JPH0473107B2 - - Google Patents
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- JPH0473107B2 JPH0473107B2 JP58241106A JP24110683A JPH0473107B2 JP H0473107 B2 JPH0473107 B2 JP H0473107B2 JP 58241106 A JP58241106 A JP 58241106A JP 24110683 A JP24110683 A JP 24110683A JP H0473107 B2 JPH0473107 B2 JP H0473107B2
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- G—PHYSICS
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般に、可溶性抗原および細胞表面
の抗原を検出するために有用な免疫検定法、さら
に詳しくは、固相表面上に形成された免疫学的反
応のパターンを用いる方法に関する。
の抗原を検出するために有用な免疫検定法、さら
に詳しくは、固相表面上に形成された免疫学的反
応のパターンを用いる方法に関する。
特異化された抗原類および／または特異的結合
パターン、抗体の検出は、近年、研究および臨床
的環境の両者において最も重要になつてきた。抗
原および抗体の検出は、種々の病気にしばしば関
係し、結局、診断においてならびに癌を含む病気
の形態発生ならびにそれらに対する治療の効果に
関する基本的理解を得るときに、きわめて有用で
ある。
パターン、抗体の検出は、近年、研究および臨床
的環境の両者において最も重要になつてきた。抗
原および抗体の検出は、種々の病気にしばしば関
係し、結局、診断においてならびに癌を含む病気
の形態発生ならびにそれらに対する治療の効果に
関する基本的理解を得るときに、きわめて有用で
ある。
結局、水性試料、すなわち、可溶性抗原、中に
見出される抗原、ならびに組織および細胞の表面
上に見出される抗原を検出する改良された方法
は、絶えす研究されている。典型的には、免疫検
定法は、用いる速度／設備により、および感度に
より、特徴づけられるであろう。
見出される抗原、ならびに組織および細胞の表面
上に見出される抗原を検出する改良された方法
は、絶えす研究されている。典型的には、免疫検
定法は、用いる速度／設備により、および感度に
より、特徴づけられるであろう。
したがつて、本発明の目的は、自動化および半
自動化された器具において使用可能な新しくかつ
新規な方法を提供することである。本発明の他の
目的は、検出すべき抗原に対して望ましいほどに
高いレベルの感度を有する免疫検定法を提供する
ことである。さらに、本発明の他の目的は、すぐ
れた信号対ノイズ比を有する信号の発生するノイ
ズ減少技術を組み込んだ方法を提供することであ
る。
自動化された器具において使用可能な新しくかつ
新規な方法を提供することである。本発明の他の
目的は、検出すべき抗原に対して望ましいほどに
高いレベルの感度を有する免疫検定法を提供する
ことである。さらに、本発明の他の目的は、すぐ
れた信号対ノイズ比を有する信号の発生するノイ
ズ減少技術を組み込んだ方法を提供することであ
る。
本発明の目的に従えば、表面へ特定化されたパ
ターンで結合された適当な抗体（すなわち、検出
すべき特定の抗原に対して特異的である抗体）を
有する表面を用いることにより、試料溶液内に可
溶化された抗原あるいは細胞の表面上に位置する
抗原を検出することができる、方法が提供され
る。これらのパターンは、抗体の存在区域及び不
存在区域が交互に配置された区域により便利に生
成され、従来技術により一般に提供されるものよ
りも、すぐれた信号対ノイズ比を有する標識の存
在に応答性の信号を発生させることができる。
ターンで結合された適当な抗体（すなわち、検出
すべき特定の抗原に対して特異的である抗体）を
有する表面を用いることにより、試料溶液内に可
溶化された抗原あるいは細胞の表面上に位置する
抗原を検出することができる、方法が提供され
る。これらのパターンは、抗体の存在区域及び不
存在区域が交互に配置された区域により便利に生
成され、従来技術により一般に提供されるものよ
りも、すぐれた信号対ノイズ比を有する標識の存
在に応答性の信号を発生させることができる。
抗原と抗体の間の免疫学的反応は、抗体を取り
付けてあるいは付着して有する表面の中あるいは
上でのみ実質的に起こるが、抗体が存在しない区
域においては起こらない。補助の標識付け抗原
を、抗体結合部位のための試料からの抗原と拮抗
（compete）させる。標識を検出できる検出体と
向かい合つている表面を移送することにより、抗
体をもつ区域と抗体をもたない区域との間におけ
る標識の測定可能なレベルの差を表わす信号を得
ることができる。この反復的信号は、よく知られ
た従来法に従い電子的および／または数学的に便
利に分析して、試料中に本来存在する抗原の量を
決定することができる。
付けてあるいは付着して有する表面の中あるいは
上でのみ実質的に起こるが、抗体が存在しない区
域においては起こらない。補助の標識付け抗原
を、抗体結合部位のための試料からの抗原と拮抗
（compete）させる。標識を検出できる検出体と
向かい合つている表面を移送することにより、抗
体をもつ区域と抗体をもたない区域との間におけ
る標識の測定可能なレベルの差を表わす信号を得
ることができる。この反復的信号は、よく知られ
た従来法に従い電子的および／または数学的に便
利に分析して、試料中に本来存在する抗原の量を
決定することができる。
あるいは、いわゆるサンドイツチ技術を用いる
ことができ、これにより検出すべき抗原に類似す
る、抗原またはハプテン（haptens）を表面上に
付着させ、抗体をそれと反応させ、次いで検出す
べき抗原を含有する試料を添加する。最後に、こ
れらの暴露された抗原を標識付け抗体の適用によ
り検出する。標識および引き続く信号の取り扱い
は、それ以外は、説明する拮抗的手順と同一であ
ろう。
ことができ、これにより検出すべき抗原に類似す
る、抗原またはハプテン（haptens）を表面上に
