JPH0478278B2 - - Google Patents
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- JPH0478278B2 JPH0478278B2 JP16914184A JP16914184A JPH0478278B2 JP H0478278 B2 JPH0478278 B2 JP H0478278B2 JP 16914184 A JP16914184 A JP 16914184A JP 16914184 A JP16914184 A JP 16914184A JP H0478278 B2 JPH0478278 B2 JP H0478278B2
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
酵素反応を利用して天然物質等を定量分析する
ことは、その基質特異性から選択性が高く、常
圧、温和な温度、中性に近いPHで測定ができるの
で、食品分析、臨床分析の分野で行なわれてい
る。酵素を利用した分析法には基本的に酵素反応
が完全に終了した状態で測定を行なう終点検出法
と、酵素反応の平衡を利用して反応の途中で測定
を行なう反応速度検出法とがある。本発明はこの
後者に関する。
ことは、その基質特異性から選択性が高く、常
圧、温和な温度、中性に近いPHで測定ができるの
で、食品分析、臨床分析の分野で行なわれてい
る。酵素を利用した分析法には基本的に酵素反応
が完全に終了した状態で測定を行なう終点検出法
と、酵素反応の平衡を利用して反応の途中で測定
を行なう反応速度検出法とがある。本発明はこの
後者に関する。
酵素反応を利用して分析を行なう場合、分析条
件を一定にするという意味から、反応時間、温度
等を精密に制御する必要がある。酵素反応は温度
依存性が高いため、温度の制御は特に重要であ
る。分析を迅速に行なう必要や、臨床化学検査で
は測定温度を生体温度に近ずけるという意味か
ら、従来は室温より高い30〜37℃付近の一定の温
度で分析が行なわれている。この様な温度での分
析をした場合、第一に温度が高いため、酵素の失
活が早くなり、長時間の使用が困難となる。第二
に室温より温度が高いため、液中に気泡が発生し
やすくなり、発生した気泡が、検出器のフローセ
ル内面や、固定化酵素膜面等に付着して分析値に
誤差を生ずる。第三に高温では酵素活性が高いた
めグルコースオキシダーゼなどの酸化還元酵素を
用いた場合、酸素消費量が基質濃度の増加に比例
して増加するが、基質濃度がある一定以上になる
と、溶存酵素を消費しつくして、検量線が直線か
らはずれ、この傾向は温度が高い程低い基質濃度
で発生し、生体サンプルや食品サンプルなどは基
質グルコース濃度が高いため100倍程度の希釈を
必要とするが、測定濃度が高いと、直線範囲から
外れた測定となり不都合を生ずる問題があつた。
件を一定にするという意味から、反応時間、温度
等を精密に制御する必要がある。酵素反応は温度
依存性が高いため、温度の制御は特に重要であ
る。分析を迅速に行なう必要や、臨床化学検査で
は測定温度を生体温度に近ずけるという意味か
ら、従来は室温より高い30〜37℃付近の一定の温
度で分析が行なわれている。この様な温度での分
析をした場合、第一に温度が高いため、酵素の失
活が早くなり、長時間の使用が困難となる。第二
に室温より温度が高いため、液中に気泡が発生し
やすくなり、発生した気泡が、検出器のフローセ
ル内面や、固定化酵素膜面等に付着して分析値に
誤差を生ずる。第三に高温では酵素活性が高いた
めグルコースオキシダーゼなどの酸化還元酵素を
用いた場合、酸素消費量が基質濃度の増加に比例
して増加するが、基質濃度がある一定以上になる
と、溶存酵素を消費しつくして、検量線が直線か
らはずれ、この傾向は温度が高い程低い基質濃度
で発生し、生体サンプルや食品サンプルなどは基
質グルコース濃度が高いため100倍程度の希釈を
必要とするが、測定濃度が高いと、直線範囲から
外れた測定となり不都合を生ずる問題があつた。
本発明は上記の問題を改良し、酵素の寿命を延
ばし、基質の測定可能濃度範囲を広げ、検出器中
での気泡の発生を防いで従来より精度よく分析で
きる方法を供することを目的とするものである。
ばし、基質の測定可能濃度範囲を広げ、検出器中
での気泡の発生を防いで従来より精度よく分析で
きる方法を供することを目的とするものである。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明は、この目的を達するため、酵素反応を
利用して反応速度検出法により基質濃度を測定す
る分析方法において、検出器を配置した恒温槽を
室温以下の25℃またはこれより下の所定の温度に
保ち、希釈液をこの恒温槽内に配置した空気透過
性の管を通して調温し前記温度にまで温度低下さ
せた後、基質を希釈液に注入混合して検出器に供
給するようにしたものである。
利用して反応速度検出法により基質濃度を測定す
る分析方法において、検出器を配置した恒温槽を
室温以下の25℃またはこれより下の所定の温度に
保ち、希釈液をこの恒温槽内に配置した空気透過
性の管を通して調温し前記温度にまで温度低下さ
