JPH0480657A - 免疫測定法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床検査や生体試料計測に適した免疫測定法に
関する。

〔従来の技術〕

従来、液相反応の後固相へ結合させ、Ｂ／Ｆ分離後液相
へ抗原抗体反応生成物を遊離させ、標識物質の濃度を測
定する免疫測定法としては、メソッズ・イン・エンジモ
ロジー、第９２巻（１９８０年）、第３４５頁から第３
５９頁（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９
２（１９８０）　３４５−３５９）において記載のよう
に、固相上に−Ｓ−８−（ジスルフィド）結合を介して
抗体を結合させ、還元剤でＳ−３結合を切断して抗原抗
体反応生成物を遊離させる方法が知られている。この方
法はＳＨ基を有する担体をつめたカラムに抗体を固定し
、これに抗原抗体反応生成物を捕捉させている。

また非特異的な標識抗体の吸着などが起きても、〜５−
８−結合部分で特定的な反応生成複合体を分離できるた
め、選択的に、低濃度まで測定できるとしている。また
特開平１−２５４８６８号公報に記載のように抗原抗体
複合体を担体上に直接捕え、洗浄後解離させ、別の担体
へ再捕捉する方法も知られているか、装置化を行うため
には固相転移と、これに伴う装置化を発明する必要があ
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は固相へ抗原抗体反応生成物を固定化する
のに固相上の抗体と反応生成物の間の反応を利用してい
るため、同一の反応容器で一連の反応を行うと、固相上
の抗体が標識抗体や標識抗原を捕えてしまい、長時間反
応させないと抗原抗体反応生成物の固定化効率が上がら
ない。また反応生成物が液相中で生成しても固相への拡
散速度が固定化効率を左右する。そこで効率を向上させ
るには液相での抗原抗体反応と固相への固定化は別の反
応容器で行う必要があり、容器間の移動に伴う所要時間
の長時間化や煩雑さ、精度の劣化などの問題があった。

また特開平１−２５４８６８号のように２つの固相間を
移動させる方法は煩雑で装置化に困難を伴うため、本発
明の目的とする迅速性や簡便さを達成し得ない。

本発明はこのような免疫測定法の迅速化や簡便化を高感
度化とともに達成することを目的としている。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明は、免疫測定に当た
り、対をなす特異反応性物質を育する連結仲介物質の一
方の特異反応性物質とこれに対応する固相上の特異反応
性物質との結合、及びその連結仲介物質の他方の特異反
応性物質とこれに対応する抗原抗体反応生成物の抗体ま
たは抗原上の特異反応性物質との結合とにより、抗原抗
体反応生成物を連結仲介物質を介して固相上に固定化す
る方法を開発し提供するものである。

さらに本発明の免疫測定方法は、液相中で抗原抗体反応
生成物を生成する第１の工程、及び液相中に前記連結仲
介物質を添加し液相中の抗原抗体反応生成物を前記連結
仲介物質を介して固相上に固定する第２の工程及び前記
抗原抗体反応生成物を測定する第３の工程とからなる免
疫測定法にある。

このように連結仲介物質を使用することにより、抗原抗
体反応と固定化反応を段階的に行えるため、同一容器内
で全ての反応を行うことが可能となり、従来のもののよ
うに反応容器を交換する必要かなくなった。

連結仲介物質としては、特異反応物質対の一方を２種類
以上有する物質であって、水に可溶性のものを用いるこ
とが好ましい。

特異反応性物質対としては、（ｉ）ビオチンとアビジン
またはストレフトアビジン、　（ｉｉ）抗原とその抗体
、（ｉｉ）プロティンＡまたはプロティンＧと免疫グロ
ブリンＧ、などの組み合わせが用いられる。

反応容器としてはカラム以外にも、例えば、マイクロタ
イタープレートや試験管やシャーレなど各種の容器や担
体が使用できる。

また迅速な測定とするために、反応生成物の検出に用い
るための標識を結合させた抗体または抗原と、連結仲介
物質と結合しうる特異反応性物質を結合させた抗体また
は抗原とを、同時に、あるいは連続させて液相中で反応
させる方法を採用している。

