JPH048033B2 - - Google Patents
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- JPH048033B2 JPH048033B2 JP57221743A JP22174382A JPH048033B2 JP H048033 B2 JPH048033 B2 JP H048033B2 JP 57221743 A JP57221743 A JP 57221743A JP 22174382 A JP22174382 A JP 22174382A JP H048033 B2 JPH048033 B2 JP H048033B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
- B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
- B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
- B29C59/14—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by plasma treatment
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、初代細胞培養に適する培養表面を用
いた細胞培養方法に関する。更に詳しくは、本発
明は、ポリスチレン表面をプラズマ曝露によつて
変性させることによつて製造された細胞培養用ポ
リスチレン表面を培養表面として用いて、新たに
採取した細胞を初代培養して、繊維芽細胞の増殖
を抑制しつつ目的とする初代細胞を増殖させるこ
とを特徴とする細胞培養方法に関する。 （従来の技術） 初代細胞培養物及び樹立細胞系統の培養物の両
者の成長に影響を及ぼす因子の一つは、培養物を
成長させる生育培地と、この培地に境界層を提供
する支持体との間の界面であることが知られてい
る。細胞培養物を成長させる分散相、即ち培地を
改良変化させる方法はよく知られている。また、
培地と支持体との間の表面界面を、一般に種々の
化学物質、例えばコラーゲンで被覆することによ
つて変化させる方法も知られている。細胞の培養
を試みる前に種々の化学的被膜を支持体に施すこ
とは、実験室において日常的に実施されている。
そのような化学物質の例は、ポリリジン、コラー
ゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４−硫酸、
コンドロイチン６−硫酸、並びに種々の多糖類及
びレクチン類である。一次細胞培養物の成長のた
めの支持体表面を変性するために最も普通に使用
されている化学物質は、コラーゲン、ゼラチン及
びポリリジンである。しかしながら、これらの被
覆は繊維芽細胞の成長の抑制はしない。 また、樹立細胞培養物を成長させるために組織
培養用プラスチツクを用いることも知られてい
る。このような市販品として入手できる組織培養
用器具は、Becton Dickinson and Companyか
らFALCONの商標名で市販されている。市販の
組織培養器具は、樹立細胞系統については十分な
性能を有するが、例えば、初代細胞又はコラーゲ
ンの被覆を必要とするある種の細胞については、
十分な性能を有しない。 本発明の好ましい実施態様においては、細胞の
培養にあたつて、表面化学特性がプラズマへの曝
露によつて変性されているポリスチレン支持体を
培養表面として用いる。 支持体を種々のプラズマに曝露して種々の目的
を達成することは公知である。例えば、
International Plasma Corporation，Product
Bulletin24000のパンフレツトは、ポリスチレン
の組織培養トレーを、酸素又はアルゴンのプラズ
マで処理することにより、親水性としかつ細胞の
成長に適するものとすることができることを示唆
している。また、上記のBecton Dickinson and
Companyから市販されているFALCONは、酸素
プラズマを照射処理したポリスチレン組織培養器
具である。また、Tegal Corporation CP1287の
パンフレツトは、電子部品の乾式ストリツピン
グ、清浄化及びエツチング、光学的表面の清浄
化、結合性、親水性及び化学的抵抗性を有する表
面の製造、並びに、フイルムの付着及び接着を改
良するための支持体の乾式清浄化に、プラズマが
使用できることを示している。Lee M.Smithの
博士論文“Cell Adhesion as Influenced by
Substrate Surface Properties”，Department
of Material Science and Engineering，the
University of Utah，1978，p.67は、細胞の付着
が表面の炭素／酸素比と相関することを示唆して
いる。しかしながら、これらの文献のいずれにお
いても、細胞を成長させる支持体の表面の化学的
変性によつて、細胞の成長に影響を及ぼすことが
できることは、開示も示唆もされていない。 （発明が解決しようとする課題） 初代細胞の成長を増強するのに適当な化学物質
で支持体を被覆することなしに、選ばれた細胞培
養物を成長させるために化学的に特異性の支持体
表面を提供すれば望ましいであろう。 培養物中のフイブロブラスト（繊維芽細胞）
は、一般に成長速度が大きいために、汚染速度が
早く、培養物中の初代細胞を成長させることが困
難であることが多い。したがつて、目的とする細
胞培養物の成長に適当であると同時に、繊維芽細
胞の成長を抑制する特異的な支持体表面の提供が
望まれている。 したがつて、本発明の主たる目的は、生育培地
と支持体との間の界面における種々の細胞培養物
の成長に影響を及ぼす表面を提供し、これを培養
表面として用いて、新たに採取した細胞を初代培
養し、繊維芽細胞の増殖を抑制しつつ、目的とす
る初代細胞を増殖させることを特徴とする細胞培
養方法を提供することである。 （課題を解決するための手段） 本発明者らの研究によれば、一般に、支持体の
表面上の培養細胞の活性は、細胞膜と接触する支
持体表面の表面化学特性を変化させることによつ
て調節可能であることが見出された。ポリマー表
面の化学特性は、表面をプラズマ処理することに
よつて変性することができる。特に、プラズマ処
