JPH0484768A - 糖付加アルブミン測定方法および測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り産業上の利用分野］ 本発明は、糖尿病の管理、治療における血糖管理指標と
して臨床応用可能な検体中の糖付加アルブミンを測定す
る方法および測定用の試薬に関する。

［従来の技術］ キル硫酸またはアルキルスルホン酸の水可溶性塩類、ア
ルキル基で置換されてもよいアリールスルホン酸または
その水可溶性塩、炭素数２〜Ｉ８の２価の脂肪酸である
ことを特徴とする請求項第４項に記載の糖付加アルブミ
ン測定用試薬 ６）　脂肪酸と競合してアルブミンに結合する化合とに
より、過去の庇部レベルを比較的安定に測定することが
でき、血糖コントロールの指標として有効であることが
判明した。例えば、ヘモグロビンが糖と非酵素的に結合
しヘモグロビンＡ　＋、　Ａ　、ｅを形成することが発
表［Ｓ、ラーバー；クリニカキミ力　アクタ（Ｒａｈｂ
ａｒ　Ｓ、、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、１２
２、２９６〜２９８．１９６８］され、又アルブミンと
糖の結合した糖付加アルブミンの非酵素的糖化が発表［
Ｒ，ドルホファーら；フエブスレターズ（ＲＤｏｌｈｏ
ｆｅｒ　ａｎｄ　Ｏ，Ｈ，Ｗｉｅｌａｎｄ、　ＦＥＢＳ
　ＬＥＴＴＥＲ３１１０３、ＮＯ，２，２８２〜２８６
．１９７９）され臨床的意義付けがなされた。

更に、血清タンパク質と糖の結合した物質（フルクトサ
ミン）においては、ジョンソンらによって、その臨床的
意義付けおよび簡易測定方法が開発されている［Ｒ，Ｎ
、ジョンソンら；クリニヵキミ力　アクタ（Ｊｏｈｎｓ
ｏｎ　ＲＮ、　Ｍｅｔｃａｌｆ　ＰＡ、ＢａｋｅｒＪＲ
，、Ｃ１１ｎ、　（：ｈｉｍ、　　Ａｃｔａ、ｌ　　１
２７．８７〜９５．　１９８２］　。

アクタ（Ｈａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｃ１１ｎ、　
Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　１１４９、１３〜１９．１９
８５］を発表した。

林らの方法Ｃ以下、ｄｎｓ−ＰＢＡ法という）は、アル
カリ性においてｄｎｓ−ＰＢＡがアルブミンと結合する
ことにより、紫外線による励起後の放射が上昇し・且つ
極大波長が短波長にシフトする現象と、この時または、
その後にホウ酸が存在すると糖付加アルブミンの糖残基
に結合しているｄｎｓ−ＰＢＡのホウ酸残基の結合が切
断され、放射の強度が低下する現象を利用した測定方法
で液体カラムクロマト法、ラジオイムノアッセイ法等が
使用されているが、いずれも煩雑な操作を必要とするこ
とや、１検体当りの測定に時間を要する等の欠点がある
。

このような状況において、林らはＮ−（５−ジメチルア
ミノ−１−ナフタレインスルホニル）３−アミノベンゼ
ンホウＩｎ（ｄｎｓ−ＰＢＡ）を使用した簡便な方法〔
林ら；クリニヵ　キミヵｄｎｓ−ＰＢＡ・アルブミンの
蛍光強度（以下Ｆｂｏｒと略称する）との差（以下、Δ
Ｆと略称する）がアルブミンの糖付加の割合と比例する
ことを原理とした画期的方法である。

本法の反応液のｐＨは８．０以上で、好ましくは８．５
〜９，５である。

本法で使用するホウ酸化合物、又はシス−ジオール化合
物としては、ホウ酸あるいはソルビトールが用いられる
。

また、反応液のｐＨを維持するため適当な緩衝剤を使用
することが好ましく、Ｎ−２−ヒドロキシメチルピペラ
ジン−Ｎ゛　−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ”１
等のグツド緩衝剤を用いることができる。

