JPH0473748B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、単一のレーザ源を利用したデユアル
レーザ励起装置に関し、より具体的には、細胞等
の特性を測定するフロサイトメトリー装置に関す
る。

従来の技術および解決しようとする問題点 レーザを光源として利用する多くの適用例があ
る。かかる適用例の１つに、フローサイトメトリ
ー装置がある。フローサイトメトリー装置によれ
ば、細胞、その他の粒子を液流中を通過させ、測
定せんとする細胞の１または複数の特性を測定す
ることができる。光学的手段を用いて細胞分析を
行なうことはフローサイトメトリー装置において
一般に採用されている技術である。一般的に、入
射光線は、装置を通る細胞に当てられる。こうし
た細胞は光線を通過するときに、光を散乱させ
る。散乱光は、細胞の形状、屈折率、不透明度、
粗さ等の関数となる。さらに、標識した細胞が入
射光の励起エネルギを通過する結果、励起されて
発光する螢光を検出して、特定標識の細胞の同定
を行なうことができる。フローサイトメトリー装
置においては、照射入射光の光源としてレーザが
使用されている。

細胞の多パラメータ分析は、個々の細胞の特性
を把握するための著しく多くの情報が得られる方
法である。この多パラメータ細胞分析の改良した
方法として、測定対象の細胞に関する多数の螢光
を検出する方法がある。細胞の２つの螢光標識の
励起源として、レーザのような単一光源を利用す
ることは当技術分野で公知であるが、多数の標識
が必要とされ、また標識の吸収率は、レーザの波
長に整合しなければならないということから、２
以上の識別可能な螢光マーカを励起させるため、
２つのレーザを利用するシステムが開発されるに
至つている。２つのレーザを利用する細胞分析装
置は、例えば、米国特許第3826364号および第
4284412号の各明細書に記載されている。

デユアルレーザシステムすなわち二重レーザシ
ステムを利用すれば、多パラメータ細胞分析およ
び３種または４種の異なる螢光色素を分類するこ
とも可能となる。かかる二重レーザシステムとし
ては、カリフオルニア州、マウンドヴユーのベク
トン・デイキンソン・イムノシトメトリーシステ
ム（Becton Dickinson Immunocytometry
Systems）が製造販売するFACS440細胞ソータ
として公知のシステムがある。このシステムは、
共通のレンズ系を利用して、全螢光色素から発す
る螢光を集め、その後、干渉フイルター、ミラー
およびビームスプリツタを適当に組立せることに
より、個々の色を分離するものである。このフロ
ーサイトメトリーシステムは、1983年４月５日に
出願され、共同して譲受けた米国特許出願第
482345号に記載されている。かかるフローサイト
メトリーシステムが各チヤネルにて最適な信号対
雑音比特性を備え、チヤネル間の混信を最小にす
るためには、２つのレーザ励起源は、スペクトル
的にまた、空間的に十分、分離していることが望
ましい。スペクトル的に分離しているということ
は、第２のレーザ励起波長が第１レーザによつて
励起された細胞の放出フイルターの受光窓の外側
にならなければならないことを意味する。

上記米国特許出願に記載したフローサイトメト
リー装置においては、細胞流上のそれぞれの焦点
が約200乃至250μmだけ、垂直方向に変位してい
るように、２つのレーザの照射方向を定めること
によつて、空間的分離が図られている。このよう
にして、２つのレーザからのパルスが時間的にず
れているのである。この空間的分離は、高反射率
のミラーを細胞流の拡大像付近で光路内に位置決
めすることにより実現される。このいわゆるスプ
リツトミラーは、第１レーザの放出ビームがミラ
ーの端縁よりも遠方を通る一方、第２レーザの放
出ビームは捕光され、反射されて交互の光路を形
成するように位置決めする。各光ビーム巾に適当
な干渉フイルターを置くことにより空間的に分離
した２つのビームの個々の放出チヤネルをさらに
分光させることができる。

単一線モードの第１レーザとして、アルゴンレ
ーザのような可視光レーザを使用し、第２レーザ
として、多重線アルゴンポンプを備える色素レー
ザを使用することにより、励起光源の分光を十分
に行なうことができる。第１レーザは、例えば
457.9nmと514.5nm間の可視アルゴン線の１つに
調節する一方、第２レーザは、580nm乃至640nm
の線を出力するように調節できる例えばR6Gの
ような色素を使用する。４つの色に適用する場
合、例えば488nmにセツトできる第１レーザは、
それぞれ520nmおよび575nmにて螢光を発するフ
ルオレスセインイソチオシアン（FITC）および
フイコエリトリンのような２種類の螢光色素を励
起させる。一方、例えば598nmにセツトできる色
素レーザは、それぞれ625nmおよび660nmで放出
ピークとなるテキサスレツド（TR）およびア
ロ・サイコシアニン〔allo−phycocyanin（Ａ−
Pc）〕のようなさらに２種類の色素を励起させ
る。

