JPH0479897A - Ｎ―アセチル―β―Ｄ―ヘキソサミニデース活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニデース（
以下ｒＮＡＨａｓｅ」と略称する。）活性測定方法に係
り、特に、ＮＡＨａｓｅ活性を良好な操作性にて、安定
かつ高精度に測定することができるＮＡ）Ｉａｓｅ活性
測定方法に関する。

［従来の技術］ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ゲルコサミニデース（ＮＡＧａ
ｓｅ）活性の測定には、従来、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド［Ｂｉｏｃｈｏ
ｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、１０，１１８
（１９６３）］又は］Δ−メチルウンベリフェリルーＮ
アセチル−β−Ｄ−グルコサミナイド［Ｃｌ１ｎｉｃａ
ｌ（ｔ＋ｅｍｉｃａ　Ａｃｔａ、６９（１）、＋１５（
１９７ｆｉ）コが広く用いられている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミナイドを用いる方法は、ｐ−ニトロフ
ェノールの吸収を測定しているため、吸収波長の近いビ
リルビンや溶血ヘモグロビンなどの生体成分の影響を受
は易い。また、界面活性剤などの薬剤によっても、ｐ−
ニトロフェノールのモル吸光係数が変化するなどの問題
があり、検体ごとにブランクを測定する必要があった。

更に、ＮＡＧａｓｅ測定の至適ｐＨ（ｐＨ４，０〜５．
５）とｐ−ニトロフェノールの発色Ｐ）Ｉ　（ｐＨ９以
上）が大きく相違するために、酵素反応と発色反応とを
切り離して行なう必要があり、酵素活性の測定に適した
方法であるレート法（キネティック分析）を適用するこ
とができないという欠点もある。

また、Δ−メチルウンベリフェリルーＮ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミナイドを用いる方法は、蛍光光度計の
ような特殊な機器が必要であり一般的ではなかった。

一方、レート法を適用可能とするために、ｐ−ニトロフ
ェノールにクロル基を導入した基質、即ち、２−クロロ
−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミナイド［Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、。

３４、（１０）２１４０（１９８８）　］も合成された
が、クロル基の導入によっても、ＮＡＧａ　ｓ　ｅ活性
測定に十分適応し得る程度の発色ｐＨの低下効果は得ら
れていない。

また、上述のＮ−アセチルグルコサミンにその他のフェ
ノール系発色物を結合させて、発色ｐＨを変えることも
考えられるが、このようなフェノール系発色物を含む基
質は、一般に溶解度が低く、酵素活性測定に十分な量を
溶解させることができない。このような問題を解決する
ために、包接化合物を用い、溶解度を上昇させる旨の報
告もあるが、この場合においても、酵素活性測定に十分
な程度の溶解性の向上効果は得られていない。

ところで、近年、尿中成分の測定には、自動分析装置を
用いた方法ばかりでなく、簡易な試験紙による分析方法
（試験紙上の濾紙に薬品類をしみ込ませて、これを尿中
に浸し、発色の有無から判定を行なう方法（試験紙法）
）の開発に対する要求が高まっている。しかし、上記基
質はいずれも試験紙法への応用が不可能若しくは非常に
困難であった。

以上のように、従来のＮＡＧａｓｅ活性測定方法は、い
ずれもレート法への適応が困難であり、操作性が悪く、
特殊な機器が必要であったり、測定精度や溶解性などに
多くの問題を有していた。

更に、簡易な試験紙による測定方法への適応も困難であ
るという欠点を有していた。

本発明は上記従来の問題点を解決し、良好な操作性にて
、安定かつ高精度にＮＡＨａｓｅ活性を測定することが
できるＮＡＨａｓｅ活性測定方法を提供することを目的
とする。

［課題を解決するための手段］ 請求項（１）のＮＡＨａｓｅ活性測定方法は、下記一般
式［Ｉコ で表されるＮＡＨａｓｅ活性測定用基質と試料とを接触
させ、遊離するＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミン（
以下ｒＮＡＨＪと略称する。）を測定して試料中のＮＡ
Ｈａｓｅ活性を測定することを特徴とする 請求項（２）のＮＡＨａｓｅ活性測定方法は、上記請求
項（１）の方法において、ＮＡＨを糖オキシダーゼと過
酸化水素分解酵素を用いて測定することを特徴とする。

