドがイー・コリで産生された組換リポコル
チンに対するウサギ抗血清に免疫反応性であることを示
した。
次いで、ゲル瀘過カラムからの溶出物をC4カラム（バイ
ダック社）での逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPL
C）にかけ、その際0.1％トリフルオロ酢酸中で０〜75％
のアセトニトリルの濃度勾配を用いて結合断片を溶出さ
せた。この溶出物は実際に２種の35Kd成分を有すること
が判明した。すなわち、65.8％アセトニトリルでカラム
から溶出した天然ヒトリポコルチン成分と、65.1％アセ
トニトリルで溶出したＮ−リポコルチン成分とである。
天然リポコルチン成分のみが、組換リポコルチンに対し
発生した抗体に免疫反応性であった。
ホスホリパーゼA2阻止活性を保持するように、これら２
種の成分をさらに精製するため、ゲル瀘過カラムからの
部分精製した調製物をモノＳ高解像陽イオンクロマトグ
ラフィー樹脂（HR5/5、ファルマシア社）にて迅速蛋白
液体クロマトグラフィー（FPLC、ファルマシア社）にか
けた。50mMのMES緩衝液（２−モルフォリノ−エタンス
ルホン酸）中pH6.0において、両成分はモノＳカラムに
結合し、NaClの濃度勾配で溶出させた。図23は蛋白の溶
出経過（280nmで監視した吸光度）（パネルＡ）および
モノＳカラムからのホスホリパーゼA2阻止活性の経過
（パネルＢ）を示している。パネルＡにおいて、ピーク
Ｉはリポコルチンに相当し、かつピークIIはＮ−リポコ
ルチンに相当する。ピークＩにおける物質のみが、組換
リポコルチンに対するウサギ抗血清に免疫反応性であっ
た。パネルＢは、明らかにリポコルチンとＮ−リポコル
チンとの両者がホスホリパーゼA2阻止活性を有すること
を示している。精製調製物におけるこの相対量に基づ
き、ホスホリパーゼ阻止剤としての２種の蛋白の特異活
性はほぼ同一であると推定された。
さらに、これら２種の蛋白をトリプシン分解地図化によ
って分析した。大部分の胎盤を処理し、上記の手順によ
り蛋白を精製した。溶液およびカラムの寸法および容積
を適当に調節した。２種の35Kd蛋白を逆相HPLCで分離し
た後、各精製蛋白の100μｇを次のようにトリプシン分
解地図化分析にかけた：適当なHPLCフラクションを減圧
化にスピード・バック・濃縮装置（サバント社）で乾燥
させ、得られたペレットを400μｌの0.1M重炭酸アンモ
ニウム（pH8.0、0.1mM CaCl2）中に再懸濁させ、そして
混合物をトリプシンで切断した。TPCK−トリプシン（ワ
ーシントン社、全部で５μｇ）を100μｇの蛋白に加
え、かつ切断を37℃にて16時間行った。トリプシンは３
つの等しい部分として加えた。すなわち、第１のもの
は、０時間で第２のものは４時間後に、かつ第３のもの
は培養12時間後にそれぞれ加えた。この切断物を、20％
（v/v）までの蟻酸によって酸性化させた。
次いで、トリプシン切断からの切断断片を、例Ａにおい
て前記したようにC18カラムにて40℃で逆相高圧液体ク
ロマトグラフィーにより分離させた。カラム溶出物は、
214nmで監視した。リポコルチン（パネルＡ）およびＮ
−リポコルチン（パネルＢ）のトリプシン分解地図を図
24に示す。胎盤から分離された天然ヒトリポコルチンの
トリプシン分解地図は、ヒト大食細胞cDNAの発現により
得られた37Kdリポコルチンからのトリプシン分解地図と
同一である。DNA配列分析は、胎盤リポコルチンと大食
細胞由来のリポコルチンとの間の２種のアミノ酸の相違
を示した。Ｎ−リポコルチンの地図は、蛋白が独特であ
ることを示している。