単一色素レーザシステムから二重線レーザの性
能を得ようとする試みは、分析細胞学協会の機関
誌（Journal of the Society for Analytical
Cytology）1980年のVol.1no.2の127−Blppに掲
載されたアーント・ジヨビン（Arndt−Jovin）
等の論文「CWポンプ式色素レーザを利用する二
重レーザフローソータ（Ａ Dual Laser Flow
Sorter Utilizing ａ CW Pumped Dye
Laser）」に記載されている。上記論文に記載さ
れた方法の性能は、多くの理由により、二重レー
ザシステムほど優れているとは考えられない。先
ず、短波長線の隔離を干渉フイルタでのみ行な
う。単一のアルゴン線を隔離するのに十分な狭さ
とした分光帯域幅の干渉フイルタは、透過ピーク
が極めて高いということができず、また、長時間
に亘り所要のパワー密度に耐えることができな
い。次に、第１レーザ線の波長を変化させるに
は、通常、単に外部から調節するのではなく、幾
つかのフイルタを交換し、おそらく、整合し直さ
なければならないであろう。最後に、２つのレー
ザ線を同時に安定させる方法は十分ではない。

単一の色素レーザシステムを使用して、二重レ
ーザ線の性能を得るためには、上記以外の技術上
の問題を伴なう。現在の色素レーザシステムは、
色素を励起させる最大のパワーが得られるという
理由だけで多重線モードのアルゴンレーザを使用
している。かかるレーザシステムは、単一のアル
ゴンレーザを使用して、第１および第２レーザの
必要条件を満足させようとするものであるため、
性能上、フイルター系の効率が極めて重要であ
る。レーザ振幅の安全性も問題である。レーザ出
力を安定化させる最も一般的な方法は、最終の出
力ビームの一部を捨い上げ、検出器によつて連続
的に監視する光制御として公知の方法がある。こ
の信号は、レーザの入力電流を制御するフイード
バツク信号として使用される。多線レーザの個々
の出力線は、必らずしも同一の状態でドリフトす
るとは限らない。従つて、単一のポンプを２つの
分離した光源に分光するシステムは、入力電流が
制御する１つの最終出力線からのフイードバツク
信号のみを受信する。このため、特別の手段を設
けなければ、少なくとも１方の入射光源は、通常
の二重レーザシステムに比べ安定性に欠ける。

上記引用論文に記載されたように、ポンプの１
部を使用して、個々の励起を行なう従来の方法
は、通常、幾つかのフイルターを交換すると共
に、整合し直して、波長を変化させなければなら
ない。また、短波長線の波長を変化させた場合、
色素レーザの性能に影響がある。さらに、狭小な
分光帯域幅の干渉フイルターは通常、長時間に亘
つては、レーザの高パワー密度に耐えることがで
きず、最後的に焼け、損傷を受け、または使用不
能となる。

最後に、アルゴンおよび色素の光路を個々に細
胞流上に集束させるための何等の手段を備えない
従来のシステムは、２つのビームの１方を最適状
態に集光することができない。ポンプレーザおよ
び色素レーザの出力ビームの拡がり角が著しく相
違する場合、各焦点を別々に調節しなければなら
ない。カリフオルニア州、パロ・アルトのコヒー
レントインク（Coherent Inc.）が製造する色素
レーザシステムは、ポンプ出力の拡がり角が
488nm時で0.00048ラジアン、同じく色素の出力
拡がり角が600nm時で0.0015ラジアンである。か
かるシステムは、色収差補正に優れたレンズであ
つても、単一のレンズでは、同時に焦点調節を行
なうことはできない。

このように、単一の色素レーザシステムを利用
して、二重レーザ線の性能が得られるようレーザ
装置を改良する必要性が生じている。本発明は、
かかる改良を目的とするものであり、さらに、上
述した欠点および問題点を解決せんとするもので
ある。

問題点を解決するための手段 本発明の二重レーザ励起装置は、複数のエネル
ギ線を備え、第１光ビームを出力する第１レーザ
を備えている。この第１光ビームを２部分に分割
する手段が設けられている。分散手段が分割され
た１方の光ビーム部分の分光線を分離し、分光的
に分離された線の少なくとも１方を第１照射領域
に向ける。第２レーザが分割された他方の光ビー
ム部分を受光するように位置決めされ、この光ビ
ーム部分によつて励起され、第２光ビームを発生
させ、第２照射領域に向ける。

