JPH06509646A

JPH06509646A - 懸濁された固体支持体の存在下でのシグナル検出アッセイ

Info

Publication number: JPH06509646A
Application number: JP5503595A
Authority: JP
Inventors: アラード，ウイリアム・ジエフリー; オブザンスキー，デイビツド・マイクル; ベイデイア，ヒーマント・チユニラル
Original assignee: デイド・ケミストリイ・システムズ・インコーポレーテツド
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1992-07-23
Publication date: 1994-10-27
Also published as: EP0597951B1; US5434051A; DE69228817T2; DE69228817D1; US5654159A; WO1993003379A1; EP0597951A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称懸濁された固体支持体の存在下でのシグナル検出アッセイ発明の分野本発明は一般に、不均一アッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｒａｓｓａｙｓ）、特に検体中の被検体（ａｎａｌｙｔｅ）の存在を懸濁された固体支持体の存在下に該被検体と関連付けられた標識により発生したシグナルを光度測定的に検出することにより検出および／または定量することに関する。

発明の背景固相アッセイは、多くの様々な方式で行うことができる。現在利用可能となっているシステムの多くは非競合または逐次結合方式を利用している。

例えばイムノアッセイの場合には、抗体を非特異的吸着または共有結合による結合のいずれかによって固相表面に結合させる。その固相に臨床標本または組織培養液を加え、そして反応のために十分な時間をとった後、洗浄手順により除去する。次に、添加抗原上に存在するが固相抗体への結合によって占有されていない抗原部位と反応する第二抗体を添加する。方式によっては、この抗体は標識に直接連結される。このような場合に、反応は未結合抗体を洗浄しモして固相表面に結合した標識量を測定することにより完結する。

別の選択肢として、前記第二抗体は未標識の形で添加でき、そしてその存在を該第二抗体と特異的に結合する別の免疫反応体の添加により定量することができる（間接方式）。第二抗体は非酵素部分で標識することもでき、そしてその反応は該部分を特異的に認識する反応体の添加により定量することができる。ストレプトアビジン−ビオチンイムノアッセイがその例である。いずれの場合も、未反応標識抗体は洗浄によって除去され、また固相に結合した標識量は適宜の機器により測定される。

１９８７年４月７日にＢａｋｅｒらに付与された米国特許第４、６５６．１４３号は、液体成分と顆粒状微粒固相とを所定の時間共にインキュベートすることより成り、そして液体成分の密度を顆粒状微粒固相の密度と、少くともその所定の時間の間、実質的に等しくなるよう維持することを特徴とする不均一結合アッセイを記載している。液体成分の密度は、顆粒状微粒固相の密度よりも大きい密度を有する密度改変媒質の添加によって、顆粒状微粒固相の密度と実質的に等しくなるよう維持される。

１９９０年４月３日にＰｈ１ｌｏに付与された米国特許第４、９１４．０２３号は、オフ−ピーク（ｏｆｆ−ｐｅａｋ）吸光度を測定することにより酵素イムノアッセイの直線範囲を延長する方法を記載している。

１９８８年ｌＯ月２６日に公開された欧州特許出願公開第２８８、１７９号は、（ａ）生物学的液体の検体、クレアチンキナーゼのＢモノマーに対する固定化抗体、およびクレアチンキナーゼのＭＢイソ酵素に対する標識モノクローナル抗体の混合物を形成し：（ｂ）その混合物をインキュベートし、（Ｃ）その混合物から固体支持体を分離し：そして（ｄ）固体支持体と関連付けられた標識の量を検出することより成る、生物学的液体中のクレアチンキナーゼのＭＢイソ酵素の検出方法を記載している。

１９７８年７月・１日にＰｉａｓｉｏらに付与された米国特許第４、０９Ｌ　８７６号は、検出されるべき被検体に対する標識抗体と液体とをインキュベートして標識抗体−被検体複合体を形成し、次いでその複合体を被検体に対する固定化抗体とインキュベートして標識抗体−被検体−固定化抗体複合体を形成しそしてそれをインキュベーション媒質から分離することより成る逆サンドイッチイムノアッセイを記載している。

１９８１年１月１３日にＪｅｏｎｇらに付与された米国特許第４、２４４．９４０号は、被検体含有検体、被検体に対する標識受容体、および固相支持体に結合された未標識受容体を水性媒質中で共にインキュベートして実質的に安定な懸濁液を形成することより成る二部位イムノアッセイを記載している。それら固相および液相は分離されそして各相を標識受容体（その濃度は検体中のりガント濃度の関数である）について分析する。

１９８７年１１月１８日に公開された英国特許出願番号ＧＢ　２１９０４９０＾は、抗原、固定化第一抗体および第二抗体を酵素標識第三抗−第二抗体と同時に反応させ、固相を液相から分離しモして固相中に存在する酵素活性量を測定することにより免疫複合体を得ることより成る酵素イムノアッセイを記載している。

発明の概要本発明は、被検体と関連付けられた標識により発生したシグナルを光度測定的に検出および／または定量し、その際検出が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る、検体中の被検体の有無を検出および／または定量するためのアッセイに関する。

別の態様として、本発明は、懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）固体支持体上に固定された捕獲試薬を被検体含有検体と反応させて固定化捕獲試薬−被検体複合体を形成し；ｂ）その固定化捕獲試薬−被検体複合体を検出自在に標識された試薬とインキュベートし：そしてＣ）段階（ｂ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイに関する。

更に別の態様として、本発明は、懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）固体支持体上に固定された捕獲試薬、被検体含有検体および検出自在に標識された試薬を同時に反応させ、そしてｂ）段階（ａ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し５、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイに関する。

更に別の態様において、本発明は、懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）被検体含有検体を検出自在に標識された試薬と共にインキュベートシ：ｂ）段階（ａ）の生成物を固体支持体上に固定された捕獲試薬と反応させ：そしてＣ）段階（ｂ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイに関する。

図面の簡単な説明図１は、緩衝液中の二酸化クロム粒子の、および二酸化クロム粒子の存在下におけるＣＰＲＧおよびＣＰＲの吸収ス木明細書に用いた「光度測定的に検出および／または定量する」という用語は、検出自在に標識された試薬を含有する溶液により吸収された光の量を少（とも二つの異なる波長を用いて測定することを意味する。

本発明のアッセイによれば、光度測定的検出により固相の光度測定に対する寄与を修正できることから、懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の有無を光度測定的に検出および／または定量することができる。

実施されたアッセイのタイプに依存して、被検体と関連付けられた標識により発生したシグナルは検体中に存在する被検体量に正比例することもあれば、あるいは検体中に存在する被検体量に反比例することもある。「と関連付けられた」とは標識により発生したシグナルを検体中に存在する被検体量に直接または間接に数学的に関係付けることができることを意味する。被検体と標識の間の関連は必ずしも直接的な物理的関連である必要はない。

本発明のアッセイは、少くとも二つの異なる波長で、すなわち少くとも二色法的に（ｂｉｃｈｒｏｗａｔｉｃａｌｌｙ）　、光度測定的に検出することによって実施するのが好ましい。

このアプローチはアッセイ過程を簡素化し、そして例えばイムノアッセイなどのアッセイを自動臨床アナライザー例えばａＣａ＠　ディスクリート臨床アナライザー（Ｅ、　Ｉ。

ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ウイルミントン、プラウエア州）およびＤｉｍｅｎｓｉｏｎ＠　に適用する複雑でない手段を提供する。

本発明のアッセイは、特定の方式や特定の被検体に限定されるものではない。それはイムノアッセイのほか核酸プローブアッセイの実施に用いることができる。

すなオ）ち、本発明のアッセイは、被検体と関連付けられた標識により発生したシグナルを光度測定的に検出および、／または定量し、その際検出が懸濁された固体支持体の存在Ｆに行われるようにして成る、検体中の被検体の有無を検出および／または定量するためのアッセイに関する。

一つの態様として、本発明は、懸濁された固体支持体の存在Ｆに検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）固体支持体上に固定された捕獲試薬を被検体含有検体と反応させて固定化捕獲試薬−被検体複合体を形成し１ｂ）その固定化捕獲試薬−被検体複合体を検出自在に標識された試薬とインキュベートシ：そしてＣ）段階（ｂ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイに関する。