Ｎ−リポコルチンのトリプシン分解地図から得られた11
個のピークに対応する溶出フラクションをスピード・バ
ック・濃縮装置で濃縮し、これらを気相配列決定装置
（アプライド・バイオシステムス470A）を用いてアミノ
末端蛋白配列分析にかけた。エドマン減成の各サイクル
から得られたPTHアミノ酸をアプライド・バイオシステ
ムス120AのPTH分析装置により逆相高圧液体クロマトグ
ラフィーで分析した。これらの分析から得られた配列を
図25に示す（図25における配列の左側の「Ｔ」数値は、
図面の頂部におけるカラム経過で示されるピーク数に対
応する）。
Ｎ−リポコルチンのペプチド配列は大部分が独特である
が、幾つかは、本発明にしたがって精製されたヒトリポ
コルチンと同様な配列を示し、このことは、２種の35Kd
成分（すなわち、それぞれリポコルチンおよびＮ−リポ
コルチン）が同じ種類の蛋白から誘導されうることを示
唆している。図25に示したように、現在までＮ−リポコ
ルチン分子の約1/3の主構造を決定した。多数の断片を
有するHPLCピークから得られたこれら断片の配列は当業
界で知られた技術によって決定しうるので、実際に分子
の50％の主構造を決定するのに必要なデータを与えたこ
とになる。
J.N−リポコルチン蛋白配列に対するオリゴヌクレオチ
ド試料の合成 ヒト胎盤からのＮ−リポコルチンにおける各種領域のア
ミノ酸配列を決定した後、これら蛋白配列の幾つかをコ
ードする対応のオリゴヌクレオチドDNA試料につき４種
の保存物を化学合成した（図25参照）。組換リポコルチ
ンにつき例Ｂで前記したと同じ手段および手法を使用し
た。Ｎ−リポコルチンの４つの選択領域に関するアミノ
酸配列並びにこれらをコードする全ゆる可能なヌクレオ
チドコドン組合せを図26に示す。コード化縮重は次のよ
うに示される:N＝C,T,AもしくはG;R＝ＡもしくはG;Y＝
ＣもしくはT;H＝A,CもしくはT;P＝ＧもしくはC;X＝A,G
もしくはT;H＝ＡもしくはＴ。
図26に示したように、DNA試料の４種の保存物はそれぞ
れトリプシン分解断片T20,T25,T24およびT9のアミノ酸
配列に対応する。試料における縮重をさらに減少させる
ため、各保存物をサブ保存物として作成した。断片T20
のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドNLip1〜N
Lip3は、128倍の縮重を有する24量体である。オリゴヌ
クレオチドNLip4〜NLip7は32倍の縮重を有する18量体で
あり、かつ断片T25のアミノ酸配列に対応する。オリゴ
ヌクレオチドNLip8〜NLip11は72倍の縮重を有する20量
体であって断片T24のアミノ酸配列に対応し、またNLip1
2〜NLip15は128倍の縮重を有する17量体であって断片T9
のアミノ酸配列に由来する。
これら合成試料が実際にヒト配列を識別するかどうかを
試験するため、３種のサブ保存物NLip1,NLip2およびNLi
p3を〔γ〕−P32‐ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてP32で末端標識した後、ヒト胎盤からのポリ
(A)+mRNAを含有する遺伝子スクリーンフィルタにハイブ
リッド化させ、その際ノーザンブロット技術を用いた
〔H.レーラッハ等、上記〕。サブ保存物NLip1は、リポ
コルチンmRNAと同じ寸法と思われる1800ヌクレオチドmR
NAにハイブリッド化した。
K.ヒト胎盤cDNA保存物の作成およびスクリーニング ヒト胎盤より分離したポリ(A)+mRNAからヒトcDNA保存物
を、ヒト大食細胞cDNA保存物の作成につき例Ｃで前記し