本発明の装置の好適な適用例において、フロー
サイトメトリー装置は、液流中を流動する粒子等
の１または複数の特性を測定する。このフローサ
イトメトリー装置は、液流中にて１時に略１つず
つ粒子を流動させる手段、複数のエネルギ線によ
り第１光ビームを提供する手段、第１光ビームを
２部分に分割する手段、分割された光ビームの１
部分の分光線を分離し、分光された少なくとも一
方の線を液流中で動く粒子に向け、この粒子の第
１照射部分を提供する手段、分割された光ビーム
の他方の部分を受光し、この部分によつて励起さ
れ、液流中を流動する粒子に向けられる第２光線
を発生させ、この粒子の第２照射部分を提供する
手段、各流動粒子に関する光を検出し、その検出
光を各粒子の１または複数の特性に関係付ける手
段を備えて構成され、さらに、上記分光的に分離
した線の１部を捕光し且つ検出し、上記検出手段
を調節して、強度の変動を補正する手段を備える
ことが望ましい。

本発明の基本的思想に依れば、従来のレーザシ
ステムに伴なう欠点および問題点を解決すること
ができる。その結果、本発明は、第１励起源およ
び第２励起源のポンプとして、単一のアルゴンレ
ーザを利用することにより、両ライン共容易且つ
独立的に調節可能な多機能で効率的な二重レーザ
線システムを提供するものである。特に注目すべ
き点は、本発明が単一の色素レーザシステムを利
用し、光学素子および構成要素を追加するだけ
で、別個の２つのレーザを使用する大規模な二重
レーザシステムと略同等の性能を提供し得ること
である。本発明に従つて、色素レーザシステムを
構成することにより著るしい経済的効果が得られ
る。本発明の二重レーザ線システムは、主とし
て、３種類および４種類螢光に適用することを目
的とするもので、上述したように、第１レーザ線
は488nmにセツトして、FITCおよびPEを励起さ
せ、第２レーザ線は約598nmにセツトして、TR
またはTRとＡ−PCを励起させることができる。
さらに、オペレータが他の用途のため、第１また
は第２レーザ線の何れかの励起波長を容易に変化
させ得るようにするための手段が設けられている
ことからも本発明が完全な二重レーザ線システム
であることが明確となる。例えば、DNAに使用
する場合には、一般に使用される色素を457.9ア
ルゴンレーザ線で励起させることができる。さら
に、RAN含有量は、同様に457.9nmで励起させ
た公知の試薬を使用して、網赤血球を計数するこ
とにより測定することができる。その他の用途に
は、514.5nmのレーザ線等が適している。

本発明により、波長は効率的、確実にしかも安
定的且つ容易に調節することが可能となる。

実施例 本発明は、多くの異なる形態の実施態様によつ
て満足し得る効果が得られるが、図面に図示した
好適な実施態様について以下詳細に説明する。但
し、その開示内容は、本発明の基本的思想を例示
するものであり、本発明の範囲がこれら態様にの
み限定されるものではない。本発明の範囲は、特
許請求の範囲の記載およびその均等物によつての
み判断すべきである。

図面、特に第１図および第２図を参照すると、
フローサイトメトリー装置１０の光学素子および
粒子の流動要素が図示されている。第１図の光学
素子および流動要素は、１時に略１つずつ液流中
に粒子を流動させ、これら粒子を分析し、その特
定の性質を測定するフローサイトメトリー装置の
主要構成要素である。例えば、第１図のフローサ
イトメトリー装置の構成要素は、カリフオルニア
州、マウントヴユーのベクトンデイキンソン・イ
ンムノシトメトリーシステムが製造販売する
FACS螢光励起細胞ソータに備えることができ
る。このFACS細胞ソータは光の散乱光および螢
光を基にして、細胞集団の分析および分離を行な
う装置で、様々な試験研究の分野にて使用されて
いる。ここで詳細に説明し、またFACS細胞ソー
タのような装置に内臓可能な光学素子および流動
要素に加えて、本発明に関して有用な細胞ソータ
装置の他の細部については、米国特許第3826364
号明細書に記載されている。本発明は、光の散
乱、粒子の容積、螢光その他の光学的パラメータ
を測定し、光に関係する特性を同定しまたは定量
化する、フローサイトメトリー装置を含む様々な
レーザ応用分野にて有用なものである。