理によつて、特異的化学官能基や元素比及び他の
表面性質を与えることができる。 本発明において用いる培養表面は、ポリスチレ
ン表面をプラズマ変性技術によつて変性すること
によつて得られる。変性されたポリマー表面を細
胞培養試験に付したところ、細胞の増殖応答はポ
リマー表面の化学特性に高度に依存性であること
が見出された。更に研究を重ねた結果、本発明者
は、ポリマー表面をある特定の雰囲気中において
発生させたプラズマに曝露することによつて、繊
維芽細胞の成長を抑制しつつ目的とする細胞培養
物の成長に適当な培養表面が提供されることを見
出した。更に、本発明者は、かかる曝露工程の後
にある特定の雰囲気に接触させると、繊維芽細胞
の成長の抑制及び培養対象の細胞の成長の促進に
有効であることを見出した。 本発明において、プラズマは、アンモニアガス
が存在する環境下で発生させる。 本発明の一実施態様によれば、細胞培養におい
て用いる培養表面は、 ポリスチレン支持体を反応ゾーン内に供給し、 上記ガスの陽イオン、陰イオン、電子及びフオ
トンよりなるプラズマを反応ゾーン内において発
生させ、 支持体の表面上に前記ガス物質の特異的官能基
を形成する、 これによつてポリスチレン表面を変性することに
よつて提供される。 本発明の他の態様によれば、前記プラズマ成分
の少なくとも１種が反応ゾーンにおいて支持体の
表面と接触するのを防ぐこともできる。この実施
態様は、プラズマの選択された反応性成分を用い
て、細胞培養物の成長に影響を及ぼす作用を有す
る特異性化学的官能基を支持体の表面上に形成す
ることができるという知見に基づいている。 以下、図面を参照しながら本発明におけるプラ
ズマ処理方法を説明する。第１図に示されるよう
に、第１ガス及び第２ガスのいずれか一方又は両
方の真空室１７へ供給する導管手段１５を有す
る、第１ガス溜め及び第２ガス溜めを用意する。
真空計２３で真空室１７内の圧力を監視する。弁
２５、２７及び２９を設けて、第１ガス溜め及び
第２ガス溜め内のガスの流速及び真空室１７へ入
るガスの流速を調節する。使用前に、弁３１を真
空ポンプ３３に対して開いて、真空室１７を排気
する。適当な電極３５及び３７を適当な電圧源３
９へ接続する。この反応系は、トラツプ４１、ベ
ント導管４３及びその弁４５も有する。 第２図に示すように、本発明におけるプラズマ
処理方法に従つて処理する支持体４７を、試料ホ
ルダー中に入れ、真空室１７内に配置する。この
試料ホルダーは、グリツド１、グリツド２及びグ
リツド３と称される三つのグリツドからなるグリ
ツドアセンブリを有している。電気的にバイアス
されたコレクター４９を、試料のグリツド系に対
して他方の側に配置する。試料は、グリツドとコ
レクターとの所定位置に適当なホルダー５１によ
り保持される。 操作において、電極３５及び３７の間で発生し
たプラズマの選択された成分を反発させるため
に、正又は負の電荷で三つのグリツド又はコレク
ターのいずれかをバイアスすることもできる。次
に、試料ホルダー中の支持体を、反発されないプ
ラズマの成分と反応させる。 かかる方法を用いて、固体のポリスチレン支持
体の表面を変性することができる。 支持体はいかなる形状であつてもよく、例え
ば、連続又は粒状、多孔質又は不透過性であつて
もよく、また、大型又は小型であつてもよい。上
記の方法を用いて、キヤスト成形、押出成形又は
圧縮成形物品等の表面を変性することができる。 本発明におけるプラズマ処理方法において使用
に適するプラズマは、放電プラズマ、ビームプラ
ズマ及びハイブリツドプラズマである。適当なプ
ラズマは、直流源又はマイクロ波の範囲の周波数
を有する交流源を用い、約1.0W〜約10kWの電力
で発生させることができる。特に限定されない
が、高い周波数、例えば無線周波数（rf）のプラ
ズマは、本発明において用いる培養表面を製造す
るために用いるのに有用であり、選択したプラズ
マ種の濃度を、周波数及び電圧によつて調節する
ことができる。また、rfプラズマは、直流及び低
周波数のプラズマでは処理が不可能な、複雑な形
状の物品、例えば管及びその他の内部表面を均一
に変性するのに適している。 一般に、本発明におけるプラズマ処理において
用いるのに適するrfプラズマは、約1.0〜約
300MHzの周波数及び絶縁破壊（ブレイクダウ
ン）を開始する電力、例えば約５〜約1000ワツト
で0.001〜10トルの圧力において発生させる。rf
プラズマへの物品の曝露は、通常、約0.1秒〜約
120分であるが、より長い時間及びより短い時間
を用いることも可能である。プラズマ曝露に続い
て急冷サイクルを行つて、１〜760トルの圧力で
１秒〜４時間、プラズマと物品の表面及びその付
近の残留活性ポリマー種との反応に適した雰囲気
を形成することもできる（接触工程）。rfプラズ
マは、第１図に示すように、二枚の平板の間で発
生させることができ、又は、米国特許第4188426
号に記載されているように、螺施コイルを用いて
発生させることができる。 以下の培養表面の製造例において、ポリスチレ
ンの支持体を種々のプラズマ種に曝露した。次い
で、支持体をＸ線光子分光分析（ESCA）により
検査して、ポリスチレン支持体の表面上の化学的
官能基の性質を決定できる。 各製造例でプラズマに曝露した後、支持体をゼ
ータ電位及びWilhelmy Plate接触角について測
定する。これらの値を表１に示す。表面電荷及び
表面張力特性についてのこれらの測定結果によつ
て、広い範囲の表面化学特性が得られることが示
される。 また、各製造例で得られたプラズマ変性ポリス
チレン表面を培養表面として用いた場合のヒト２
培体繊維芽細胞（MRC−５）の平板効率
（plating efficiency）を求めた。平板効率の試験
においては、MRC−５細胞はAmerican Type
Culture Collection，Rockville，Marylandから
購入したものを用いた。また、生育培地として
は、10％のウシ胎児血清を含む最小必須培地
（MEM）を用いた。平板効率は、かかる生育培
地中にほぼ30細胞／mlのヒト２倍体繊維芽細胞
（MRC−５）を含む細胞懸濁液を、ペトリ皿に接
種し、37℃、５％CO2雰囲気中、相対湿度94％の
条件下で、コロニーが100〜300個の細胞集団にな
るまで成長させ、計数された各皿のコロニーの数