別の態様として、本発明は、懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）固体支持体上に固定された捕獲試薬、被検体含有検体および検出自在に標識された試薬を同時に反応させ、そしてｂ）段階（ａ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイに関する。

更に別の態様において、本発明は、懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）被検体含有検体を検出自在にｓ謙された試薬と共にインキユベートシ。

ｂ）段階（ａ）の生成物を固体支持体上に固定された捕獲試薬と反応さゼ：ぞしてＣ）段階（ｂ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイに関する。

本発明の実施に使用できる懸濁された固相には、被覆二酸化クロム粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子、多糖樹脂ベース粒子などが包含される。好ましい固相は１９８７年４月２８日にＬａｕらに付与された米国特許第４．６６１．４０８号に記載さねているような被覆二酸化クロム粒子であるところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

これらの二酸化クロムは加水分解的に十分安定であり、不均一イムノアッセイおよびバイオアフィニティー分離における固体支持体として有用である。粒子の芯部は、５〜１００１２／ｇの表面積、１００〜７５０エルステツドの保持力、５〜４５ｅ謬ｕ／ｇの残留磁気および８〜８５ｅ■ｕ／ｇの飽和磁気を有する針状、ルチル二酸化クロムである。これらの粒子は表面安定化され、モして５ｉＯ１のコーティングで更に安定化される。そのシリカ被覆二酸化クロムは次いで更に、シランで被覆することによってその粒子を更に安定化させると共にタンパク質に対する結合部位を与える。

本発明のアッセイは、任意の被検体の存在を検出および／または定量するのに用いることができる。例えばグリコペプチドホルモン例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ■）、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）　、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、 α−フ二トプロテイン（ＡＦＰ）　、クレアチンキナーゼ−１１８（ＣＫＭＢ）などが挙げられる。

捕獲試薬は免疫または非免疫特異結合対の構成員であってよい。免疫特異結合対としては例えば抗原／抗体系またはハブテン−抗−ハブテン系が挙げられる。抗体を用いる場合、それはポリクローナル、モノクローナル、またはその免疫反応性断片であってよく、そして当業者によく知られた常法により製造することができる。

「免疫反応性抗体断片」または「免疫反応性断片」という用語は、抗体の結合領域を含む断片を意味する。かかる断片はＦＣ部分を欠く断片として定義されるＦａｂ−型断片、例えばＦａｂ、　Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）、断片であってもよく、あるいは完全な抗体の重鎮成分を接続しているジスルフィド結合の還元的切断により得られるいわゆる「半分子」断片であってもよい。特異結合対の抗原構成員が非免疫原性である場合、例えばハプテンである場合、それは担体タンパク質に共有結合的にカプリングさせてそれを免疫原性とすることができる。かがる断片は当業者によ（知られた常法を用いて製造することができる。

非免疫結合対には、二つの成分が相互に対する天然アフィニティーを共有するが抗体ではない系が包含される。

非免疫結合対の例にはビオチン−ストレプトアビジン、葉酸−葉酸（ｆｏｌａｔｅ）結合性タンパク賀、相補プローブ核酸などが包含される。

捕獲試薬は当業者に知られた任意の慣用手段例えば吸着、共有結合的結合などを用いて固体支持体の表面に固定することができる。

固定化捕獲試薬−被検体複合体の形成は検出自在に標識された試薬を用いて検出および／または定量される。

例えば、検出自在標識はその生成物が光度測定的に検出され得る酵素であってよい。かかる酵素の例にはβ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが包含される。その他の例がＩｓｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　Ａｃｔａ、　１９４：　５１〜７４（１９９０）にみられるところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。検出自在標識は当業者によく知られた常法を用いて免疫または非免疫特異結合対の構成員にカプリングすることができる。

別の態様として、例えば１９９０年２月２２日に公開されたＰＣＴ出願公開番号ｔｏ　９０１０１５５９（その開示を引用により本明細書の記載に含める）に記載されているような、検出および定量を高めるための酵素増幅カスケードを用いることができる。そこに記載されたヒドロラーゼ酵素の増幅アンセイは、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）の測定のために開発された高感度フラビンアデニンジヌクレオチド−３′−ホスフェ−１−（ＦＡＤＰ）−ベースの酵素増幅カスケードである。そのカスケードは基質ＦＡＤＰからコファクターＦＡＤ（これは不活性アポｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−Ａ＾０）に化学量論的に結合する）を生成する脱ホスホリル化を介してＡＬＰを検出する。生成する活性ハロＤ−＾＾０はｄ−プロリンを酸化して過酸化水素を生成するが、これは３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸（Ｄ（ＪＩＢＳ）および４−アミノアンチピリン（＾へＰ）から着色生成物へのＦｌｌｉＰが介在する転化により定量される。

特に、レポーター酵素であるＡＬＰはＦＡＤＰを脱リン酸して、Ｄ−＾＾０に対する補欠分子族であるＦＡＤを生じる。シグナル対ノイズ比と感度の両者が、ＡＬＰの単一分子がＦＡＤの多数分子を生成するカスケードの増幅特性によって高められる。これらＦＡＤ分子は更に等価数のアポＤ−＾ＡＯ分子に結合してそれらを活性水ロＤ−＾＾０分子に転化する。ホロＤ−＾＾０の各分子は次いで、ＤＣＩＩＢＳおよび＾＾Ｐを着色生成物に転化する過酸化水素の多分子を生成する。すなわち最終的シグナルはもともとの数の＾ＬＰ分子の相乗的二段階増幅から生じる。そのスキームはまた、感度を一段と高めるための「ティルーエンド（ｔａｉｌ−ｅｎｄ）　Ｊ基質循環系を含め、その他のヒドロラーゼ酵素、アポ酵素および検出酵素系を色種するべく容易に一般化することができる。

検出感度およびアッセイ精度は、シグナルを少（とも二つの異なる波長（一つは生成物の吸収ピークのあるいはその近傍のものとし、そして第二基準波長は生成物の吸収ピークから離れたものとする）で記録することにより固相の光度測定寄与を修正することによって高めるのが好ましい。ピーク波長での読みから基準波長での読みを差し引いた後に得られる値は検体の被検体濃度に比例する、すなわち二色性検出（ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）である。

以下の実施例は本発明を例説するためのものであっていささかも限定としてとらえられてはならない。

割鼻μ 下記のすべての実施例はａｃａ　＠　ディスクリート臨床アナライザー（Ｅ、　１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

ウイルミントン、プラウエア州１９８９ｇ）を用いた。ａＣａ［Ｆ］の一例は米国特許第４．０６６、４１２号に記載されているところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

ａ）　ＣＫＭＢイムノアッセイに用いられた細胞系統用いられたモノクローナル抗体を産生ずる細胞系統は、米国特許第４．９１２．０３３号およびＶａｉｄｙａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１ｉｎＣｈｅｗ、　３２（４）：　６５７〜６６３（１９８６）に記載された手順を用いて取得したところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

脱水生産完了後、そのようにして得られたモノクローナル抗体は、例えば硫酸アンモニウム沈殿透析、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど任意の数の標準的技法を用いて精製することができる。モノクロ −六ル抗体の単離および精製のためのこれらのおよびその他の方法は一般的に、Ｇｏｄｉｎｇ。

１ｉｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、ロンドンおよびニューヨーク、１９８３および米国特許第４．５３３．４９６号に記載さねているところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

精製および単離のための好ましい方法はプロティンＡセファ０−ス（ＰｈａｒＩＩａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　ウプサラ。

スエーデン）でのアフィニティークロマトグラフィーであった。プロティンＡは免疫グロブリンを抗原結合部位と相互作用することなく結合する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）から単離されたポリペプチド（分子量４２．０００）である。

後述の如く二酸化クロム粒子上に固定された捕獲試薬として用いられた抗−ＣＫＢモノクローナル抗体は前述の如く取得した。クローン番号は２５８１　８８１．１であり、そしてモノクローナル抗体はＩｇＧ、サブクラスのものであった。

後述の免疫反応性断片の生産に用いられた抗−ＣＫＭＢモノクローナル抗体は前述の細く取得した。クローン番号は２５８０　ＣＣ４，２であり、そしてモノクローナル抗体はＩｇＧｚｂサブクラスであった。

