JPH0471494A

JPH0471494A - α―ヒドロキシ酸の製法

Info

Publication number: JPH0471494A
Application number: JP18212590A
Authority: JP
Inventors: Teruyuki Nikaido; 輝之二階堂; Yoshinori Kobayashi; 良則小林
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1990-07-10
Filing date: 1990-07-10
Publication date: 1992-03-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はα−ヒドロキシ酸の製造法に関する。α−ヒド
ロキシ酸は種々の医農薬中間体として重要であり、取り
分けその光学活性体の効率の良い、安価な製法が求めら
れている。

（従来の技術） α−ケト酸を微生物又は酵素で還元し、α−ヒドロキシ
酸、取り分けその光学活性体を製造する方法には様々な
ものか知られているが、いずれも工業的製法とはなって
いない（例えば特開昭５７−１９８０９６、特開昭５７
−１９８０９７、特開昭６３−３２４９２、特開昭６３
−３２４９３．特開昭５９−７４９８３、特公昭６１−
１１５９１、特開昭６０−１２９７５、特開昭６２−１
００２８６、特開平２−３９８９３、特開平１−２１１
４９４など）。

この原因は基質阻害、又は生成物阻害のため、基質であ
るα−ケト酸の仕込み濃度、α−ヒドロキシ酸の蓄積濃
度は高くても１％止まりであり、生成効率が悪いため、
コストが高くなるからである。また補酵素あるＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨも高価であり、その再生系を組み込んで
連続反応するのも容易ではない、これらを解決するため
、種々のりアクタ−か考案されているが、実用化にまで
は至っていない、［山崎幸苗ら、バイオインダストリー
５　（４）、２６１〜２６８　（１９８８）、Ｓｉｍｏ
ｎＥ、Ｓ、ＰｌａｎｔｅＲ，＆Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ　
　Ｇ。

Ｍ、、Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、。

２２．１６９〜１７９　（１９８９）］。

（発明が解決しようとする課題）上述の状況に鑑みて、本発明の課題は種々の医農薬中間
体として重要なα−ヒドロキシ酸を簡便で効率の良い方
法で、工業的に生産するため、酵素又は微生物でα−ケ
ト酸を還元するに際して、α−ヒドロキシ酸の蓄積濃度
を画期的に向上させる方法を提供することにある６（問
題点を解決するための手段）本発明者らは簡便で、かつ高い生成物蓄積濃度を達成す
る実用的な方法を鋭意検討した結果、α−ケト酸及び又
はα−ヒドロキシ酸を難溶性の塩で存在させれば基質阻
害、生成物阻害がほとんどかからないことを見出し本発
明を完成した。即ち、本発明によればα−ケト酸を微生
物又は酵素で還元し、α−ヒドロキシ酸とするに際し、
α−ケト酸を水に難溶性の無機塩とするか、又は／及び
α−ケト酸の中和剤として無機塩を用いる事によって、
酵素反応特有の欠点である基質阻害、生成物阻害を回避
することができ、生成物であるα−ヒドロキシ酸の蓄積
濃度の飛躍的向上がはかれる。

本発明で用いられるα−ケト酸としては、２−ケト４−
メチルペンタン酸、２−ケト酪酸、２−ゲトベンタン酸
、２−メチル酪酸、２−ケトヘキサン酸、２−ケト３−
メチルペンタン酸、２−ゲトオクタン酸、２−ケト−３
−メルカプト１０ピオン酸、２−ケト−４−（メチルメ
ルカプ１〜）−酪酸、２−ケト−３−フェニルプロピオ
ン酸、２−ケト−４−フェニル醋酸、ベンゾイルギ酸、
フェニルピルビン酸等があけられる。

α−ケト酸としては水に難溶性を有すればよく、例えば
α−ケト酸の２価金属塩、更に具体的にはアルカリ土類
金属であるカルシウム、バリウム、ストロンチウム塩を
あげることができる。

又、中和剤としては、α−ケト酸、α−ヒドロキシ酸と
水にＨ，溶性の塩を形成するものであればいずれも公的
に用いることかできるが、例えば２価金属イオンを形成
するカルシウム、バリウム、ストロンチウム等のアルカ
リ土類金属塩かあけられる。具体的中和剤としては前述
の金属のもの、つまり、炭酸カルシウム、炭酸バリウム
、炭酸ストロンチウム等があげられる。