第１図に示すように、このフローサイトメトリ
ー装置の光エネルギは、レーザ１２によつて供給
される。レーザ１２は、アルゴンイオンレーザの
ような多線レーザであることが望ましい。説明
上、適当な多線アルゴンレーザを調節し、457.9
乃至514.5nmの別々の波長にて出力ラインを提供
するようにすることができる。勿論、本発明の目
的には、他の波長のレーザを使用することができ
る。また、多線レーザ１２の出力は、垂直方向に
偏向させTEMOOモードとすることが望ましい。
こうした特性によつて、レーザ１２の幾つかのポ
ンプ線を第１励起線用として直接利用することが
できる。

レーザ１２から放出される光ビーム１６は、長
パスの２色性フイルター１８に当たり、この干渉
フイルター１８が光の一部を透過させ、１部を反
射させる。長パスの干渉フイルターの透過率およ
び反射率は第３図に示してあり、両者共干渉フイ
ルターに入射する光の波長如何によることが分か
る。干渉フイルター１８で反射された光線は、１
９で示してあり、干渉フイルター１８を透過する
光線は２０で示してある。

反射光線１９を誘導するため、１対の内部反射
式回転プリズム２１が設けられ、光線１９は光分
散要素２２に向けられる。光分散要素２２は、以
下に詳細に説明するように、ポンプレーザからの
分光線を分離させるモノクロメータの形態の一部
とした、極細の線を形成し著るしく変調した回折
格子とすることが望ましい。回折したアルゴン線
は、中間の集光１視準レンズおよびスリツト系２
４によつて格子要素２２から隔離され、レンズ３
２に向けられ、粒子液流中の領域２８に集束され
る。

透過光線２０を参照すると、長波長に強く依存
するポンプ出力エネルギの約2/3が透過し（第３
図に示すように）、色素レーザ２９の励起に利用
される。色素レーザ２９の出力は、可視スペクト
ル領域をカバーするように選択し、レーザ１２の
スペクトル領域から略分離された波長となるよう
にする。この要件を満足させるレーザの１つは、
約598nmにて第１レーザ線を放出するローダミン
６−Ｇ色素レーザである。色素レーザ２９からの
出力レーザは、内部反射プリズム２３によつて、
レンズ３２に向けられ軌線はアルゴン光ビームに
対し若干下方を向き、粒子液流中の領域３４上に
集束される。

本発明のフローサイトメトリー装置１０内に内
蔵されたノズル４０は、流体流３８中の粒子の流
動を促進する作用をする。この型式のノズルを利
用することは周知であり、例えば米国特許第
3826364号明細書に記載されている。本発明の装
置において、２８および３４で示した２つのレー
ザと粒子流の交差部分は、約200乃至250μmだけ
間隔を置いた位置となる。流体流はその後、液滴
４１に分解し、偏向されて細胞が分類される。

流体流３８中を流動する粒子は、先ず、ノズル
４０から出ると、集光領域２８を流動する。この
集光領域２８を通つた非散乱レーザ光は、光散乱
チヤネルの光軸上にある光散乱妨害バー４２に当
たる。レンズ４４によつて集められた散乱光は、
集光した散乱光の最大角度を決定する第１アイリ
スすなわち虹彩４５を通過する。この第１アイリ
ス４５に続いて、入射光の１部を反射させ、残り
の入射光を光吸収装置（図示せず）に透過するビ
ーム・スプリツトミラー４６がある。第２アイリ
ス４９は、散乱光源を集束領域２８で示した交差
点に制限する視野絞りとして作用する。フイルタ
ー５０を通過した後、散乱光は、検出器４８で検
出される。この検出器４８は、周知の技術に従つ
て電気的に機能し、流体流中を流動する粒子の寸
法を測定する。上述した光散乱の特徴は、散乱光
を利用して、光線を通る粒子から情報を入手でき
る典型的なフローサイトメトリー装置の特徴を補
充するために記載したものである。

第１図に示した本発明の実施態様において、色
素レーザ２９からの光は、また、液流３８の縦軸
線に沿つて集束領域２８から垂直方向に変位され
た集束領域３４に流動する流体流３８に向けられ
る。粒子によつて散乱された色素レーザからの色
は、散乱光チヤネル光学素子によつて捨い上げら
れるが、散乱光チヤネル内に位置決めした誘導体
多層フイルターによつて遮断することが望まし
い。