付着させ、抗体をそれと反応させ、次いで検出す
べき抗原を含有する試料を添加する。最後に、こ
れらの暴露された抗原を標識付け抗体の適用によ
り検出する。標識および引き続く信号の取り扱い
は、それ以外は、説明する拮抗的手順と同一であ
ろう。
蛍光を用いるもののような種々の標識付け技術
と組み合せて流れ細胞測定法（cytometry）の原
理を、溶液中にあるいは細胞表面上に存在する抗
原の測定および定量に適用することができる。標
識として蛍光色素または蛍光染料を使用すること
は本発明にとくに適するが、他の型の標識は同等
に好適であろう。簡素化の目的で、考察は蛍光染
料の使用に限定するが、他の標識、たとえば、金
属粒子（コロイド状金）、酵素、ラジオアイソト
ープなどを同等に容易に使用できるであろう。
と組み合せて流れ細胞測定法（cytometry）の原
理を、溶液中にあるいは細胞表面上に存在する抗
原の測定および定量に適用することができる。標
識として蛍光色素または蛍光染料を使用すること
は本発明にとくに適するが、他の型の標識は同等
に好適であろう。簡素化の目的で、考察は蛍光染
料の使用に限定するが、他の標識、たとえば、金
属粒子（コロイド状金）、酵素、ラジオアイソト
ープなどを同等に容易に使用できるであろう。
従来の免疫検定技術において直面する典型的な
問題は、所望の感度を獲得するためには信号対ノ
イズ比が十分に高くなるということである。典型
的には、バツクグラウンドの蛍光は、とくに信号
が普通に低い抗原濃度により占められている弱い
免疫学的反応によつて発生されるとき、所望の信
号をマスクするはたらきをする。本発明は、周期
的参照信号の助けにより分析される周期的信号を
発生する、ノイズ減少技術を利用することによ
り、この問題を回避する新規な方法を提供する。
これは、テープのストリツプにより適供されるよ
うな表面上の特定化されかつ区分された区域にた
いする、抗原−抗体の免疫学的反応を減少するこ
とにより達成される。さらに、本発明は拮抗的阻
害型検定およびサンドイツチ型検定の両者に対し
て同等に適用可能である。前者の検定型におい
て、所望の抗原に対する抗体を表面上にあるいは
テープ自体内に、いずれの場合においても、特定
の反復するパターンが生成されるように交互する
特定化された位置において、付着させるが、後者
において、抗原は抗体の代わりに付着され、抗体
−抗原−抗体の架橋が生成される。第１型の検定
は、概念的に理解容易であるので、それをまず詳
しく説明する。
問題は、所望の感度を獲得するためには信号対ノ
イズ比が十分に高くなるということである。典型
的には、バツクグラウンドの蛍光は、とくに信号
が普通に低い抗原濃度により占められている弱い
免疫学的反応によつて発生されるとき、所望の信
号をマスクするはたらきをする。本発明は、周期
的参照信号の助けにより分析される周期的信号を
発生する、ノイズ減少技術を利用することによ
り、この問題を回避する新規な方法を提供する。
これは、テープのストリツプにより適供されるよ
うな表面上の特定化されかつ区分された区域にた
いする、抗原−抗体の免疫学的反応を減少するこ
とにより達成される。さらに、本発明は拮抗的阻
害型検定およびサンドイツチ型検定の両者に対し
て同等に適用可能である。前者の検定型におい
て、所望の抗原に対する抗体を表面上にあるいは
テープ自体内に、いずれの場合においても、特定
の反復するパターンが生成されるように交互する
特定化された位置において、付着させるが、後者
において、抗原は抗体の代わりに付着され、抗体
−抗原−抗体の架橋が生成される。第１型の検定
は、概念的に理解容易であるので、それをまず詳
しく説明する。
さらに、本発明の原理および範囲を、図面を参
照しながら説明する。
照しながら説明する。
テープ１０によつて形成されるような表面が、
第２図に描かれている。区域１１はそれに取り付
けられた抗体を有するが、区域１２は抗体の不存
在によつて特徴づけられる。区域１１および１２
は、後述するゲート・トラツク・コントロール区
域１６と対照的に、テープ１０の区画１５に限定
される。容易に理解されるように、区域の形状
は、本発明の目的および原理を逸脱しないで、大
きく変化させることができる。
第２図に描かれている。区域１１はそれに取り付
けられた抗体を有するが、区域１２は抗体の不存
在によつて特徴づけられる。区域１１および１２
は、後述するゲート・トラツク・コントロール区
域１６と対照的に、テープ１０の区画１５に限定
される。容易に理解されるように、区域の形状
は、本発明の目的および原理を逸脱しないで、大
きく変化させることができる。
次いで、抗体を取り付けられたテープを既知量
の蛍光化抗原とともに有利に保温することができ
る。蛍光化抗原は、試料内の定量すべき抗原と同
様に、テープへ付着された抗体に対して同等に反
応性（あるいは少なくとも比較的既知のレベル
で）である。こうして、蛍光化抗原および試料の
抗原は、存在する抗体結合部位について拮抗す
る。次いで、結合しない抗原は、理想的には、除
去される。これは標準的洗浄技術により、たとえ
ば、テープをバツチまたはスプレーに通過させる
ことにより、有利に達成される。
の蛍光化抗原とともに有利に保温することができ
る。蛍光化抗原は、試料内の定量すべき抗原と同
様に、テープへ付着された抗体に対して同等に反
応性（あるいは少なくとも比較的既知のレベル
で）である。こうして、蛍光化抗原および試料の
抗原は、存在する抗体結合部位について拮抗す
る。次いで、結合しない抗原は、理想的には、除
去される。これは標準的洗浄技術により、たとえ
ば、テープをバツチまたはスプレーに通過させる
ことにより、有利に達成される。
第１図を参照すると、テープはその後、標準の
光学的装置の使用により、それを照明することが
できる器具を通過する。この光学的装置は、たと
えば、光源１、レンズ２，１１′、フイルター３、
開口４、および鏡５を含む。生ずる全体の蛍光
は、再び、よく知られた装置、たとえば、レンズ
１１′、開口６、レンズ７、フイルター８および
光電子増倍管９からなる装置により、測定され
る。テープが収束された光源を通過するとき、交
互に配置された、抗体を含有する区域および抗体