プロティンＡ精製抗体は４℃で一夜アセテート緩衝液（１００ｄ酢酸ナトリウム、Ｉ５ｈＭ塩化ナトリウム、ｐＨ３，５）に対して透析した。透析した抗体を透析緩衝液を用いて５鳳ｇ／ｍｅの濃度まで希釈した。抗体溶液を３７℃の水浴に５〜ｌＯ分間置いた。

ペプシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、セントルイス、ミズーリ州）の１０ｇ９／′ｍ／溶液をアセテート緩衝液中で調製した。５０・１の抗体・ペプシン重量比を与えるのに必要なペプシン量を計算した。ペプシンを添加しながら抗体溶液を撹拌した。その混合物を１０〜１５分間インキュベートした。３．５Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基を溶液のｐｎが７．０〜８．０の範囲となるまで徐々に滴加することにより反応を止めた。

Ｆ（ａｂ’　）　ｘｍ製物を２．２Ｘ２５ｃｍカラム中、４〜４．５ｍ／／時の流速で、１５〜２ＴｏｌのプロティンＡ−セファロースを通した。タンパク質ビークを両分の吸光度を２８００■で記録することによりモニターした。タンパク質ピークを集め、そして６２ｍ＠ＰＭ　３０膜フイルターを嵌装したへｍ１ｃｏｎ撹拌セルを用いて約３０諺ｑ／ｙｓｌまで濃縮した。滅菌したＦ（ａｂ’）２濃縮液を濾過しそして一２０℃で貯蔵した。

ｂ）　Ｆ（ａｂ’）ｔβ−ガラクトシダーゼ接合体の製造前述の如き抗−ＣＫＭＢ抗体断片を、“Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ−ａｓｓａｙｓ”　、ｌ５ｈｉｋａｖａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｄｓ、、ｐｐ、８１〜９０（１９８１）中のＫｉｔａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｎｚｙｍｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　ｏｆ　ｍａｌｅｉｓｉｄｅに実質的に記載された手順を用いてβ−ガラクトノダーゼにカプリングしたところ、その開示を引用により本発明の記載に含める。接合体は次のようにして製造した・抗−ＣＫＭＢモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ”）ｚ断片を抗体透析緩衝液（２０ｍＭホスフェート緩衝液、３００ｄ　ＮａＣ１，ｐＨ７，０）に対して透析した。１モルのＦ（ａｂ’）ｚを３０モルのＳＭＣＣ〔Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキンレート〕と混合しそして室温で３５分間絶えず撹拌しながらインキュベートした。

その混合物をＵＶ検出器（２ｇ０ｎｍでの吸光度）を設けた５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（２，２Ｘ　１３ｃｍ）にかけた。活性化Ｆ（ａｂ′）ｚ断片を抗体透析緩衝液を用いて溶出した。タンパク質ピークを集めた。体積を記録しそしてタンパク質濃度を推定した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入した１モルの大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ［ＳＭＣＣ活性化Ｆ（ａｂ′）２と当量］を抗体透析緩衝液に溶解した。活性化Ｆ（ａｂ′）　２をβ−ガラクトノダーゼと混合しそして少（とも２５分間２５℃で絶えず撹拌しながらインキユベートした。接合体の合成は、■００μｌループＧＦ　４５０分析カラムを備えたＬＫＢ　ＲＰＬＣを用いてモニターした。主ピークがクロマトグラム上で第二ビークを超えたところで、接合体反応混合物１ｍｌあたりＬＯａｌの０．１ＭＮ−エチルマレイミド溶液を添加することにより反応を急止した。その混合物をへｍ１ｃｏｎ撹拌セルおよびＹＭ　１００フイルター（いずれもＡｍｌｃｏｎ社製）を用いて４．０ｍｌまで濃縮した。その接合体濃縮液を０．２μノリンジフイルターを通して濾過し、そして１１１１ループＧＦ　４５０カラム、０１モニター、フラクションコレクターおよびチャートレコーダーを備えたＬＫＢ　ＨＰＬＣを用いて精製した。適切な両分を集め、プールしモして２ｇ０ｎｍ波長で吸光度を測定したタンパク質濃度を推定した。生成濃縮液を濾過し、滅菌しそして４℃で貯蔵した。

接合体濃縮液は、ＣＫ１１Ｂアツセイのために必要に応じてβ−ガラクトシダーゼ接合体希釈緩衝液（脱イオン水１１あたり、３３．５９　ＰＩＰＥＳ　（ピペラジン−Ｎ、　Ｎ’−ビス〔２−１タンスルホン酸）　）０．２　ｑ　ＭｇＣｌ２．２９．２　ｑ　ＮａＣ１，１００ｑ牛血清アルブミン、および０．１６７９マウスＩｇＧ、　ｐＨ７，０）で希釈した。

Ｃ）二酸化クロム粒子にカプリングされた抗−ＣＫＢ捕獲抗体抗−ＣＫＢ抗体を、実質的にＢｉｒｋｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｔ。

（Ｂｉｒｋｍｅｙｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｖｅｌ　ｃｈｒｏｍｉｕｍｄｉｏｘｉｄｅ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｔｏ　ｉｅｉｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｄｅｖｅｌｏｐ−ｍｅｎｔ、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　３３．　１５４３〜１５４７．１９８７）により記載された手順に従って二酸化クロム粒子上に固定したところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

４１のカプリング緩衝液を、１９６ｍ１の１０５Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４（−塩基性）および２０４＠ｌの１ｈＭ　Ｋ２ＨＰＯ４（二塩基性）を混合し７、そしてその容量を脱イオン水を用いて４Ｉ！まで増加さぜることにより７Ａ製した。ｐＨは７．０に調節した。抗−ＣＫＢモノクローナル抗体（２５８１Ｂ＋（１，１，）を変えられたカプリング緩衝液に対し一夜透析し、そして透析を更に４時間続りた。透析した抗体の容量を測定し、そしてタンパク質濃度を推定した。抗体溶液をカプリング緩衝液を用いて２＊ｑ／ｗｓｉまで名訳した。希釈抗体（２１１９／　Ｉｔｌ）およびグルタルアルデヒド活性化二酸化クロム粒子の５％腎濁液を等容ずつ組織培養フラスコ中で混合した（この実験では、最終反応容量は２００ｍ／とじた）。混合物を４℃で一夜放置混合した。その組織培養フラスコを室温で磁気プレート上に置くことにより、粒子を６０分間放置分離した。上演を除去し、そして粒子に結合した抗体量を測定するためにアリコートを貯蔵した。これらの条件下では９８％以上の抗体が粒子に結合した。２０１）＋４’のクエンチ溶液（２，０Ｍグリシン緩衝液）を用いて反応をクエンチし７、そして室温で１時間揺動させた。粒子を磁気プレート上で３０分間分離した。上清を除去し、次いで組織培養フラスコ中１５Ｔｏｌの洗浄緩衝液（１０菖１ノン酸カリウム緩衝液、０１％牛血清アルブミン、ｐ１１７．４）で１０回洗浄した。最終洗浄からのに清を捨てた。２００＋＋４！の貯蔵緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、０．１％牛血清アルブミン、０．０１％チメロサール、ｐＨ７，４）を粒子懸濁液に添加しそして４℃で貯蔵した。１Ｏａ（！の粒子懸濁液は１０Ｍｇの抗− ＣＫＢ抗体と２５０ｐｇの二酸化クロムを含有した。

ｄ）ＣＫＭＢに対する終点（ｅｎｄｐａｉｎｔ）法によるβ−ガラクトシダーゼ活性測定用波長の選択自動化イムノアッセイについてここに記載するＣＫＭＢの一１ムノアッセイは、レポーター酵素、１なわち検出自在標識、としてβ−ガラクトシダーゼを用いた。クロロフェノールＬノッドガラクトンド（ＣＰＲＧ）を基貫として用いてβ− ガラクトシダーゼ活性を測定したところ、その際酵素はＣＰＲＧと反応してクロロフェノールレッド（ＣＰＲ）を生成した。アッセイ１回あたり約３冨すのＣＰＲＧを用いた。