螢光チヤネルに関しては、レーザの異なる波長
作用による照射を、利用して、次に、略分離され
た放出分光を有する螢光色素を励起させることが
できる。各レーザの光エネルギの励起エネルギに
よつて、放出分析の異なる少なくとも１つ、望ま
しくは２以上の免疫螢光性色素を励起させる。第
１図に示すように、２つの独立したレーザ光線
は、垂直に間隔を置いた集束領域２８，３４にて
液流３８に交差し、よつて粒子は先ず領域２８を
横切り、次に領域３４を横切る。従つて、２対の
光学信号が光ビームを通る粒子によつて発生され
る。これら２対の信号は、粒子が第１光ビームと
の交差点から第２光ビームとの交差点まで移動し
得るだけの時間を置いて発生されることが望まし
い。この時間間隔により、対の信号は、別個に分
析され、２つの異なる励起波長にて励起されたと
き、粒子の放出螢光に比例した信号を出す。粒子
から放出された螢光は、妨害バー５４の周囲に向
けられ、このバー５４は分離された光ビームから
の反射光を遮断する。全ての螢光信号は、第１ビ
ームスプリツタ５６付近のレンズ５５によつて集
束される。好適実施態様において、ビームスプリ
ツタ５６は、領域３４からの螢光のみを補足して
反射し、領域２８からの螢光はビームスプリツタ
５６の下方を通つて、交互の光路に達するよう
に、光路内に位置決めした高反射率ミラーであ
る。

このように、領域２８内で励起された粒子から
発する螢光は、ビームスプリツタ５６を通つた
後、干渉ミラー５７に当たる。干渉ミラー５７の
目的は、螢光路に沿つて進む２種類の異なる色を
分離し、別個に分析し得るようにすることであ
る。例えば、干渉ミラー５７は、領域２８内で励
起した粒子の異なる色波長を分離し得るように選
択する。この場合、単に１列として説明すれば、
緑領域内の波長が干渉ミラー５７を通り、その
後、１つの色領域（この場合、緑）の波長以外は
透過させないようにしたバリヤフイルタ５９を通
る。次いで、緑色光は、螢光検出器６０に入る。

例えば、黄色領域にて干渉ミラー５７に当たつ
た光は、１つの色領域（この場合、黄色）の波長
以外は透過させないバリヤフイルタ６１を通り、
干渉ミラーによつて反射される。次いで、螢光検
出器６２が黄色の光を受光する。

領域３４内に集光された光は、また、領域２８
内で励起された螢光と異なる種類の螢光まで励起
するのに十分な単一波長の励起エネルギを発生す
る。領域３４内で励起された粒子の発生螢光がレ
ンズ５５を通り、ビームスプリツタ５６から反射
された後、この光は、別の干渉ミラー５８に当た
る。上記干渉ミラー５７に対する説明と同様、こ
の第２干渉ミラー５８は、色スペクトルの異なる
２領域の波長を分離し得るように選択してある。
例えば、粒子が励起領域３４を通る結果として赤
および遠赤信号を発生させることができる。赤色
領域の波長は、干渉ミラー５８を通り、次いで赤
色領域の波長以外は透過させないようにしたバリ
ヤフイルタ６３を通る。この光は、螢光検出器６
４に向けられる。遠赤色領域の波長は、バリヤフ
イルタ６５を経て、干渉ミラー５８によつて反射
され、その後、この光は螢光検出器６６に入る。
従つて、それぞれの作用波長にて２以上の螢光を
励起することのできる２つのレーザからの光によ
つて、標本が上述したようなフローサイトメトリ
ー装置内を１回通過する間に、この標本粒子の多
数の細区分を検出し、数量化ことができる。

４つの分離した緑、黄、赤および遠赤の光路を
受光することが望ましい螢光検出器６０，６２，
６４および６６が設けられている。これら螢光検
出器は、光信号を電気信号に変換する低雑音の光
電倍増管とすることができる。第１図には図示し
てないが、これら電気信号は、次いで電気的に供
給して、フローサイトメトリー装置の電子素子に
よつて処理し、分析、その他の目的に使用され
る。フローサイトメトリー装置には各種の表示、
情報提示、蓄積または記録手段を設けることがで
きる。同様に、特定の性質を持つ粒子は、米国特
許第3826364号明細書に教示された技術に従つて、
分離し且つ分類することができる。

本発明のレーザ装置の光学的要素および光エネ
ルギ要素のさらに詳細は、第１図と共に、第２図
を参照することにより認識できよう。長パスの干
渉レンズ１８は、ポンプ頭部と色素頭部間のスペ
ース内にて多線ポンプを設けることが理解できよ
う。干渉レンズ１８は、単に非吸収層を重ね合わ
せて誘導層とすることが望ましい。勿論、層の数
は、レーザ装置の設計基準如何による。上述した
フローサイトメトリー装置の場合、第１レーザの
所要の励起ラインは、488nmにセツトする一方、
第２の色素レーザの励起ラインは598nmにセツト
することが望ましい。これを満足し得るように達
成するためには、例えば514.5nm時における干渉
レンズ１８の透過率は高く、色素レーザーの効率
が著るしく低下しないようにしなければならな
い。略理想的な反射率は、514.5nm時、10％乃至
15％，488nm時、40％乃至50％、および458nm
時、95％以上とする。上記仕様に満足し得るよう
に適合する設計は、各々、二酸化チタンおよび二
酸化ケイ素、またはその何れか一方で製造した11
乃至15の非吸収層を積重ねた干渉レンズを使用す
る。ポンプパワーが３ワツトの場合、反射および
透過後の各種アルゴンラインの生ずるパワーレベ
ルは、第２図に示してある。

