JPH0475920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト白血球およびヒトガンマインタ
ーフエロンの遂次的な製造方法に関する。

本発明に従い、同一の細胞集団から２工程でα
−およびγ−インターフエロンを製造する方法を
提供する。従つて、本発明は、インターフエロン
産生能力をもつ、入手できる量が限定的であるヒ
ト白血球の最大限かつ最適の利用を可能とするも
のである。

ヒト白血球から、ウイルスを用いてα−インタ
ーフエロンを産生し得ることおよび分裂促進因子
の助けによつてγ−インターフエロンを産生し得
ることが知られている。前記２つの型のインター
フエロンの産生は、ヒト白血球が入手できるが限
定的であるという事実によつて限定されている。
ヒトに対する療法には、２つの型のインターフエ
ロンが必要である。その理由は、相異なるインタ
ーフエロンの型が相異なる好都合な性質を有して
おり（従つて、α−インターフエロンは、とりわ
け抗ウイルス活性を示し、γ−インターフエロン
は抗腫瘍活性を示す）、かつこれらのインターフ
エロンの組合せの適用は、相異なるインターフエ
ロンが互いに他の活性（抗ウイルス作用、抗腫瘍
作用、免疫調節作用）を増強する場合に望まし
い。２つの型のインターフエロンは、限定された
量であるが入手可能な白血球から産生されるの
で、１つのインターフエロンの型の産生は他の型
の産生を除外する。

１つのかつ同一の白血球培養からα−およびγ
−インターフエロンを遂次的に調製する方法を練
ることが本発明の目的である。同一の細胞集団か
ら数回にわたつてα−インターフエロンを産生さ
せる多くの試みがなされた。しかしながら、これ
らの試みは成功しなかつた。その理由は、細胞に
よつて産生された多量のα−インターフエロンが
細胞に作用して、細胞を反応性の低い状態にし、
その結果、次の誘発段階において、細胞のα−イ
ンターフエロン産生能力が極端に減少するからで
ある。

本発明は、多量のα−インターフエロンでγ−
インターフエロン産生系を処理した後でさえ、こ
の系は低反応状態に至らず、一方、インターフエ
ロンは未処理試料の場合より多量に産生されると
いう認識に基づいている。このことはα−インタ
ーフエロン産生段階の終わりにも起こり、それに
よつて多量のα−インターフエロンが得られ、そ
して同時に、γ−インターフエロン産生細胞のイ
ンターフエロン産生能力が維持され、さらに増大
する。

本発明に従つて、血液の淡黄膜画分を単離し、
赤血球を除去し、適当な栄養培地中に白血球を懸
濁し、そしてα−インターフエロン誘発因子を用
いおよびγ−インターフエロン誘発因子を用いて
処理することによつてα−およびγ−インターフ
エロンを調製する方法を提供する。この方法は、
血液の白血球（淡黄膜）画分を分離し、赤血球を
除去し適当な栄養培地中にこの白血球を懸濁した
後に得られた懸濁液をα−またはβ−インターフ
エロンで予備処理すること、α−インターフエロ
ン誘発因子と接触させること、α−インターフエ
ロンを含有する液体を細胞から分離し、所望なら
ばα−インターフエロンを回収すること、適当な
栄養培地中で細胞を洗浄し懸濁させること、分裂
促進因子で処理すること、γ−インターフエロン
を含有する液体を細胞から分離し、所望ならばγ
−インターフエロンを回収し、そして所望ならば
γ−インターフエロンからα−インターフエロン
を除去すること、によつて同一の白血球培養中で
順次α−インターフエロンおよびγ−インターフ
エロンを調製することを含んでいる。

本発明の方法に従い、出発物質として、０〜８
℃で48時間以下貯蔵した抗凝血処理のヒト血液の
淡黄膜画分（白血球）を用いる。

抗凝血物質として、ACD溶液（クエン酸およ
びグルコースを含有する溶液）または種々の塩基
（例えば、アデニンまたはグアニン）を補充した
ACD溶液を用いることができる。集めた白血球
を濃度勾配遠心分離（例えば、フイコール
（Ficoll）またはペルコール（Percoll））によつ
て、または好ましくは塩化アンモニウムを用いて
実施する溶血によつて取り出すことができる。

好ましくは、濃縮した白血球懸濁液を、０〜10
℃の温度を有する0.5〜1.0％、好ましくは0.83％
の塩化アンモニウム溶液と、体積比１：３〜20
で、好ましくは１：５で混合することによつて実
施することができる。この懸濁液を、撹拌しなが
らまたは撹拌しないで、０〜８℃で、５〜20分
間、好ましくは10分間インキユベートする。崩壊
した赤血球から（例えば、遠心分離によつて）白
血球を分離する。好ましくは、１容量部の細胞懸
濁液に対して10重量部の塩化アンモニウム溶液を
用いることによる塩化アンモニウム処理を繰り返
すことによつて実施することができる。

