JPH0483171A - 大腸菌群の免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ、産業上の利用分野 本発明は大腸菌群の免疫学的測定法に関し、特に大腸菌
群以外の微生物とはほとんど反応せず、しかも大腸菌群
を高感度に測定しうる大腸菌群の免疫学的測定法に関す
る。

Ｂ０発明の概要 本発明は大腸菌群の免疫学的測定法であって、大腸菌群
を免疫して得られる抗体を大腸菌群以外の微生物で吸収
した後、アフィニティ精製して標識又は固相抗体として
用いることにより、　大腸菌群のみ特異的にしかも高感
度に測定することを可能とする。

Ｃ９従来の技術 現在、微生物の定量法としては一般的に次のような方法
が知られている。

（１）菌の集落数を肉眼で数える方法（新井裁判ら著、
　“最新微生物検査法の実際”Ｐ６２．工業技術会）。

（２）微生物が生産する酵素量から定量する方法〔（山
中茂ら著、　“日本食品衛生学会第４９回学術講演要旨
集″Ｐ２９，１９８５）、　　（大橋実ら著、　“日本
発酵工学学会講演要旨集“、Ｐ７３゜１９８９））。

（３）抗原抗体反応を用いた方法［５ａｒａｆｉａｎら
によるリン菌の定量法（Ｓ、に、５ａｒａｆｉａｎ　　
ｅｔ　　ａｌ、、Ｉ、Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、
１５，５４１．１９８２）、Ｄａｄｄらによる大腸菌の
定量法（Ｄ、Ｃ９Ｄａｄｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎ　　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ、３８，７６
４．１９８２）。

北川らによるイネいもち病菌の定量法（北用常廣。

特公昭６Ｏ−４６４６１）Ｅ。

しかしながら、これらの方法は、それぞれ次のような問
題点を有していた。

（１）菌の集落を肉眼で数える方法の問題点この方法は
２４時間培養後に測定するので迅速な結果を得ることは
できない。また操作は全て無菌的に行うので熟練を要す
る。

（２）微生物が生産する酵素量を定量する方法の問題点 ａ）山中らの方法にあっては結果が判るまでに培養も含
めて１０時間も要する上、ｐＨ調製、遠心分離などの煩
雑な操作を必要とする。

ｂ）大橋らの方法にあっては検出感度が１０６個／冨ｌ
であり、目標感度３Ｘ１０’個／菖ｌに比し感度不足で
ある。

（３）抗原抗体反応を用いた方法の問題点ａ）Ｓ、に、
５ａｒａｆｉａｎらの方法及びり。

Ｃ，Ｄａｄｄらの方法にあっては菌に対する抗体を得る
のに用いた菌株は高感度に測定できるが他の菌株はほと
んど測定できず、大腸菌群など複数の菌株を総括的に定
量するには不向きである。

ｂ）北川らの方法にあっては測定に２日を要する上に、
サンドイツチ法よりも１工程多い。

以上説明したように、既存の定量法は測定時間。

特異性、感度及び測定操作の面で多くの問題を有してい
ると言える。

このため本発明者らは大腸菌群を特異的に検出可能で、
かつ測定が３時間程度で終了し、更に高い感度で測定し
つる方法を提案した（特願平第２−１０９６６４号）。

Ｄ０発明が解決しようとする課題 しかしながら、上記出願に係る方法では測定感度が未だ
１０４個／ｍｌ程度で、目標感度の３×１０’個／富ｌ
には達していなかった。このことは大腸菌の抗原濃度に
おける特異的結合が不十分であり、大腸菌群以外の菌と
の交差率の低下を妨げていることが示唆される。

従って本発明はこの問題を解決するために創案されたも
のであって、 大腸菌群を免疫して得られる抗体を前記大腸菌群以外の
微生物で吸収した後、アフィニティ精製して標識又は固
相抗体として用いることにより、特異的結合の増大、即
ち大腸菌群以外の菌との交差率を低下させ、これにより
大腸菌群を測定するに際し、目標感度の３Ｘ１０’個／
ｙａｌを達成せんとすることを目的とするものである。