さらに連結仲介物質で反応生成物を固定化した後、反応
生成物を含む複合体を固相から脱離させることにより、
特異的に反応生成物を検出することができ、標識を結合
した抗原または抗体の吸着等による感度の低下を防ぐこ
とができる。脱離する工程としては、連結仲介物質の分
割、固相からの特異反応性物質の脱離、または測定対象
物質に結合した固相上の抗体または抗原の脱離を行う方
法を採用した。

連結仲介物質に２種類以上の特異反応性物質対の一方を
組み込むことにより、抗原抗体反応生成物と固相とを選
択的に結合させることが可能になった。これにより液相
中で抗原抗体反応を行わせ、この反応生成物を固相へ固
定化することが迅速に行え、反応容器を移し替える必要
がな（なった。

また、この固相として、複数の異種の固相を同一反応容
器内に存在させることにより、複数の異なった測定対象
物質を同時に測定することができる。

さらに、固相及び連結仲介物質として測定対象物質の種
類によらず同一のものを使用することも可能となる。

また複数の測定対象物質を検出することが、抗体の種類
、標識物の種類、連結仲介物質上の特異反応性物質を適
宜選択することにより、可能となる。

また、本発明は、抗体または抗原の標識物質として酵素
、蛍光物質、発光物質などを用い、それを検出しかつ測
定するための測定装置をも開発し提供する。その装置は
、固相としての機能を持つ容器、及び抗原抗体反応を行
うに必要な各種物質を順次該容器内に供給し得る複数の
分注ノズル、とからなり、該容器と分注ノズルとは互い
に相対移動するようになっている。さらに、その装置に
おいて、該容器内に複数の異種の固相を形成することも
可能である。

本発明の概要を添付の図面に基づいて説明する。

第１図は本発明の原理について説明した図であり、第１
図ａ）は固相上で試料中の測定対象物ｌが標識物質３や
特異反応性物質４のついた抗体（または抗原）２と反応
生成物を形成している状態を示しており、第１図ｂ）は
連結仲介物質７を第１図ａ）の状態に続き、反応させ、
固相へ反応生成物を固定化した状態を示す。第１図Ｃ）
は第１図ｂ）の固定化が終了した後、未反応の試薬、共
存物質を洗浄し、さらに固定化した反応生成物を切断し
て遊離させた状態を示す。遊離した反応生成物を計測器
に移し、その標識物質３の濃度を検定することにより、
測定対象物質である抗原（抗体）１の濃度が測定できる
。

〔作　用〕

連結仲介物質は液相中の抗原抗体反応生成物と固相とを
連結する機能を果し、複数の特異反応性物質の担体とし
て機能する。連結仲介物質が水に可溶性である場合には
、反応はさらに迅速になる。

特異反応性物質対は選択性が高く、結合が強い物質の組
み合わせで、標識や抗原抗体反応を妨害しないような物
質であるため、反応生成物の固定化を迅速に行うことが
できる。

連結仲介物質で固定化後、抗原抗体反応生成物を脱離さ
せる方法は、吸着による固相への標識抗体の結合と相互
作用なく行えるため選択性を高め、その後の計測手段の
適用範囲を広げることができる。

反応容器が固相をも兼ねることができれば、測定時間の
短縮、操作の簡便化を図ることができる。

本発明のように反応容器を交換しないで固定化できる方
法の発明により、このような目的か果せる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

但し、本発明はこれらの実施例によりなんら制限される
ものでない。

（実施例１） 本発明を血清中のα−フェトプロティンに適用した例を
説明する。まずガラス試験管にγ−アミノプロピルトリ
エトキシシランの１％溶液を１ｍｌ加え、室温で１時間
放置した。１時間後試験管を水洗した後、１１０″Ｃで
１時間加熱し、ガラス表面をアミノシラン化した。この
試験管にＳ−アセチルメルカプト無水こはく酸のジメチ
ルホルムアミド溶液をＯ，１ｍｌ　（６ｍｇ含有）を入
れて３０分間室温に置き、アミノシランにＳＨ基を導入
した。次に、抗アビジン抗体に架橋試薬Ｎ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸（
ＳＰＤＰ）のエタノール溶液（３０ｍＭ）を抗体の重量
の０．６％となる量を加えて、３０分間反応させた後、
セファデックスＧ−２５のカラムで５ＰＤＰの結合した
抗体を未反応の試薬から分離した。そしてこの抗体液を
０．２　ｍｇ／ｍｌの濃度で入れ、ガラス試験管底部に
導入したーＳＨ基との間で−８−８結合を作らせ、抗ア
ビジン抗体固定化試験管を調製した。一方、抗α−フェ
トプロティン抗体は２分し、一方にはＳ、Ａｖｒａｍｅ
ａｓ　ａｎｄ　Ｔ、Ｔｅｒｎｙｎｃｋ　；Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　８　　（１９７１）　ｐ、１１
７５の方法でゲルタールアルデヒドを用いてβ−ガラク
トシダーゼ（β−ｇａｌ）を結合させ、他方にはビオチ
ニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＮＨ
８）のジメチルホルムアミド溶液をｐＨ８，５の炭酸緩
衝液中で抗体：ビオチンの量比を１０：ｌにして反応さ
せた。以上の操作によりＰＯＤ標識抗体とビオチン化抗
体を調製した。