精製した白血球を、アミノ酸およびビタミンを
含有する細胞培養の栄養溶液（例えば、イーグル
栄養培地、PRMI 1640、ダルベツク
（Dulbecce）変形MEM、グラスゴー（Glasgow）
変形MEM等）中でインキユベートする。オート
クレーブ処理されていてもよい、下記の組成の安
価な栄養培地を用いることも好ましい。

成 分 量mg／ 塩化カルシウム 175〜350 塩化カリウム 300〜500 硫酸マグネシウム または塩化マグネシウム 175〜500 塩化ナトリウム 5000〜7000 炭酸水素ナトリウム 200〜3500 燐酸二水素ナトリウム 30〜150 グルコース 500〜5500 硝酸第二鉄 ０〜0.2 細胞数を10⁶〜10⁸、好ましくは10⁷細胞／mlに
調製する。

用いる栄養培地に、動物またはヒトの血清また
はガンマグロブリン不含血清を補充する（0.5〜
10％）。栄養培地に、抗生物質（例えば、ネオマ
イシンまたはゲンタマイシン）を加えることが好
ましい。

次いで、細胞を、α−またはβ−インターフエ
ロンで処理する。この目的のために、誘発因子不
含の粗製または精製のインターフエロンを、10〜
500IU／ml、好ましくは200〜300IU／mlの量で用
いることができる。この予備的処理を、35〜39
℃、好ましくは37℃で、１〜６時間、好ましくは
２時間実施する。

次いで、細胞を、α−インターフエロン誘発因
子、好ましくは、100〜800、好ましくは400赤血
球凝集単位／mlの濃度で好都合に適用する粗製ま
たは精製のセンダイウイルスと接触させる。

35〜39℃、好ましくは37℃の温度で、５〜48時
間、好ましくは15〜20時間、インキユベートす
る。その後、細胞を水性相から分離する。この上
清は、−20℃〜＋４℃の間の温度で貯蔵すること
ができるか、または公知の方法で精製することが
できる。粗製のα−インターフエロンを含有して
いる。

次いで、好ましくは生理的食塩水を用いて、と
りわけ前記組成を有する栄養培地を用いて１回、
細胞を洗浄する。細胞を洗浄した後、濃度を、栄
養培地中、好ましくは前記開示の組成を有する栄
養培地中、５×10⁶〜10⁸の値、好ましくは2.5×
10⁷の値に調整する。前記栄養培地は、ヒトまた
は動物の血清またはグロブリン不含血清を、好ま
しくはヒトのグロブリン不含血清を、0.5〜５
mg／ml、好ましくは１〜２mg／mlの濃度（３〜６
％）で含んでいる。

次いで、待望をγ−インターフエロン誘発因子
と接触させる。この目的のため、好ましくはコン
カナバリンＡ、フイトヘムアグルチニンまたはス
タフイロコンカスのエンテロトキシンを用いるこ
とができる。誘発因子として、コンカナバリンＡ
を、好都合には2.5〜30ug／ml、とりわけ15ug／
mlの濃度で用いることが好ましい。

誘発は、通常、35〜39℃、好ましくは37℃の温
度で、８〜48時間、好ましくは12〜16時間実施す
る。この誘発因子は、所望ならば所定の時間（例
えば、１時間）の後に洗浄によつて除去してもよ
いが、この工程は省略してもよい。その理由は、
誘発因子の存在が、不都合なようにインターフエ
ロンの産生に影響を与えないからである。この理
由で、通常は、誘発因子を除去しない。次いで、
細胞を液相から分離する。この上清は、α−イン
ターフエロンによつて汚染されている粗製のγ−
インターフエロンを含有している。その理由は、
インターフエロン産生の第２段階において（すな
わち、γ−インターフエロン産生の段階におい
て）、α−インターフエロン産生細胞も多少の量
のインターフエロンを産生するからである。

これらのインターフエロンは、互いに多の抗ウ
イルス活性を増強するので、α−およびγ−イン
ターフエロンの混合物中のγ−インターフエロン
の実際の量は、検量線（第１図）によつてのみ計
算することができる。γ−インターフエロンの量
を計算するために、増強された力価および混合物
中のα−インターフエロン量を知ることが必要で
ある。後者の値は、混合物をPH２で処理し、その
後それを滴定することによつて決定することがで
きる。その理由は、γ−インターフエロンが、こ
のPH値で選択的に分解され得るからである。