たとほぼ同じ手順で作成した。しかしながら、この具体
例においては女性胎児のヒト胎盤から全RNAをJ.M.シャ
ーグイン等によって実質的に記載されたグアニジンイソ
チオシアネート法によって抽出した〔バイオケミストリ
ー、第18巻、第5294-5299頁（1979）〕このRNA調製物
を、オリゴ（dt）−セルロースカラム（PLバイオケム
社）に２回通してポリ(A)+RNAにつき濃縮し、これを使
用して二重鎖cDNA配列を合成し、次いでこれをλgt10中
に挿入すると共に、イー・コリC600hfl菌体で増殖させ
た。
ヒト胎盤cDNA保存物を下記するようなニトロセルロース
フィルタによって標識オリゴヌクレオチド試料（NLip
1）でスクリーニングした。Ｌブロスおよび0.2％マルト
ースにおけるC600hfl菌体の１晩培養物をペレット化さ
せかつ同量のSM緩衝液に再懸濁した。0.9mlの菌体に２
×106個のファージ粒子を室温で15分間予備吸着させ
た。懸濁物をLB＋10mM MgSO4および0.7％アガロース中
で55℃にて50mlまで希釈し、これをLBプレート＋10mM M
gSO4に移植した。30枚のこれらプレートをスクリーニン
グした。プレートを37℃にて約５時間培養し、次いで４
℃に１時間冷却してアガロースを硬化させた。次いで、
λファージ粒子をプラーク保存プレートからＳ＆Ｓニト
ロセルロースフィルタに移し、その際フィルタを組換プ
ラークを有するプレート上へ５分間載置した。次いで、
プレートからフィルタを持ち上げ、フィルタ上のファー
ジを溶菌させ、その際フィルタを0.5N NaOH-1.5M NaCl
の溶液上に５分間載置し、さらに中和しかつフィルタを
1Mトリス−HCl-1.5M NaCl（pH7.0）に浸漬した。次い
で、フイルタを風乾しかつ80℃にて２時間焼成した。
処理したフイルタを0.2％ポリビニルピロリドン（M.W.4
0,000）、0.2％フィコール（M.W.400,000）、0.2％牛血
清アルブミン、0.05Mトリス−HCl（pH7.5）、1M塩化ナ
トリウム、0.1％ピロ燐酸ナトリウム、１％SDS、10％硫
酸デキストラン（M.W.500,000）および変性鮭精子DNA
（≧100μg/ml）においてコロニー／プラークスクリー
ン（登録商標）メンブランに対する製造業者の指示（ニ
ューイングランド・ヌクレア社）にしたがいオリゴヌク
レオチド試料（NLip1）に予備ハイブリッド化し、かつ
ハイブリッド化させた。自動放射線分析によってハイブ
リッド化するcDNA配列を検出した。
この技術により６種の陽性プラークを釣上げ、かつ同じ
試料を用いて低密度にて再スクリーニングした。これら
クローンのDNAを分離し、このDNAをEcoRIで切断し、そ
してサウザン・ブロット技術によりこれら配列をNLip1
試料とハイブリッド化させた〔E.M.サウザン、上記〕。
全部で６種のクローンのcDNA挿入物がNLip1試料にハイ
ブリッド化した。
次いで、これらファージのDNAをEcoRIで切断し、cDNA挿
入物を分離した。これらクローンの１種（λ−NLipo21-
2）のEcoRIによる切断は約500塩基対断片をもたらし、
これをプラスミドpUC9にサブクローン化してプラスミド
pNLip1を生成させた。このプラスミドをマキサムおよび
ギルバードの方法によって配列決定した〔A.M.マキサム
およびW.ギルバード、上記〕。図27に示したように、こ
のプラスミドは394塩基対のcDNA挿入物を有し、この挿
入物はＮ−リポコルチンコード配列（33アミノ酸に対応
する）の99塩基対を有し、さらにポリ（Ａ）付加部位を