と接種した細胞の数の比として定義し、百分率で
表した。結果を、表１に相対平板効率として示し
た。ここで、相対平板効率は、各製造例において
処理されたポリスチレン支持体を培養表面として
用いて成長させた繊維芽細胞の平板効率と、
FALCONの商標名でBecton Dickinson and
Companyから市販されているペトリ皿を培養表
面として用いて成長させた繊維芽細胞の平板効率
との比（百分率）である。したがつて、相対平板
効率の値が小さいほどヒト２培体繊維芽細胞の増
殖が抑制されたことになる。 表１から明らかなように、繊維芽細胞の成長
は、プラズマ処理により得られた支持体表面の化
学特性に高度に依存している。表に示されている
ように、繊維芽細胞の成長は、細胞膜と接触する
支持体の表面化学特性を変化させることによつて
調節することができることが見出された。 培養表面の製造例 １ N2＋H2／空気 本製造例は、プラズマ曝露工程においてH2＋
N2の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製
造を示す。 ペトリ皿（ポリスチレン製：以下の製造例にお
いても特に記載していない限り同様である）をプ
ラズマ室に入れ、20分間かけて60μに排気した。
この室を140μの水素及び70μの窒素で５分間充填
した。 10MHz、40ワツトのrfプラズマを５分間作動
させた。この系を真空のまま２分間保持してか
ら、空気の雰囲気に戻した。得られた表面の性質
と、この表面を培養表面として用いた場合の
MRC−５の相対平板効率を表１に示す。また、
表面のESCA分析結果を第３図に示す。 製造例 ２ CO2／空気 本製造例は、プラズマ曝露工程においてCO2の
雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を示
す。 ペトリ皿をプラズマ室内に入れ、75μに10分間
かけて排気し、次にCO2を180μの圧力に２分間充
填した。rfプラズマを、11MHzの周波数及び40
ワツトの電力で５分間発生させた。処理後、この
系を直ちに空気の雰囲気に戻した。 得られた表面の性質と、この表面を培養表面と
して用いた場合のMRC−５の相対平板効率を表
１に示す。 製造例 ３ O2／NH3 本製造例は、プラズマ曝露工程においてO2の
雰囲気を用い、その後の接触工程においてNH3
の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を
示す。 ペトリ皿をプラズマ室に入れ、75μに10分間か
けて排気した。180μの酸素を系に２分間導入し
て、残留空気を追い出した。180μの酸素を維持
しながら、10W，11MHzのrfプラズマを５分間
発生させた。次に、この室に700トルまでNH3を
導入して２時間急冷した。表面の性質及びMRC
−５の相対平板効率を表１に示す。 製造例 ４ CO2＋NH3／NH3 本製造例は、プラズマ曝露工程においてCO2＋
NH3の雰囲気を用い、その後の接触工程におい
てNH3の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面
の製造を示す。 ペトリ皿をプラズマ室に入れ、10分間かけて
75μに排気した。NH3とCO2をこの系に90μ導入
した。10W、11MHzのrfプラズマを５分間発生
させた。次に、この室をNH3で700トルにして２
時間急冷した。表面の性質及びMRC−５の相対
平板効率を表１に示す。 製造例 ５ NH3／CO2 本製造例は、プラズマ曝露工程においてNH3
の雰囲気を用い、また、接触工程においてCO2の
雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を示
す。 ペトリ皿をプラズマ室に入れ、10分間かけて
75μに排気した。180μのNH3を２分間填した。
10MHz、35Wのrfプラズマを５分間発生させた。
次に、この系をCO2で700トルにして２時間急冷
した。室を１トルに排気して空気雰囲気に戻し
た。表面の性質及びMRC−５の相対平板効率を
表１に示す。また、ESCAのデータを第４図に示
す。 製造例 ６ NH3／NH3 本製造例は、プラズマ曝露工程においてNH3
の雰囲気を用い、また、接触工程においてNH3
の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を
示す。 製造例５と同様に行つたが、700トルの急冷を
CO2の代わりにNH3を用いて行つた。表面の性質
及びMRC−５の相対平板効率を表１に示す。ま
た、ESCAのデータを第５図に示す。 製造例 ７ NH3／空気 本製造例は、プラズマ曝露工程においてNH3
の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を
示す。 製造例５と同様に行つたが、支持体表面は直ち
に空気雰囲気に戻した。表面の性質及びMRC−
５の相対平板効率を表１に示す。また、ESCAの
データを第６図に示す。 製造例 ８ SO2／空気 本製造例は、プラズマ曝露工程においてSO2の
雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を示
す。 ポリスチレンのペトリ皿を入れたプラズマ室を
50μに20分間排気し、次に200μのSO2を10分間満
たした。10MHz、34Wのrfプラズマを５分間発
生させた。この系を200μに２分間放置し、次に
50μに２分間排気し、最後に空気雰囲気に戻し
た。表面の性質及びMRC−５の相対平板効率を
表１に示す。また、ESCAのデータを第７図に示
す。この製造例から明らかなように、繊維芽細胞
の成長は培養表面上のイオウ含有基によつて遅延
された。 製造例 ９ SO2／SO2 本製造例は、プラズマ曝露工程においてSO2の
雰囲気を用い、また、接触工程においてSO2の雰
囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を示
す。 ペトリ皿をプラズマ室に入れ、50μに20分間排
気した。SO2を200μに10分間導入した。10MHz、
45Wのrfプラズマを５分間発生させた。次いで、
直ちにこの系にSO2を700トルの圧力に充填し、
２時間急冷した。この系を50μに排気し、次に空
気雰囲気に戻した。表面の性質及びMRC−５の