このようにして調製した試薬等を用いて免疫測定を行っ
た。ヒト血清５０μｌを抗アビジン抗体固定化試験管に
添加し、次にβ−ｇａｌ標識抗α−フェトプロティン抗
体溶液とビオチン化抗α−フェトプロティン抗体溶液を
５０μｌずつ添加し、よく混合した。１時間室温に置い
た後、アビジン溶液を１００μｌ添加し、１時間室温で
反応させた。この後りん酸緩衝液（ｐＨ７，０、塩化ナ
トリウムＯ，１ｍｏｌ／ｌ　）でガラス試験管をリンス
し、未反応の試薬共存物質を除去した。次にジチオスレ
イトール１０ｍＭ（ｐＨ８）溶液を３００μＩ加えて５
０分分間光した。

還元により固相から遊離した反応生成物溶液５０μｌを
マイクロタイタープレートのウェルに入れ、０、ＯＩＭ
りん酸緩衝液（０，１Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣｌ
２，０．１％ウシ血清アルブミン含有）で１：１に希釈
後、基質液である５０ｍＭ　２−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトシドのりん酸緩衝溶液を５０μｌ加えて３
７°Ｃ１３０分間反応させ、次に０．５　Ｍ　Ｎａ２Ｃ
Ｏ３１５０μｍを加えて反応を停止させ、４２０ｎｍの
吸光度を測定した。α−フェトプロティンの標準溶液に
よる本実施例の検量線を第２図に示す。本実施例ではア
ビジンを連結仲介物質とし、そのビオチン、及び抗アビ
ジン抗体との特異結合反応性を利用し液相中の抗原抗体
反応生成物を固定し、抗アビジン抗体の固相との結合か
−８−８−結合であることから、還元剤による脱離か可
能となることを示した。本実施例のような−８−８−結
合の切断による選択的な脱離を行うことにより、標識抗
体の固相への吸着によるブランク値の上昇を防ぐことか
できた。また抗原抗体反応生成物は同一のガラス試験管
内で固定化でき、反応容器を替える必要はなかった。

（実施例２） 血清中のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定に
本発明を適用した。まず２つの抗原と反応しうるキメラ
抗体Ｆ（ａｂ’）２断片を調製した。抗つシ血清１ｇＧ
抗体のＦ　（ａｂ’　）２断片（ウサギより免疫調製）
と抗ＤＮＰ　（ジニトロフェニル）抗体のＦ　（ａｂ’
　）２断片（ウサギより免疫調製）とを用意し、等モル
濃度の溶液とし、これに２−メルカプトエタノール０．
１Ｍ溶液を加え、Ｆ　（ａｂ’　）２断片を還元させ、
−３Ｈ基を生じさせた。反応液を透析チューブに入れ、
２−メルカプトエタノールを含まないりん酸緩衝溶液中
に浸漬した。２種類のＦ　（ａｂ’　）２断片は還元後
放置すると再度酸化され、−５−Ｓ＝結合を形成するか
、このとき交差再結合し、抗ウシＩｇＧ活性を持つＦ　
ａｂ’　断片と抗ＤＮＰ活性を有するＦａｂ’断片の間
てキメラ抗体を生じる。次にＤＮＰ−結合アルブミンと
ウシＩｇＧをそれぞれＣＮＢｒ活性化５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　４Ｂに結合させ、アフィニティーカラムを作製した
。まずＤＮＰ−アルブミン結合カラムにＦ　（ａｂ’　
）２再結合液を通し、抗ＤＮＰ活性のあるＦ　（ａｂ’
　）２断片を結合させた。次に抗ＤＮＰ活性Ｆ（ａｂ’
）２断片をｐＨ２，０，０，１Ｍグリシン−塩酸緩衝液
でカラムから溶出させ、ｐＨを中性に戻し、透析、濃縮
し、今度はウシＩｇＧ結合カラムに注入した。再びｐＨ
２，０，０，１Ｍグリシン−塩酸緩衝液でカラムから抗
ウシＩｇＧ活性のあるＦ　（ａｂ’　）２断片を溶出さ
せた。これを中和後、透析、濃縮し、抗ＤＮＰ活性と抗
ウシＩｇＧ活性を合わせもつキメラ抗体Ｆ　（ａｂ’　
）２断片を調製した。