反射プリズム２１は、レーザ装置１０内に取付
けられ、回転させて、回折格子２２上での反射光
１９の位置を調節することができる。回折格子
は、また、フローサイトメトリー装置内にも調節
可能に取付けられている。回折格子は１mm当り約
1500乃至2000の線を備えた平坦な反射型とするこ
とが望ましい。また、この格子は、500nmブレー
ズの目盛り付き格子またはホログラフイで記録し
た変調格子の何れかとすることができる。例え
ば、１mm当り1700線のBausch and Lomlu格子
は、格子ラインと平行なベクトルを有する直線状
に偏光させた光に対し、458nm時、86％，488nm
時、84％および514nm時、77％の効率が得られ
る。従つて、第２図に示すように、格子線と平行
な軸線を中心として格子２２を回転させるだけ
で、波長を変化させることができる。かかる回転
は、装置のオペレータが外部調節として、簡単な
マイクロメータの親ねじを回すことによつて行な
うことができる。

光は、格子２２から、２４で示したレンズ組立
体に向けられる。このレンズ組立体２４は、空気
を介在された第１色消しレンズ２５を備えてい
る。光は、この色消しレンズ２５によつて、ビー
ムウエストの幅１／e²の２乃至３倍の間の幅とす
ることが望ましいスリツト２６上の回折制限スポ
ツトに集束される。好適な設計において、レンズ
の焦点距離は48mm，488nm時のビームウエストは
約20μm、およびスリツト幅は約50μmとする。第
２レンズ２７がレンズ組立体２４内に具備されて
いる。このレンズ組立体２４は、ろ波したレーザ
線の出力ビームの拡がりを調節し、色素レーザ光
線と同時に、その出力ビームがレンズ３２によつ
て、粒子３８流上に略集束されるようにすること
ができる。プリズムおよびレンズ入射面および出
射面といつた単色性光学素子は、全て、アルゴン
波長時、0.955以上の透過率となるように反射防
止コーテイングされている。さらに、ホクグラフ
イで記録したか、または目盛り付きであるか否か
を問わず、回折格子は、銅基板上に模写し、
5.0Wのポンプを使用した場合でも、エネルギ密
度のしきい値問題が生じないようにすることがで
きる。

本発明の回折格子がアーンドトージヨビン等の
米国特許に記載されたような近接ろ波用の狭小線
干渉フイルタと如何に比肩し得るか知るため、本
発明による半値幅のスリツトの作用を狭小線干渉
フイルタの帯域幅と比較する。１mm当り1700線の
格子の場合、本発明のシステムは、半値幅が
0.5nmとなり、488nm時のピーク効率は84％とな
る。半値幅が10nmの干渉フイルタは、通常、ピ
ーク効率が40乃至50％である。帯域幅1nmの干渉
フイルタの効率は、15乃至30％である。従つて、
本発明の格子モノクロメータは、干渉フイルタと
比べ著るしく優れた効率が得られる。1nm当り
1700線で3.0Wの回折格子アルゴンポンプの好適
形態は、488nm時、約320mw、また、598nm時、
約280mwの色素レーザ出力を提供する。このシ
ステムにより、第１レーザ線を457.9nmに調節す
ることにより、約150mwの出力が得られるが、
これは依然かなりの値である。5.0wの多線アル
ゴンポンプを使用するならば、488nmおよび
598nm時、500mv以上、457.9nm時250mw以上の
出力が期待できる。