相対平板効率を表１に示す。表１から分かるよう
に、この培養表面上における繊維芽細胞の平板効
率は無視できる程度に小さいものであつた。 このように、独特な表面が形成され、この表面
は培養中の繊維芽細胞の成長を遅延又は阻害す
る。これは、繊維芽細胞の成長が培養中の１次細
胞の維持を妨害する恐れがある場合に特に有用で
ある。ESCAにより測定した表面の化学特性を第
８図に示す。
いた細胞培養方法に関する。更に詳しくは、本発
明は、ポリスチレン表面をプラズマ曝露によつて
変性させることによつて製造された細胞培養用ポ
リスチレン表面を培養表面として用いて、新たに
採取した細胞を初代培養して、繊維芽細胞の増殖
を抑制しつつ目的とする初代細胞を増殖させるこ
とを特徴とする細胞培養方法に関する。 （従来の技術） 初代細胞培養物及び樹立細胞系統の培養物の両
者の成長に影響を及ぼす因子の一つは、培養物を
成長させる生育培地と、この培地に境界層を提供
する支持体との間の界面であることが知られてい
る。細胞培養物を成長させる分散相、即ち培地を
改良変化させる方法はよく知られている。また、
培地と支持体との間の表面界面を、一般に種々の
化学物質、例えばコラーゲンで被覆することによ
つて変化させる方法も知られている。細胞の培養
を試みる前に種々の化学的被膜を支持体に施すこ
とは、実験室において日常的に実施されている。
そのような化学物質の例は、ポリリジン、コラー
ゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４−硫酸、
コンドロイチン６−硫酸、並びに種々の多糖類及
びレクチン類である。一次細胞培養物の成長のた
めの支持体表面を変性するために最も普通に使用
されている化学物質は、コラーゲン、ゼラチン及
びポリリジンである。しかしながら、これらの被
覆は繊維芽細胞の成長の抑制はしない。 また、樹立細胞培養物を成長させるために組織
培養用プラスチツクを用いることも知られてい
る。このような市販品として入手できる組織培養
用器具は、Becton Dickinson and Companyか
らFALCONの商標名で市販されている。市販の
組織培養器具は、樹立細胞系統については十分な
性能を有するが、例えば、初代細胞又はコラーゲ
ンの被覆を必要とするある種の細胞については、
十分な性能を有しない。 本発明の好ましい実施態様においては、細胞の
培養にあたつて、表面化学特性がプラズマへの曝
露によつて変性されているポリスチレン支持体を
培養表面として用いる。 支持体を種々のプラズマに曝露して種々の目的
を達成することは公知である。例えば、
International Plasma Corporation，Product
Bulletin24000のパンフレツトは、ポリスチレン
の組織培養トレーを、酸素又はアルゴンのプラズ
マで処理することにより、親水性としかつ細胞の
成長に適するものとすることができることを示唆
している。また、上記のBecton Dickinson and
Companyから市販されているFALCONは、酸素
プラズマを照射処理したポリスチレン組織培養器
具である。また、Tegal Corporation CP1287の
パンフレツトは、電子部品の乾式ストリツピン
グ、清浄化及びエツチング、光学的表面の清浄
化、結合性、親水性及び化学的抵抗性を有する表
面の製造、並びに、フイルムの付着及び接着を改
良するための支持体の乾式清浄化に、プラズマが
使用できることを示している。Lee M.Smithの
博士論文“Cell Adhesion as Influenced by
Substrate Surface Properties”，Department
of Material Science and Engineering，the
University of Utah，1978，p.67は、細胞の付着
が表面の炭素／酸素比と相関することを示唆して
いる。しかしながら、これらの文献のいずれにお
いても、細胞を成長させる支持体の表面の化学的
変性によつて、細胞の成長に影響を及ぼすことが
できることは、開示も示唆もされていない。 （発明が解決しようとする課題） 初代細胞の成長を増強するのに適当な化学物質
で支持体を被覆することなしに、選ばれた細胞培
養物を成長させるために化学的に特異性の支持体
表面を提供すれば望ましいであろう。 培養物中のフイブロブラスト（繊維芽細胞）
は、一般に成長速度が大きいために、汚染速度が
早く、培養物中の初代細胞を成長させることが困
難であることが多い。したがつて、目的とする細
胞培養物の成長に適当であると同時に、繊維芽細
胞の成長を抑制する特異的な支持体表面の提供が
望まれている。 したがつて、本発明の主たる目的は、生育培地
と支持体との間の界面における種々の細胞培養物
の成長に影響を及ぼす表面を提供し、これを培養
表面として用いて、新たに採取した細胞を初代培
養し、繊維芽細胞の増殖を抑制しつつ、目的とす
る初代細胞を増殖させることを特徴とする細胞培
養方法を提供することである。 （課題を解決するための手段） 本発明者らの研究によれば、一般に、支持体の
表面上の培養細胞の活性は、細胞膜と接触する支
持体表面の表面化学特性を変化させることによつ
て調節可能であることが見出された。ポリマー表
面の化学特性は、表面をプラズマ処理することに
よつて変性することができる。特に、プラズマ処
理によつて、特異的化学官能基や元素比及び他の
表面性質を与えることができる。 本発明において用いる培養表面は、ポリスチレ
ン表面をプラズマ変性技術によつて変性すること
によつて得られる。変性されたポリマー表面を細
胞培養試験に付したところ、細胞の増殖応答はポ
リマー表面の化学特性に高度に依存性であること
が見出された。更に研究を重ねた結果、本発明者
は、ポリマー表面をある特定の雰囲気中において
発生させたプラズマに曝露することによつて、繊
維芽細胞の成長を抑制しつつ目的とする細胞培養
物の成長に適当な培養表面が提供されることを見
出した。更に、本発明者は、かかる曝露工程の後
にある特定の雰囲気に接触させると、繊維芽細胞
の成長の抑制及び培養対象の細胞の成長の促進に
有効であることを見出した。 本発明において、プラズマは、アンモニアガス
が存在する環境下で発生させる。 本発明の一実施態様によれば、細胞培養におい