次にガラス試験管の底部に実施例１と同様にアミノシラ
ン化を施し、そこにウシＩｇＧを固定化した。またＤＮ
Ｐ化合物の一種であるジニトロベンゼン・スルホン酸を
ｈＣＧ抗体に結合させ、ＤＮＰ結合抗ｈＣＧ抗体を調製
した。

これらの試薬を用いてｈＣＧの測定を行った。

ウシＩｇＧを結合させたガラス試験管に血清試料を分注
し、これにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（βｇａｌ）標識
抗ｈＣＧ抗体液とＤＮＰ結合抗ｈＣＧ抗体液を加え、３
７°Ｃで２時間反応させた。この試験管に抗ＤＮＰ活性
と抗ウシＩｇＧ活性をもつキメラ抗体Ｆ（ａｂ’）２断
片溶液を加え、３７°Ｃて２時間攪拌しながら反応させ
た。反応後ｐＨ７，２のりん酸緩衝生理的食塩水で５回
試験管を洗浄した。次にジチオスレイトール０．１Ｍ溶
液を加えて、３０分攪拌放置した。３０分後ジチオスレ
イトールをブロックするために０．１Ｍシスチン中性溶
液を加え、次に試験管内の溶液を計測用試験管に移した
。脱離した抗原抗体反応生成物を含む溶液にβ−ｇａｌ
の基質４−メチルウムベリフェリル・β−Ｄ−ガラクト
シド１ｍＭ溶液を加え、反応を開始する。３０°Ｃで３
０分反応させた後１０ｍＭ　ＥＤＴＡ含有０．５Ｍ　Ｋ
Ｈ２ＰＯ４−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０，５をｌＯ倍量加
えて反応を停止させた。

この溶液の蛍光強度を励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４
５００ｍで測定した。血清標準液を用いてｈＣＧｌ、Ｏ
ＩＵ／ｍｌから２００４Ｕ／ｍｌまでの範囲で検量線を
得ることができた。

（実施例３） 本発明を尿中のβ２−マイクログロブリン（β２ｍ）の
測定に適用した。ガラスピーズ（直径６　ｍｍ）の表面
にγ−アミノプロピルトリエトキシシラン液を用いて実
施例１と同様にしてアミノシラン化を施した。次に０．
１％ゲルタールアルデヒド溶液にガラスピーズを入れて
室温で１時間反応させ、１時間後イオン交換水で２回す
すいだ後、プロティンＡ溶液（０，５ｍｇ／ｍｌ含有、
５０ｍＭ、　ｐＨ７，２りん酸緩衝液に溶解）と接触さ
せ、プロティンＡ固定化ガラス・ビーズを調製した。未
反応のアルデヒド基は０．１％モノエタノールアミン溶
液でブロックした。次にウサギから得た抗β２−ｍ抗体
を用意し、これをペプシン固定化セファロースを入れた
ビーカーに入れて、分解し、抗β２−ｍ抗体のＦ　（ａ
ｂ’　）２断片とし、これをセファデックスＧ−１５０
のカラムでゲルろ適法により精製した。この抗β２−ｍ
抗体Ｆ　（ａｂ’　）２断片の一部を窒素置換した０、
　５　Ｍ　ＴｒｉｓＨＣ１緩衝液ｐＨ７，８で希釈し、
２−メルカプトエタノールをこれに１０ｍＭとなるよう
に加え、３７°Ｃ１時間還元反応を行い、Ｆ　ａｂ’　
　とした。このＦ　ａｂ’　断片の−ＳＨ基に、架橋剤
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）を反応させた西洋ワサビ・ペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）を結合させた。ＭＢＳ処理ＰＯ
Ｄはジメチルホルムアミドに溶解させたＭＢＳとｐＨ７
，０で１時間室温で反応させて調製した。Ｆ　ａｂ’　
　とＰＯＤの結合はｐＨ６，０の１００ｍＭりん酸緩衝
液（ＥＤＴＡ　５　ｍＭ金含有中で行い、セファデック
スＧ−１５０のカラムで未反応Ｆ　ａｂ’　や試薬を除
去した。またマウス由来の抗つサギＩｇＧ抗体（ウサギ
のＩｇＧのＦ（ａｂ’）２部分に選択的に結合性のもの
）を用意した。