を含有しない区域は、照明されるであろう。
光学的装置の使用により、それを照明することが
できる器具を通過する。この光学的装置は、たと
えば、光源１、レンズ２，１１′、フイルター３、
開口４、および鏡５を含む。生ずる全体の蛍光
は、再び、よく知られた装置、たとえば、レンズ
１１′、開口６、レンズ７、フイルター８および
光電子増倍管９からなる装置により、測定され
る。テープが収束された光源を通過するとき、交
互に配置された、抗体を含有する区域および抗体
を含有しない区域は、照明されるであろう。
抗体を含有する区域は、それへ結合した標識抗
原をある比率で有することを期待できる。その量
は、試料中の抗原により発生される抗体結合部位
の拮抗のレベルに依存するであろう。こうして、
抗体をもたない区域、結局蛍光性抗原がそれに結
合していない区域において、非常に低いかあるい
は蛍光の不存在の信号が測定されるであろう。完
全に製作されている場合、これらの区域は、事実
上信号を提供しないが、実際には、代表的信号
は、バツクグラウンドを表わす、多少高いとはい
え雑音のレベル（第１Ａ図中のV1はこの図にお
いて完全に一定のレベルとして理想化されてい
る）を有する。対照的に、抗体を有し、結局ある
量の蛍光化抗原をそれに結合して有する区域は、
より高いレベルの信号V2が光電子増倍管
（PMT）により検出されるであろう。信号の分析
は、第１図中に描かれかつ後述するゲート・コン
トロール・トラツクおよび関連する回路により調
整されるであろう。検出器と向かい合う大きさが
制限された区域の相対的移送のため（テープより
はむしろ検出器を動かすことが有利であろう）、
このPMT誘導信号は性質が周期的であり、そし
てこの特性を利用することにより、すぐれた信号
対ノイズの信号を得ることができる。蛍光が高い
レベルおよび低いレベルの間の差は、試料または
血清中に存在する抗原の量に反比例し、そして後
述するように、スイツチまたはゲート付きの合計
技術により増大することができるであろう。
原をある比率で有することを期待できる。その量
は、試料中の抗原により発生される抗体結合部位
の拮抗のレベルに依存するであろう。こうして、
抗体をもたない区域、結局蛍光性抗原がそれに結
合していない区域において、非常に低いかあるい
は蛍光の不存在の信号が測定されるであろう。完
全に製作されている場合、これらの区域は、事実
上信号を提供しないが、実際には、代表的信号
は、バツクグラウンドを表わす、多少高いとはい
え雑音のレベル（第１Ａ図中のV1はこの図にお
いて完全に一定のレベルとして理想化されてい
る）を有する。対照的に、抗体を有し、結局ある
量の蛍光化抗原をそれに結合して有する区域は、
より高いレベルの信号V2が光電子増倍管
（PMT）により検出されるであろう。信号の分析
は、第１図中に描かれかつ後述するゲート・コン
トロール・トラツクおよび関連する回路により調
整されるであろう。検出器と向かい合う大きさが
制限された区域の相対的移送のため（テープより
はむしろ検出器を動かすことが有利であろう）、
このPMT誘導信号は性質が周期的であり、そし
てこの特性を利用することにより、すぐれた信号
対ノイズの信号を得ることができる。蛍光が高い
レベルおよび低いレベルの間の差は、試料または
血清中に存在する抗原の量に反比例し、そして後
述するように、スイツチまたはゲート付きの合計
技術により増大することができるであろう。
第１Ａ図は、本発明のPMTから生ずる信号の
型をグラフで示す。V1およびV2の相対的大きさ
は一定の割合で描かれておらず、むしろ波形の周
期的性質、それらのグラウンドからの差（OV）
を強調し、さらに理想的な正方形の波の信号を図
解する。実際には、検出される信号は系の物理
的・電子的不完全性、たとえば、ノイズ、表面上
の不完全な境界などを反映するであろう。
型をグラフで示す。V1およびV2の相対的大きさ
は一定の割合で描かれておらず、むしろ波形の周
期的性質、それらのグラウンドからの差（OV）
を強調し、さらに理想的な正方形の波の信号を図
解する。実際には、検出される信号は系の物理
的・電子的不完全性、たとえば、ノイズ、表面上
の不完全な境界などを反映するであろう。
それにもかかわらず、レベルの差、すなわち、
V2−V1、ここでV2は抗体を含有するテープの区
域において測定された蛍光のレベルであり、そし
てV1は抗体を含有しない区域において測定して
蛍光のレベルである、はゲート付き積分器を使用
して有利に増大することができるでろう。
V2−V1、ここでV2は抗体を含有するテープの区
域において測定された蛍光のレベルであり、そし
てV1は抗体を含有しない区域において測定して
蛍光のレベルである、はゲート付き積分器を使用
して有利に増大することができるでろう。
ゲート付き積分器は、次ぎのように操作される
合計装置である：ゲート・トラツク（後述する）
と同期する時間間隔で、信号は正にまたは負に積
分される。各信号における差V2−V1は、前の差
信号に関して合計（積分）される。こうして、所
望の成分V2は前の所望の信号成分、前のV2に密
着して加えられる。なぜなら、これらの所望の信
号成分は正に積分され、一方バツクグラウンドの
信号V1は負に積分されるからである。正または
負の積分のこの切り換えは、ゲート・トラツク・
リーダーから誘導される信号に応答して、標準の
積分器の正または負の部分へPMT信号をゲート
する（gating）ことにより達成される。ゲート・
トラツク・リーダーの信号は、第１図に描かれて
いるように、ゲートおよびインバーターへ供給さ
れる。ゲートはPMT信号の積分器への入力をコ
ントロールする。こうして、本発明の物理的・電
子的面の賢明なタイミングは、所望信号成分−
（マイナス）バツクグラウンド信号を加えるため
に、PMT信号の差の合計を許す。
合計装置である：ゲート・トラツク（後述する）
と同期する時間間隔で、信号は正にまたは負に積
分される。各信号における差V2−V1は、前の差
信号に関して合計（積分）される。こうして、所
望の成分V2は前の所望の信号成分、前のV2に密
着して加えられる。なぜなら、これらの所望の信
号成分は正に積分され、一方バツクグラウンドの
信号V1は負に積分されるからである。正または