［発明が解決しようとする課題］ 検体中には、通常遊離脂肪酸が０．２〜０．８ｍＭ、ま
たビリルビンやヘモグロビン等が共存するが、前記のｄ
ｏｓ−ＰＢＡ法は遊離脂肪酸、ビリ性のもと、Ｎ−５−
ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル）−３−ア
ミンベンゼンホウ酸（ｄｎｓ−ＰＢＡ）と反応させる測
定方法において、反応混合物中に遊離脂肪酸やビリルビ
ンと競合してアルブミンに結合する化合物を共存させる
ことにより、体液中共存の物質の干渉を除（ことを特徴
とする糖付加アルブミンの測定方法であり本発明によれ
ば個々の検体中に含まれる共存物質（特に遊離脂肪酸、
ビリルビン）に干渉されず。

より正確な血糖値モニタリングを行うことが可能の役割
を担っている物質により負の誤差を受ける傾向がある。

本発明は検体中に共存する物質（特に遊離脂肪酸）の干
渉を除き簡便にしかもより正確な糖付加アルブミンの測
定法及び測定試薬を提供するものである。

［課題を解決しようとするための手段ｊ本発明は、体液
中の糖付加アルブミンをアルカにその基礎的研究がなさ
れつつある。

非常に興味あるところは、アルブミンのどの部位が糖付
加され易いかであるが、ロバートらは５２５番目のりジ
ン残基が最も糖付加されると発表している［Ｌ、ロバー
トら；ジャーナル　オブバイオロジ力ル　ケミストリー
（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｌ、　ａｎｄ　Ｊ。

ｎａｔｈａｎ　Ｓ、　Ｍａｚｅｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、）　２５８．６１４：’−６１４６、１９
８３１゜ このことは、アルブミンのドメイン３の第９ループ上に
位置する５２５番目のリジンが糖化されそこにｄｎｓ−
ＰＢＡが結合した場合、ｄｎｓの入る疎水領域が遊離脂
肪酸（特に長鎖Ｃ１８以上がドメイン３の第フループの
領域に結合）の結合する疎水領域と一致するが、その近
傍に位置する可能性があることを示唆している。

従って、ａｎｓ−ＰＢＡ法は遊離脂肪酸により少なから
ず影響を受けると予想できる。

アルブミンからの脱脂操作は酸性側で活性炭をンに結合
する化合物を添加することで糖付加の定量性を損なわず
に、共存物質の影響もほとんど受けない測定系をみいだ
し、本発明に至った。

本発明に用いられる遊離脂肪酸やビリルビンと競合して
アルブミンに結合する化合物を例示すれば、２−クロル
フェノキシ酢酸、３−クロルフェノキシ酢酸、４−クロ
ルフェノキシ酢酸、２．４−ジクロルフェノキシ酢酸、
２．６−ジクロルフェノキシ酢酸、２，４．５−１リク
ロルフエノキシ酢酸、２−メチルフェノキシ酢酸、２．
４−ジＢｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、１２４２，１７−、１９
６７）で可能であるが、操作が煩雑で日常の検査ルーチ
ンでは使用できない。

本発明者はｄｎｓ−ＰＢＡ法の簡便さを損なうことなし
に、より正確な糖付加アルブミンの測定を可能にする方
法を検討した。

鋭意検討の結果、特許請求の範囲に示したように、遊離
脂肪酸やビリルビンと競合してアルブミ酸、２−クロル
フェノキシイソ酪酸、４−クロルフェノキシイソ酪酸８
酸もしくはこれらの塩類、エタン硫酸、プロパン硫酸、
ブタン硫酸、ペンタン硫酸、ヘキサン硫酸、ヘプタン硫
酸、オクタン硫酸、ノナン硫酸、デシル硫酸、ウンデシ
ル硫酸、ドデシル硫酸、トリデシル硫酸、テトラデシル
硫酸、ペンタデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸、ヘプタデ
シル硫酸、オクタデシル硫酸、エタンスルポン酸、プロ
パンスルホン酸、ブタンスルホン酸、ペンタンスルホン
酸、ヘキサンスルホン酸、ヘプタンスルホン酸、オクタ
ンスルホン酸、ノナンスルホン酸、デシルスルホン酸、
ウンデシルスルホン酸、ドデシルスルホン酸、トリデシ
ルスルホン酸、テトラデシルスルホン酸、ペンタデシル
スルホン酸、ヘキサデシルスルホン酸、ヘプタデシルス
ルホン酸、オクタデシルスルホン酸等の水溶性塩類、ベ
ンゼンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、ドデシル
ベンゼンスルホン酸、メチルベンこれらフェノキシ脂肪
酸、アルキル硫酸、アルキルスルホン酸、アリール硫酸
、アリールスルホン酸、または２価の脂肪酸の各々の水
溶性塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金
属類塩やアンモニウム塩等が挙げられる。