て用いる培養表面は、 ポリスチレン支持体を反応ゾーン内に供給し、 上記ガスの陽イオン、陰イオン、電子及びフオ
トンよりなるプラズマを反応ゾーン内において発
生させ、 支持体の表面上に前記ガス物質の特異的官能基
を形成する、 これによつてポリスチレン表面を変性することに
よつて提供される。 本発明の他の態様によれば、前記プラズマ成分
の少なくとも１種が反応ゾーンにおいて支持体の
表面と接触するのを防ぐこともできる。この実施
態様は、プラズマの選択された反応性成分を用い
て、細胞培養物の成長に影響を及ぼす作用を有す
る特異性化学的官能基を支持体の表面上に形成す
ることができるという知見に基づいている。 以下、図面を参照しながら本発明におけるプラ
ズマ処理方法を説明する。第１図に示されるよう
に、第１ガス及び第２ガスのいずれか一方又は両
方の真空室１７へ供給する導管手段１５を有す
る、第１ガス溜め及び第２ガス溜めを用意する。
真空計２３で真空室１７内の圧力を監視する。弁
２５、２７及び２９を設けて、第１ガス溜め及び
第２ガス溜め内のガスの流速及び真空室１７へ入
るガスの流速を調節する。使用前に、弁３１を真
空ポンプ３３に対して開いて、真空室１７を排気
する。適当な電極３５及び３７を適当な電圧源３
９へ接続する。この反応系は、トラツプ４１、ベ
ント導管４３及びその弁４５も有する。 第２図に示すように、本発明におけるプラズマ
処理方法に従つて処理する支持体４７を、試料ホ
ルダー中に入れ、真空室１７内に配置する。この
試料ホルダーは、グリツド１、グリツド２及びグ
リツド３と称される三つのグリツドからなるグリ
ツドアセンブリを有している。電気的にバイアス
されたコレクター４９を、試料のグリツド系に対
して他方の側に配置する。試料は、グリツドとコ
レクターとの所定位置に適当なホルダー５１によ
り保持される。 操作において、電極３５及び３７の間で発生し
たプラズマの選択された成分を反発させるため
に、正又は負の電荷で三つのグリツド又はコレク
ターのいずれかをバイアスすることもできる。次
に、試料ホルダー中の支持体を、反発されないプ
ラズマの成分と反応させる。 かかる方法を用いて、固体のポリスチレン支持
体の表面を変性することができる。 支持体はいかなる形状であつてもよく、例え
ば、連続又は粒状、多孔質又は不透過性であつて
もよく、また、大型又は小型であつてもよい。上
記の方法を用いて、キヤスト成形、押出成形又は
圧縮成形物品等の表面を変性することができる。 本発明におけるプラズマ処理方法において使用
に適するプラズマは、放電プラズマ、ビームプラ
ズマ及びハイブリツドプラズマである。適当なプ
ラズマは、直流源又はマイクロ波の範囲の周波数
を有する交流源を用い、約1.0W〜約10kWの電力
で発生させることができる。特に限定されない
が、高い周波数、例えば無線周波数（rf）のプラ
ズマは、本発明において用いる培養表面を製造す
るために用いるのに有用であり、選択したプラズ
マ種の濃度を、周波数及び電圧によつて調節する
ことができる。また、rfプラズマは、直流及び低
周波数のプラズマでは処理が不可能な、複雑な形
状の物品、例えば管及びその他の内部表面を均一
に変性するのに適している。 一般に、本発明におけるプラズマ処理において
用いるのに適するrfプラズマは、約1.0〜約
300MHzの周波数及び絶縁破壊（ブレイクダウ
ン）を開始する電力、例えば約５〜約1000ワツト
で0.001〜10トルの圧力において発生させる。rf
プラズマへの物品の曝露は、通常、約0.1秒〜約
120分であるが、より長い時間及びより短い時間
を用いることも可能である。プラズマ曝露に続い
て急冷サイクルを行つて、１〜760トルの圧力で
１秒〜４時間、プラズマと物品の表面及びその付
近の残留活性ポリマー種との反応に適した雰囲気
を形成することもできる（接触工程）。rfプラズ
マは、第１図に示すように、二枚の平板の間で発
生させることができ、又は、米国特許第4188426
号に記載されているように、螺施コイルを用いて
発生させることができる。 以下の培養表面の製造例において、ポリスチレ
ンの支持体を種々のプラズマ種に曝露した。次い
で、支持体をＸ線光子分光分析（ESCA）により
検査して、ポリスチレン支持体の表面上の化学的
官能基の性質を決定できる。 各製造例でプラズマに曝露した後、支持体をゼ
ータ電位及びWilhelmy Plate接触角について測
定する。これらの値を表１に示す。表面電荷及び
表面張力特性についてのこれらの測定結果によつ
て、広い範囲の表面化学特性が得られることが示
される。 また、各製造例で得られたプラズマ変性ポリス
チレン表面を培養表面として用いた場合のヒト２
培体繊維芽細胞（MRC−５）の平板効率
（plating efficiency）を求めた。平板効率の試験
においては、MRC−５細胞はAmerican Type
Culture Collection，Rockville，Marylandから
購入したものを用いた。また、生育培地として
は、10％のウシ胎児血清を含む最小必須培地
（MEM）を用いた。平板効率は、かかる生育培
地中にほぼ30細胞／mlのヒト２倍体繊維芽細胞
（MRC−５）を含む細胞懸濁液を、ペトリ皿に接
種し、37℃、５％CO2雰囲気中、相対湿度94％の
条件下で、コロニーが100〜300個の細胞集団にな
るまで成長させ、計数された各皿のコロニーの数
と接種した細胞の数の比として定義し、百分率で
表した。結果を、表１に相対平板効率として示し
た。ここで、相対平板効率は、各製造例において
処理されたポリスチレン支持体を培養表面として
用いて成長させた繊維芽細胞の平板効率と、
FALCONの商標名でBecton Dickinson and
Companyから市販されているペトリ皿を培養表
面として用いて成長させた繊維芽細胞の平板効率
との比（百分率）である。したがつて、相対平板
効率の値が小さいほどヒト２培体繊維芽細胞の増
殖が抑制されたことになる。 表１から明らかなように、繊維芽細胞の成長
は、プラズマ処理により得られた支持体表面の化
学特性に高度に依存している。表に示されている
ように、繊維芽細胞の成長は、細胞膜と接触する
支持体の表面化学特性を変化させることによつて
調節することができることが見出された。 培養表面の製造例 １ N2＋H2／空気 本製造例は、プラズマ曝露工程においてH2＋