なお、本発明において、前記一般式［Ｉ］で示されるＮ
ＡＨａｓｅ活性測定用基質のＧとしては、フルクトース
、ガラクトース、Ｎ−アセチルへキソサミン（Ｎ−アセ
チルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン）、グ
ルコース、シュークロース、グルコース−６−リン酸等
が挙げられる。

［作用コ 以下に本発明の反応機構について詳細に説明する。

本発明は係るＮＡＨａｓｅ活性測定用基質は、前記一般
式［Ｉ］で示される構造、即ち、ＮＡＨの１位に糖類又
は糖類の誘導体がβ結合したもの（以下ｒＮＡＨ−ＧＪ
と略称する場合がある。）である。このようなＮＡＨａ
ｓｅ活性測定用基質は、ＮＡＨａ　ｓ　ｅにより氷解さ
れると、１分子のＮＡＨを生成する。このＮＡＨにＮ−
アセチルへキソサミン・オキシダーゼ（以下ｒＮＡＨＯ
ＤＪと略称する。）を作用させるとＨ２０２を発生する
。このＨ２Ｏ２を従来より広く行なわれているＰＯＤ発
色茶色系き、例えば、ジメチルアニリン、ジエチルアニ
リンなどのアニリン話導体、４−クロロフェノール、２
．４−ジブロムフェノールなどのフェノール誘導体、４
−アミンアンチピリンなどのアンチピリン誕導体、３−
メチル−２−ベンゾチアゾリノンなどのベンゾチアゾリ
ノン話導体、ナフトール話導体、ヒドロキシキノリン話
導体、更にはロイコ型色素などのパーオキシダーゼの基
質として一般に用いられるものを単独もしくは２種以上
組み合わせて用い、その縮合反応の結果生じる色素を比
色定量することにより、活性を測定することができる。

反応式の一例を以下に示す。なお、下記式中、ＨＤは水
素供与体、ＰＯＤはパーオキシダーゼを示す。

ＮＡ）ｌａｓｅ ↓ ＮＡＨ−Ｇ　　＋　　Ｈ２ＯＮＡ）Ｉ　＋　　ＧＡＨＯ
Ｄ ↓ ＨＡＨ◆　０２＋）１２０−−→Ｎ−７セチルー　β−
Ｄ−ヘキソサミン酸　十　Ｈ２Ｏ２ＯＤ ↓ Ｈ２Ｏ２◆）１０−ｍ−色素＋８２０ 特に、ＮＡＨａｓｅ活性測定用基質が、ＮＡＨの２量休
ＮＡＨ−ＮＡ）Ｉである場合゛、これはＮＡＨａｓｅに
より氷解され、２分子のＮＡＨを生成する。従って、こ
のＮＡＨを上記と同様の方法で測定することにより、Ｎ
ＡＨａｓｅ活性を測定することができる。この場合には
、１分子の基質からＮＡＨが２分子生成することから、
他の基質を用いた場合と比較して２倍の感度が得られ、
測定精度が向上する。

また、Ｎ−アセチルグルコサミンの１位にグルコース又
はガラクトースがβ結合した基質の場合には、遊離した
糖をグルコースオキシダーゼ又はガラクトースオキシダ
ーゼによりＨ２Ｏ２へ導籾、上記と同様パーオキシダー
ゼ系へ導くことによりＮＡＨａｓｅ活性を測定すること
ができる。

また、ＮＡＨＯＤを共存させることにより、従来の２倍
の感度の測定が可能となる。更に、この最終段のＨ２Ｏ
２定量系は、カタラーゼを用いた系をとすることもでき
る。反応式の一例を以下に示す。

１１２０□　＋　ＣＨ３０ＨＨ２Ｏ＋　　ＨＣＨＯ（メ
タノール）　　カタラーゼ　　　　　　　　（ホルムア
ルデヒド）１１　ＣＨＤ ２ＣＨ３ＧＯＣＩ２ＧＯＣＩ’＋３ （７七チＪげ七トン） Ｈ３ （１ｍａｘ：４１２ｒ＋ｍ） （３，５−ジアセチル−１，４−ジヒドロルチジン）［
実施例コ 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。