含めＮ−リポコルチン３′非コード化領域の295塩基対
および約50塩基対のポリ（Ａ）末端をも有する。Ｎ−リ
ポコルチンのDNAコード化配列はトリプシン分解断片T20
から誘導されたオリゴヌクレオチド試料に対応する配列
（すなわちNLip1）だけでなく、トリプシン分解断片T32
に対応する配列をも含有し（図25参照）、このことはＮ
−リポコルチン蛋白をコードする遺伝子の１部がクロー
ン化されたことを確認する。このcDNA配列並びに例Ｊで
記載したオリゴヌクレオチド試料を次いで試料として使
用することにより、全長Ｎ−リポコルチンをコードする
DNA配列をスクリーニングしかつ分離した。
クローンλNLipo21-2は蛋白の小領域のみをコードする
Ｎ−リポコルチンDNA配列を有するが、リポコルチンと
Ｎ−リポコルチンとの間の構造類似性がこの領域に保持
される。下記表４に示すように、２種の蛋白におけるカ
ルボキシル末端の最後の17個のアミノ酸のうち11個は同
一である。５つの相違点のうち殆どはアミノ酸置換が保
持されている。２種の蛋白におけるホスホリパーゼA2阻
止活性の類似性、並びに蛋白およびDNA配列の類似性に
基づき、Ｎ−リポコルチンとリポコルチンとは１群の関
連蛋白であると結論した。
表４ リポコルチンおよびＮ−リポコルチンのＣ−末端におけ
る配列類似性 リポ:GlnLysMetTyrGlyIleSerLeuCysGlnAlaIleLeu− Ｎ−リポ:LysArgLysTyrGlyLysSerLeuTyrTyrTyrIleGln− リポ:AspGluThrLysGlyAspTyrGluLysIleLeuValAla− Ｎ−リポ:GlnAspThrLysGlyAspTyrGlnLysAlaLeuLeuTyr− リポ:LeuCysGlyGlyAsn Ｎ−リポ：LeuCysGlyGlyAspAsp 本発明のリポコルチンおよびＮ−リポコルチンにおける
ヌクレオチド配列の比較はほぼ60％の類似性を示してい
る（図28参照）。
ここに開示した方法により作成された微生物および組換
DNA配列は、インビトロ・インターナショナル・インコ
ーポレイション、アン・アーバー、ミシガン州のカルチ
ャーコレクションに寄託した培養物で例示される。この
培養物は1986年１月８日付けで寄託され、次のように同
定されている： イー・コリ JA221（pNLip1）:IVI No.10093 本発明により産出されたヒトリポコルチン様ポリペプチ
ドの収量および活性の向上 蛋白の産生レベルは３つの主因子によって支配される：
すなわち細胞内の遺伝子のコピー数、これら遺伝子コピ
ーを転写する効率、およびこれらを翻訳する効率であ
る。転写および翻訳（これらは一緒になって発現を構成
する）の効率は、一般に所望のコード化配列の先端に位
置するヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオ
チド配列または発現制御配列は、特にRNAポリメラーゼ
が互いに反応して転写を開始する位置（プロモータ配
列）およびリボソームが結合しかつmRNA（転写の生成
物）と相互作用して翻訳を開始する部位を規定する。必
ずしも全てのこれら発現制御配列が同等の効率を有する
とは限らない。したがって、本発明の特定リポコルチン
コード化配列をその隣接ヌクレオチド配列から分離しか
つこれらを他の公知の発現制御配列に融合させてより高
レベルの発現を促進すると共に、リポコルチン様ポリペ
プチドを産生させるのが有利である。これを達成した
後、新たに作成されたDNA配列をより多いコピー数のプ
ラスミドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入して、