本発明に用いられる酵素としては、α−ケト酸を還元し
α−ヒドロキシ酸とする酵素であればいずれも好適に用
いることができる０例えばウシ心臓由来のし一乳酸デヒ
ドロゲナーゼ、微生物由来の酵素としてはスタフィロコ
ッカス　エピデーミジス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｅｐ＋ｄｅｒｏｌ−ｄｉｓ）　ＤＳＨ２０３４３０
イコノストツク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓ
ｔｏｃｎｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）　ＤＳＨ２０３４
３由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクトバチルス・
カセイ（Ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　
）　ＤＳＨ２０００８由来のＤ−２−ヒドロキシイソカ
プロン酸デヒドロゲナーゼ、ラクトバチルス・コア７７
、：Ｌ−サス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏｎｆ
ｕｓｕｓ）　ＤＳＨ２０１９６由来のＬ−２−ヒドロキ
シイソカプロン酸デヒドロゲナーゼ、ラクトバチルス・
クルバラス（Ｌａｃｔｏｂａｃ　ｉ　ｌ　ｌｕｓ　ｃ−
ｕｒｖａｔｕｓ　）　ＤＳＨ２００１由来のＤ−７ンデ
ル酸デヒドロゲナーゼ等があげられる。補酵素ＮＡＤＨ
を再生するための酵素としてはキャンディダ・ボイジニ
ー（Ｃａｎｄｉａ　ｂｏ＋ｂ−ｎｉｉ）　、クロストリ
ジウム・フォルミコアセチカム（Ｃ−ｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｎ　ｆｏｒｌｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｎ）　ＤＳＨ９２由
来のギ酸デヒドロギナーゼ、パン酵母由来のアルコール
デヒドロゲナーゼ等があげられる。ＮＡＤＰＨを再生す
るための酵素としては、ロイコノストック・メセンテロ
イデス（Ｌｅｕｃｏ−ｎｏｓｔｏｃ　ｎｃｓｅｎｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）由来のグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼが挙げられる。これらの酵素は市販品でも好適に
用いることができるし、生物より分離した天然そのまま
の酵素でも良いし、化学的に修飾した酵素、蛋白質工学
的に変異させた酵素であっても良い、更に、アクリルア
ミド、アルギン酸カルシウム等に固定化したしのでも良
い。

また、微生物自体としては例えばストレプトコッカス・
フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａ
ｌｉｓ）　ＩＦｏ　１２９６４、ラクトバチルス・カセ
イ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ　）　Ｉ
ＦＯ１２００４、ロイコンス１〜ツク・メセンテロイデ
ス・サブ・スピーシズ・テキストラニカム（Ｌｅｕｃｏ
ｎｏｓｔｏｃ　ｎｅｓｅｎｔｅ−ｒｏｉｄｅｓ　５ｕｂ
ｓｐ、　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕ　＞　ＩＦＯ３３４９、
ロイコメスｌ−ツタ　テキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎ
ｏｓｔｏｃ　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｎ　）ＩＦＯ３３４
７、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕ−ｃ
ｏｎｏｓｔｏｃ　１１ｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）　Ａ
ＨＵ　１０６７、ラクトバチルス・１ランクラム（Ｌｅ
ｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｐｌａｎｔａｒｕｌ）　ＡＨＵ　
３０７０等があげられる。

これらの微生物は、野生株、変異株、又は、細胞融合も
しくは遺伝子操作法等の遺伝的手法により誘導される組
み替え株など、いずれの株でも好適に用いることかでき
る。

尚、ＩＦＯ番号の付された微生物は（財）醗酵研究所（
ＩＦＯ）醗酵のＬｉ５ｔ　　ｏｆ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ
、第８版、第１巻（１９８８）に記載されており、該Ｉ
Ｆ０から入手することができる。ＡＨＵ番号の付された
微生物は日本微生物株保存連盟（ＪＦＣＣ）醗酵のＣａ
ｔａｌｏｇｕｅ　　ｏｆ　　Ｃｕ１ｔｕｒ’ｅｓ、第４
版、（１９８７）に記載されており、北海道大学農学部
から入手することができる。