Ｅ１課題を解決するための手段及び作用即ち本発明に係
る大腸菌群の免疫学的測定法は、大腸菌群を免疫して得
られる抗体を前記大腸菌群以外の微生物で吸収した後、
アフィニティ精製して標識又は固相抗体として用いるこ
と、をその解決手段としている。

以下、本発明について更に詳細に説明する。

本発明に係る方法で用いる抗体としては、被測定物質で
ある大腸菌群、好ましくはその超音波破砕抗原を動物、
例えばウサギ、ヤギ、モルモットなどに免疫して得られ
る抗体（ＩｇＧ）又はこの抗体にタンパク質分解酵素を
作用されて得られる抗原結合活性のあるフラグメント（
Ｆ　ａ　ｂ）のうち、被測定物質である大腸菌群以外の
微生物、好ましくはその超音波破砕抗原と交差する抗体
を大腸菌群以外の微生物で吸収して除去し、次いで、こ
の吸収した抗体を被測定物質である大腸菌群の超音波破
砕抗原を担体、例えばＣＮＢｒ活性化担体などに結合さ
せ、これを充てんしたカラムに通過させるアフィニテイ
精製による溶出法１例えばｐＨ変化による方法、好まし
くはグリシン−塩酸緩衝液を用いたｐＨ変化による方法
、 又はカオトロピックイオンによる方法、好ましくはチオ
シアン酸ナトリウムを用いるカオトロピックイオンによ
る方法などのアフイニテイ精製したものを用いる。

次に得られた抗体を酵素免疫測定法である非競合法１．
特にサンドイツチ法に用いる標識抗体又は固相抗体に調
製する。

こうして得られる標識抗体又は固相抗体を用いて大腸菌
群を高感度にしかも特異的に測定しうる。

Ｆ、実施例 以下、本発明に係る大腸菌群の免疫学的測定法の詳細な
説明を実施例に基づいて説明する。

実施例■　表１に示す固相抗体および標識抗体の組み合
わせにて大腸菌群および大腸菌群以外の菌の測定を行い
、感度および交差率を求めた。

免疫測定法を操作手順６．７にそれぞれ示す。

■　操作手順 Ａ　操作手順１　　大腸菌群の分離法 ■　下水処理場の流入水と放流水を適当に希釈し、デイ
オキシコール酸塩培地に塗抹した。

■　次に３７℃で１晩培養後、赤色集落を釣菌した。

（以下余白） まず大腸菌群および非大腸菌群の分離法を操作手順１．
２に、抗血清の調製法、抗血清の吸収法。

およびアフィニティ精製抗体の調製法を操作手順３．４
．５に、また標識抗体の調製法および酵素Ｂ　操作手順
２　一般細菌の分離法（大腸■　■を１〜２週間間隔で
ウサギの皮下に注射■　下水処理場の流入水と放流水を
適当に希釈し、普通寒天培地に塗抹した。

■　次に３７℃で１晩培養後、集落を釣菌し、デイオキ
シコール酸塩培地に植菌した。

■　更に３７℃で１晩培養後、赤色集落以外の集落を分
離した。

Ｃ操作手順３　　抗血清調製法 ■　操作手順１に従って分離した大腸菌群を普通栄養液
体培地にて３７℃で１晩振とうしながら培養した。

■　■で培養した菌を集菌し、洗浄後、超音波破砕した
（水冷下で５分間）。

■　■をフロイントのアジュバントを混合した。

した。

■　■を２〜４回繰り返した。

■　全採血を行い抗血清を得た。

Ｄ　操作手順４　　抗血清の吸収操作 ■　操作手順２に従って分離した一般細菌を超音波破砕
した。

■　■ヲＣＮ　Ｂ　ｒ−活性化セファロース４Ｂ■（フ
ァルマシア製）に結合させ、吸収用担体を得た。

■　■で調製した担体をカラム（ＩＸ３ｃｍ）に充てん
した。

■　■のカラムに操作手順３で調製した抗血清を通過さ
せた。溶出緩衝液には０．１ｍｏＡ’／Ａ’ホウ酸緩衝
液（ｐＨ８，５）を使用した。

■　■で得た抗血清よりＩ　ｇＧ、　　Ｆ　（ａｂ）　
ｚを調製した。

Ｅ　操作手順５　　アフィニティ精製抗体の調製法 ■　操作手順１で分離した大腸菌群を超音波破砕した。

■　■をＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ■（ファル
マシア社製）に結合させ、アフィニティ精製用担体を調
製した。