細胞内の遺伝子コピー数を増加させ、これによりさらに
発現リポコルチン様ポリペプチドの収量を増大させるこ
とができる。
上記のように、数種の発現制御配列を使用することがで
きる。これらはイー・コリのラクトースオペロン（「la
c系」）のオペレータ、プロモータ並びにリボソーム結
合および相互作用配列（たとえば、シャイン−ダルガル
ノ配列のような配列を含む）、イー・コリのトリプトフ
ァン シンセターゼ系（「trp系」）の対応配列、ファ
ージλの主オペレータおよびプロモータ領域（上記のよ
うなOLPLおよびORPR）、フィラメント状一本鎖DNAファ
ージの制御領域、tacもしくはtrc系、３−ホスホグリセ
レートキナーゼもしくはその他の糖分解酵素のプロモー
タ、酸ホスファターゼのプロモータ（たとえば、Pho
5）、酵母α−結合因子のプロモータ、たとえばSV40早
期および後期プロモータのような哺乳動物細胞のプロモ
ータ、アデノウイルス後期プロモータおよびメタロチオ
ニンプロモータ、並びに原核もしくは真核細胞およびウ
イルスの遺伝子の発現を制御する他の配列またはその組
合せを包含する。
したがって、本発明のリポコルチン様ポリペプチドの産
生を向上させるには、これらポリペプチドのDNA配列を
前記と同様に作成しかつ組換DNA分子中へその最初の発
現制御配列の近傍に挿入し、或いは上記向上した発現制
御配列の制御下に挿入することができる。この種の方法
は当業界で公知である。
翻訳の効率を向上させるのに有用な他の方法は、化学的
もしくは酵素的に作成したオリゴヌクレオチドを本発明
のリポコルチン関連DNA配列の開始コドンの前に挿入す
ること、或いはDNA配列のＮ−末端におけるコドンを化
学的もしくは酵素的に作成したこれらオリゴヌクレオチ
ドで置換することを含む。この手順により、RNAの一層
最適な一次およびより高次の構造を得ることができる。
より詳細には、開始AUGコドンがヘアピンの頂部或いは
他の単一鎖領域のいずれかにおける容易にアクセスしう
る位置（すなわち二次構造により遮蔽されていない）で
生ずるように配列を設計することができる。上記シャイ
ン−ダルガルノ断片の位置および配列を同様に最適化す
ることができる。メッセンジャーRNAの一般構造（重ね
構造）の重要性は既に記載されている。〔D.イセレンタ
ントおよびW.ファイエルス、「mRNAの二次構造および翻
訳開始の効率」、ジーン、第９巻、第1-12頁〕198
0）〕。
本発明のリポコルチン様ポリペプチドの細胞収量におけ
る増加は、さらに細胞内で使用しうる遺伝子の個数を増
加させて達成することもできる。これは、リポコルチン
遺伝子（その転写および翻訳制御要素を有するまたは持
たない）をより多いコピー数のプラスミド中へまたは温
度制御されたコピー数のプラスミド（すなわち、プラス
ミドのコピー数が温度の変化の後に増加するような変異
を有するプラスミド）中に挿入して達成することができ
る〔B.ユーリン等、「クローン化遺伝子およびその生産
物の増殖に対する温度依存性コピー数を有するプラスミ
ド」、ジーン、第６巻、第91-106頁（1979）〕。
代案として、遺伝子投入量における増加は、たとえば上
記のように処理された組換DNA遺伝子を雛型バクテリオ
ファージλ中に挿入することにより、特に簡単にはプラ
スミドを制限酵素で切断して線状分子を与え、これを次
いで制限ファージλクローン化ベヒクル（たとえば、N.
E.マレー等により「インビトロ組換体における回収を単
純化させるλファージ」、モレキュラー・ゼネラル・ジ
ェネティックス、第150巻、第53-61頁（1977）およびN.