本発明に使用される微生物の培養には、該微生物が増殖
し得るものであれば、いずれも好適に用いることができ
るか、具体的には、グルコース、フルクトース、シュク
ロース、デキストリン、デンプン等の糖類、ソルビトー
ル、エタノール、クリセロール等のアルコール類、フマ
ール類、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有ＦＲ酸
類及びその塩類、パラフィン等の炭化水素類などあるい
はこれらの混合物を炭素源とし、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、肉エキス等の有機窒素源を単独あるいは
混合物として窒素源とすることかできる。他に無機塩、
微量金属塩、ビタミン類等、通常の培養に用いられる栄
養源を適宜混合して用いることかできる。また、必要に
応じて、微生物の増殖を促進する因子、本発明の目的化
合物の生成能力を高める因子、あるいは培地のＰＨ保持
に有効な物質も添加できる。培養方法としてはＰＨは３
゜０〜９，５、好ましくは５〜８、培養温度は２０〜４
５°Ｃ１好ましくは２５〜３７゛Ｃで、嫌気的あるいは
好気的に、その微生物の生育に適した条件下５〜１２０
時間、好ましくは１２〜７２時間程度培養する。

還元反応の方法としては、還元すべきα−ケト酸又はα
ゲト酸塩の存在下に培養後の菌体培養物、そこから採取
した気体又はその処理物をα−ケト酸又はα−ケト酸塩
に作用させる場合、又は精製酵素及びその処理物を用い
る場合、のいずれでも実施することかできる。ここでい
う菌体の処理物とは、例えはホモジナイザー等による菌
体破砕物、アセトン処理、凍結乾燥などの処理を施した
もの、またこれらの菌体あるいは前述の処理を施したも
のを、例えばポリアクリルアミドゲル法、含硫酸多糖ゲ
ル法（カラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天
ゲル法などの公知の方法で固定化した物をも含む。

微生物培養後の菌体培養物から菌体を採取して反応させ
る場合、遠心分離などの方法で菌体を集めた後、そのま
ま、あるいは水または生理食塩水で洗浄した後、適当な
緩衝液に懸濁して、α−ケト酸又はその２価金属塩、あ
るいは２価金属塩の炭酸塩を加えて反応させる。

この反応の際、グルコース、シュクロース等の炭酸源を
エネルギー源とし添加したほうがよい場合もある。

基質であるα−ケト酸の加え方としては一遊離のα−ケ
ト酸を加える場合、２価金属の炭酸塩とともに加えても
良い。

精製酵素を用いる場合は、α−ケト酸を還元する酵素、
基質であるα−ケト酸、又はその２価金属塩、遊離酸の
場合はさらに２価金属の炭酸塩、補酵素であるＮＡＤＨ
又はＮＡＤＰＨ（これは該酵素により適当なほうを選択
する）を加え、さらに工業的に有利に実施するためには
、補酵素をリサイクルするための酵素、リサイクル酵素
の基質を加えて反応させる。酵素の量としては有利には
、Ｎ　Ａ　Ｄ　ＨあるいはＮＡＤＰＨリサイクル酵素の
活性と基質α−ケト酸還元酵素の活性の比が１：０．１
〜１：５であるような量でもって用いられる。ＮＡＤＨ
リサイクル酵素とその基質の組み合わせとしては、ギ酸
デヒドロゲナーゼ／ギ酸、又は、そのアルカリ金属塩系
、アルコールデヒドロゲナーゼ／エタノール系が有利で
あり、ＮＡ　Ｄ　Ｐ　Ｈリサイクル酵素とその基質の組
み合わせとじては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ／グルコース−６−リン酸、又はそのアルカリ金
属塩系が好適に用いられる。

反応の混合物は酵素反応に通常用いられているように、
ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５〜８の範囲で、温度は１
０〜６０℃、好ましくは、２０〜４０°Ｃの範囲で、１
〜１２０時間程度、攪拌下あるいは静置下で行う、基質
の添加濃度は０．１〜２０％、好ましくは０．５〜１０
％であるが、−括仕込みでもよいし、分割仕込みあるい
は連続仕込みを行うこともできる。中和剤の添加濃度は
、反応に好適なＰＨが保てる範囲となるよう必要量を加
えれば良いか、−殻内には０．０１〜１０％より、好ま
しくは０．５〜５％加える。補酵素は使用する酵素量に
よるが、−殻内には０．０１〜１０ｉＨ好ましくは０、
ＨｇＨ程度加える。

反応によって生成したα−ヒドロキシ酸の採取は、α−
ヒドロキシ酸の大半が不溶性の塩を形成しているので、
反応終了液を鉱酸類で酸性にし、α−ヒドロキシ酸を遊
離の酸とした後、適当な有機溶媒で抽出するのが効率的
である。抽出後は種々のカラムクロマトグラフィー、晶
折、活性炭処理等通常の方法で容易に生成することがで
きる。

（実施例）以下、本発明を具体的に実施例にて説明するが、本発明
はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