N2の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製
造を示す。 ペトリ皿（ポリスチレン製：以下の製造例にお
いても特に記載していない限り同様である）をプ
ラズマ室に入れ、20分間かけて60μに排気した。
この室を140μの水素及び70μの窒素で５分間充填
した。 10MHz、40ワツトのrfプラズマを５分間作動
させた。この系を真空のまま２分間保持してか
ら、空気の雰囲気に戻した。得られた表面の性質
と、この表面を培養表面として用いた場合の
MRC−５の相対平板効率を表１に示す。また、
表面のESCA分析結果を第３図に示す。 製造例 ２ CO2／空気 本製造例は、プラズマ曝露工程においてCO2の
雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を示
す。 ペトリ皿をプラズマ室内に入れ、75μに10分間
かけて排気し、次にCO2を180μの圧力に２分間充
填した。rfプラズマを、11MHzの周波数及び40
ワツトの電力で５分間発生させた。処理後、この
系を直ちに空気の雰囲気に戻した。 得られた表面の性質と、この表面を培養表面と
して用いた場合のMRC−５の相対平板効率を表
１に示す。 製造例 ３ O2／NH3 本製造例は、プラズマ曝露工程においてO2の
雰囲気を用い、その後の接触工程においてNH3
の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を
示す。 ペトリ皿をプラズマ室に入れ、75μに10分間か
けて排気した。180μの酸素を系に２分間導入し
て、残留空気を追い出した。180μの酸素を維持
しながら、10W，11MHzのrfプラズマを５分間
発生させた。次に、この室に700トルまでNH3を
導入して２時間急冷した。表面の性質及びMRC
−５の相対平板効率を表１に示す。 製造例 ４ CO2＋NH3／NH3 本製造例は、プラズマ曝露工程においてCO2＋
NH3の雰囲気を用い、その後の接触工程におい
てNH3の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面
の製造を示す。 ペトリ皿をプラズマ室に入れ、10分間かけて
75μに排気した。NH3とCO2をこの系に90μ導入
した。10W、11MHzのrfプラズマを５分間発生
させた。次に、この室をNH3で700トルにして２
時間急冷した。表面の性質及びMRC−５の相対
平板効率を表１に示す。 製造例 ５ NH3／CO2 本製造例は、プラズマ曝露工程においてNH3
の雰囲気を用い、また、接触工程においてCO2の
雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を示
す。 ペトリ皿をプラズマ室に入れ、10分間かけて
75μに排気した。180μのNH3を２分間填した。
10MHz、35Wのrfプラズマを５分間発生させた。
次に、この系をCO2で700トルにして２時間急冷
した。室を１トルに排気して空気雰囲気に戻し
た。表面の性質及びMRC−５の相対平板効率を
表１に示す。また、ESCAのデータを第４図に示
す。 製造例 ６ NH3／NH3 本製造例は、プラズマ曝露工程においてNH3
の雰囲気を用い、また、接触工程においてNH3
の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を
示す。 製造例５と同様に行つたが、700トルの急冷を
CO2の代わりにNH3を用いて行つた。表面の性質
及びMRC−５の相対平板効率を表１に示す。ま
た、ESCAのデータを第５図に示す。 製造例 ７ NH3／空気 本製造例は、プラズマ曝露工程においてNH3
の雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を
示す。 製造例５と同様に行つたが、支持体表面は直ち
に空気雰囲気に戻した。表面の性質及びMRC−
５の相対平板効率を表１に示す。また、ESCAの
データを第６図に示す。 製造例 ８ SO2／空気 本製造例は、プラズマ曝露工程においてSO2の
雰囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を示
す。 ポリスチレンのペトリ皿を入れたプラズマ室を
50μに20分間排気し、次に200μのSO2を10分間満
たした。10MHz、34Wのrfプラズマを５分間発
生させた。この系を200μに２分間放置し、次に
50μに２分間排気し、最後に空気雰囲気に戻し
た。表面の性質及びMRC−５の相対平板効率を
表１に示す。また、ESCAのデータを第７図に示
す。この製造例から明らかなように、繊維芽細胞
の成長は培養表面上のイオウ含有基によつて遅延
された。 製造例 ９ SO2／SO2 本製造例は、プラズマ曝露工程においてSO2の
雰囲気を用い、また、接触工程においてSO2の雰
囲気を用いた変性ポリスチレン表面の製造を示
す。 ペトリ皿をプラズマ室に入れ、50μに20分間排
気した。SO2を200μに10分間導入した。10MHz、
45Wのrfプラズマを５分間発生させた。次いで、
直ちにこの系にSO2を700トルの圧力に充填し、
２時間急冷した。この系を50μに排気し、次に空
気雰囲気に戻した。表面の性質及びMRC−５の
相対平板効率を表１に示す。表１から分かるよう
に、この培養表面上における繊維芽細胞の平板効
率は無視できる程度に小さいものであつた。 このように、独特な表面が形成され、この表面
は培養中の繊維芽細胞の成長を遅延又は阻害す
る。これは、繊維芽細胞の成長が培養中の１次細
胞の維持を妨害する恐れがある場合に特に有用で
ある。ESCAにより測定した表面の化学特性を第
８図に示す。
【表】
【表】
実施例 １
ポリリジン及びコラーゲンで被覆したペトリ皿
を一次細胞の培養において比較例として用いた。
これらの表面のESCA走査結果をそれぞれ第９図
及び第１０図に示す。また、本実施例においては
製造例５及び例６において調製されたNH3／CO2
及びNH3／NH3の２種のプラズマ変性法による
窒素含有表面を用いた。NH3／NH3の表面の
ESCA分析によると、Ｏ／Ｃ＝0.12、Ｎ／Ｃ＝
0.14であり、NH3／CO2の表面については、Ｏ／
Ｃ＝0.14、Ｎ／Ｃ＝0.19であつた。 脊髄細胞をSchnaar and Schaffner，J.