せた後、基質を希釈液に注入混合して検出器に供
給するようにしたものである。
酵素反応を利用して反応速度検出法により基質
濃度を分析する分析計には、固定化酵素を用いる
ものと、溶液状の酵素を用いるものとがある。固
定化酵素を用いる分析計においては、酵素を固定
化した担体をカラムに充填したものを用いる場
合、酵素的に活性な内壁をもつナイロンチユーブ
に酵素を固定化して用いる場合、又は化学的ある
いは物理的方法により高分子膜に固定する場合な
どがある。また検出器としては、電気化学的検出
器、光学的検出器などを用いる。これら検出器は
固定化酵素を用いる場合にも溶液状の酵素を用い
る場合にも用いられる。本発明は上記何れの場合
にも適用できるものである。空気透過性の管とし
てはポリ四フツ化エチレンやシリコンゴム製のも
のを用いることができる。
濃度を分析する分析計には、固定化酵素を用いる
ものと、溶液状の酵素を用いるものとがある。固
定化酵素を用いる分析計においては、酵素を固定
化した担体をカラムに充填したものを用いる場
合、酵素的に活性な内壁をもつナイロンチユーブ
に酵素を固定化して用いる場合、又は化学的ある
いは物理的方法により高分子膜に固定する場合な
どがある。また検出器としては、電気化学的検出
器、光学的検出器などを用いる。これら検出器は
固定化酵素を用いる場合にも溶液状の酵素を用い
る場合にも用いられる。本発明は上記何れの場合
にも適用できるものである。空気透過性の管とし
てはポリ四フツ化エチレンやシリコンゴム製のも
のを用いることができる。
本発明方法において恒温槽を温室以下の25℃ま
たは25℃以下の温度にして分析を行なうようにし
たのは、従来行なわれている分析温度では、酵素
の失活が早く寿命が短かいため、酵素の活性を長
時間維持できるようにすると共に基質濃度が下記
実施例に示すように従来より高濃度まで分析可能
とし分析範囲を広げることができるようにするた
めである。25℃以下の室温より低い温度で分析を
行なうと、室温に保存された希釈液が温度低下に
より、液中に存在する気泡が消失し、検出器や、
フローセル、固定化酵素等の表面に気泡が発生す
ることがなく、精度の良い分析ができるようにす
るためである。
たは25℃以下の温度にして分析を行なうようにし
たのは、従来行なわれている分析温度では、酵素
の失活が早く寿命が短かいため、酵素の活性を長
時間維持できるようにすると共に基質濃度が下記
実施例に示すように従来より高濃度まで分析可能
とし分析範囲を広げることができるようにするた
めである。25℃以下の室温より低い温度で分析を
行なうと、室温に保存された希釈液が温度低下に
より、液中に存在する気泡が消失し、検出器や、
フローセル、固定化酵素等の表面に気泡が発生す
ることがなく、精度の良い分析ができるようにす
るためである。
溶液の飽和溶存酸素量は、温度が低いほど多く
なる。希釈液を室温より冷すと、液中への溶存酸
素を増すことができるので、恒温槽内に配置した
空気透過性の管を通して希釈液を検出器に送る途
中で管を通して希釈液の溶存酸素を飽和させるこ
とにより、酸化還元反応に必要な酸素を供給し高
濃度の基質に対する分析を可能にし分析範囲を広
げることを可能としたものである。
なる。希釈液を室温より冷すと、液中への溶存酸
素を増すことができるので、恒温槽内に配置した
空気透過性の管を通して希釈液を検出器に送る途
中で管を通して希釈液の溶存酸素を飽和させるこ
とにより、酸化還元反応に必要な酸素を供給し高
濃度の基質に対する分析を可能にし分析範囲を広
げることを可能としたものである。
第１図に示す容器９内に入れたPH5.6の燐酸塩
水溶液を希釈液とし、これをポンプ８により毎分
６mlの流量で、一定温度に保持した恒温槽５内に
配置したシリコンゴム製（内径２mm、外径３mm、
長さ７ｍ）の調温コイル６を通過させ、希釈液の
温度を一定にすると共に希釈液中の溶存酸素を飽
和せしめた。恒温槽５中には、調温コイル６の他
サンプルインジエクター７、混合コイル６′、攪
拌子３を入れたフローセル２、フローセル２に装
着した酵素電極１が収納されており、調温コイル
６を通した希釈液は、サンプルインジエクター７
で、β−Ｄグルコース溶液を8μ添加し、混合
コイル６′を通してフローセル２内に一定量導入
しスターラー４で攪拌子３を回転して攪拌した。
グルコースオキシダーゼ固定化膜を取付けたグル
コースオキシダーゼ50mUの酵素電極１により、
フローセル２内に導入してから一定時間後発生し
た過酸化水素をピーク電位として取り出し、微分
回路を具えた増幅器１２で電流値として検出し
た。この結果を増幅器１２に接続したマイクロコ
ンピユータ１３に入力し、グルコース濃度を計算
した。測定後のフローセル２内の液はポンプ１０
で廃液タンク１１に排出し基質濃度を変えて試験
した。このときのピーク電位とグルコース濃度と
の関係を第２図に示す。希釈倍率は約500倍であ
る。
水溶液を希釈液とし、これをポンプ８により毎分
６mlの流量で、一定温度に保持した恒温槽５内に
配置したシリコンゴム製（内径２mm、外径３mm、
長さ７ｍ）の調温コイル６を通過させ、希釈液の