■　■で調製した担体をカラム（ＩＸ３ｃｍ）に充てん
した。

■　３０ｍｇ／ｍＩの抗大腸菌群ＩｇＧ２ｍｊ！を■の
カラムに添加した。

■　０．１５ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含む０．０１
ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）カラムを充分、
洗浄した。

■　Ｑ、１ｍｏｌ／ｊ！グリシンー塩酸緩衝液（ｐＨ２
，３）で溶出し、１　ｍｏｌ　／ｌ　トＩＪス溶液を０
．１ｍｌ含む試験管に１ｍＡ’ずつ分取した。

■　■で得たアフィニティ精製抗大腸菌群１ｇＧは０．
１ｍｏｌ／Ａ’ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）にゲル濾過
法により緩衝液を交換した。

Ｆ　操作手順６　　標識抗体の調製法 ■　１５ｍｇ／ｍＡ’のゲルコールを含む０．１ｍｏｌ
／ｌリン酸緩衝液１ｍＡ’が入っている試験管に５．６
ｍｇのｒ−マレイミドブチリルオキシ−Ｎ−サクシミド
を含むジメチルホルムアミド６０μｌをを加え、３０℃
にて１時間、撹拌しながら反応させた。

■　ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）にて脱塩し
、マレイミド化ＣＯＤを得た。溶出は０．１ｍｏＡ’／
Ｉリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で行った。

■　各抗体のＦ（ａｂ）’ｚ画分９ｍｇを含む０．１ｍ
ｏ７／Ａ’リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）１ｍｌに、β−
メルカプトエチルアミン０．８ｍｇを含む０．１ｍｏｌ
／Ｖリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）５０μノを加え、３７
℃で１，５時間、撹拌しながら反応させた後、ＰＤ−１
０カラムにて脱塩した。

■　■で得たマレイミド化ＣＯＤ３ｍｇと■で得た各抗
体のＦａｂ’画分５．４ｍｇを混合後、４℃にて１晩静
置した。

■　ＴＳＫＧ３０００ＳＷ（２１，５Ｘ６０ｃｍ。

東ソー製）にて精製し、標識抗体を得た。

Ｇ　操作手順７　　酵素免疫測定法 ■　各抗原溶液０．１ｍｊ？と■液（０，１％ＢＳＡを
含むＱ、１ｍｏｌ／Ａ’ホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５））
０．２ｍｌをウェルに入れ、抗大腸菌群ＩｇＧを被覆し
たポリスチレンボールを１個人れた。

■　室温で１時間反応後、蒸留水にて固相を３回洗浄し
た。

■　操作手順６に従って調製した標識抗体０．３ｍｌを
加えた。

■　室温で１時間反応後、蒸留水にて固相を３回洗浄し
た。

■　Ｑ、５ｍｏｆ／ｌグルコースを含む０．０１ｍｏｌ
／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５，１）を０．３ｍｌ加え３７℃
で３０分間反応させた。

■　反応液０．１　ｍｌをとり２　Ｘ　１０−７ｍｏｌ
／１ルミノールを含む０．２ｍｏｌ／ＩＩ炭酸緩衝液（
ｐＨ９，８）と、６　Ｘ　１０−”ｍｏ／　／ｌフェリ
シアン化カリウム溶液とを各０．５ｍＡ’ずつ加え、１
６〜４５秒の化学発光量を測定した。

実施例１　標識抗体として大腸菌群以外の菌で吸収した
後、アフィニティ精製した抗 体を用いた測定法 ■　０．１０”、５Ｘ１０”、１０’、５Ｘ１０’。

１０’、５Ｘ１０’、１０’、５Ｘ１０’、１０’（Ｉ
Ｉ／ｍｌの大腸菌群および大腸菌群以外の菌を超音波破
砕したものを抗原として操作手順６に準じて検量線を作
成した。標識抗体としては大腸菌群以外の菌で吸収した
後アフィニティ精製した抗体を使用した。また、大腸菌
群以外の菌の交差率（％）は１０６個／ｍｌの大腸菌群
以外の菌を抗原としたときの化学発光量を１０３個／ｍ
ｌの大腸菌群を抗原としたときの化学発光量を除して１
００を乗じた値とした。