Neuroscience，１，204−217，1981に記載の方
法に従つて調製した。脊髄細胞を、令６日のヒナ
胚から摘出し、トリプシン及び穏やから機械的剪
断を用いて単一の細胞に解離した。細胞を遠心分
離によつて採取し、10％（容量／容量）のウマ血
清及び２％（容量／容量）のヒナ胚（chick
embryo）抽出物を加えたDubelcoのMEM
（GIBCO＃430−1600）からなる培地中に再懸濁
させて、温度36.5℃、10％CO2：90％空気中で培
養した。 培養表面としてポリリジン及びコラーゲンで被
覆したペトリ皿を用いた比較例並びにNH3／CO2
及びNH3／NH3の２種のプラズマ変性法による
窒素含有表面を用いた場合のそれぞれにおける、
コリンアセチルトランスフエラーゼ（CAT）の
量変化を測定した。その結果を第１１図に示す。
第１１図において縦軸は、細胞数106個あたり、
１分あたりのCATの量（ピコモル）を表す。
CATは、支持体が神経細胞に富んでいることを
示す特異的な生化学マーカーである。第１１図か
ら、プラズマ変性した２種類の窒素含有表面：
HH3／CO2及びNH3／NH3は、化学的に被覆さ
れた表面よりも非常に大きい程度に一次神経細胞
の成長を促進することが分かる。これは、ポリリ
ジン及びコラーゲンで被覆した比較表面と比較し
て、上記の２種類のプラズマ処理表面を培養表面
として用いると、一次神経細胞が、繊維芽細胞の
成長がないために際立つた成長性を示すことを示
している。これは、通常、繊維芽細胞の成長速度
は一次神経細胞の成長に比して極めて大きいの
で、本実施例の条件において繊維芽細胞の成長が
抑制されていないと神経細胞は実質的に成長する
ことができないと考えられるからである。 実験例 ヒト２培体繊維芽細胞（MRC−５）を用いて、
増殖試験を行つた。製造例８及び９に記載のよう
にプラズマ処理した２種類の表面：SO2／空気及
びSO2／SO2、並びに比較例としてポリリジンで
被覆した表面を培養表面として用い、前記の
MRC−５の平板効率の試験におけるものと同様
の培養条件で培養した。 培養物中のラクテートデヒドロゲナーゼ
（LDH）の含有量の変化を測定した。結果を第１
２図に示す。第１２図においては、LDHの量変
化を340nmにおける吸光度の変化によつて示して
いる。ラクテートデヒドロゲナーゼは、非特異的
細胞の細胞質の体積を示すマーカーであり、従つ
て、培養物中に存在する繊維芽細胞の量を示唆す
る。第１２図から、プラズマ処理された表面は、
比較表面と比較して、繊維芽細胞の成長を大きく
遅延させることが分かる。
を一次細胞の培養において比較例として用いた。
これらの表面のESCA走査結果をそれぞれ第９図
及び第１０図に示す。また、本実施例においては
製造例５及び例６において調製されたNH3／CO2
及びNH3／NH3の２種のプラズマ変性法による
窒素含有表面を用いた。NH3／NH3の表面の
ESCA分析によると、Ｏ／Ｃ＝0.12、Ｎ／Ｃ＝
0.14であり、NH3／CO2の表面については、Ｏ／
Ｃ＝0.14、Ｎ／Ｃ＝0.19であつた。 脊髄細胞をSchnaar and Schaffner，J.
Neuroscience，１，204−217，1981に記載の方
法に従つて調製した。脊髄細胞を、令６日のヒナ
胚から摘出し、トリプシン及び穏やから機械的剪
断を用いて単一の細胞に解離した。細胞を遠心分
離によつて採取し、10％（容量／容量）のウマ血
清及び２％（容量／容量）のヒナ胚（chick
embryo）抽出物を加えたDubelcoのMEM
（GIBCO＃430−1600）からなる培地中に再懸濁
させて、温度36.5℃、10％CO2：90％空気中で培
養した。 培養表面としてポリリジン及びコラーゲンで被
覆したペトリ皿を用いた比較例並びにNH3／CO2
及びNH3／NH3の２種のプラズマ変性法による
窒素含有表面を用いた場合のそれぞれにおける、
コリンアセチルトランスフエラーゼ（CAT）の
量変化を測定した。その結果を第１１図に示す。
第１１図において縦軸は、細胞数106個あたり、
１分あたりのCATの量（ピコモル）を表す。
CATは、支持体が神経細胞に富んでいることを
示す特異的な生化学マーカーである。第１１図か
ら、プラズマ変性した２種類の窒素含有表面：
HH3／CO2及びNH3／NH3は、化学的に被覆さ
れた表面よりも非常に大きい程度に一次神経細胞
の成長を促進することが分かる。これは、ポリリ
ジン及びコラーゲンで被覆した比較表面と比較し
て、上記の２種類のプラズマ処理表面を培養表面
として用いると、一次神経細胞が、繊維芽細胞の
成長がないために際立つた成長性を示すことを示
している。これは、通常、繊維芽細胞の成長速度
は一次神経細胞の成長に比して極めて大きいの
で、本実施例の条件において繊維芽細胞の成長が
抑制されていないと神経細胞は実質的に成長する
ことができないと考えられるからである。 実験例 ヒト２培体繊維芽細胞（MRC−５）を用いて、
増殖試験を行つた。製造例８及び９に記載のよう
にプラズマ処理した２種類の表面：SO2／空気及
びSO2／SO2、並びに比較例としてポリリジンで
被覆した表面を培養表面として用い、前記の
MRC−５の平板効率の試験におけるものと同様
の培養条件で培養した。 培養物中のラクテートデヒドロゲナーゼ
（LDH）の含有量の変化を測定した。結果を第１
２図に示す。第１２図においては、LDHの量変
化を340nmにおける吸光度の変化によつて示して
いる。ラクテートデヒドロゲナーゼは、非特異的
細胞の細胞質の体積を示すマーカーであり、従つ
て、培養物中に存在する繊維芽細胞の量を示唆す
る。第１２図から、プラズマ処理された表面は、
比較表面と比較して、繊維芽細胞の成長を大きく
遅延させることが分かる。
第１図は、本発明におけるプラズマ処理方法に
おいて用いることのできる装置の概略図；第２図
は、第１図の装置内のサンプルホルダーの斜視
図；第３図〜第８図は、本発明におけるプラズマ
処理方法で得られた表面（それぞれ、N2＋H2／
空気、NH3／CO2、NH3／NH3、NH3／空気、
SO2／空気及びSO2／SO2）のESCAスペクトル
を示す図；第９図及び第１０図は、それぞれ、ポ
リリジン、コラーゲンで被覆された比較表面の
ESCAスペクトルを示す図；第１１図は、製造例
５及び例６において調製されたNH3／CO2及び
NH3／NH3の２種のプラズマ変性法による窒素
含有表面を培養表面として用いて一次神経細胞を
培養した際のCATの量変化を示す図であり；第
１２図は、プラズマ処理した表面（SO2／SO2）
を並びに比較例としてポリリジンで被覆した表面
を培養表面として用いてヒト２培体繊維芽細胞
（MRC−５）を培養した際のLDHの量変化を示
す図である。
おいて用いることのできる装置の概略図；第２図
は、第１図の装置内のサンプルホルダーの斜視
図；第３図〜第８図は、本発明におけるプラズマ
処理方法で得られた表面（それぞれ、N2＋H2／
空気、NH3／CO2、NH3／NH3、NH3／空気、
SO2／空気及びSO2／SO2）のESCAスペクトル
を示す図；第９図及び第１０図は、それぞれ、ポ
リリジン、コラーゲンで被覆された比較表面の
ESCAスペクトルを示す図；第１１図は、製造例
５及び例６において調製されたNH3／CO2及び
NH3／NH3の２種のプラズマ変性法による窒素
含有表面を培養表面として用いて一次神経細胞を
培養した際のCATの量変化を示す図であり；第