負の積分のこの切り換えは、ゲート・トラツク・
リーダーから誘導される信号に応答して、標準の
積分器の正または負の部分へPMT信号をゲート
する（gating）ことにより達成される。ゲート・
トラツク・リーダーの信号は、第１図に描かれて
いるように、ゲートおよびインバーターへ供給さ
れる。ゲートはPMT信号の積分器への入力をコ
ントロールする。こうして、本発明の物理的・電
子的面の賢明なタイミングは、所望信号成分−
（マイナス）バツクグラウンド信号を加えるため
に、PMT信号の差の合計を許す。
さらに図面を参照すると、ゲート・コントロー
ル・トラツク１６は、有利には、抗体含有区域に
近接して位置し、そして抗体含有区域の開始およ
び終了を示す。さらに、このようなゲート・コン
トロール・トラツクは、有利には、種々の型の抗
体でテープ、デイスクまたは他の表面の異なる区
域をコーテイングすることを可能とし、あるいは
多数のコントロールを可能とする。こうして、コ
ントロール・トラツクは、種々の試験物質、抗体
および／またはコントロールの存在ならびに異な
る試験を信号にすることができるであろう。
ル・トラツク１６は、有利には、抗体含有区域に
近接して位置し、そして抗体含有区域の開始およ
び終了を示す。さらに、このようなゲート・コン
トロール・トラツクは、有利には、種々の型の抗
体でテープ、デイスクまたは他の表面の異なる区
域をコーテイングすることを可能とし、あるいは
多数のコントロールを可能とする。こうして、コ
ントロール・トラツクは、種々の試験物質、抗体
および／またはコントロールの存在ならびに異な
る試験を信号にすることができるであろう。
制限された数の区域、すなわち、１つの試料お
よび１つの参照位置と反対に、とくに有利なスト
リツプタイプのフオーマツト（fomat）におけ
る、多数の区域の利点は、支持体へ抗原を結合す
るための非特異的結合または他の空間的不均質性
が、試料および参照区域の寸法に等しいかあるい
はそれより大きい、比較的大きい空間的周期をも
つことができる、ということである。多数のスト
リツプを、これらのバツクグラウンドの非均質性
より高い空間的度数で使用することにより、生ず
る、ゆつくり変化するバツクグラウンドの検出信
号は、前述の周期的ゲーテイングまたはゲート付
き積分器の使用により、大部分を拒絶することが
できる。
よび１つの参照位置と反対に、とくに有利なスト
リツプタイプのフオーマツト（fomat）におけ
る、多数の区域の利点は、支持体へ抗原を結合す
るための非特異的結合または他の空間的不均質性
が、試料および参照区域の寸法に等しいかあるい
はそれより大きい、比較的大きい空間的周期をも
つことができる、ということである。多数のスト
リツプを、これらのバツクグラウンドの非均質性
より高い空間的度数で使用することにより、生ず
る、ゆつくり変化するバツクグラウンドの検出信
号は、前述の周期的ゲーテイングまたはゲート付
き積分器の使用により、大部分を拒絶することが
できる。
別のサンドイツチ型検定において、検出すべき
抗原に対して免疫学的に類似する反応性を有する
抗原、すなわち、それらは用語がこの分野におい
て普通に理解されているハプテンであることがで
きる、を抗体の代わりに表面へ付着することがで
きる。ちなみに、このフオーマツトにおいて、本
発明は流体の試料中の抗体の存在を検出するため
に使用することができ、こうして診断分野におい
てそれ以上の利点および重要性をさらに有する。
抗原に対して免疫学的に類似する反応性を有する
抗原、すなわち、それらは用語がこの分野におい
て普通に理解されているハプテンであることがで
きる、を抗体の代わりに表面へ付着することがで
きる。ちなみに、このフオーマツトにおいて、本
発明は流体の試料中の抗体の存在を検出するため
に使用することができ、こうして診断分野におい
てそれ以上の利点および重要性をさらに有する。
次いで、１系列の免疫学的反応により、交互に
配置された抗体−抗原のレベルのサンドイツチが
つくられる。すべての抗原的に反応性の部位をお
おうように、表面の抗原を過剰の抗体と反応させ
る。抗原をもつ試料をそれと反応させ、次いで標
識抗体と反応させる。このようにして抗体は試料
の抗原により供給された抗原部位へのみ付着し、
結局、検出可能な標識のレベルを試料中の抗原の
量および存在へ関係ずけることができる。PMT
信号（すなわち、検出可能な標識）の検出および
分析は、すべて他の面において前述のものと同一
である。
配置された抗体−抗原のレベルのサンドイツチが
つくられる。すべての抗原的に反応性の部位をお
おうように、表面の抗原を過剰の抗体と反応させ
る。抗原をもつ試料をそれと反応させ、次いで標
識抗体と反応させる。このようにして抗体は試料
の抗原により供給された抗原部位へのみ付着し、
結局、検出可能な標識のレベルを試料中の抗原の
量および存在へ関係ずけることができる。PMT
信号（すなわち、検出可能な標識）の検出および
分析は、すべて他の面において前述のものと同一
である。
さらに他の簡単なサンドイツチ技術は、検出す
べき試料の抗原に対して特異性の表面上に第１の
抗体を付着することを含む。付着した第１抗体と
試料を接触させ、そして未反応の物質を除去した
後、第２標識抗体を抗原と、第１抗体が特異性で
あるものと異なるエピトープ部位（epitopic
site）において、反応させる。引き続く検出およ
び分析は、前述したとおりである。
べき試料の抗原に対して特異性の表面上に第１の
抗体を付着することを含む。付着した第１抗体と
試料を接触させ、そして未反応の物質を除去した
後、第２標識抗体を抗原と、第１抗体が特異性で
あるものと異なるエピトープ部位（epitopic
site）において、反応させる。引き続く検出およ
び分析は、前述したとおりである。
同様に、本発明の原理を用いて、選択した細胞
表面の抗原の存在あるいはこのような表面の抗原
を含有する細胞の存在を決定することができる。
これは、細胞を、検出すべき細胞表面の抗原に対
して特異性の抗体を特定した区域に付着して有す
る表面と、接触させることによつて達成すること
ができる。標準の免疫学的反応のおかげで、所望
の細胞の表面の抗原を有する細胞は、抗体を含有
するテープの区域へ付着される。