上記試薬類を用いて測定を行った。プロティンＡ結合ガ
ラス・ビーズ１個を試験管に入れ、これに希釈尿試料を
５００μｍ人れ、次にウサギ由来抗β２−ｍ　　Ｆａｂ
’抗体液（０，１ｍｇ／ｍｌ含有）１００μｌを加え、
３０℃で３０分混合反応させた。３０分後、この試験管
にマウスの抗つサギＩｇＧ抗体（Ｆ　（ａｂ’　）　２
特異性）溶液（０，１ｍｇ／ｍｌ　Ｉｇ　Ｇ含有）２０
０μｌを加えて３７°Ｃ１３０分間反応させた。マウス
のＩｇＧ抗体はウサギの抗β＝−ｍ　　Ｆ　（ａｂ’　
）！抗体と結合し、ビーズ上のプロティンＡによってビ
ーズ上に固定化された。この反応用試験管内部の液を除
き、さらにりん酸緩衝液（１００ｍＭ、　ｐＨ７，０）
で３回洗浄した。次に特異性のないマウスＩｇＧを５ｍ
ｇ／ｍｌの濃度で５００μｌ加え、３７°Ｃで１時間攪
拌を行った。

１時間後試験管内部の溶液を吸い上げ、別の試験管に移
した。この試験管から溶液を１００μｌ取り出し、１０
０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）を１ｍｌ加え、これ
に２０ｍＭ３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン
酸３００μｌと８ｍＭ過酸化水素水２００μｌを加えて
ｌＯ分反応させ、１０分経過後０．１ＭグリシンＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ１０，３）　２ｍｌを加えて反応を停止
させた。この溶液の蛍光強度を励起波長３２０ｎｍ、　
　蛍光波長４０５ｎｍで測定し、β、−ｍの濃度を測定
した。

標準溶液を調製し、測定に供したところβ２２−ｍ３ｎ
／ｍｌから３００ｎｇ／ｍｌまでの間で直線性を示す検
量線が第３図に示すように得られた。実試料ても測定で
き、検量線からβｚ−ｍの濃度を決定できた。

（実施例４） 連結仲介物質を用いる免疫装置を作製した。第４図に構
成模式図を示す。血清や尿など生体試料を入れた試験管
を試料トレー４０に入れ、反応用試験管を試験管ラック
４１に設置する。反応用試験管は上記実施例に示したよ
うに、固相として機能している。この実施例では、試験
管ラック４１及び分注ノズル４２はともに移動用レール
Ｌ、　　Ｌ’上を摺動し得るように装着されており、そ
のいずれかまたは双方をレール上で移動させることによ
り以下の工程を連続して行い得るようになっている。

この試験管に分注ノズル４２を用いて、試料を一定量（
５０〜１００μｌ）導入する。ラックには温度調節用ヒ
ーター（図示していない）が備わっており、反応に適し
た温度に設定できるようになっているか、試験環境によ
ってはそのような加熱機器は必ずしも必要ではない。つ
いで同じ分注ノズル４２を用いて、試験管ラック４１上
の反応用試験管に対し、標識抗体や特異反応性物質を結
合させた抗体の溶液Ａを注入し抗原抗体反応を開始させ
る。拡散を速めるため、特に図示していないがラック４
１内にマグネチック・スターシーのような手段を備えて
、各試験管内の溶液を攪拌できるようにすることもでき
る。