E.マレー等、「バクテリオファージT4からのDNAリガー
ゼ遺伝子の分子クローン化」、ジャーナル・モレキュラ
ー・バイオロジー、第132巻、第493-505頁（1979）に記
載された種類）と混合し、組換DNA分子をDNAリガーゼと
の培養により生成させて達成することができる。次い
で、所望の組換ファージを選択し、かつこれを使用して
イー・コリの宿主菌株をリソゲナイズする。
したがって、本発明のリポコルチン様ポリペプチドをコ
ードする配列を開示したベクターから除去すると共に、
これを他の発現ベクター中へ前記のように挿入し、これ
らベクターを前記したように各種の宿主中で使用して本
発明のヒトリポコルチン様ポリペプチドの産生を向上さ
せうることを了解すべきである。
以上、本発明を多くの具体例につき説明したが、本発明
の基本的構成を変化させて本発明の方法および組成物を
使用する他の具体例を与えることもできる。したがっ
て、本発明の範囲は、例として上記した特定具体例のみ
に限定されないことが了解されよう。
1991年６月20日に、本明細書中で同定した寄託をインビ
トロ・インターナショナル・インコーポレイテッド
（「IVI」）からメリーランド州・ロックビルのアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（「ATCC」）
に移転した。
以下にIVI寄託番号と共に相当するATCCにより割当られ
た寄託番号を挙げる。
IVI ATCC 10042 68812 10046 68763 10088 74106 10093 68811
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ７７２８９２ (32)優先日 1985年９月５日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８８１２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８７６３ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ７４１０６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８８１１ (72)発明者 ガーウイン，ジエフリー エル アメリカ合衆国、マサチユーセツツ 01730、ベドフオード、フレツチヤー ロ ード 76 (72)発明者 シンドラー，ダニエル ジー アメリカ合衆国、マサチユーセツツ 02135、ブライトン、モナステリー ロー ド 36 (72)発明者 ホアン，クオーセング アメリカ合衆国、マサチユーセツツ 02173、レキシントン、ステイーブンス ロード 12 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．857, Ｐ．247−254（1985)

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ） （ｂ）前記（ａ）部のDNA配列に55℃にて６×SSPEでハ
    イブリッド化しかつ前記（ａ）部のDNA配列によりコー
    ドされたヒトリポコルチンのホスホリパーゼA2阻害活性
    および免疫学的活性を有するヒトポリペプチドをコード
    するDNA配列 および （ｃ）前記（ａ）および（ｂ）のDNA配列と縮重関係で
    あるDNA配列よりなる群から選択されるDNA配列を特徴と
    する組換DNA分子。
  2. 【請求項２】前記DNA配列が分子中の発現制御配列に作
    動的に結合されている請求の範囲第１項記載の組換DNA
    分子。
  3. 【請求項３】発現制御配列がlac系、β−ラクタマーゼ
    系、trp系、tac系、trc系、ファージλの主オペレータ
    およびプロモータ領域、fdコート蛋白の制御領域、３−
    ホスホグリセレートキナーゼもしくはその他の糖分解酵
    素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ、酵母
    α−接合因子のプロモータ、哺乳動物細胞のプロモー
    タ、SV40の早期および後期プロモータ、アデノウイルス
    の後期プロモータおよびメタロチオニンプロモータなら
    びに原核もしくは真核細胞およびそのウイルスの遺伝子
    の発現を制御するその他の配列、およびそれらの組合せ
    よりなる群から選択される請求の範囲第２項記載の組換
    DNA分子。
  4. 【請求項４】pLipPLT4A、pLipPLT4TおよびpSVL9109より
    なる群から選択される請求の範囲第３項記載の組換DNA
    分子。
  5. 【請求項５】順に、カナマイシン耐性のための遺伝子、
    酵母アクチン発現制御配列および により表わされるヒトリポコルチンをコードするDNA配
    列よりなる組換DNA分子pBg120［ATCC74106］。
  6. 【請求項６】（ａ） （ｂ）前記（ａ）部のDNA配列に55℃にて６×SSPEでハ
    イブリッド化しかつ前記（ａ）部のDNA配列によりコー
    ドされたヒトリポコルチンのホスホリパーゼA2阻害活性
    および免疫学的活性を有するヒトポリペプチドをコード
    するDNA配列 および （ｃ）前記（ａ）および（ｂ）のDNA配列と縮重関係で
    あるDNA配列よりなる群から選択されるDNA配列を特徴と
    する少なくとも１個の組換DNA分子により形質転換され
    た単細胞宿主。
  7. 【請求項７】イー・コリ、シュードモナス、バチルス、
    ストレプトミセス、酵母細胞、その他の真菌類、ネズミ
    細胞もしくはその他の動物細胞宿主、植物細胞宿主およ
    びヒト組織細胞よりなる群から選択される請求の範囲第
    ６項記載の形質転換宿主。
  8. 【請求項８】 からなるDNA配列。
JP61500637A 1985-01-10 1986-01-10 リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主 Expired - Lifetime JPH0787789B2 (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/690,146 US4879224A (en) 1985-01-10 1985-01-10 DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor polypeptides
US06/712,376 US4874743A (en) 1985-01-10 1985-03-15 DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor-like polypeptides
US76587785A 1985-08-14 1985-08-14
US77289285A 1985-09-05 1985-09-05
US690146 1985-09-05
US765877 1985-09-05
US772892 1985-09-05
US712376 1985-09-05