■　その結果を第１図に示す。第１図に示すように１０
３〜５Ｘ１０’個／　ｍ　ｌの範囲で大腸菌群を測定で
きることがわかる。また交差率（交差率（％）：１０’
個／ｍｌの大腸菌群以外の菌の化学発光量／１０６個／
　ｍ　ｌの大腸菌群の化学発光量Ｘ１００）は１．９％
と低い。これらの値から標識抗体として大腸菌群以外の
菌で吸収した後アフィニティ精製した抗体を用いる方法
は大腸菌群の特異的測定に有効であることがわかる。

比較例１　標識抗体として大腸菌群以外の菌で吸収した
抗体を用いた測定法 ■　大腸菌群以外の菌で吸収した抗体を標識抗体として
用いる以外は実施例１と同様な方法により大腸菌群の測
定及び交差率を求めた。

■　その結果を第２図に示す。第２図に示すように５Ｘ
１０３〜５Ｘ１０６個／ｍｌの範囲で大腸菌群を測定で
きることがわかる。また、交差率は７．７％である。こ
れらの値は実施例１に比べて感度は１１５と低く、交差
率は約４倍と高いことを示している。更に１０’、１０
’、１０’個／ｍｌのＳ／Ｎも実施例１に比べて約１／
３〜１／２と低かった。

比較例２　標識抗体としてアフィニティ精製抗体を用い
た測定法 ■　アフィニティ精製抗体を標識抗体として用いる以外
は実施例１と同様な方法により大腸菌群の測定及び交差
率を求めた。

■　その結果を第３図に示す。第３図に示すように１０
３〜１０６個／ｍｌの大腸菌群を測定できるが交差率は
３９．３％と実施例１に比べて約２０倍高いことがわか
る。また１０’、１０５１０６個／ｍｌのＳ／Ｎも実施
例１に比べて１／２〜４１５と小さかった。

比較例３　標識抗体として未処理の抗体を用いた測定法 ■　未処理の抗体を標識抗体として用いる以外は実施例
１と同様な方法により大腸菌群の測定及び交差率を求め
た。

■　その結果を第４図に示す。第４図に示すように１０
４〜５Ｘ１０’個／ｍｌの大腸菌群を測定できることが
わかる。また、交差率は７４．１％である。これらの値
は共に実施例１に比べてかなり劣ることを示している。

更に１０’、１０５１０６個／ｍｌのＳ／Ｎも実施例１
に比べて約１／８〜１／２と低かった。

以上説明した実施例１及び比較例１□　２．３における
大腸菌群を測定したときの検量域、交差率および大腸菌
群１０’、１０５．１０’個／ｍＡ’のＳ／Ｎを表２に
示す。表２に示すように実施例１は比較例１，２．３に
比べて検量域、特異的結合及び交差率のいずれについて
も優れていることがわかる。

（以下余白） 表２ 大腸菌群の測定結果のまとめ 実施例■　表３に示す固相抗体および標識抗体の組み合
わせにて大腸菌群および大腸菌群以外の菌の測定を行い
、感度および交差率を求めた。

（以下余白） 表３　固相抗体および標識抗体の組み合わせなお、大腸
菌群および非大腸菌群の分離法、抗血清の調製法、抗血
清の吸収法、アフィニティ精製抗体調製法、標識抗体の
調製法および酵素免疫測定法は実施例Ｉで示した操作手
順１．　２．　３゜４．５．６および７に従って行った
。

実施例２　固相抗体として大腸菌群以外の菌で吸収した
後、アフィニティ精製した抗 体を用いた測定法 ■　標識抗体に代えて固相抗体を用いる以外は実施例１
と同様な方法により大腸菌群の測定及び交差率を求めた
。

■　その結果を第５図に示す。第５図に示すように１０
３〜５Ｘ１０’個／ｍｌの範囲で大腸菌群を測定できる
ことがわかる。また交差率は２．３％と低い。これらの
値から固相抗体として大腸菌群以外の菌で吸収した後ア
フィニティ精製した抗体を用いた方法は大腸菌群の特異
的測定に有効であることがわかる。