抗原抗体反応終了後、試験管ラック４１をレールＬ゛上
で第４図において右方に移動させる。分注ノズル４２の
右方には別の分注ノズル４３が位置しており、移動して
きた試験管ラック４１内の試験管に対し分注ノズル４３
から本発明の連結仲介物質Ｂを試験管に添加する。連結
仲介物質により反応生成物は、試験管内の固相に固定化
される。

試験管ラック４１をさらに右方に移動して、次の分注ノ
ズル４４の下に位置させる。該分注ノズル４４より、界
面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０など）やウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を加えたＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液などの洗浄
液Ｃを加え、未反応の試薬を除去する。

洗浄後、試験管ラック４１を蛍光測定部４５に移動させ
る。ラック４１内の試験管には、適宜の手段により脱離
剤りを分注する。脱離反応後、試験管内部の脱離した液
を測定部内の図示されない測定用試験管に移しかえる。

この実施例においては、酵素標識を用いているので、適
宜の手段により測定用試験管に酵素基質Ｅを加える。反
応開始一定時間後に停止液Ｆを加えて反応を停止させ、
適宜の測定手段、例えば石英オプティカル・ファイバー
型蛍光検出プローブ（励起光入射ファイバーと蛍光受光
ファイバーの２本を組み込んだ検出器）を試験管内容液
に導入し、蛍光強度を測定する。

本装置の操作は適宜の制御機構を用いて、ラック４１、
分注ノズル４０の移動や各種試験物質の添加などを全て
自動的に行うようにすることも可能である。図において
、４６はそのような操作のためのコントロールパネルを
、また４７は所用のデータなどの表示窓を示している。

測定に際しては、別途、標準溶液について同じ操作を行
い、蛍光強度から濃度曲線を作成し、試料中の抗原や抗
体を測定する。実施例１を本測定装置に適用した場合に
ついて示すと、測定対象はα−フェトプロティンで、脱
離液にはジチオスレイトール含有りん酸緩衝液を使用し
た。酵素標識としてβ−ガラクトシダーゼを用いたので
、基質には４−メチルウムベリフエリルーβ−Ｄ−ガラ
クトシド１ｍＭ溶液を使用し、生じた蛍光性生成物を励
起波長３６０ｎｍ、測定波長４５０ｎｍで蛍光測定した
。第５図にα−フェトプロティンの本測定装置による検
量線を示す。

（実施例５） ２種類の抗原を同一反応容器表面に固定し、それぞれの
濃度を測定する方法及び装置を説明する。

第６図に反応容器内の反応模式図を示した。

α−フェトプロティン（ＡＦＰ）１５と癌胎児性抗原（
ＣＥＡ）２１とを検出する方法及び装置について説明す
る。第６図に示される測定装置にセットされる試験管ラ
ック２３内の試験管８の模式的断面図を第５図に示して
いる。試験管８はプラスチック（ポリカーボネートやポ
リスチレンなと）製またはガラス製であり、試験管８内
には試料及び反応液９が注入されている。試験管８内に
２個の多孔性ガラス・リング１１．１２を入れスリーブ
ｌＯにより固定した。このガラス・リングの１１．１２
の内面にはあらかじめ抗アビジン抗体１６とウシＩｇＧ
　１８とをそれぞれ固定化しておいた。リングは反応液
量か少なくできるように試験管底部に置いた。

測定は次のようにして行った。第６図、第７図を用いて
説明する。第７図において、測定装置３０は試験管ラッ
ク２３を有しており該ラック内に試験管８を収納する。

試験管ラック２３と平行に長孔が開口していて液体用ノ
ズルアーム２４が該開口に沿い移動しかつ回動し得るよ
うに設けである。

液体用ノズルアーム２４の先端には、試験管に液体を供
給するための複数のノズル２５か形成されている。また
、試験管ラック２３と該長孔をはさんだ対照位置には複
数の試薬ボトル２６か位置している。また、液体用ノズ
ルアーム２４の移動範囲内の位置に計量液導入口２８が
設けられている。この装置も従来知られた制御手段によ
り制御可能に設計されており、操作用パネル２９及び表
示窓２７が装置の前面に形成しである。