アルゴンレーザの出力を安定させるためには、
一般に「光制御」と称されるダイオード監視、フ
イードバツクシステムを使用する。このシステム
により、少量の光がレーザの出力により捨い上げ
られ、フオトダイオード検出器によつて連続的に
監視される。次いで、この信号の変化をフイード
バツク信号として利用し、レーザの入力電流を制
御する。このように、多線モードにおいて、総合
計した出力は、時間が経過しても極めて一定して
いる。しかし、上述した発明のように、２つの分
離ラインを分割する際、両ラインの出力は、別個
に受けた場合、多線モードにて共に受けた全線の
合計出力に必然的に従うという大きな問題点が生
じる。この問題点を解決するため、光学的捨い上
げ要素が内蔵されており、各光線からの少量の出
力光を別個に監視する。これら要素は、第２図に
示してある。このように、回折格子２２からの少
量の反射光１９は、スリツト２６を通過後捨い上
げられ、ダイオード検出器７５によつて連続的に
監視される。１つの好適設計において、レーザ出
力における多線捨い上げ手段は省き、フオトダイ
オード７５の観察された強度の変化を利用して、
多線ポンプ１２の入力電流を制御する。従つて、
短波長の励起は、多線アルゴンポンプにフイード
バツクする結果、安定させることができる。長波
長の色素線を安定させるためには、色素レーザ２
９の少量の出力光線をダイオード検出器７７によ
つて捨い上げ、監視する。検出器７７における信
号の変化は、前方に送られ、第２（染料レーザ）
ラインからの放射を測定する光電信増管６４，６
６の利得を制御する。ダイオード検出器７５，７
７の役割を反対にし、検出器７７の信号を多線レ
ーザ１２の入力電流を制御するフイードバツク信
号とし、検出器７５の信号を短波長励起線からの
螢光および散乱光を測定する検出器６０，６２お
よび４８（第１図）の利得を変化させるフイード
フオワード信号として利用することもできる。

さらにオプシヨンとして、ポンプレーザ１２の
多線「光制御」システムを保持することができる
が、さらに、分離した両光線から適当な検出器ま
で前方に送ることができる。このようにして、ポ
ンプレーザ１２は、光スプリツトが生ずる前に、
多線からのフイードバツク信号により安定化し、
分割ビームの単一線の出力の相対変動は、各単一
波長線からのフイードフオワードによつて調節さ
れる。このシステムにおいて、光ダイオード７５
（第２図）の出力は、検出器６０，６２，４８
（第１図）の利得にフイードフオワードされ、光
ダイオード７７（第２図）の出口は、検出器６
４，６６（第１図）の利得にフイードフオワード
される。入力電流の変化の関数として、レーザ出
力パワーの応答はかなり遅いため、かかるフイー
ドフオワードシステムは、感覚安定性の点で通常
のフイードバツクシステムに優る性能を備えるこ
とが期待される。

上述した微細線格子システムに代えて、分散が
増し、また、入射角がブルースターの角に接近
し、高い透過率が得られるように配設した幾つか
のプリズムにて分散システムを構成することがで
きる。しかし、かかるプリズム系は、より複雑化
し、コスト高となり、好適な回折格子のような直
線状の分散を行なうことはできない。

本発明の典型的な適用例であるフローサイトメ
トリーにおいて、第１レーザ１２は、457.9mm乃
至514.5nm間の１つの可視アルゴン線に調節する
一方、ローダミン−６−Ｇとして公知の色素を利
用する第２レーザ２９は、独立的に調節して、
580nm乃至640nm間の線を出力することができ
る。４色適用のためには、488nmに設定した第１
レーザは、それぞれ520nmおよび575nmにて螢光
を発するFITCおよびPEのような２つの螢光を励
起させる。独立的に598nmにセツトした色素レー
ザは、それぞれ放出ピークが625nmおよび660nm
であるTRおよびＡ−pcとして公知の追加的な２
種類の色素を励起させる。