純粋なγ−インターフエロンは、粗製のγ−イ
ンターフエロン中のα−インターフエロン量を除
去することによつて得られる。この粗製のγ−イ
ンターフエロンを、好ましくはα−インターフエ
ロンを除去する前に、（例えば、CPG−350多孔
質ガラス粒子、Electron−Nucleonic N.J.米国、
によつて）部分的に精製し、そして濃縮する。下
記の方法を用いることができる。１つの方法は、
２つの型のインターフエロンの相異なる分子量
（α＝18000〜21000ダルトン、γ＝40000〜45000
ダルトン）に基づくものであり、ゲル過（例え
ば、セフアクリル（Sephacryl）Ｓ−200クロマ
トグラフイー）によつて実施するものである。他
の方法によれば、γ−インターフエロンを汚染し
ているα−インターフエロンを、セフアロースゲ
ルに結合した抗−α−インターフエロン抗体によ
つて結合させる。

本発明の方法の好都合は、α−およびγ−イン
ターフエロンが同一の白血球培養中で２工程で調
製され得るということである。インターフエロン
１単位の調製コストは、有意に減少する。なぜな
らば、インターフエロンの製造コストの大部分
が、血液試料の集収、「淡黄膜」画分の調製およ
び白血球の精製からなつているからである。本発
明の方法は、限定的であるが入手可能な白血球の
インターフエロン産生の有意な増加を可能とする
ものである。

本発明の一層の詳細を、以下の実施例に示す
が、これは、前記実施例の保護の範囲を限定する
ものではない。

実施例 １ 血液試料を、ACD溶液（クエン酸およびグル
コースを含有する水溶液）中に＋４℃で３時間貯
蔵した。このようにして得られた１容量部の白血
球コンセントレートを、氷冷した0.83％塩化アン
モニウム水溶液５重量部と混合した。この懸濁液
を、赤血球の溶解が起こるまで（５〜10分間）氷
冷下に放置し、その後、下記の組成： 成 分 量、mg／ 塩化カルシウム 175〜350 塩化カリウム 300〜500 硫酸マグネシウム または塩化マグネシウム 175〜500 塩化ナトリウム 5000〜7000 炭酸水素ナトリウム 200〜3500 燐酸二水素ナトリウム 30〜150 グルコース 500〜5500 硝酸第二鉄 ０〜0.2mg／ を有する栄養培地中に白血球を懸濁した。

１部の白血球懸濁液に対して、0.83％塩化アン
モニウム水溶液10容量部を用いたという相違点を
もつて、前記の赤血球の溶解操作を繰り返した。
この白血球を、前記組成の栄養培地中に懸濁し、
細胞数を１×10⁷細胞／mlの値に調整した。

前記栄養培地は、２mg／mlのヒトグロブリン不
含血清（約６％）を含有していた。前記細胞を、
37℃において一定の撹拌下に、200IU／mlの誘発
因子不含の濃縮ヒトα−インターフエロンで処理
した。２時間後、細胞を400赤血球凝集単位のセ
ンダイウイルスで誘発した。インキユベーシヨン
は、誘発の後、18時間以内で終えた。上清の抗ウ
イルス性α−インターフエロンの力価は
54200IU／mlであつた。α−インターフエロンの
産生のために用いた細胞を、前記の栄養培地で１
回洗浄し、前記白血球を栄養培地中に2.5×10⁷細
胞／mlの濃度で懸濁した。この栄養培地は、１
mg／mlのグロブリン不含のヒト血清（約３％）を
含んでいた。次いで、細胞を15ug／mlのコンカ
ナバリンＡで刺激した。この誘発因子は系から除
去しなかつた。インキユベーシヨンを37℃で一定
の撹拌下に実施し、誘発後16時間以内に上清を遠
心分離によつて細胞から取り出した。γ−インタ
ーフエロンを含む上清の抗ウイルス性力価を
WISHヒト羊水細胞によつて決定し、この力価を
ヒトα−インターフエロン標準と比較してＵ／ml
（単位／ml）で表わした（現在のところ、国際的
なヒトγ−インターフエロン標準組成物はない）。
上清の力価は、10600U／mlであつたが、これは
調製したγ−インターフエロン組成物がα−イン
ターフエロンをも含んでいたため増強されたレベ
ルのものであつた。もとの物質の力価およびPH２
で処理した場合の力価に基づき、第１図の検量線
によれば、実際のγ−インターフエロンの量は
1840U／mlであつた。

比較のために、γ−インターフエロン産生の前
にセンダイウイルスを用いないで細胞を１日間イ
ンキユベートした以外は前記した方法を繰り返し
た。コンカナバリンＡによつて産生されたγ−イ
ンターフエロン力価は、340U／mlであつた。

比較のために、第１の段階、すなわち、α−イ
ンターフエロン産生段階を省略して、単離した白
血球を直接コンカナバリンＡで誘発した。産生さ
れたγ−インターフエロンの力価は450U／mlで
あつた。