ＣＰＲＧの吸収極大は４１２ｎｓで生じた。

他方、ＣＰＲは５７７ｎ■に吸収極大を有した。酵素により形成されたＣＰＲ量はＣＰＲＧの１％以下である。図１は、緩衝液中の二酸化クロム粒子の吸収スペクトルのほか、二酸化クロム粒子の存在下におけるＣＰＲＧおよびＣＰＲの吸収スペクトルを示す。

三色法終点測定が良好で再現性ある測定値を与えることを見出した。選択された第一波長は５７７ｎ■であったがこれはＣＰＲの吸収がその波長で最大となるからである。

６００ｎｓ波長をブランクとして用いると満足できる性能が得られた。この検出系で最良結果を得るには６２０ｎｓフイルターが必要であると分析された。それより低い例えば５１０や５４０ｎ園といった波長を用いることもできるが、それらはＣＰＲＧビークの下向き勾配にあたり、従ってＣＰＲＧ濃度の変動に対し敏感である可能性がある。

従って、好ましい測定系は、β−ガラクトシダーゼ活性を有する生成物を５７７ｎｌｌの第一波長、および６００ｐｗまたはそれ以上の第二波長で測定すべきである。第一波長から（１られた読みから第二波長から得られた読みを差し引くことにより酵素活性の正確な測定が可能となった。

実施例２ＣＫＭＢイムノアッセイａ）試薬ｌ　ＣＫＭＢギヤリプレー々−１ｍ／あたり０、Ｉ２．５．２５．５０、＋００および２００ｐｇのイヌＣＫＩＩＢ、、またはＩｔｌあたり０１１３８．３２．６４および１２８ｐｇのヒＩ−ＣＫＭＢ０精製ヒトまたは・イヌＣＪＭＢ　（＾ａｌｔｏ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｌｔｄ、、ビスツ（Ｖｉｓｔａ）。

カリホルニア州）をＣＫＭＢ不含ヒト血清プールに添加した。

２　抗−ＣＫＢ二酸化クロム粒子を前述の如く調製した。

３、　抗−ＣＫＭＢ　Ｆ（ａｈ′）ｚβ−ガラクトシダーゼ接合体濃縮液を前述の如く調製しｔ二。

４　接合体希釈緩衝液は、脱イオン水１！あたり、】００９の牛血清アルブミン、３３５ｇのナトリウムＰＩＦＥＳ。

２９２ｇの塩化士トリウムおよび０，２ｇの塩化マグネシウムを有した（　ｐＨ７，０）。

５　洗浄緩衝液は２５０ｐｍＭ　Ｔｒｌｓ、５０厘麗ホウ酸ナトリウムより構成した（　ｐｌ＋７．８５）。

６　再懸濁緩衝液は０．０３Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　０．０２Ｍナトリウム）ＩＥＰＥＳ、　ｏ、ｏｔＭ酢酸マグネシウムおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０より構成した（　ｐｌ＋７．６）。

７３翼９のクロロフェノールし・ソドガラクトンド、８７５肩ｑのトリハロース、３０ｍ９のマンニトールおよび３．１５ｍｇのカーボワノクス（２０ミクロン）を含むＣＰＩ？Ｇ錠剤（Ｊ、１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国特許第３、９３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて調製されたところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

８、　４０．４１のナトリウムＩＩＥＰＥｓ、２２．　ＦｈｒｇのＩＩＥＰＥＳ、７０りのソルビトール、１．１５＊９の酢酸マグネシウムおよび４、０１９のカーボワソクス（２０ミクロン）を含有する肛ＰＥ５（（ｎ−［２−ヒドロキシエチルコピペラジン−Ｎ′−〔２−エタンスルホン酸））錠剤は１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国特許第３．９３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて調製されたところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

ｂ）プロトコール前述の如く二酸化クロム粒子上に被覆された抗−ＣＫＢ抗体１０ｐ９を３００μ ｌの適宜に希釈された接合体と共に反応管に分注した。３００ｐ、ｌの検体またはキャリブレータ−をその反応管に分注し、次いでその反応管内に渦流生成させ（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）そして１５分間３７℃の水浴に入れそして２分間ごとに混合した。そのインキュベーション時間経過後、それら反応管をＣｏｒｎｉｎｇ磁気試験管立てに置（ことにより粒子を分離した。上清を吸引した後、５００ｇ／の洗浄緩衝液を添加しそして粒子を再懸濁した。この段階を３回繰り返した。最終洗浄段階の後で７５ａｌの再墾濁緩衝液を添加しそして粒子を再び再等濁した。６ｈ／の粒子墾濁液をパックに分注した。

粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性をａＣａ＠（Ｅ、　Ｉ、　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅ５ｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ウイルミントン、プラウエア州１９８９ｇ）で測定した。ａＣａ■　ディスクリート臨床アナライザーと共に用いるためのａｃａ＠ＣＰＲＧパック（プラウエア州つイルミントンのＥ、　１．　ｄｕ　Ｐｏ口ｔｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ社から入手可能な標準的ａＣａ　＠ディスクリート臨床アナライザーバック）は、ディンプル（（ぼみ）２にＩ’１ＥＰＥＳ錠剤をそしてディンプル３にはＣＰＲＧ錠剤を含む。ここでディンプル２および３とは標準的ａＣａ■ディスクリート臨床アナライザーパック内の錠剤貯蔵区域のことであり、ＣＰＲＧ錠剤は３１１９のクロロフェノールレッドガラクトシド、８．７５１９のトレハロース、３０１１ｇのマンニトールおよび３．１５ｍｇのカーポワックス〔２０ミクロン〕を含有しくこれは１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国特許第３．９３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて製造されたところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める）、またＩＩＥＰＥＳ錠剤は４０．４ｍｇのナトリウム）ＩＥＰＥＳ、　２２．８■９の１ｌＥＩ’Ｅｓ、　７．０窮９のソルビトール、１．．１５ｍｇの酢酸マグネシウムおよび４．　Ｑｍｇのカーボワックス〔２０ミクロン〕を含有する（これは当該技術分野に知られた標準的錠剤化方法を用いて調製された）。

次にそれらバンクをセロファンテープでシールしそして粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性を次のようにしてａｃａ　＠　ディスクリート臨床アナライザーを用いて測定した。パックをａｅａ＠　にかけたところで、２ｍｇのホスフェート緩衝液（ｐ［１７，８）および３ｍｇの水をパックに分注した。ブレーカ− ミキサー１（錠剤試薬を破砕しそして試薬の混合を助長するａｃａ　＠　ディスクリート臨床アナライザーの一成分）を用いてＩＩＥＰＥＳおよびＣＰ！ｉＧ錠剤を溶解しそして粒子を懸濁させる。結合した酵素はＣＰＲＧと反応して３７℃ でＣＰＲを形成した。４．２分後、形成されたＣＰＲを５７７および６θＯｎ− 波長で測定した。５７７ｎ■はＣＰＲが吸収極大を有する第一波長であり、そして６００ｎ量はブランク用波長であった。６００ｎ■での読みを５７７ｎ諺での読みから差し引いて、懸濁された粒子による干渉を除去した。ａｃａ■での終点読みと呼ばれる５７７ｎｗ読み−６００ｎ■読みをＣＫ１１Ｂキャリブレータ− のボトル値に対してプロットして標準曲線を作成した。

Ｃ）結果イヌＣＫＭＢ　（表１）およびヒトＣＫＩＩＢ　（表２）キャリブレータ−を用いてＣＫＭＢ標準曲線を作成した。アッセイは前述の如〈実施した。最終吸光度はａｃａ　＠　を５７７および６００ｎｓの波長で用いて読みとった。結果を表１および２表　１イヌ　終点読みＣＫＭＢ　（５７７−６００伊ＶシΩ　久堪−四−壁　店１）尤−景準偏差　変動係数０　５　１１６．８　１．５　１．３１２．５　５　１４０．４　２．６　１．８２．５　５　１７１．９　６．２　３．６５０　５　２０７．８　６．６　３．２１００　５　３１７．２　ｇ、５　２．９２００　５　５１０．６　１３．６　２．７ヒト　終点読みＣＫＭＢ　（５７７−６００（恵月、イー！Ｑ　リ」」−欽　倶１Ｌ−１−一　轡１学づ―じ筆　湾づ１Ｊ酢１季０　３　９２．２　０．４　０，５１３．８　３　１１９．５　２．１　１．８３２　３　１６５．１　１．７　１．０６４　３　２５０．９　５．４　２．２１２８　３　４２７．４３　６．５　１．５実施例３試験（ｒｕｎ）内情度ＣＫＭＢアッセイの試験的精度および分析感度を三つのレベルの対照物質を分析することにより確認した。ＣＫＭＢアッセイの感度はゼロのレベルの対照物質の二標準偏差として規定した。結果を表３に示す。