実施例に置ける反応生成物の定量は、逆相カラムを用い
る高速液体クロマトグラフィーにて行った（カラム：Ｎ
ｕｃｌｅｏｓｉｌ　１０Ｃ１８＋６４．６ｍ１ｘ２５０
ｎｌ、移動相：４０ｎＨカリウムリン酸バツフアーｐＨ
３，０／アセトニトリル＝４＝１、流速：　１　、　Ｏ
ｎｌ／ｎｉｎ、検出：２５４ｎｉ）。

また、光学純度の測定は、光学分割カラムを用いる高速
液体クロマトグラフィーにて行った（カラム：ダイセル
化学工業製　キラルパックＷＨ１φ４．６ｎｒｔ　ｘ２
５０ｕ、移動相：　０．２５ｎＨＣｕＳＯ４／アセトニ
トリル＝４：Ｌｉ速：１　、　Ｏｎｌ／ｎｉｎ　、検出
：２５４ｒ＋ｎ）。

実施例１、比較例１　　（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−
フェニル醋酸の製造グルコース８％、酵母エキス１％、ＭｎＳＯ４・４〜５
５Ｈ２Ｏ１０ｐｐよりなる借地２０００ｍ１を２．６Ｌ
容ミニジヤー（丸菱バイオエンジ製）にいれ、滅菌後、
ｔｅｕｃｏｎｏｓ　ｔｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　
５ｕｂｓｐ、　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｎ　ＩＦＯ３３４
９を植菌し、３０°Ｃ１１００ｒｐｉで１７時間培養し
た４培養植にはｐＨ電極を取り付け、２５％ＮａＯＨに
て、ｐＨを６．５〜７．０調節しなから培養した。培養
終了後、遠心分離にて菌体を分離し、菌体濃度０Ｄ６６
ｏが４０となるように蒸溜水に懸濁した。これを２００
ｍ１ずつ同じ２．６し容ミニジャーにいれ、さらに４０
％グルコース２０Ｃ）ｎｌ、６％２−ケト−４−フェニ
ル酪酸４００ｎｌ＜　Ｋ　ＯＨにて中和し、ｐＨ７゜０
に調整済み）を加えた。

培養槽ＡについてはさらにＣａ　ＣＯ３を２％加え、培
養槽Ｂにはｐ）ｌ電極を取り付け、２５％Ｎ　ａ　ＯＨ
Ｔ　ｐ　Ｈを６．５〜７．０に保ちながら、それぞれ３
０℃、１１００ｒｐで反応させた。（終濃度：２−ケト
−４−フェニル酪酸３％、グルコース１０％、菌体濃度
　０Ｄ６６ｏ−反応結果を表１に示す。

実施例２２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造クル
コース８％、酵母エキス１％、ペプトン１％、ＣａＣＯ
３５％、ＨｎＳＯ４−５〜６Ｈ２０１０ｐｐｎ、　Ｆｅ
ＳＯ４・７Ｈ２０１０００１、Ｎ　ａ　ＣＩ　１０ＤＤ
Ｉｌよりなる信地１００ｍ１を５００ｍ１容三角フラス
コに入れ、滅菌後、ｔｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｄｅｘ−
ｔｒａｎｉｃｕｎ　ＩＦＯ３３４７、Ｌｅｕｃｏｎｏｓ
ｔｏｃ　ｎｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　５ｕｂ−３Ｄ、
　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｎ　ＩＦＯ３３４９、ｔｅｕｃ
ｏｎｏｓｔｏｃ　ＩＩｅＳｅｎｔｅｒＯｌｄ−ｅｓ　Ａ
ＨＵ　１０６７を植菌した。３０℃で４０時間培養後、
それぞれ遠心分離にて菌体を分離し、蒸溜水に懸濁した
。

終濃度で菌体濃度０Ｄ６６ｏ−１０、グルコース１０％
、Ｃａ　ＣＯ３１％、２−ケト−４−フェニル酪酸４．
５％、反応液量２ｍｌとなるように反応液を調整し、　
φ２１ｍｍ試験管中、３０℃、４３時間反応させた。結
果を表２に示す。

Claims

【特許請求の範囲】１　水に難溶なα−ケト酸の無機塩を微生物又は酵素で
還元させることを特徴とするα−ヒドロキシ酸の製法２　α−ケト酸を水に難溶な無機塩の存在下で微生物又
は酵素で還元させることを特徴とするα−ヒドロキシ酸
の製法