α−インターフエロン産生段階を省略し、かつ
誘発の前に４時間、白血球を1500U／mlのヒトα
−またはβ−インターフエロンで処理（初回抗原
刺激）した場合に、産生されたγ−インターフエ
ロンの力価は2300U／mlであつた。

実施例 ２ 栄養培地としてイーグル−溶液を用いた
（Virology 14、359（1961年））以外は、実施例
１に従つて実施した。α−インターフエロンの力
価は、56000IU／mlであつた。産生の第２の段階
における同一の栄養培地中のγ−インターフエロ
ン力価は、1680U／mlであつた。

α−インターフエロン産生を省略した場合に、
産生されたγ−インターフエロンの力価は
280U／mlであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、α−インターフエロンおよびγ−イ
ンターフエロンの混合物中のγ−インターフエロ
ン量を設定するための検量線を表わすものであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血液の淡黄膜画分を単離し、赤血球を除去
   し、適当な栄養培地中に白血球を懸濁し、そして
   α−インターフエロン誘発因子を用いおよびγ−
   インターフエロン誘発因子を用いて処理すること
   によつてα−およびγ−インターフエロンを調製
   する方法であつて、 血液の白血球（淡黄膜）画分を分離し、赤血球
   を除去し適当な栄養培地中に前記白血球を懸濁し
   た後に得られた懸濁液をα−またはβ−インター
   フエロンで予備処理すること、α−インターフエ
   ロン誘発因子と接触させること、α−インターフ
   エロンを含有する液体を前記細胞から分離し、所
   望ならばα−インターフエロンを回収すること、
   適当な栄養培地中で前記細胞を洗浄し懸濁させる
   こと、分裂促進因子を用いて処理すること、γ−
   インターフエロンを含有する液体を前記細胞から
   分離し所望ならばγ−インターフエロンを回収
   し、そして所望ならばγ−インターフエロンから
   α−インターフエロンを除去すること、によつて
   同一の白血球培養中で順次α−インターフエロン
   およびγ−インターフエロンを調製することを含
   んでなる、α−およびγ−インターフエロンの調
   製方法。 ２ 前記予備処理を、10〜500IU／mlのα−また
   はβ−インターフエロンを用いて実施することを
   含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 前記予備処理を、１〜６時間実施することを
   含む、特許請求の範囲第１項または第２項記載の
   方法。 ４ 前記予備処理を、35〜39℃で実施することを
   含む、特許請求の範囲第１項から第４項までのい
   ずれかに記載の方法。 ５ 前記α−インターフエロン誘発因子として、
   粗製または精製のセンダイウイルスを用いること
   を含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 前記センダイウイルスを、１ml当り100〜800
   の赤血球凝集単位で用いることを含む、特許請求
   の範囲第５項記載の方法。 ７ 前記α−インターフエロン誘発を、５〜48時
   間実施することを含む、特許請求の範囲第５項ま
   たは第６項記載の方法。 ８ 前記α−インターフエロン誘発を、35〜39℃
   で実施することを含む、特許請求の範囲第５項か
   ら第７項までのいずれかに記載の方法。 ９ 前記分裂促進因子として、コンカナバリン
   Ａ、フイトヘムアグルチニンまたはスタフイロコ
   ツカスのエンテロトキシンを用いることを含む、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０ 前記γ−インターフエロン誘発を、８〜48
   時間実施することを含む、特許請求の範囲第９項
   記載の方法。 １１ 前記の得られた粗製γ−インターフエロン
   を部分的に粗製し濃縮すること、およびゲル過
   によつてα−インターフエロンを除去することま
   たは前記α−インターフエロンを抗−α−インタ
   ーフエロン抗体と結合させることを含む、特許請
   求の範囲第１項から第１０項までのいずれかに記
   載の方法。 １２ 前記赤血球を、塩化アンモニウムを用いた
   溶血によつて前記淡黄膜画分から除去することを
   含む、特許請求の範囲第１項から第１１項までの
   いずれかに記載の方法。 １３ 前記栄養培地として、175〜350mg／の塩
   化カルシウム、300〜500mg／の塩化カリウム、
   175〜500mg／の硫酸マグネシウムまたは当量の
   塩化マグネシウム、5000〜7000mg／の塩化ナト
   リウム、200〜3500mg／の炭酸水素ナトリウム、
   30〜150mg／の燐酸二水素ナトリウム、500〜
   5500mg／のグルコースおよび任意に0.0〜0.2
   mg／の硝酸第二鉄および0.5〜10％の血清また
   は血清タンパク（0.5〜５mg／ml）を含有する水
   溶液を用いることを含む、特許請求の範囲第１項
   から第１２項までのいずれかに記載の方法。