表面の抗原の存在あるいはこのような表面の抗原
を含有する細胞の存在を決定することができる。
これは、細胞を、検出すべき細胞表面の抗原に対
して特異性の抗体を特定した区域に付着して有す
る表面と、接触させることによつて達成すること
ができる。標準の免疫学的反応のおかげで、所望
の細胞の表面の抗原を有する細胞は、抗体を含有
するテープの区域へ付着される。
あるいは、抗原を有利に用いてテープの特定区
域を被覆することができ（抗原はしばしば安定で
あり、こうして抗体よりも容易に取り扱われる）
そしてサンドイツチ技術または抗体架橋を用い
て、抗原をテープ上に存在させて、問題の抗原を
含有する細胞を付着することができる。いずれの
場合においても、細胞は次いで有利にこの分野の
常用の技術により着色される。たとえば、細胞は
フルオスレセインジアセテートで着色することが
できる。この試薬は、遊離溶液中において、フル
オスレセイン（蛍光部分）はアセテート部分によ
り消滅されるので、蛍光性ではない。このような
着色物は典型的には細胞中へ吸着され、ここで、
それはアセテート部分を開裂する細胞のエステラ
ーゼの存在下に蛍光性となる。
域を被覆することができ（抗原はしばしば安定で
あり、こうして抗体よりも容易に取り扱われる）
そしてサンドイツチ技術または抗体架橋を用い
て、抗原をテープ上に存在させて、問題の抗原を
含有する細胞を付着することができる。いずれの
場合においても、細胞は次いで有利にこの分野の
常用の技術により着色される。たとえば、細胞は
フルオスレセインジアセテートで着色することが
できる。この試薬は、遊離溶液中において、フル
オスレセイン（蛍光部分）はアセテート部分によ
り消滅されるので、蛍光性ではない。このような
着色物は典型的には細胞中へ吸着され、ここで、
それはアセテート部分を開裂する細胞のエステラ
ーゼの存在下に蛍光性となる。
なお他の実施態様において、本発明を用いて細
胞の抗原に対して特異性の血清抗体、たとえば、
赤血球の型決定（typing）抗原（Ａ、Ｂ、AB、
Ｏ、Ｄ）の存在を決定することができる。このよ
うな試験は次ぎの方法により達成することができ
る。血液の型に特異性の抗原を含有する細胞を、
テープの特定区域または他の表面、これらの区域
はゲート・コントロール・トラツクによりコード
化されている、へ適用する。次いで、このように
処理されたテープを試料の血清中に通過させる。
条件は、テープ上に存在する細胞と血清中に存在
する抗体との間に免疫学的反応を許すように、適
当に調整される。次いで、テープを洗浄して、た
とえば、スプレーによりあるいは引き続く浴によ
り、洗浄して未反応物質を除去し、蛍光化クーム
ス血清中に通過させる。結局、テープを前述のよ
うな装置により読取り、次いで蛍光はゲート・コ
ントロール・トラツクの助けにより検出し、個体
または動物の血液型を決定することができる。
胞の抗原に対して特異性の血清抗体、たとえば、
赤血球の型決定（typing）抗原（Ａ、Ｂ、AB、
Ｏ、Ｄ）の存在を決定することができる。このよ
うな試験は次ぎの方法により達成することができ
る。血液の型に特異性の抗原を含有する細胞を、
テープの特定区域または他の表面、これらの区域
はゲート・コントロール・トラツクによりコード
化されている、へ適用する。次いで、このように
処理されたテープを試料の血清中に通過させる。
条件は、テープ上に存在する細胞と血清中に存在
する抗体との間に免疫学的反応を許すように、適
当に調整される。次いで、テープを洗浄して、た
とえば、スプレーによりあるいは引き続く浴によ
り、洗浄して未反応物質を除去し、蛍光化クーム
ス血清中に通過させる。結局、テープを前述のよ
うな装置により読取り、次いで蛍光はゲート・コ
ントロール・トラツクの助けにより検出し、個体
または動物の血液型を決定することができる。
テープの代わりに種々のものを有利に使用する
ことができる。このようなものの例は、抗体を交
互に含有しかつ含有しない、半径が定められた区
域を有するデイスクのような表面である。明らか
なように、このような実施態様において、好まし
い動き（あるいは、検出器に関する有効移動）は
テープに関連する直線型と反対に回転型であろ
う。さらになお他の実施態様は、写真スライドの
ような表面の製造を包含し、このような表面は完
全に照明することができ、そして検出器を動かし
て特定区域の漸次的呼掛けまたは検出を達成する
ことができる。適当な代わりのものを用いると、
このれらのすべての別々の実施態様を前述の考察
におけるテープの代わりに使用することができ
る。
ことができる。このようなものの例は、抗体を交
互に含有しかつ含有しない、半径が定められた区
域を有するデイスクのような表面である。明らか
なように、このような実施態様において、好まし
い動き（あるいは、検出器に関する有効移動）は
テープに関連する直線型と反対に回転型であろ
う。さらになお他の実施態様は、写真スライドの
ような表面の製造を包含し、このような表面は完
全に照明することができ、そして検出器を動かし
て特定区域の漸次的呼掛けまたは検出を達成する
ことができる。適当な代わりのものを用いると、
このれらのすべての別々の実施態様を前述の考察
におけるテープの代わりに使用することができ
る。
さらに、細胞の代わりのものを前述の種々の実
施態様において有利に使用することができ、これ
らには、たとえば、ラテツクス粒子が包含され
る。このような粒子は、典型的には、細胞よりは
苛酷な機械的および／または化学的処理に耐える
ことができるので、好ましい。また、ラテツクス
粒子は、コーテイングおよびへりの限定を最適化
するために、より有用であることが明らかとなる
であろう。
施態様において有利に使用することができ、これ
らには、たとえば、ラテツクス粒子が包含され
る。このような粒子は、典型的には、細胞よりは
苛酷な機械的および／または化学的処理に耐える
ことができるので、好ましい。また、ラテツクス
粒子は、コーテイングおよびへりの限定を最適化
するために、より有用であることが明らかとなる
であろう。
光りに基づく細胞測定装置、たとえば、本出願
人から入手できるもの、の他の原理を、本発明の
方法および原理と組み合せて使用することができ
る。たとえば、第３図を参照すると、全体の蛍光