実施例１ 被検液中のＮＡＧａｓｅ活性を下記の試薬と操作法によ
って測定した。

虱皇 ＮＡＧ−Ｆ　（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミンの
１位にフルクトースがβ結合したもの）；　４　ｍ　ｍ
　ｏ　ｎ　／　Ｉｔ 塩化ナトリウム ：２００ｍｍ０Ｊ２／’Ｊ！ ＮＡＧＯＤ　（Ｎ−アセチルグルコサミンオキシダーゼ
）　　　　　　　　：１０Ｕ／ｍｌ！ＰＯＤ　（パーオ
キシダーゼ）：　５Ｕ／ｍＡ４ＡＡ　（４−アミノアン
チピリン） ：　１　ｍ　ｍ　ｏ　ｆ　／　Ｉｔ フェノール　　　　　：１０ｍｍｏＪ２／Ａクエン酸−
リン酸Ｎ衝液 ：　５０ｍｍｏｕ／Ａ　（ｐＨ６，０）Ｔｒｉｔｏｎ　
　Ｘ−１００：０．５％操作法 上記試薬２．７ｍｕを３７℃で予備加温し、５００ｎｍ
にて吸光度変化のないことを確肥の上、試料０．３ｍ℃
を加え、十分に攪拌し５００ｎｍにて吸光度変化を測定
した。２００ｍ　Ｕ　／　ｍ　１のβ−ＮＡＧ　（Ｎ−
アセチル−β−Ｄ−グルコサミン）をこの方法で測定し
たときの反応曲線を第１図に示した。また、各種活性試
料を測定したときの反応速度との関係を第２図に示した
。

実施例２ 被検液中のＮＡＧａ　ｓ　ｅ活性を下記の試薬と操作法
によって測定した。

バ丞 ＮＡＧ−Ｆ　　　　　　　：　４ｍｍｏＪ２／ｆＬ塩化
ナトリウム　　　　：２００ｍｍｏｆ／ｆＬＮＡＧＯＤ
　　　　　　　：５０Ｕ／ｍｌ１ＰＯＤ　　　　　　　
　　：１０Ｕ／ｍＪＺＯ−トリジン　　　　　：　１０
　ｍ　ｍ　Ｏｊ２　／　Ｉｔクエン酸−リン酸緩衝液 ：　５０ｍｍｏＪ２／ｊ２　（ｐＨ５，４）Ｔｒｉｔｏ
ｎ　　　Ｘ−１００：０．５　％操作法 上記試薬を濾紙に浸潤させ凍結乾燥した。このようにし
て製作した濾紙に、ＮＡＧａ　ｓ　ｅ活性既知溶液を添
加後、温度２３℃で反射強度計（中心波長７００ｎｍ）
にて反応タイムコースを求め、結果を第３図に示した。

第１〜３図により、本発明の方法によれば、ＮＡＨａｓ
ｅ活性を精度良く、安定に測定することがで籾、レート
法又は試験紙法での測定も可能であることが明らかであ
る。

［発明の効果〕 以上詳述した通り、本発明のＮＡＨａ　ｓ　ｅ活性測定
方法によれば、 ■　ＮＡＧａｓｅ活性測定を操作性良く、測定機器に左
右されずに正確に測定することができる。

■　ＮＡＧａｓｅ活性のレート法による測定が可能であ
る。

■　ＮＡＧａ　ｓ　ｅ活性の試験紙法での測定が可能で
ある。

■　基質の溶解度が飛躍的に向上し、このため、正確な
測定のために十分量の基質を添加使用することかできる
。

等の効果が達成され、ＮＡＨａｓｅ活性を安定かつ高精
度に、容易に測定することが可能とされる。

特に、請求項（２）の方法により、より一層優れた効果
が奏される。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は実施例１で得られた結果を示し、第
１図は反応曲線を示すグラフ、第２図は酵素活性と反応
速度との関係を示すグラフである。第３図は実施例２で
得られた、反応タイムコースを示すグラフである。 代理人　　弁理士　　重　　野　　　剛第 図 時 間 （分） 第 図 酵 素 活 性（ｒｎＵ／ｍｆｆ１） 時 間 （秒）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一般式［ I ］で表されるＮ−アセチル−β
   −Ｄ−ヘキソサミニデース活性測定用基質と試料とを接
   触させ、遊離するＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミン
   を測定して試料中のＮ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミ
   ニデース活性を測定することを特徴とするＮ−アセチル
   −β−Ｄ−ヘキソサミニデース活性測定方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・［ I ］ ［ I ］式中、Ａ＿１、Ａ＿２はいずれか一方が水素で
   他方がＯＨを示し、 Ｇは糖又は糖の誘導体を示す。
2. （２）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミンを糖オキシ
   ダーゼと過酸化水素分解酵素を用いて測定することを特
   徴とする請求項（１）に記載の方法。