表　３ＣＫＩｉＢアッセイの試験的精度および感度平均ＣＫＭＢヌ復回数　（口９／ｌｌ）　Ｉｌｌ−１ｉ１９　艮！員１１０　−０．１５　０．１２　７７．２感度　ゼロの（２ＳＤ）　０．２４１０　４．８　０．３　６．３１０　７７．３　２．９　３．８実施例４ｈＣＧイムノアッセイａ）　Ｆ（ａｂ’）２β−ガラクトシダーゼ接合体試薬の製造デテクター抗体断片接合体の製造に用いられた抗−ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　５１４）をＢｙｂｒｉｔｅｃｈＩｎｃ　社（Ｐ、　０．　Ｂｏｘ　２６９００６、サンジエゴ、カリポルニア州９２１２６）から購入した。この抗体は約３　Ｘ　１０−”Ｍのアフィニティーを有するβ鎖特異的モノクローナル抗体であった。しかしながら、イムノアッセイ方式に用いるのに十分なアフィニティーを有する任意の抗−ｈＣＧモノクローナル抗体を用いることができ、またかかる抗体は当業者に知られた技法、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＬ目５ｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、２５６：　４９５〜４９７　（１９７５年８月７日）に記載の方法を用いて製造することができる。Ｆ（ａｂ’）、断片およびＦ（ａｂ’　）□ β−ガラクト／ダーゼ接合体は前記実施例１と同様に製造した。

前記実施例１と同様にして製造された濃縮接合体の溶液をある量のβ−ガラクトシダーゼ接合体希釈緩衝液（１００ｍｌｌ　ＰＩＰＥＳ、　ＬｍＭ　ＭｇＣら、５００ｄ　Ｍａｃｅ、　１．０％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、および１６７４ｇ／＋ｇ／のプロティン精製マウスＩｇＧを含有する。ｐＨ７，０’）で希釈して４　Ｘ　１０１Ｍβ−ガラクトシダーゼの最終濃度とする。

ｂ）二酸化クロム粒子にカプリングされた抗−ｈＣＧ捕獲抗体二酸化クロム粒子は、１９８７年４月２８日にＬａｕらに付与された米国特許第４．６６１，４０８号に実質的に記載されているように製造したところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。捕獲抗体として用いられた抗−ｈＣＧ抗体（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ細胞系統３４／　２５）は、全分子ｈＣＧを免疫原として用い、そしてモノクローナル抗体の生産について当該技術分野において知られる常法を用いて製造された。

前述のＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの論文を参照されたい。使用した抗体は約３×１０−目Ｍのアフィニティーを有するα−鎖特異的抗−ｈＣＧモノクローナル抗体であった。しかしながら、イムノアッセイ方式に用いるのに十分なアフィニティーを有する任意の抗−ｈＣＧモノクローナル抗体を用いることができ、そしてかかる抗体は、モノクローナル抗体の生産について当該技術分野において知られる技法を用いて製造することができる。この場合も、本発明のイムノアッセイはイムノアッセイに用いるのに適した任意の抗体および／または免疫反応性断片を用いて実施することができる。

捕獲抗−ｈＣＧ抗体は、前記実施例１に記載されているように二酸化クロム粒子にカプリングした。０．７５ｗ９　（抗−ＨＣＧ捕獲抗体）／■ｌ（二酸化クロム粒子）の濃度となるように２５ｍｇ／ｍｌの固体を含有する二酸化クロム粒子のスラリーに添加した。このようにして得られた抗−ＨＣＧ捕獲抗体被覆二酸化クロム粒子スラリーを、不活性物質として添加された９、８３回りのトレハロース、０．９８ｍｑのカーボワックスおよび０．０３■すのチメロソルと共に、１錠あたり３、０ｍｇの抗体被覆二酸化クロム粒子を含有する錠剤にした。それら錠剤は、１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国特許第３．９３２．９４３号に実質的に開示されたような方法を用いて製造されたところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

ｃ）　ａｃａ＠　ディスクリート臨床アナライザーパック中の懸濁された二酸化クロム粒子の存在がクロロフェノールレッドがラクトシト（ＣＰＲＧ）吸光度に及ぼす効果ａＣａ［Ｆ］ディスクリート臨床アナライザーバックにおけるＣＰＲＧの吸光度に対する二酸化クロム粒子の効果を測定した。各々１０本の試験管より成る三セットを用意したところ、各セット（下記においてｉ、ｉ４および伍として表示される）は次のものを含有する：ｉ　）　０．０３Ｍ　［ＩＥＰＥＳ、０．０２Ｍナトリウム！ＴＥＰＥＳ、　０．０１Ｍ酢酸マグネシウムおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ　２０より成る再懸濁緩ｌ１ｌｉ液、ｐＨ７，６゜Ｕ）再懸濁緩衝液および抗−ｈＣＧ捕獲抗体被覆二酸化クロム粒子　名々３りのクロム固体を有する５個のクロム錠剤を３ｍ／の水に溶解して５ｍｇ７ｍ１の固体を有する溶液を作った。、各試験管に、２５０ｇｇのクロム固体を含有する７５バｌを加えた。

ｆｆ＋）再懸濁緩衝液およびｈＣＧ　Ｏキャリブレータ−（ＰｅｉＦｒｅｅｚ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ａジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）　、アリシナ州７２７５６．　より得られたウマ血清）で処理された抗−ｈＣＧ捕獲抗体被覆二酸化クロム粒子。

前述の如く、２０本の１２ｉ諺×７５■諷ポリエチレン試験管（七ソトロおよび開）の各々に７５１の抗−ＥＩＣＧ捕獲抗体被覆二酸化クロム粒子を分注し、た。４００１１の適切に希釈されたＦ（ａｂ′）　２β−ガラクトシダーゼ接合体試薬（ｌｏＯＩＩ＋１ｌＰＩＰＥＳ、ｌ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５００ｍＭ　ＮａＣ１！、　１０％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンおよび１６７μｇ　／　ｍ　ｌプロティン−Ａ精製マウスＩｇＧを含有する接合体希釈緩衝液（ｐＨ７、Ｏ）で希釈されたβ−ガラクトンダーゼ標識抗体接合体）を１０本の試薬管（セットｉ）の各々に添加した。１００１４のｈＣＧ　Ｏキャリブレータ−をセソトホの各試験管に添加した。容管の内容物を渦流生成により混合し、そして３７℃加熱ブロックに１５分間装いた。１５分後に、管を磁気試験管立てに粒子が試験管の側壁に磁気的に保持されるように置くことにより粒子を分離した。容管の上清を吸引により除去し、５００ａｌの洗浄緩衝液（２５０１１Ｍ　Ｔｒｉｓ、　５０ｗ１ｌホウ酸ナトリウム、ｐＨ７，８５）を容管に添加し、そして粒子を渦流生成により再懸濁した。その洗浄手順をさらに２回繰り返した。

最終洗浄の後、７５μｌの再懸濁緩衝液（０，０３Ｍ　［１ＥＰＥＳ、０．０２ＭナトリウムＨＥＰＥＳ、０．０１Ｍ酢酸マグネシウム、および０．００５％Ｔｖｅｅｎ２０．．　ｐＨ７，６）を添加し、そして粒子を渦流生成により再懸濁した。