を検出する別の方法は、テープから反射された光
り（検出器２０および２３）、透過したあるいは
テープにより吸収された光り（検出器３６）、固
有蛍光対結合された蛍光および多蛍光色（検出器
２０，２３）の検出を含む。たとえば、第１つの
色を抗体に対して特別に使用し、そして第２の色
を非特異的抗原へ標識付けすることができる。他
の実施態様は、ゲート・コントロール・トラツク
および抗体区域に加えて参照チヤンネルを有する
テープ１０の使用を包含する。このような参照信
号は、表面上に同時に実施できる試験の数または
種類を拡張するためにとくに便利であろう。透過
された信号、散乱された信号および蛍光の特定の
検出のために、干渉フイルター２８，２２，２５
および３４ならびに検出器２０，２３，３６それ
ら自体（開口２１，２４，３５と一緒に）を、こ
の分野においてよく知られた技術に従い調整する
ことができる。
人から入手できるもの、の他の原理を、本発明の
方法および原理と組み合せて使用することができ
る。たとえば、第３図を参照すると、全体の蛍光
を検出する別の方法は、テープから反射された光
り（検出器２０および２３）、透過したあるいは
テープにより吸収された光り（検出器３６）、固
有蛍光対結合された蛍光および多蛍光色（検出器
２０，２３）の検出を含む。たとえば、第１つの
色を抗体に対して特別に使用し、そして第２の色
を非特異的抗原へ標識付けすることができる。他
の実施態様は、ゲート・コントロール・トラツク
および抗体区域に加えて参照チヤンネルを有する
テープ１０の使用を包含する。このような参照信
号は、表面上に同時に実施できる試験の数または
種類を拡張するためにとくに便利であろう。透過
された信号、散乱された信号および蛍光の特定の
検出のために、干渉フイルター２８，２２，２５
および３４ならびに検出器２０，２３，３６それ
ら自体（開口２１，２４，３５と一緒に）を、こ
の分野においてよく知られた技術に従い調整する
ことができる。
さらに、上において考察したすべての抗原−抗
体反応は免疫学的反応を実施するための適当な条
件に依存することを、理解すべきでる。また、抗
原、ハプテンまたは配位子の選択および配位子が
結合するパートナー、すなわち、抗体またはその
反応性部分、これらのすべての用語は普通に用い
られている、は、免疫学的反応が実際に起こるよ
うに、それらの反応性、特異性および親和性に従
うことが、仮定される。こうして、用語の抗原お
よび抗体は、本発明に総称的に適用され、こうし
て免疫学分野において普通に理解されているすべ
ての可能な免疫学的変法を包含するこを、理解す
べきである。
体反応は免疫学的反応を実施するための適当な条
件に依存することを、理解すべきでる。また、抗
原、ハプテンまたは配位子の選択および配位子が
結合するパートナー、すなわち、抗体またはその
反応性部分、これらのすべての用語は普通に用い
られている、は、免疫学的反応が実際に起こるよ
うに、それらの反応性、特異性および親和性に従
うことが、仮定される。こうして、用語の抗原お
よび抗体は、本発明に総称的に適用され、こうし
て免疫学分野において普通に理解されているすべ
ての可能な免疫学的変法を包含するこを、理解す
べきである。
一般に、それゆえ、上の考察、図面ならびに開
示から、本発明の精神および範囲を逸脱しないで
本発明の種々の変更を誘導することができること
は、当業差にとつて明らかであろう。
示から、本発明の精神および範囲を逸脱しないで
本発明の種々の変更を誘導することができること
は、当業差にとつて明らかであろう。
第１図は、好ましい実施態様における本発明の
操作を線図的に描く。第１Ａ図は、周期的、光電
子増倍管が検出した信号を示す。第２図は、テー
プ型表面上に付着した交互に配置された区域を有
するパターンを示す。第３図は、本発明の別の実
施態様を示す。 １……光源、２……レンズ、３……フイルタ
ー、４……開口、５……鏡、６……開口、７……
レンズ、８……フイルター、９……光電子増倍
管、１０……テープ、１１……区域、１２……区
域、１５……区画、１６……ゲート・トラツク・
コントロール区画、２０……検出器、２１……開
口、２２……干渉フイルター、２３……検出器、
２４……開口、２５……干渉フイルター、２８…
…干渉フイルター、３４……干渉フイルター、３
５……開口、３６……検出器。
操作を線図的に描く。第１Ａ図は、周期的、光電
子増倍管が検出した信号を示す。第２図は、テー
プ型表面上に付着した交互に配置された区域を有
するパターンを示す。第３図は、本発明の別の実
施態様を示す。 １……光源、２……レンズ、３……フイルタ
ー、４……開口、５……鏡、６……開口、７……
レンズ、８……フイルター、９……光電子増倍
管、１０……テープ、１１……区域、１２……区
域、１５……区画、１６……ゲート・トラツク・
コントロール区画、２０……検出器、２１……開
口、２２……干渉フイルター、２３……検出器、
２４……開口、２５……干渉フイルター、２８…
…干渉フイルター、３４……干渉フイルター、３
５……開口、３６……検出器。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水性試料中の抗原の存在を決定する方法であ
つて、 (a) 決定すべき抗原に対して特異性であり、特異
性化されたパターンの区域において適用された
第１抗体を有する表面手段を準備し、 前記区域には、前記第１抗体の存在区域およ
び不存在区域が交互に配置されており、 該表面手段が、前記第１抗体の存在区域およ
び不存在区域のパターンに対応するゲート・ト
ラツク・コントロール手段を含み、 (b) 前記第１抗体が決定すべき抗原について有す
るのと同一の反応性を実質的に有する、既知量
の標識抗原を含有する水溶液をさらに準備し、 (c) 前記水性試料および前記水溶液を、前記手段
と接触させ、前記接触の条件は、免疫学的反応
を発生させ、これにより前記抗体が前記第１抗
体へ結合できるようにするために適当であり、 (d) 前記表面手段上の前記第１抗体と免疫学的に
反応しなかつた決定すべき前記抗原および前記
標識抗原を除去し、 (e) ゲート・トラツク・コントロール検出手段に
よつて、前記ゲート・トラツク・コントロール