このように、本発明は、ポンプレーザからスペ
クトル線を分離する高分散度、高効率のモノクロ
メータを提供するものである。この技術は、多パ
ラメータ分析用の二重線励起システムを実現する
経済的な方法を提供するものである。同時に、本
発明は、効率、波長調節の容易さ、安定性および
信頼性の点で、干渉フイルタを使用する従来の公
知のシステムに優る性能と提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、多パラメータ細胞分析に特に有用な
フローサイトメトリー装置の光学素子および光路
の好適実施態様を示す、概略図、第２図は、第１
図の装置の光学素子および光要素の拡大概略図、
および第３図は、第１図のフローサイトメトリー
装置の干渉要素の透過率および反射率を示すグラ
フである。 主要符号の説明、１０……クローサイトメトリ
ー装置、１２……レーザ、１６……レーザビー
ム、１８……干渉フイルタ、１９……反射光、２
０……透過光、２１……プリズム、２３……プリ
ズム、２９……色素レーザ、３２……レンズ、４
０……ノズル、４５……第１虹彩絞り、４８……
散乱光検光器、４９……第２虹彩絞り。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 細胞を液流中で一時に略１つずつ流動さ
   せる手段と、 (b) 第１光ビームを提供する第１励起光源と、 (c) 前記光ビームの光路内に位置決めされ、前記
   光ビームの一部を伝達し且つ前記光ビームの一
   部を反射させる二色性要素と、 (d) 前記二色性要素によつて反射された光の波長
   をスペクトルにより分離し、前記スペクトルに
   より分離した光を前記液流中を流動する前記細
   胞に向け、第１照射領域を提供する分離手段
   と、 (e) 前記二色性要素を経て伝達される光を受光し
   得るように位置決めされ且つ前記伝達された光
   のエネルギによつて第２光ビームを発生し、前
   記第２光ビームを前記液流中を流動する前記細
   胞に向け、第２照射領域を提供する第２励起光
   源と、 (f) 各流動細胞が前記照射領域を通る際に発生さ
   れるこの細胞と関係する光を検出する手段と、 (g) 前記検出光を用いて前記細胞の１または複数
   の特性を測定する手段と、を備えることを特徴
   とする、液流中を流動する細胞等の特性測定用
   フローサイトメトリー装置。 ２ 前記第１励起光源が、複数のスペクトルエネ
   ルギ線にて光ビームを発生させるレーザであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載した
   フローサイトメトリー装置。 ３ 前記レーザが多線のアルゴンポンプレーザで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記
   載したフローサイトメトリー装置。 ４ 前記分離手段が、前記反射光の光路内に調節
   可能に位置決めされて角度に対応して波長を分散
   させる回折格子であり、前記分散させた１つの波
   長だけを前記流動細胞に効率的に向けることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載したフロー
   サイトメトリー装置。 ５ 前記回折格子が、１mm当たり1500乃至2000の
   線を有する略平坦な板であることを特徴とする特
   許請求の範囲第４項に記載したフローサイトメト
   リー装置。 ６ 前記分離手段が、さらに、少なくとも１つの
   色消しレンズと、スリツトとを備え、前記格子か
   らの光が流動細胞に当たる前に、前記スリツトを
   通ることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記
   載したフローサイトメトリー装置。 ７ 前記第２励起光源が、単一波長にて前記第２
   光ビームを発生させるレーザであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載したフローサイ
   トメトリー装置。 ８ 前記第２励起光源の出力波長が、一定波長範
   囲に亙つて調節可能であることを特徴とする特許
   請求の範囲第７項に記載したフローサイトメトリ
   ー装置。 ９ 前記レーザが色素レーザであることを特徴と
   する特許請求の範囲第８項に記載したフローサイ
   トメトリー装置。 １０ 前記第２光ビームの出力波長が、前記第１
   励起光源によつて発生されたエネルギの全光線と
   異なることを特徴とする特許請求の範囲第９項に
   記載したフローサイトメトリー装置。 １１ 前記第２光ビームの出力波長が、前記第１
   励起光源によつて発生されたエネルギの全ての光
   線より低い周波数であることを特徴とする特許請
   求の範囲第９項に記載したフローサイトメトリー
   装置。 １２ さらに、前記第２光ビームの光路内に位置
   決めされ、前記第２励起光源の光出力を監視し、
   前記第１励起光源に信号をフイードバツクして前
   記第２励起光源の出力エネルギ線の安全性を制御
   するフイードバツク手段を備えることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１１項に記載したフローサイ
   トメトリー装置。 １３ さらに、前記スリツトを経た光路内に位置
   決めされ、分散された光ビームを監視し、前記第
   １励起光源に信号をフイードバツクして前記第１
   励起光源の出力エネルギ線の安定性を制御するフ
   イードバツク手段を備えることを特徴とする特許
   請求の範囲第６項に記載したフローサイトメトリ
   ー装置。 １４ 前記第２励起光源を経た光路内に位置決め
   され、前記第２励起光源の光出力を監視し、前記
   光を検知する手段へと信号をフイードフオアード
   して前記第２励起光源の出力エネルギ線の変化を
   補正するフイードフオワード手段を備えることを
   特徴とする特許請求の範囲第１３項に記載したフ
   ローサイトメトリー装置。 １５ 前記スリツトを経た光路内に位置決めさ
   れ、分散された光ビームを監視し、前記光を検知
   する手段へと信号をフイードフオアードして前記
   分散された光ビームのエネルギの変化を補正する
   フイードフオワード手段を備えることを特徴とす
   る特許請求の範囲第６項に記載したフローサイト
   メトリー装置。 １６ 前記光検知手段が、前記照射領域のうちの
   一方を通過する細胞によつて発生された蛍光を検
   知するための第１検出手段を備えることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載したフローサイ
   トメトリー装置。 １７ 前記光検出手段が、前記照射領域のうちの
   他方を通過する細胞によつて発生された蛍光を検
   知するための第２検出手段を備えることを特徴と
   する特許請求の範囲第１４項に記載したフローサ
   イトメトリー装置。