セットｉ、ｔｉおよび迅のすべての管からの６０ａｌを、ディンプル２にはｔｌＥＰＥｓ錠剤をそしてディンプル３にはＣＰＲＧ錠剤を含んでいるａｃａ［Ｆ］ＣＰＲＧバック標準的ａＣａ■ディスクリート臨床アナライザーパック（ａＣａ ■ディスクリート臨床アナライザーと共に用いるべく、プラウエア州つイルミントンのＥ、１．ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅ＊ｏｕｒｓ　ａｎｄＣｏｍｐａｎｙから入手できる）のディンプル１に分注した。ここでディンプル２および３とは標準的ａｃａ［Ｆ］　ディスクリート臨床アナライザーバック内の錠剤貯蔵区域のことであり、ＣＰＲＧ錠剤は３ＩＩｇのクロロフェノールレッドがラクトシト、８．１５Ｎ９のトレハロース、３０りのマンニトールおよび３．１５肩９のカーボワックス〔２０ミクロン〕を含有しくこれは１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国特許第３．９３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて製造されたところ、その開示を引用により本明細書の記載の一部に含める）、またＨＥＰＥＳ錠剤は４０．４＋＋ｇのナトリウム１’１ＥＰＥＳ１２２．８ｍｇノＨＥＰＥＳ、　７．０ｍｇＣＤ　’／　ｋ　ヒト−ｋ、１．１５１９の酢酸マグネシウム、および４．０ｍｇのカーポワックス〔２０ミクロン〕を含有する（これは当該技術分野に知られらた標準的錠剤化方法を用いて調製された）。

次にそれらバックをセロファンテープでシールし、そして粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性を次のようにしてａｃａ■ディスクリート臨床アナライザーを用いて測定した。バックをａＣａ＠　にかけたところで２■ｌのボスフェート緩衝液ＣｐＨ７，８）および３ｍｌの水をバック内に分注した。ブレーカ−ミキサー１（錠剤試薬を破砕し、そして試薬の混合を助長するａｃａ　＠　ディスクリート臨床アナライザーの一成分である）を用いてＩＩＥＰＥｓおよびＣＰＲＧ錠剤を溶解しそして粒子を懸濁させた。結合したβ−ガラクトシダーゼ酵素はＣＰＲＧと反応して３７℃でクロロフェノールレッド（ＣＰＲ）を形成した。４．２分後、形成されたＣＰＲを５７７および６００ｎｍ波長で測定した。５７７ｎ園はＣＰＩ？が吸収極大を有する第一波長であり、モして６００ｎ−はブランク用波長である。６００ｒｖでの読みを５７７０−での読みから差し引いた。結果を表１に示す。

表　１ａＣａ　＠　ディスクリート臨床アナライザーパック中の懸濁された二酸化クロム粒子の存在がクロロフェノールガラクトシド（ＣＰＲＧ）吸光度に及ぼす効果 −なし　５１．４　０．４４　０．８６＋　なし　５０．５　０．５１　１．０十０　５１．８　０．５１　０．９８＊　＋は二酸化クロムが存在することを示す−は二酸化クロムが存在しないことを示す表１の結果は、懸濁された二酸化クロム粒子の存在下および非存在下に得られた三色法終点読み（５７７ｎｍでの吸光度測定値から６００ｎｓでの測定値を引いたもの）間に有意差がないことを示している。

実施例５ａＣａ■ディスクリート臨床アナライザーバック中に存在する二酸化クロム粒子を用いて作成されたｈＣＧ櫟準曲線被検体ｈＣＧに適用した場合の本発明のイムノアッセイ方式の精度、正確さ、曲線形および範囲を下記の如く評価した。

２５０ｇｗのクロム固体および抗−ＨＣＧ捕獲抗体を含有する７５μｌの二酸化クロム粒子溶液を１５本の１２＋＋＋ＩＸ　７５ｍｍポリエチレン試験管に分注した。４００ａｌの適切に希釈されたβ−ガラクトシダーゼ標識抗体接合体（１００■Ｍ　ＰＩＰＥＳ。

ｌ　ｄ　ｌ１ｇｃ／ｚ、５００ｄ　ＮａＣＡ！、　１０％（Ｗ／Ｖ）牛血清アルブミンおよび１６７μｇ／ｍｅプロティンーＡ精製マウスＩｇＧを含有する接合体希釈緩衝液（ｐＨ７，０）で希釈された４×１０−’Ｍ　β−ガラクトシダーゼ標識抗体接合体）を１０本の試験管の各々に添加した。一連のｈＣＧキャリブレータ−（０，２５，１，００，３００および５００ｍＩＵ／肩ｌのヒトｈＣＧ／麿ｌ：ｈＣＧは妊婦尿から精製しそして世界保健機関（１１１０）のファースト・インターナショナル・レファレンス・プレバレージョン（１”　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　；略してＦｉｒｓｔ　ＩＲＰ）に従って標準化した）の各々の１Ｏａｌを一連の試験管に添加しく各キャリブレータ−濃度について重複実験用試験管を用意した）、次にその内容物を渦流生成により混合しそして３７℃加熱ブロックに１５分間装いた。

１５分後に、管を磁気試験管立てに粒子が試験管の側檗及び底に磁気的に保持されるように置くことにより粒子を分離した。容管の上清を吸引により除去し、５０ｈ／の洗浄緩衝液（２５０１１Ｍ　Ｔｒｉｓ、５０５Ｍホウ酸ナトリウム、ｐｉ（７，８５）を容管に添加し、そして粒子を渦流生成により再懸濁した。その洗浄手順をさらに２回繰り返した。最終洗浄の後、１５ｕｌの再懸濁緩衝液（０，０３Ｍ　ＩＩＥＰＥｓ、　０．０２ナトリウムＦＩＥＰＥＳ、０゜０１Ｍ酢酸マグネシウムおよび０．００５％Ｔｖｅｅｎ２０、ｐＨ７，６）を添加し、そして粒子を渦流生成により再懸濁した。

容管からの６０ｐｌを、ディンプル２にはＨＥＰＥＳ錠剤をそしてディンプル３にはＣＰＲＧ錠剤を含んでいるａｃａ　＠　ＣＰＲＧバック（ａＣａ＠　ディスクリート臨床アナライザーと共に用いるべく、プラウエア州つイルミントンのＥ、１．　ｄｕＰｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙから入手できる標準的ａｃａ　＠　ディスクリート臨床アナライザーパック）のディンプル１に分注した。ここでディンプル２および３とはディスクリート臨床アナライザーバック内の錠剤貯蔵区域のことであり、ＣＰＲＧ錠剤は３■りのクロロフェノールレッドガラクトシド、８．７５１９のトレハロース、３０すのマンニトールおよび３．１５１１９のカーポワックス〔２０ミクロン〕を含有しくこれは１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国特許第３．９３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて製造されたところ、その開示を引用により本明細書の記載の一部に含める）、またＨＥＰＥＳ錠剤は４０．４８９のナトリウムＴＩＥＰＥＳ、　２２．８露９のＩＴＥＰＥｓ、　７．０関９のソルビトール、］、、１５１１９の酢酸マグネシウム、および４．９＋＋ｇのカーポワックス〔２０ミクロン〕を含有する（これは当該技術分野に知られた標準的錠剤化方法を用いて調製された）。それらバックをセロファンテープでソールしそして粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼの活性をａＣａ■　で測定した。前記実施例４と同様にしてａｃａ■　で測定値を得た。

ａＣａ■　での二色法読みと呼ばれる、５７７ｎｍでの測定値から６００ｎｓでの測定値を引いたものをｈＣＧキャリプレーターの濃度に対してプロットして標準曲線を作成した。結果を表２に示す。

０　３　−２３．０　０．８７　３１８．８６．５２５　３　−４．４５　１．１　３５２．８　１０１００　３　８０．８　２．０　５３２．５　４．１３００　３　２８３．５　ｇ、８　９４４．０　１９．３５００　３　４４０．８　３７．７　１２７４　８３．８表２に示した結果は、墾濁された二酸化クロム粒子の存在下に、０〜５００菖Ｉ　Ｕ　／　ｍ　ｌの範囲にわたってｈＣＧイムノアッセイの標準曲線を作成することができること、そして更に、二色法読み（５７７ｎ■測定値−６９９０−測定値）の精度が一色法読みにより得られるものよりも著しく優れていることを実証している。