手段を検出し、結合した標識抗原を、光り手段
により照明しかつ前記標識抗原への前記照明の
効果を検出手段により検出し、これにより前記
標識抗原の存在に応じた信号を発生させ、 (f) 前記表面手段を前記検出手段に関して移動さ
せ、 (g) 前記ゲート・トラツク・コントロール検出手
段によつて付勢されるゲートを有する積分手段
によつて前記信号を分析し、これにより前記水
性試料中の抗原の存在を決定する ことを含むことを特徴とする、水性試料中の抗原
の存在を決定する方法。 ２ 前記標識は蛍光染料であり、前記光り手段は
照明光の周波数が前記標識を蛍光性とさせるよう
に選択され、そして前記照明の効果を検出する工
程は前記標識と関連する全体の蛍光を検出するこ
とからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 除去工程は、前記表面手段の洗浄、前記表面
手段のスプレー処理、および前記前記表面手段の
洗浄とスプレー処理との組み合わせから成る群よ
り選ばれた作業により達成される特許請求の範囲
第２項記載の方法。 ４ 前記照明の効果を検出する工程は、全体の蛍
光の検出、前記表面手段から反射された光りの検
出、前記表面手段を透過した光りの検出、全体の
蛍光および全体の蛍光の真のレベルを評価できる
ようにする参照として使用する前記表面手段の固
有蛍光の検出、前記抗体へ特異的に結合した第１
蛍光染料および前記標識抗原へ非特異的に結合し
た第２蛍光染料の検出、および前記の組み合わせ
から成る群より選ばれる特許請求の範囲第２項記
載の方法。 ５ 前記表面手段は、実質的に直線の動きに適合
する長方形のテープ、回転の動きに適合するデイ
スク、および実質的に完全な照明に適合する写真
スライドから成る群より選ばれ、そして、表面手
段が写真スライドであるとき、照明の効果を検出
する特許請求の範囲第１項記載の方法は、前記写
真スライドの合計の区域よりも実質的に小さい部
分を順次に検出することができる表面手段を用い
て達成する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 特異性化された表面の抗原を有する細胞の存
在を試料内で決定する方法であつて、 (a) 決定すべき表面の抗原に対して特異的である
第１抗体の存在区域および不存在区域が交互に
配置されている、特異性化された反復パターン
の区域を有する表面手段を準備し、 該表面手段が、前記第１抗体の存在区域およ
び不存在区域のパターンに対応するゲート・ト
ラツク・コントロール手段を含み、 (b) 前記細胞を含有する前記試料を前記表面手段
と、免疫学的反応を発生させるために適当な条
件下に、接触させ、 (c) 検出可能な標識で免疫学的に反応した前記細
胞を着色し、 (d) ゲート・トラツク・コントロール検出手段に
よつて、前記ゲート・トラツク・コントロール
手段を検出し、前記表面手段を光り手段で照明
しかつ前記標識細胞への前記照明の効果を検出
手段で検出し、これにより前記標識の存在に応
じた信号を発生させ、 (e) 前記表面手段を動かして前記検出手段を通過
させ、 (f) 前記表面手段へ免疫学的に結合した細胞のみ
の標識を検出し、 (g) 前記ゲート・トラツク・コントロール検出手
段によつて付勢されるゲートを有する積分手段
によつて前記信号を分析し、これにより特異的
な表面の抗原を有する細胞の存在を決定するこ
とができる ことを含むことを特徴とする、特異性化された表
面の抗原を有する細胞の存在を試料内で決定する
方法。 ７ 細胞を着色する工程は、有効量のフルオレス
セインジアセテートを細胞に適用することによつ
て達成する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 結合しない細胞を検出工程前に実質的に除去
する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９ 特試料内に存在する、特異性化された表面の
抗原を有する細胞の存在を決定する方法であつ
て、 (a) 第２抗原の存在区域および不存在区域が交互
に配置されている、特異性化されたパターンの
区域において適用された第２抗原を有する表面
手段を準備し、 該表面手段が、前記第２抗原の存在区域およ
び不存在区域のパターンに対応するゲート・ト
ラツク・コントロール手段を含み、 (b) 特異性化された細胞の表面の抗原および第２
抗原に対して特異性の抗体−錯体を形成し、こ
れにより、免疫学的反応をさせた後、表面手段
と細胞との間の抗体架橋を形成することがで
き、 (c) 適当な条件下に、免疫学的反応を起こさせ、 (d) 検出可能な標識で免疫学的に反応した前記細
胞を着色し、 (e) ゲート・トラツク・コントロール検出手段に
よつて、前記ゲート・トラツク・コントロール
手段を検出し、前記表面手段を光り手段で照明
しかつ前記標識細胞への前記照明の効果を検出
手段で検出し、これにより前記標識の存在に応
じた信号を発生させ、 (f) 前記表面手段を動かして前記検出手段を通過
させ、 (g) 前記表面手段へ免疫学的に結合した細胞のみ
の標識を検出し、 (h) 前記ゲート・トラツク・コントロール検出手
段によつて付勢されるゲートを有する積分手段
によつて前記信号を分析し、これにより特異的
な表面の抗原を有する細胞の存在を決定するこ
とができる ことを含むことを特徴とする、特異性化された表
面の抗原を有する細胞の存在を決定する方法。 １０ 細胞を着色する工程は、有効量のフルオレ
スセインジアセテートを細胞に適用することによ
つて達成する特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 結合しない細胞を検出工程前に実質的に除
去する特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 水性試料中の抗原の存在を決定する方法で
あつて、 (a) 決定すべき抗原と実質的に同一の反応性をも
ち、特異性化されパターンの区域において表面
へ適用された第２抗原を有する表面手段を準備
し、 前記各区域には、前記第２抗原の存在区域お
よび不存在区域が交互に配置されており、 該表面手段が、前記第２抗原の存在区域およ