比較例４　固相抗体として大腸菌群以外の菌で吸収した
抗体を用いた測定法 ■　大腸菌群以外の菌で吸収した抗体を固相抗体として
用いる以外は実施例２と同様な方法により大腸菌群の測
定及び交差率を求めた。

■　その結果を第６図に示す。第６図に示すように５Ｘ
１０”〜５Ｘ１０’個／ｍｌの範囲で大腸菌群を測定で
きることがわかる。また、交差率は９．８％である。こ
れらの値は実施例２に比べて感度は１１５と低く、交差
率は約３倍と高いことを示している。更に１０’、、　
　１０’、　　１０’個／ｍｌのＳ／Ｎも実施例１に比
べて約１／７〜１／３と低かった。

比較例５　固相抗体としてアフィニティ精製抗体を用い
た測定法 ■　アフィニティ精製抗体を固相抗体として用いる以外
は実施例２と同様な方法により大腸菌群の測定及び交差
率を求めた。

■　その結果を第７図に示す。第７図に示すように１０
”〜５Ｘ１０’個／ｍノの大腸菌群を測定できるが交差
率は４７．９％と実施例２に比べて約２０倍高いことが
わかる。また１０’、１．０５１０６個／ｍｌのＳ／Ｎ
も実施例２に比べて１／２〜２／３と低かった。

比較例６　固相抗体として未処理の抗体を用いた測定法 ■　未処理の抗体を固相抗体として用いる以外は実施例
２と同様な方法により大腸菌群の測定及び交差率を求め
た。

■　その結果を第８図に示す。第８図に示すように１０
４〜５Ｘ１０’個／ｍｌの大腸菌群を測定できることが
わかる。また、交差率は６６．７％である。これらの値
は共に実施例２に比べてかなり劣ることを示している。

更に１０’、１０’１０６個／　ｍ　ｌのＳ／Ｎも実施
例２に比べて約１／２〜２／３と低かった。

以上説明した実施例２及び比較例４，５．６における大
腸菌群を測定したときの検量域、交差率および大腸菌群
１０’、　　１０’、　　１０’個／ｍｌのＳ／Ｎを表
４に示す。表４に示すように実施例２は比較例４，５．
６に比べて検量域、特異的結合及び交差率のいずれにつ
いても優れていることがわかる。

（以下余白） 表４ 大腸菌群の測定結果のまとめ Ｇ０発明の効果 本発明は大腸菌群を測定するに際し、大腸菌群以外の菌
で吸収した後アフィニティ精製した抗体を標識又は固相
抗体のいずれか一方に使用することにより、吸収した抗
体（比較例１．４）、アフィニティ精製した抗体（比較
例２，５）および未処理の抗体（比較例３，６）を固相
抗体とした場合に比べて、免疫学的測定の感度を上昇し
、大腸、菌群以外の菌との交差率を低下し、特異的結合
を増加する。

従って本発明に係る大腸菌群の免疫学的測定法によれば
、標識又は固相抗体のいずれか一方が未処理の抗体であ
っても、他方を吸収した後アフイニティ精製した抗体と
した使用する限り、目標感度の３Ｘ１０”個／ｍｌとい
う高い感度でしかも交差性が低い大腸菌群の測定を可能
とする。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第５図はそれぞれ標識抗体及び固相抗体とし
た大腸菌群以外の菌で吸収した後、アフィニティ精製し
た抗体を用いた大腸菌群の測定結果を示すグラフ、第２
図及び第６図はそれぞれ標識抗体及び固相抗体として大
腸菌群以外の菌で吸収した抗体を用いた大腸菌群の測定
結果を示すグラフ、第３図及び第７図はそれぞれ標識抗
体及び固相抗体としてアフィニチイ精製抗体を用いた大
腸菌群の測定結果を示すグラフ、第４図及び第８図はそ
れぞれ標識抗体及び固相抗体として未処理の抗体を用い
た大腸菌群の測定結果を示すグラフである。 外１名

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）大腸菌群を免疫して得られる抗体を前記大腸菌群
   以外の微生物で吸収した後、アフィニティ精製して標識
   又は固相抗体として用いることを特徴とする大腸菌群の
   免疫学的測定法。