これらの遊離脂肪酸と競合してアルブミンに結合する化
合物は、１種類を用いてもよく、また２種以上を併用し
てもよい。

その測定系の添加量は、効果の強さによって異なるが、
検体に含有されている遊離脂肪酸の１０ベンゼンスルホ
ン酸、ナフタレンスルホン酸、メチルナフタレンスルホ
ン酸、ベンゼン−ｍ−ジスルホン酸、２，６−ナフタレ
ンジスルホン酸。

２．７−ナフタレンジスルホン酸等の水溶性塩、または
コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スペ
リン酸、アゼライン酸、セバシン酸ブラシル酸等の２価
の脂肪酸の水溶性塩が挙げられる。

は１〜１０ｙｎＭである。

本発明に用いられる、遊離脂肪酸やビリルビンと競合し
てアルブミンに結合する化合物の代表として４−クロル
フェノキシ酢酸（以下、ＣＰＡという）を添加した場合
の励起光波長３３０ｎｍでの放射光のスペクトルを第１
図に示すが、それによると、検体中の遊離脂肪酸に係わ
らずその極大に変化はなく安定したものであった・ 一方、ＣＰＡ無添加の場合のスペクトルを示した第２図
によれば、遊離脂肪酸高濃度（３，０ｍＭ）で極大が長
波長にシフトし、スペクトルが一定しない。

これら、遊離脂肪酸、ビリルビンの添加試験の結果から
通常の範囲であればこれらの物質の影響を受けないこと
も確認され、本発明にはかなりの優位性がみとめられる
。

［実施例］ 以下実施例を示す。

試薬−２ａ ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　Ｏ，１モル上記成
分を精製水に溶解し水酸化ナトリウムでｐＨ８，５に調
製後、精製水で全量１，０００ｍ１として調整した。

試薬−２ｂ ホウ酸　　　　　　　　　　　　０．１　　モル上記成
分を精製水に溶解し水酸化ナトリウムでｐＨ８，５に調
製後、精製水で全量１．ＯＯＯ＋ｎｌ試薬−１ ・Ｎ−２−ヒドロキシメチルピペラジン−Ｎ′−２−エ
タンスルホン酸ｆＨＥＰＥｓｌ　　　０．１　　モル・
ｄｎｓ−ＰＢＡ　　　　　　　　　　１．２ｕモル・４
−クロルフェノキシ酢酸（ＣＰＡＩ　　３　　ｍモル上
記成分を精製水に溶解、混合し水酸化ナトリウムでｐＨ
８，５に調製後、精製水で全量１，０００ｍ１として調
整した。

試薬−１ ・Ｎ−２−ヒドロキシメチルピペラジン−Ｎ′−２−エ
タンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）　　　０．１　　モル・
ｄ　ｎ　ｓ　−Ｐ　Ｂ　Ａ　　　　　　　　　１．２ｕ
モル・４−クロルフェノキシイソ酪酸　３１Ｔ１モル上
配成分を精製水に溶解、混合し水酸化ナトリウムでｐＨ
８，５に調製後、精製水で全量１，０００ｍ１として調
整した。

試薬−２ａ、並びに試薬−２ｂは実施例１と同様にして
調整した。

実施例３゜ 実施例１、実施例２で調整した本発明の試薬を用い、以
下の操作手順により測定した。尚、被検体には正常のプ
ール血清にオレイン酸ナトリウム（生体中の遊離脂肪酸
の代表例）を１７対３の開広の計算式により、アルブミ
ンの糖付加の割合を示すアルブミン１μＭ中のΔＦ値を
得、その結果を第１表に示す。

Ｌ豆ヱ △Ｆ　／　ｇ　Ｍ　Ｈ５Ａ　・（Ｆｈｅｐ　−Ｆｂｏｒ
　ｌ　／　Ｈ５Ａｃｏｎｃ（糖付加の度合はアルブミン
１分子あたりの放射強度で示される。） Ｆｈ、ｅｐ　　　″：試薬−２に試薬−２８を使用した
時の放射強度値。