実施例６被検体ＴＳＩ（に適用した場合の本発明のイムノアッセイ方式の精度、感度、標準曲線および範囲を下記の如く評価した。

ａ）　ＴＳＨ接合体濃縮液の調製・抗−ＴＳＨ−Ｆ（ａｂ’）ｉ−アルカリ性ホスファターゼ接合体の調製ｉ）　抗−ＴＳＨ−Ｆ（ａｂ′）　２のチオール反応性基による官能化抗−ＴＳＨ−Ｆ（ａｂ’　）　２抗体断片は、９７２．２として同定されるＢｙｂｒｉｔｅｃｈハイブリドーマ細胞系統から取得された抗−ＴＳ［ｌモノクローナルＩｇＧ抗体から調製した。プロティン−Ａ−セファロースＣＬ　４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏ、　）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりその細胞系統に由来する腹水液からＩｇＧを単離した。そのカラムから酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ［Ｉ３．０）でＩｇＧを溶出し、次いで１０曽麗リン酸ナトリウムおよび３００＠Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７，０）に対して透析した。次にその単離されたＩｇＧ溶液を５０：１モル比のペプシンを用いて３７℃ で６５分間消化した。得られた溶液からプロティン−Ａ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏ、）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより抗−ＴＳＢ　−Ｆ（ａｂ’　）　ｘ抗体断片を単離した。抗−ＴＳＨ −Ｆ（ａｂ’）を抗体断片は、１Ｍグリシン、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐ［，６を用いてカラムから溶出し、次いでＧＦ−２５０ＸＬカラム（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ｃｏ、社）を用いたｌ’１ＰＬｃサイズ排除カラムクロマトグラフィーにより精製した。５　ｗｓｇ／　ｍｌ抗−ＴＳＩ’ｌ　Ｆ（ａｂ’）ｔを含有する１ａｌの溶液を１０００容のｌＱｍＭリン酸ナトリウム／　３００ｄ　ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析し、そして絶えず撹拌しながら２〜８℃に一夜保った。透析後、Ｆ（ａｂ’）、含有溶液を暗色バイアル中に移した。次にその抗体断片溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０倍モル過剰の交叉連結試薬、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ’）　ロへ４−サン −］−カルボキシレート（ＳＩＩＣＣ）　（ＰｉｅｒｃｅＣｏ、社）で処理した。その反応混合物を室温で３０分間ゆるやかに揺動させた。次のその混合物を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（１，０ｃｍ　Ｘ　３０ｃｍ）にかけ、そして１０■麗リン酸ナトリウム／３００ｙａＭ　ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ６，５）で溶出した。両分を集め、プールしてマレイミド−官能化Ｆ（ａｂ’）２溶液とした。

ｉｉ）　アルカリ性ホスファターゼの官能化アルカリ性ホスファターゼ原液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ＊　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）の１０ｍｇ／ｍＩ溶液１冨Ｉを１０００容の１０−１ノン酸ナトリウムｙ’　３００ｍＭ　ＮａＣ／緩衝液（ｐＨ７，０）に対し、で透析し、そして絶えず撹拌しながら２〜８℃に一夜保持した。透析後、その酵素溶液を暗色バイアルに移し、そしてタンパク質濃度を透析緩衝液をその溶液に添加することにより調節した。最終酵素溶液タンパク質濃度は５８９／ＩＩｌに調節した。酵素溶液をジメチルスルホキシド（ＤＩＩＩＳＯ）中の１５倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）で処理してブロフクされた千オール基を導入した。

その反応混合物を室温で３０分間ゆるやかに揺動させ、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ− ２５カラム（１，ＯＸ　３０ｃｍ）にかけ、そして次に１０５Ｍリン酸ナトリウム／　３００ｍＭ　ＮａｆＪｖＩｉｌｉ液（ｐＨ６，５）で溶出した。両分を集め、プールしてアセチルチオール化されたアルカリ性ホスファターゼを得た。

１ｉｉ）　脱ブロックおよび接合マレイミド−官能化抗−ＴＳ［ｌ　−Ｆ（ａｂ’　）　２の２．９１／の１１０ ■ｇ／ｍｅ溶液をアセチルチオール化アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の４．ｌ＠ｌの１１９／諺／溶液に添加し、モして２１０＋＋ｌの１Ｍヒドロキシルアミン（ｐ［１７，０）で処理した。

その反応混合物を室温で６０分間ゆるやかに揺動させた。

その接合反応を、反応が完了する才で４５０サイズ排除カラム（９，４ｃ＋＋Ｘ２５ｃ＋＋）　（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　Ｃａ社）を用いた［ＩＰＬＣによりモニターした。

接合反応を１ａｌのＯ，１ＭＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）溶液の添加により室温で急止させた。３０分後、粗製接合体溶液を（へｍ１ｃｏｎ撹拌セル、ｐＨ３０膜を用いて）２１１１まで濃縮した。

徨）　接合体分離抗−ＴＳＨ−Ｆ（ａｂ′）　２−アルカリ性ホスファターゼ接合体をＧＦ−４５０ＸＬサイズ排除カラム（２２，５ｍｍ　Ｘ　２５ｃ＋ｉ）を用？、また１’１ＰＬＣにより精製した。接合体を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐｌ＋７．０、を２ｓ＋／／分の流速で溶出した。流出液を２８ｏｎ−でモニターした。１ｍｌ注入を２回行いそして両分（各々１．０ａｌ）を集めた。免疫反応性と酵素活性の双方を有する両分をプールした。

接合体濃縮液を２８０ｒｖでの吸光度が０．１となるまで希釈した。

ｂ）抗体−被覆二酸化クロム粒子ＴＳＩＩに対して特異的なマウスモノクローナル抗体を含有する二酸化クロム磁性粒子を作った。Ｆｒｅｕｎｄ、　Ｊ、　ＡｄｖＴａｂｅｔｃ、　Ｒｅｓ、、　Ｆ：　１３０＝１４８（１９５６）に記載された方法に従って純製全ＴＳ［ｌでＢＡＬＢ／　ｃマウスを免疫することにより生成させたｎｕ　Ｆｏｎｔハイブリドーマ細胞系統４／４６．２からこのモノクローナル抗体を取得した。肺臓リンパ球を取得しそして標準的技法を用いてミエローマ細胞と融合した。Ｇａ１ｆｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２６６：　５５０〜５５２（１９７６）。

Ｅｎｇｖａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１０９：　１２９〜１３５　（１９７２）の手順を用いて生成りローンをスクリーニングした。

Ｃ）接合体希釈剤の調製接合体希釈剤を下記のとおり調製した：塩化ナナトリウム　２９．２３　ｑ／１塩化マグネシウム　０．２０３５　９　／　１塩化亜鉛　０．０１３５　９　／　ＩＢＳＡ　３０％溶液　４１．６５　関１／１マンニトール５００　ＭＩＣＲ２５９／　Ｉ！熱処理ウマ血清　７５０　諺１／ＩＴｆＥＥＮ　２０　０．０７５　ｄ／　１アムフすテリンンＢ　Ｏ，０１ｑ／１２−クロロアセタミド　２．５　９／１硫酸ゲンタマイシン　０．１　９／ｌ’ 硫酸ネオマイシン　１　９　／　１硫酸ストレプトマイシン　０．１　ｑ／１検体（０，３厘ｌ）　（ＴＳＨキャリブレータ−ニレベル０．０．５．５．３０．５０μＩＵ／諺ｌ）、接合体試薬（０，４■／）（接合体希釈液中の接合体濃縮液の’／ｓｏ希釈液）および抗体被覆クロム（０，０５ｍ１．１２５１１９のクロム）をポリプロピレン試験管中、周期的に渦流生成しながら３７℃で１５分間インキュベートした。粒子を磁気的に分離し、そして１．０ｍｌアリコートの洗浄緩衝液（０，２５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７，８５および５０ＩＩＭホウ酸ナトリウム）で３回洗浄した。第３回目の洗浄の後、粒子を０．０６ｘｌの１００ａｌｌ　Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８，８、ｌ−再懸濁Ｌ、そして同一レベルからの試験管をプールした。次に５０ｘｌのクロムをａＣａバックのディンプル４に置いた。クロムの構造は次の通りであるニクロム粒子・抗体：　ＴＳｔｌ　：Ｆ（ａｂ’　）２　：アルカリ性ホスファターゼ。

ＦＡＤＰベースのカスケードのためのすべての試薬を次のようにしてバックに含めた：　ＦＡＤＰはディンプル２（ブレーカ−ミキサー１）に入れ、アポｄ−アミノ酸オキシダーゼはディンプル６（ブレーカ−ミキサー２）に入れ、ＨＲＰＳＤＣＨＢＳ、　４−＾＾Ｐ溶液はディンプル５（ブレーカ−ミキサー２）に入れ、そしてプロリンはディンプル１に入れた。