１２図は、プラズマ処理した表面（SO2／SO2）
を並びに比較例としてポリリジンで被覆した表面
を培養表面として用いてヒト２培体繊維芽細胞
（MRC−５）を培養した際のLDHの量変化を示
す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ポリスチレン表面を、アンモニアガスを存在
させた、0.001〜10トルの圧力の環境内に置き、
５〜1000ワツトの電力及び１〜300メガヘルツの
周波数で放電プラズマを発生させて、前記物体の
表面を該プラズマに曝露して（以下、曝露工程と
いう）、前記表面の化学組成を変化させることに
より製造された細胞培養用ポリスチレン表面を培
養表面として用いて新たに採取した細胞を初代培
養し、繊維芽細胞の増殖を抑制しつつ目的とする
初代細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養
方法。 ２ プラズマに曝露した後、ポリスチレン表面を
１〜760トルの圧力下で、アンモニア及び炭酸ガ
スから選択されるガスと接触させる工程（以下、
接触工程という）を更に含む特許請求の範囲第１
項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36928282A | 1982-04-16 | 1982-04-16 | |
| US369282 | 1982-04-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58201983A JPS58201983A (ja) | 1983-11-25 |
| JPH048033B2 true JPH048033B2 (ja) | 1992-02-13 |
Family
ID=23454831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57221743A Granted JPS58201983A (ja) | 1982-04-16 | 1982-12-17 | 培養中の細胞活性に影響を及ぼすための化学的に特異性の表面 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0092302B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58201983A (ja) |
| CA (1) | CA1201400A (ja) |
| DE (1) | DE3375157D1 (ja) |
| DK (1) | DK157142C (ja) |
| MY (1) | MY102711A (ja) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8331865D0 (en) * | 1983-11-29 | 1984-01-04 | Univ Glasgow | Microstructures |
| EP0205790B1 (de) * | 1985-06-18 | 1992-01-08 | Anawa München Aktiengesellschaft Biologische Laboratorien | Träger für die Kultivierung von menschlichen und/oder tierischen Zellen in einem Fermenter |
| DE3850957T2 (de) * | 1987-09-17 | 1995-03-30 | Commw Scient Ind Res Org | Neutralisierte perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7-octen sulphonyl fluorid kopolymer fläche zur befestigung und zucht tierischer zellen. |
| US5712137A (en) * | 1990-03-05 | 1998-01-27 | Smith & Nephew Plc | Laminate of a culture substrate on a carrier for producing an apertured wound dressing |
| GB9004911D0 (en) * | 1990-03-05 | 1990-05-02 | Smith & Nephew | Cell culture products |
| IT1265355B1 (it) * | 1993-11-26 | 1996-11-22 | Biomat Snc | Procedimento per ottenere articoli per saggi immunologici a migliorate proprieta' |
| GB9516556D0 (en) * | 1995-08-12 | 1995-10-11 | Smith & Nephew | Cell culture laminate |
| US6617152B2 (en) * | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
| GB2394477B (en) * | 2002-08-22 | 2005-03-30 | Celltran Ltd | Cell culture |
| JP2005110676A (ja) * | 2003-09-17 | 2005-04-28 | Think Engineering Kk | 生細胞培養基材、該基材の製造方法、および該製造方法に用いるエッチング処理装置、並びに生細胞の培養方法 |
| US8017395B2 (en) | 2004-12-17 | 2011-09-13 | Lifescan, Inc. | Seeding cells on porous supports |
| CA2613889A1 (en) | 2005-06-08 | 2006-12-14 | Centocor, Inc. | A cellular therapy for ocular degeneration |
| US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
| US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
| MX2010001335A (es) | 2007-07-31 | 2010-06-02 | Lifescan Inc | Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas. |
| CN107574142B (zh) | 2007-11-27 | 2021-07-06 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| CN102046779A (zh) | 2008-02-21 | 2011-05-04 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物 |
| US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
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