検体２０μｍに試薬−１の４ｍｌを加え、撹拌後、２５
℃で５分間放置する。この反応混合物の各々１．５ｍｌ
に試薬−２ａ、または試薬−２ｂを１．５ｍｌ加え撹拌
後、２０℃で５分間放置し励起波長３３０ｎｍ、放射波
長５００ｎｍにて蛍光強度を測定する。尚、蛍光分光光
度計には高滓ＲＦ−５０００（■高滓製作所製）を使用
した。

Ｈ３Ａｃｏｎｃ　　：アルブミンの反応混合物中での最
終濃度。

同時に、従来法として実施例１の試薬−１の成分中のＣ
ＰＡを添加せず、他は同様にして調整した試薬を用い、
操作手順も放射波長５００ｎｍの代わりに４９０ｎｍで
測定する他は同様にして測定した結果を合わせて第１表
に示した。

第１表中のＦＦＡ／ＡＬＢ値は遊離脂肪酸濃度をアルブ
ミン濃度で割った値を表わし、検体中のアルブミン濃度
は、ブロムクレゾールパープル法（商品名、ＥＡテスト
　°栄研゛、栄研化学■製）にて測定し、遊離脂肪酸濃
度は、酵素法（商品名、ＮＥＦＡ−３Ｓ　’栄研°、栄
研化学■製）にて測定した。

以下余白 第１表の結果より、従来法においては遊離脂肪酸高濃度
では全く測定不能になるのに対し、本発明によれば、は
とんど干渉されず測定が正確になされていることが確認
された。

実施例４゜ 実施例１で調整した本発明の試薬、並びに実施第３図か
ら明らかなとうり、人の血清でもＦＦＡ／ＡＬＢ値が上
昇するに連れ本発明による方法と従来法との差は大きく
なり、その程度は第４図に示した添加試験の結果とほぼ
同様であった。

このことは、人の血清でも従来法が遊離脂肪酸の影響を
受けることを意味し、本発明による方法がより正確に測
定していることを支持するものである。

実施例５゜ 厘及び計算式により糖付加アルブミン値（ΔＦ／μＭ　
ＩＳＡ　）を算出し、その差を求めた。又、同検体の　
ＦＦＡ／ＡＬＢ値（実施例３と同様に測定）を測定した
。

両者の関係を第３図に示した。尚、縦軸は糖付加アルブ
ミン値、横軸はＦＦＡ／ＡＬＢ値を表す。

同様にして、実施例３で得られた結果についての関係を
第４図に示した。尚、縦軸は糖付加アルブミン値、横軸
は　ＦＦＡ／ＡＬＢ値を表す。

実施例１、実施例２で調整した本発明の試薬、並びに実
施例３に示した従来法の試薬により、以下の各被検体に
ついて、実施例３の操作手順により測定し、計算式によ
り糖付加アルブミン値（ΔＦ／μＭ　ＩＳＡ　）　を算
出した。その結果を第２表に示す。

被検体として正常人プール血清より、非アルブミン分画
を分離したものと、非糖付加アルブミン分画と糖付加ア
ルブミン分画とに分離したものを検体として用いた。非
アルブミン分画とアルブミン分画の分離は、チバクロン
ブルーによるアフィニティーカラム法〔Ｊ、トラビスら
；クリニカキミ力　アクタ　（Ｔｒａｖｉｓ　Ｊ、　ａ
ｎｄ　Ｐａｎｎｅｌｌ　Ｒ。

Ｃ１１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、１４９．４９〜５２．
１９７３］で行い、非糖付加アルブミン分画と糖付加ア
ルブミン分画の分離にはアミノフェニルホウ酸によるア
フィニティーカラム法［Ｎ、サクレイら；ジャーナル　
オＰ　バイオロジカル　ケミストリー　（Ｎｕｒｉｔｈ
Ｓｈａｋｌａｉ　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、）２５９，３８１２〜３８１７゜き・ １９８４］を使用した。

以下余白 第２表より、いずれの方法も非アルブミンおよび非糖付
加アルブミンをほとんど測り込まず糖付加アルブミンを
特異的に測定していることが確認された。

実施例６゜ 第３表 本発明の方法並びに従来法による各被検血清分画のΔＦ
／μＭ　Ｈ５，Ａ値測定結果実施例１で調整した本発明
の試薬、並びに実施例３に示した従来法の試薬により、
以下のジタウ加アルブミン値（ΔＦ／μＭ　Ｈ５Ａ　）
を算出した。