PCT/US1986/000027 WO1986004094A1 (en) 1985-01-10 1986-01-10 Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human lipocortin-like polypeptides

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6156761A Division JPH0787980A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 Ｎ−リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主
JP6156762A Division JPH07101994A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 Ｎ−リポコルチンポリペプチドおよびその製造方法
JP6156760A Division JPH0789996A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 リポコルチンポリペプチドおよびその製造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62501679A JPS62501679A (ja) 1987-07-09
JPH0787789B2 true JPH0787789B2 (ja) 1995-09-27

Family

ID=27505426

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61500637A Expired - Lifetime JPH0787789B2 (ja) 1985-01-10 1986-01-10 リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主
JP6156762A Pending JPH07101994A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 Ｎ−リポコルチンポリペプチドおよびその製造方法
JP6156760A Pending JPH0789996A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 リポコルチンポリペプチドおよびその製造方法
JP6156761A Pending JPH0787980A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 Ｎ−リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6156762A Pending JPH07101994A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 Ｎ−リポコルチンポリペプチドおよびその製造方法
JP6156760A Pending JPH0789996A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 リポコルチンポリペプチドおよびその製造方法
JP6156761A Pending JPH0787980A (ja) 1985-01-10 1994-06-14 Ｎ−リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0209568B1 (ja)
JP (4) JPH0787789B2 (ja)
CN (1) CN86100721A (ja)
AT (1) ATE108830T1 (ja)
AU (1) AU601676B2 (ja)
DE (1) DE3689977T2 (ja)
DK (1) DK433686D0 (ja)
ES (1) ES8704184A1 (ja)
FI (1) FI863626L (ja)
HU (1) HUT40695A (ja)
WO (1) WO1986004094A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5264550A (en) * 1985-04-15 1993-11-23 Scios Nova Inc. Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein
WO1986006100A1 (en) * 1985-04-15 1986-10-23 Biotechnology Research Partners, Limited Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein
JPS6256429A (ja) * 1985-09-04 1987-03-12 Teijin Ltd フオスフオリパ−ゼａ↓２阻害活性を有する蛋白
PT87083B (pt) * 1987-03-28 1992-07-31 Boehringer Ingelheim Int Processo para a preparacao de uma proteina anticoagulante vascular, de adn que codifica para esta proteina e de composicoes farmaceuticas que a contem
EP0285405A1 (en) * 1987-03-31 1988-10-05 Schering Biotech Corporation Glycosylation inhibition factors
JPH06799B2 (ja) * 1987-04-02 1994-01-05 帝人株式会社 起炎性フオスフオリパ−ゼａ▲下２▼阻害活性を有する蛋白
DE3737237A1 (de) * 1987-11-03 1989-05-18 Behringwerke Ag Anticoagulatorisches protein pp4-x, seine herstellung und verwendung
US5320950A (en) * 1987-11-03 1994-06-14 Behringwerke Aktiengesellschaft DNA encoding anticoagulative protein PP4-X, and its preparation and use
JPH01199995A (ja) * 1988-02-04 1989-08-11 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ホスホリパーゼａ↓２阻害ペプチド
US5733732A (en) * 1996-01-03 1998-03-31 University Of Iowa Research Foundation Methods for detecting primary adhalinopathy
CA2219299A1 (en) * 1997-10-24 1999-04-24 Elias Georges P-40, a new member of the multidrug resistance gene family
KR100835879B1 (ko) * 2006-10-10 2008-06-09 학교법인 한림대학교 아넥신 융합 단백질