測定に際し、まず試料を試験管ラック２３の試験管８に
注入し、この試験管８に液体用ノズル２５で抗体溶液を
２種類注入した。３０分後、液体用ノズル２５から連結
仲介物質溶液を注入した。１時間後、洗浄液を試薬ボト
ル２６から吸い上げ、洗浄を行い、再び液体用ノズル２
５で排出した。ＡＦＰＩ５に対する抗体としては、アル
カリ・ホスファターゼ結合抗ＡＦＰ抗体１４とビオチン
化抗ＡＦＰ抗体１３の混合液を用い、ＣＥＡ２１に対す
る抗体としてはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合抗ＣＥＡ
抗体Ｆ（ａｂ’　）２断片２２とＤＮＰ結合抗体とαＦ
（ａｂ’　）！断片１９との混合液を用いた。第６図に
示すようにＡＦＰ１５は液相中の２種類の抗体と結合し
、連結仲介物質アビジン１７を加えることにより、リン
グ１１に固定される。ＣＥＡ２１も同様に２種類の抗体
を結合し、これに連結仲介物質として抗ＤＮＰ、抗つシ
ＩｇＧ活性を保有する抗体Ｆ（ａｂ’）ｚ断片を加える
とリング１２に固定化されることになる。ＡＦＰ１５と
ＣＥＡ２１が固定化した後、洗浄液を注入し、不要な試
薬や成分を除去する。リング１１内側には実施例１と同
様に−５−８−結合を介して抗アビジン抗体が結合しで
ある。したがってＡＦＰ　１５も、ＣＥＡ２１も−５−
３−結合を介してガラス・リング表面に結合しており、
この試験管にジチオスレイトールを加えると、−５−Ｓ
−結合が切断されて、抗原抗体複合体が遊離してくる。

この遊離液を第７図の計測液導入部２８より反応容器へ
導き、酵素反応を行わせた。アルカリ・ホスファターゼ
、β−Ｄ−ガラクトシダーセとも蛍光を生じる基質を用
いた。アルカリ・ホスファターゼには４−メチルウムベ
リフエリル・ホスフェート０．５ｍＭ含む基質液を用い
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼには４−メチルウムベリフ
ェニルーＤ−ガラクトシド０．５ｍＭ含む基質液を用い
、ともに生成物は同じ蛍光波長４５０ｎｍて測定した。

ＡＦＰ。

ＣＥＡについて検量線を作成てき、同一血清中の両者の
濃度を測定することかできた。測定項目数は２種に限定
されることはなく、固相であるリングを多く設けること
により、３種以上の抗原も測定できた。またリングを別
々の反応容器に入れて酵素活性を測定することにより、
同じ標識物質を用いていても、個々の成分を測定するこ
とか可能である。また標識物質として酵素以外にも蛍光
物質、化学発光物質、生物発光物質か使用できた。

（実施例６） 複数の測定項目を同一の固相を用いて測定した例を説明
する。実施例１と同様に、抗アビジン抗体を固定化した
試験管を調製した。この試験管を２本用意し、これに血
清５０μＩをそれぞれ入れ、次にβ−ｇａｌ標識抗ＡＦ
Ｐ抗体とビオチン化抗ＡＦＰ抗体の混合液を１本の方に
、残りの１本にβ−ｇａｌ標識抗ＣＥＡ抗体とピオチン
化抗ＣＥＡ抗体の混合液を加えた。１時間室温に置いた
後試験管にアビジン溶液を１００μｌ加えて、さらに１
時間室温に置いて結合させた。１時間後りん酸緩衝液（
０，１Ｍ、　ｐＨ７，０，ＮａＣ１０，１Ｍ含有）３０
Ｃ１ｃｚｌで４回洗浄した。試験管に固定化した抗アビ
ジン抗体は実施例１で示したように５ＰＤＰて−８−３
−結合を介して試験管に固定化されているので、−５−
Ｓ−結合の還元剤で遊離させることができる。本実施例
ではジチオスレイトール１０ｍＭ　（ｐＨ８）溶液を試
験管に加えて攪拌しながら５０分間室温で還元した。