その結果を第３表に示す。

被検体として正常の人プール血清にジタウロビリルビン
を１７対３の割合で混合し、ジタウロビリルビンの添加
終濃度０．ｍｇ／ｄ１　、　１５ｍｇ／ｄｉ　、　３０
　ｍｇ／ｄｉ　、　４５　ｍｇ／ｄｉとなるように調製
したものを検体として用いた。

以下余白 第３表より、従来法は低濃度ビリルビンではほとんど干
渉されないが、高濃度においては本発明による方法は干
渉が小さく、より正確な測定をしていることが確認され
た。

［発明の効果Ｊ 以上説明したように本発明の測定方法、並びに測定用試
薬によれば、検体中の共存物質の干渉を抑制し、検体間
の誤差を著しく低減させることができるため、検体中の
糖付加アルブミン濃度を正標（過去２週間前後）として
好適であることから臨床的意義の大きい測定が実施でき
る。

又、本発明の方法は迅速且つ簡便であるため日常検査に
適用できる実用性の高い優れたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３で行った本発明による方゛法の遊離脂
肪酸添加の有無での放射スペクトルを示し、第２図は実
施例３で行った従来法の遊離脂肪酸添加の有無での放射
スペクトルを示している。 本発明法は遊離脂肪酸の濃度に係わらず一定の波長に極
大があり安定してることを示している。 第３図は実施例４で行った本発明による方法と従来法の
糖化アルブミン個差とＦＦＡ／　ＡＬＢ（ａとの関係を
示し、第４図は実施例３で行った本発明による方法（実
施例１の試薬使用）と従来法の糖化アルブミン個差とＦ
ＦＡ／ＡＬＢ値の関係を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）体液中の糖付加アルブミンをアルカリ性のもとＮ−
   （５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル）−
   ３−アミノベンゼンホウ酸（以下、ｄｎｓ−ＰＢＡと略
   称する）と反応させる測定方法において、反応混合物中
   に遊離脂肪酸やビリルビンと競合してアルブミンに結合
   する化合物を共存させることを特徴とする糖付加アルブ
   ミンの測定方法 ２）遊離脂肪酸やビリルビンと競合してアルブミンに結
   合する化合物が下記一般式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１〜Ｒ＿５は水素、ハロゲン、ヒドロキシル
   基、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基の
   群より選ばれ、重複してもよい。Ｒ＿６は分岐してもよ
   い炭素数１〜１０の脂肪酸を表す）で示されることを特
   徴とする請求項第１項に記載の測定方法 ３）遊離脂肪酸やビリルビンと競合してアルブミンに結
   合する化合物が、炭素数２〜１８のアルキル硫酸または
   アルキルスルホン酸の水可溶性塩類、アルキル基で置換
   されてもよいアリールスルホン酸またはその水可溶性塩
   、炭素数２〜１８の２価の脂肪酸であることを特徴とす
   る請求項第１項に記載の測定方法 ４）下記ａ）〜ｄ）の化合物を、単独あるいは複数組み
   合わせて含むことを特徴とする糖付加アルブミン測定用
   試薬： ａ）ｄｎｓ−ＰＢＡ ｂ）ホウ酸化合物、又はシス−ジオール化合物 ｃ）緩衝剤 ｄ）下記一般式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１〜Ｒ＿５は水素、ハロゲン、ヒドロキシル
   基、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基の
   群より選ばれ、重複してもよい。Ｒ＿６は分岐してもよ
   い炭素数１〜１０の脂肪酸を表す）で示される脂肪酸と
   競合してアルブミンに結合する化合物 ５）遊離脂肪酸やビリルビンと競合してアルブミンに結
   合する化合物が、炭素数２〜１８のアルキル硫酸または
   アルキルスルホン酸の水可溶性塩類、アルキル基で置換
   されてもよいアリールスルホン酸またはその水可溶性塩
   、炭素数２〜１８の２価の脂肪酸であることを特徴とす
   る請求項第４項に記載の糖付加アルブミン測定用試薬 ６）脂肪酸と競合してアルブミンに結合する化合物濃度
   が０．０１ｍＭ〜５０ｍＭであることを特徴とする請求
   項第４項に記載の糖付加アルブミン測定用試薬