GB2542391A (en) 2015-09-17 2017-03-22 Annexin Pharmaceuticals Ab Process of manufacture

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4239780A (en) * 1979-10-11 1980-12-16 The Upjohn Company Phospholipase A2 inhibition
US4537858A (en) * 1984-06-22 1985-08-27 E. R. Squibb & Sons, Inc. Plastatin
WO1986006100A1 (en) * 1985-04-15 1986-10-23 Biotechnology Research Partners, Limited Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA=1985 *
ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，Ｖｏｌ．８５７，Ｐ．２４７−２５４（１９８５）

Also Published As

Publication number Publication date
DK433686A (da) 1986-09-10
DE3689977T2 (de) 1994-10-27
DE3689977D1 (de) 1994-08-25
ATE108830T1 (de) 1994-08-15
AU601676B2 (en) 1990-09-20
JPS62501679A (ja) 1987-07-09
EP0209568B1 (en) 1994-07-20
JPH0789996A (ja) 1995-04-04
JPH0787980A (ja) 1995-04-04
FI863626A7 (fi) 1986-09-09
EP0209568A1 (en) 1987-01-28
AU5318286A (en) 1986-07-29
EP0209568A4 (en) 1988-10-27
ES8704184A1 (es) 1987-03-16
DK433686D0 (da) 1986-09-10
WO1986004094A1 (en) 1986-07-17
FI863626A0 (fi) 1986-09-09
HUT40695A (en) 1987-01-28
CN86100721A (zh) 1987-02-11
FI863626L (fi) 1986-09-09
ES550784A0 (es) 1987-03-16
JPH07101994A (ja) 1995-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2525438B2 (ja) ファクタ―８：ｃの製造方法
US4879224A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor polypeptides
Tillmann et al. cDNA clones of the auxin‐binding protein from corn coleoptiles (Zea mays L.): isolation and characterization by immunological methods.
JP2515468B2 (ja) ヒト抗トロンビンｉｉｉ
JP2709113B2 (ja) フォリスタチンおよびその精製法
JPH08505280A (ja) インターロイキン１βプロテアーゼおよびインターロイキン１βプロテアーゼ阻害剤
JP2989853B2 (ja) ポリペプチド、その製造方法、ｄｎａ塩基配列及び形質転換細胞宿主
JPH0787789B2 (ja) リポコルチンをコードするｄｎａ分子および形質転換宿主
JPH03505279A (ja) インターロイキン―１インヒビター
JP2757987B2 (ja) ヒト抗‐炎症ホスホリパーゼ阻害蛋白
JP2533869B2 (ja) Ｈｕｓｉ―ｉ型インヒビタ―の生物学的活性を有するタンパク質をコ―ドするｄｎａ配列、前記ｄｎａ配列を含む組換え体クロ―ニングベクタ―及び前記ベクタ―により形質転換された細菌
US5185431A (en) Recombinant natural killer cell activator
US5484711A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lipocortins III, IV, V & VI
JP3011274B2 (ja) 組み換え技術により産生した、３−デス−ヒドロキシ−シスタチンｃポリペプチドまたはその修飾物
US4874743A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human phospholipase inhibitor-like polypeptides
US5646254A (en) Antibodies for human phospholipase inhibitory protein (hPIP)
US4828988A (en) Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine
US4950646A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human lipocortin-like polypeptides
US5081019A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lipocortin-like polypeptides
DK172677B1 (da) Monoklonale antistoffer mod et interferoninduceret protein, fremgangsmåde til fremstilling deraf, hybridomacellelinier som
EP0454765A1 (en) Pregnancy specific proteins applications
DK172400B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af renset minactivin, minactivinkodende DNA-molekyle, rekombinant DNA-molekyle, sammensmeltet gen, vært, reagent til lokalisering og definering af grænserne for tumorer i histologiske prøver, samt anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, minactivinet og peptider deraf
JP2829397B2 (ja) フィブリン結合活性ポリペプチド
JP2676341B2 (ja) Ｂ細胞分化因子の製造法
JPS63270698A (ja) 組み換え型ヒトリンホトキシン