び不存在区域のパターンに対応するゲート・ト
ラツク・コントロール手段を含み、 (b) 前記第２抗原およびおよび決定すべき抗原の
両者に対して反応性の第１抗体と前記第２抗原
の実質的にすべてを免疫学的に反応させ、そし
て結合しない第１抗体の実質的にすべてを除去
し、 (c) 前記水性試料を前記表面手段と接触させ、前
記接触の条件は免疫学的反応を起こさせ、これ
により決定すべき前記抗原が前記第１抗体へ結
合できるようにするために適当であり、 (d) 免疫学的反応を起こさせるのに適当な条件下
で決定すべき前記抗原と免疫学的に反応性の第
２標識抗体を含有する水溶液をさらに準備し、
これにより前記第２標識抗体を、存在する場
合、決定すべき前記抗原へ結合させることがで
き、 (e) ゲート・トラツク・コントロール検出手段に
よつて、前記ゲート・トラツク・コントロール
手段を検出し、結合した第２標識抗体を、光り
手段により照明しかつ前記結合した標識抗体へ
の前記照明の効果を検出手段により検出し、こ
れにより前記結合した標識抗原の存在に応じた
信号を発生させ、 (f) 前記表面手段を前記検出手段に関して移動さ
せ、 (g) 前記ゲート・トラツク・コントロール検出手
段によつて付勢されるゲートを有する積分手段
によつて前記信号を分析し、これにより前記水
性試料中の抗原の存在を決定する ことを含むことを特徴とする、水性試料中の抗原
の存在を決定する方法。 １３ 前記照明工程前に、免疫学的に反応しなか
つた実質的にすべての結合しなかつた第２標識抗
体を除去する特許請求の範囲第１２項記載の方
法。 １４ 前記標識は蛍光染料であり、前記光り手段
は照明光の周波数が前記標識を蛍光性とさせるよ
うに選択され、そして前記照明の効果を検出する
工程は前記標識と関連する全体の蛍光を検出する
ことからなる特許請求の範囲第１３項記載の方
法。 １５ 除去工程は、前記表面手段の洗浄、前記表
面手段のスプレー処理、および前記前記表面手段
の洗浄とスプレー処理との組み合わせから成る群
より選ばれた作業により達成される特許請求の範
囲第１４項記載の方法。 １６ 前記照明の効果を検出する工程は、全体の
蛍光の検出、前記表面手段から反射された光りの
検出、前記表面手段を透過した光りの検出、全体
の蛍光および全体の蛍光の真のレベルを評価でき
るようにする参照として使用する前記表面手段の
固有蛍光の検出、および前記の組み合わせから成
る群より選ばれる、特許請求の範囲第１４項記載
の方法。 １７ 前記表面手段は、実質的に直線の動きに適
合する長方形のテープ、回転の動きに適合するデ
イスク、および実質的に完全な照明に適合する写
真スライドから成る群より選ばれ；そして、表面
手段が写真スライドであるとき、照明の効果を検
出する特許請求の範囲第１２項記載の方法は、前
記写真スライドの合計の区域よりも実質的に小さ
い部分を順次に検出することができる表面手段を
用いて達成する特許請求の範囲第１２項記載の方
法。 １８ 水性試料中の抗原の存在を決定する方法で
あつて、 (a) 決定すべき抗原の第１エピトープ部位に対し
て特異性の第１抗体を有し、この第１抗体が特
異性化されパターンの区域において適用されて
いる表面手段を準備し、 前記区域には、前記第１抗体の存在区域およ
び不存在区域が交互に配置されており、 該表面手段が、前記第１抗体の存在区域およ
び不存在区域のパターンに対応するゲート・ト
ラツク・コントロール手段を含み、 (b) 前記水性試料を前記表面手段と接触させ、前
記接触の条件は免疫学的反応を起こさせ、これ
により決定すべき前記抗原が前記第１抗体へ結
合できるようにするために適当であり、 (c) 免疫学的反応を起こさせるのに適当な条件下
で決定すべき前記抗原の第２エピトープ部位に
対して免疫学的に反応性の第２標識抗体を含有
する水溶液をさらに準備し、これにより前記第
２標識抗体を、存在する場合、決定すべき前記
抗原へ結合させることができ、 (d) ゲート・トラツク・コントロール検出手段に
よつて、前記ゲート・トラツク・コントロール
手段を検出し、結合した第２標識抗体を、光り
手段により照明しかつ前記標識抗体への前記照
明の効果を検出手段により検出し、これにより
前記結合した標識抗体の存在に応じた信号を発
生させ、 (e) 前記表面手段を前記検出手段に関して移動さ
せ、 (f) 前記ゲート・トラツク・コントロール検出手
段によつて付勢されるゲートを有する積分手段
によつて前記信号を分析し、これにより前記水
性試料中の抗原の存在を決定することができる ことを含むことを特徴とする、水性試料中の抗原
の存在を決定する方法。 １９ 前記照明工程前に、免疫学的に反応しなか
つた実質的にすべての結合しなかつた第２標識抗
体を除去する、特許請求の範囲第１８項記載の方
法。 ２０ 前記標識は蛍光染料であり、前記光り手段
は照明光の周波数が前記標識を蛍光性とさせるよ
うに選択され、そして前記照明の効果を検出する
工程は前記標識と関連する全体の蛍光を検出する
ことからなる特許請求の範囲第１９項記載の方
法。 ２１ 除去工程は、前記表面手段の洗浄、前記表
面手段のスプレー処理、および前記前記表面手段
の洗浄とスプレー処理との組み合わせから成る群
より選ばれた作業により達成される特許請求の範
囲第２０項記載の方法。 ２２ 前記照明の効果を検出する工程は、全体の
蛍光の検出、前記表面手段から反射された光りの
検出、前記表面手段を透過した光りの検出、全体
の蛍光および全体の蛍光の真のレベルを評価でき
るようにする参照として使用する前記表面手段の
固有蛍光の検出、および前記の組み合わせから成
る群より選ばれる特許請求の範囲第２０項記載の
方法。 ２３ 前記表面手段は、実質的に直線の動きに適
合する長方形のテープ、回転の動きに適合するデ
イスク、および実質的に完全な照明に適合する写
真スライドから成る群より選ばれ、そして、表面
手段が写真スライドであるとき、照明の効果を検
出する特許請求の範囲第１８項記載の方法は、前
記写真スライドの合計の区域よりも実質的に小さ
い部分を順次に検出することができる表面手段を
用いて達成する特許請求の範囲第１８項記載の方
法。
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