一一一成　分　最終バック！厚　」１」対　世に巨ＬＦＡＤＰ　３．６　１９／肩Ｉ　ＬＢＬ本Ｍｇ５０４０．０３　ｌ１ｉｌ　ＦｉｓｃｈｅｒＺｎＳＯ４ｏ、　０００３　ＷＭ　Ｓｉｇ＋ａａｄ−プロリン　２４．６　ｍＭ　Ｓｉｇｍａアポｄ−アミノ酸オキシダーゼ　０．１８８　ｕｎｉｔｓ／ｓ＋／　ＬＢＬ本西洋ワサビーベルオキシダーゼ　０．０２５　ｍ９／ｍｌ　５ｈｉｎｋ。

４−＾＾Ｐ　Ｏ，２５ｓＭ　ＳｉｇＩＩｌａＤＣＩＩＢＳ　２．５　ｍＭ　ＳｉｇｍａＴｒｊｓ　ＨＣＩ　１００　ｍＭ　Ｓｉｇｍａｐｌ＋８．８＊　ＬＢＬ＝Ｌｏｎｄｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｔｄ社バツバツクＣａで処理した。すべての反応は５ｍ１反応容量で３７℃で行った。その反応速度論モードで、１７秒二色法（ＢＣ）速度測定を５１０および６００ｎ−で行った。そのデータを二色性終点および三色法速度モードで分析した。

（ｍＡまたは■＾／分）応答をＬｏｇｉｔ式を用いて被検体に換算した。結果を以下にまとめて示す：精度　被検体結果０　２０　０．００　０．０２９　０．０２　０．０１６０．５　４　０．４０　０．０４　０．３９　０．０４５　１０　５．００　０．６２　５，００　０．４５３０　１０　３０．０６　２．３３　３０．１６　３．１９５０　９　４８．６２　５．２９　４９．３２　７．９５感度　０．０６　０．０３（ＴＳ［ｌ　ＯレベルにおけるＳＤの２倍値に基づ（）・　標準曲線応答結果０　２０　０．０２７　０．００１０　５．１ｇ　０．８６０．５　４　０．０４５　０．００９２　２５．０９　２．１５５　１０　０．１１１！４０．０１７５　２４９．２１２０．０９３０　１０　０．６７２　０．０３２０　９５８．６６　５７．０９５０　９　０．８９２　０．０６６５　１２１９．７８　９０．４５ＩＡ＝吸光度実施例７この実験はバック中のクロムを用いて三色法値・−色法値対比を行うことにより変動が改善されることを示すように設計した。この実験では免疫化学は全く用いなかった。バックは空であった。

ＴＳＨクロムは０５■！あたり１２５ｘｇのクロムとなるように組成した。ａｃａ　＠　においてバックあたり０．５ｍｊを加え、モして４．５ｍｌの９（１＋＋ＩＩ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８，８）をパックに希釈剤として加えた。パックをａＣａに通して処理しそして次のとおり、２波長において光度計測定を行った：＾１　０　５１０　０．２４　０．０３＾２　５．３　６００　０．２６　０．０３＾３　１７．１　５１０　０．２３　０．０３＾４　２２．４　６００　０．２５　０．０３＾２−Ａ１　０．０２　０．０００７＾４−Ａ３　０．０２　０．０００７（＾４−Ａ５）−（＾２−＾１）　０．００１　０．０００３＾３−Ａ１　−０．００３　０．０００５二色法終点測定値（Ａ２−Ａｌ）の方が、０および５３秒時点でのＡ１またはＡ２波長における一色法終点測定値よりも顕著に精度が高い。三色法終点測定値（Ａ４−Ａ３）の方が１７．１および２２４秒時点でのＡ４またはＡ３波長における一色法終点測定値よりも顕著に精度が高い。

二色性速度測定［（（Ａ４−Ａ３）−（Ａ２−ＡＩ））の方が一色法速度測定１１（Ａ３−Ａｌ）よりも精度が高い。

ＣＰＲＧおよびＣＰＲと共に、あるいはＣＰＲＧおよびＣＰＲなしに二酸化クロム粒子を含有する緩衝液の吸収スペクトル５Ｇ０　５２０　５４０　５ａＯｉｌｌ　！００　！２０波　長　（ｎｍ）ＦＩの旺ユ国際調査報告　ｏｒｒ、＋＋＜　ｏｙｔｎｔ、ｎｎζ、　＋ｍ　、　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０６００５フロントページの続き（７２）発明者　ペイプイア、ヒーマント・チュニラルアメリカ合衆国プラウエア州　１９８０８．つ

Claims

【特許請求の範囲】

１．被検体と関連付けられた標識により発生したシグナルを光度測定的に検出および／または定量し、その際検出が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る、検体中の被検体の有無を検出および／または定量するためのアッセイ。
２．懸濁された固体支持体が被覆された二酸化クロム粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子および多糖樹脂ベース粒子より成る群より選択される請求項１記載のアッセイ。
３．被検体がグリコペプチドホルモンである請求項１記載のアッセイ。
４．被検体がＴＳＨ、ＣＫＭＢおよびＨＣＧより成る群より選択される請求項１記載のアッセイ。
５．検出および／または定量が酵素増幅カスケードを用いて行われる請求項１記載のアッセイ。
６．前記カスケードがＦＡＤＰ−ベースの酵素増幅カスケードである請求項５記載のアッセイ。
７．懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）固体支持体上に固定された捕獲試薬を被検体含有検体と反応させて固定化捕獲試薬−被検体複合体を形成し；ｂ）その固定化捕獲試薬−被検体複合体を検出自在に標識された試薬とインキュベートし；そしてｃ）段階（ｂ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイ。
８．懸濁された固体支持体が被覆された二酸化クロム粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子および多糖樹脂ベース粒子より成る群より選択される請求項７記載のアッセイ。
９．被検体がグリコペプチドホルモンである請求項７記載のアッセイ。
１０．被検体がＴＳＨ、ＣＫＭＢおよびＨＣＧより成る群より選択される請求項７記載のアッセイ。
１１．検出および／または定量が酸素増幅カスケードを用いて行われる請求項７記載のアッセイ。
１２．前記カスケードがＦＡＤＰ−ベースの酸素増幅カスケードである請求項１１記載のアッセイ。
１３．懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）固体支持体上に固定された捕獲試薬、被検体含有検体および検出自在に標識された試薬を同時に反応させ；そしてｂ）段階（ａ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイ。
１４．懸濁された固体支持体が被覆された二酸化クロム粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子および多糖樹脂ベース粒子より成る群より選択される請求項１３記載のアッセイ。
１５．被検体がグリコペプチドホルモンである請求項１３記載のアッセイ。
１６．被検体がＴＳＨ、ＣＫＭＢおよびＨＣＧより成る群より選択される請求項１３記載のアッセイ。
１７．検出および／または定量が酵素増幅カスケードを用いて行われる請求項１３記載のアッセイ。
１８．前記カスケードがＦＡＤＰ−ベースの酵素増幅カスケードである請求項１７記載のアッセイ。
１９．懸濁された固体支持体の存在下に検体中の被検体の存在を検出または定量するためのアッセイであって、ａ）被検体含有検体を検出自在に標識された試薬と共にインキュベートし；ｂ）段階（ａ）の生成物を固体支持体上に固定された捕獲試薬と反応させ：そしてｃ）段階（ｂ）の生成物を光度測定的に検出および／または定量し、その際検出および／または定量が懸濁された固体支持体の存在下に行われるようにして成る前記アッセイ。
２０．懸濁された固体支持体が被覆された二酸化クロム粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子および多糖樹脂ベース粒子より成る群より選択される請求項１９記載のイムノアッセイ。
２１．被検体がグリコペプチドホルモンである請求項１９記載のアッセイ。
２２．被検体がＴＳＨ、ＣＫＭＢおよびＨＣＧより成る群より選択される請求項１９記載のアッセイ。
２３．検出および／または定量が酵素増幅カスケードを用いて行われる請求項１９記載のアッセイ。
２４．前記カスケードがＦＡＤＰ−ベースの酵素増幅カスケードである請求項１９記載のアッセイ。