温度を一定にすると共に希釈液中の溶存酸素を飽
和せしめた。恒温槽５中には、調温コイル６の他
サンプルインジエクター７、混合コイル６′、攪
拌子３を入れたフローセル２、フローセル２に装
着した酵素電極１が収納されており、調温コイル
６を通した希釈液は、サンプルインジエクター７
で、β−Ｄグルコース溶液を8μ添加し、混合
コイル６′を通してフローセル２内に一定量導入
しスターラー４で攪拌子３を回転して攪拌した。
グルコースオキシダーゼ固定化膜を取付けたグル
コースオキシダーゼ50mUの酵素電極１により、
フローセル２内に導入してから一定時間後発生し
た過酸化水素をピーク電位として取り出し、微分
回路を具えた増幅器１２で電流値として検出し
た。この結果を増幅器１２に接続したマイクロコ
ンピユータ１３に入力し、グルコース濃度を計算
した。測定後のフローセル２内の液はポンプ１０
で廃液タンク１１に排出し基質濃度を変えて試験
した。このときのピーク電位とグルコース濃度と
の関係を第２図に示す。希釈倍率は約500倍であ
る。
第２図において、25℃，10℃の曲線は室温を28
℃，20℃とし恒温槽25℃，10℃としたときのも
の、35℃の曲線は室温25℃で、恒温槽を35℃とし
たときのものである。
℃，20℃とし恒温槽25℃，10℃としたときのも
の、35℃の曲線は室温25℃で、恒温槽を35℃とし
たときのものである。
この結果によれば、低温ほど直線部分が伸びて
おり、25℃の曲線では35℃の場合より約３％，10
℃では35℃の場合より約11％濃い基質まで精度よ
く測定できることが判る。
おり、25℃の曲線では35℃の場合より約３％，10
℃では35℃の場合より約11％濃い基質まで精度よ
く測定できることが判る。
本発明分析方法によれば、従来より高濃度の基
質を分析濃度範囲を拡大できると共に気泡の発生
を防止できることから分析値をより正確ならしめ
ることができ、固定化酵素を用いる場合には恒温
槽の温度が従来より低いだけ寿命を延長できる。
質を分析濃度範囲を拡大できると共に気泡の発生
を防止できることから分析値をより正確ならしめ
ることができ、固定化酵素を用いる場合には恒温
槽の温度が従来より低いだけ寿命を延長できる。
第１図は本発明方法の実施例に用いた分析装置
の概略図、第２図は実施例の結果をピーク電位と
グルコース濃度の関係の曲線として示した図であ
る。
の概略図、第２図は実施例の結果をピーク電位と
グルコース濃度の関係の曲線として示した図であ
る。
Claims (1)
- １ 酵素反応を利用して反応速度検出法により基
質濃度を測定する分析方法において、検出器を配
置した恒温槽を室温以下の25℃またはこれより下
の所定の温度に保ち、希釈液をこの恒温槽内に配
置した空気透過性の管を通して調温し前記温度に
まで温度低下させた後、基質を希釈液に注入混合
して検出器に供給することを特徴とする酵素反応
を利用した分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16914184A JPS6147199A (ja) | 1984-08-13 | 1984-08-13 | 酵素反応を利用した分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16914184A JPS6147199A (ja) | 1984-08-13 | 1984-08-13 | 酵素反応を利用した分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6147199A JPS6147199A (ja) | 1986-03-07 |
| JPH0478278B2 true JPH0478278B2 (ja) | 1992-12-10 |
Family
ID=15881043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16914184A Granted JPS6147199A (ja) | 1984-08-13 | 1984-08-13 | 酵素反応を利用した分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6147199A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013182237A1 (en) * | 2012-06-06 | 2013-12-12 | Apeiron Biologics Ag | Method for measurement of peptidic degradation products of a proteolytic cascade in blood samples |
-
1984
- 1984-08-13 JP JP16914184A patent/JPS6147199A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6147199A (ja) | 1986-03-07 |
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