抗ＡＦＰ抗体および抗ＣＥＡ抗体を加えたいずれの試験
管でも抗原抗体反応生成物か遊離できた。

遊離物を含む溶液を１００μｍ分注ノズルで吸い上げ、
計測用試験管に注入し、これに酵素の基質２ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシド溶液を加えて反応させ、発
色後吸光度を測定した。反応条件は実施例１と同様に設
定した。ＡＦＰ、ＣＥＡの標準溶液について同様の操作
を行い、検量線を作成し、血清中のＡＦＰおよびＣＥＡ
を同一の抗アビジン抗体固定化試験管を利用して測定す
ることかできた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、抗原抗体反応から反応生成物の固定化
、共存不要物の分離までを１つの反応容器で行わせるこ
とができるので、従来のような反応容器間の移動を伴う
選択的反応方法に比較すると迅速に測定でき、操作が簡
便になる。

また共通の特異反応物質対を利用できるので測定対象に
よらず、同種の反応容器を用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の原理を示す図で、第２図は実施例１の
検量線を示し、第３図は実施例３でのβｘ−ｍの検量線
を示している。第４図は実施例４の免疫測定装置の構成
を示す図である。第５図は実施例４の免疫測定装置によ
るα−フェトプロティンの検量線を示している。第６図
は実施例５の反応模式図を示し、第７図は実施例５の装
置の一例の外観を示している。 １・・・測定対象物、２・・・抗体または抗原、３・・
・標識物質、４・・・特異反応性物質、５・・・第二特
異反応性物質、６・・・固相、７・・・連結仲介物質。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、対をなす特異反応性物質を有する連結仲介物質の一
   方の特異反応性物質とこれに対応する固相上の特異反応
   性物質との結合、及びその連結仲介物質の他方の特異反
   応性物質とこれに対応する抗原抗体反応生成物の抗体ま
   たは抗原上の特異反応性物質との結合とにより、抗原抗
   体反応生成物を連結仲介物質を介して固相上に固定化す
   ることを特徴とする免疫測定法。 ２、請求項１に記載の免疫測定法において、液相中で抗
   原抗体反応生成物を生成する第１の工程、及び液相中に
   前記連結仲介物質を添加し液相中の抗原抗体反応生成物
   を前記連結仲介物質を介して固相上に固定する第２の工
   程及び前記抗原抗体反応生成物を測定する第３の工程と
   からなることを特徴とする免疫測定法。 ３、請求項１または２に記載の免疫測定法において、抗
   原抗体反応生成物の生成とその固相上への固定化とを同
   一反応容器内で行うことを特徴とする免疫測定法。 ４、請求項２に記載の免疫測定法において、前記第３の
   工程が固相上に固定された抗原抗体反応生成物を脱離さ
   せる工程をさらに有していることを特徴とする免疫測定
   法。 ５、請求項１に記載の免疫測定法において、前記連結仲
   介物質が有している特異反応性物質は２組以上の対をな
   す特異反応物質のそれぞれ一方の特異反応性物質である
   ことを特徴とする免疫測定法。 ６、請求項１に記載の免疫測定法において、特異反応性
   物質対が（ｉ）ビオチンとアビジンまたはストレフトア
   ビジン、（ｉｉ）抗原とその抗体、（ｉｉｉ）プロテイ
   ンＡまたはプロテインＧと免疫グロブリンＧのいずれか
   であることを特徴とする免疫測定法。 ７、請求項１に記載の免疫測定法において、連結仲介物
   質が水に可溶性であることを特徴とする免疫測定法。 ８、請求項１に記載の免疫測定法において、複数の異種
   の固相を同一反応容器内に存在させることにより、複数
   の異なった測定対象物質を同時に測定しうるようになっ
   ていることを特徴とする免疫測定法。 ９、請求項３に記載の免疫測定法において、固相及び連
   結仲介物質として測定対象物質の種類によらず同一のも
   のを使用することを特徴とする免疫測定法。 １０、固相としての機能を持つ容器、抗原抗体反応を行
   うに必要な各種物質及び脱離する工程に必要な各種物質
   を順次該容器内に供給し得る複数の分注ノズル、とから
   なり、該容器と分注ノズルとは互いに相対移動するよう
   になっている、免疫測定装置。 １１、請求項１０に記載の免疫測定のための装置におい
   て、該容器内に複数の異種の固相が形成されていること
   を特徴とする、免疫測定装置。