JPH0484899A

JPH0484899A - 核酸測定法

Info

Publication number: JPH0484899A
Application number: JP19627590A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Yamagishi; 裕明山岸
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1990-07-26
Filing date: 1990-07-26
Publication date: 1992-03-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、核酸ハイブリダイゼーションをより効果的に
実施するための方法に関するものであり、従って例えば
サンドイッチハイブリダイゼーションを利用した核酸の
測定等に好適な方法に関するものである。

（従来技術とその課８）核酸ハイブリダイゼーションを利用して、特定の塩基配
列を有する核酸プローブを使用することでこの特定の塩
基配列と相補的な塩基配列部分を有する核酸を測定する
ことが可能である。

従来の核酸プローブを用いた核酸測定法には、フィルタ
ーハイブリダイゼーション、液相ハイブリダイゼーショ
ン、サンドイッチハイブリダイゼーション等が挙げられ
る（ＤＮＡプローブ、ＣＭＣ出版等参照）。

サンドイッチハイブリダイゼーション測定法では、識別
しようとする標的核酸に相補的な核酸プローブを少なく
とも２種使用する。一方の核酸プローブは固相に結合さ
せて捕捉または捕獲試薬として使用しく以下捕捉プロー
ブと呼ぶ）、もう一方の核酸プローブは標識して検出用
試薬として使用する（以下標識プローブと呼ぶ）。標識
プローブの標識には、ラジオアイソトープ、螢光色素、
酵素などが用いられる。ハイブリダイゼーション溶液に
、変性した核酸を含む試料と捕捉プローブ、標識プロー
ブを一緒にあるいは順次に加えてサンドイツチハイブリ
ダイゼーションさせることが出来る。試料中に標的核酸
が存在すれば捕捉プローブ・・・標的核酸・・・標識プ
ローブの様に３者が結合したハイブリッド体が形成され
る。次にハイブリッド体とハイブリッド体を形成しなか
った遊離の核酸断片および遊離の標識プローブを分離す
る。捕捉プローブがフィルターに固定化されている場合
は、フィルターを洗浄溶液中で洗浄することができる。

捕捉プローブがゲルに固定化されている場合は、ゲルを
フィルター上で濾過するか、または遠心により集めて遊
離の標識プローブと分離することが出来る。分離後ハイ
ブリッド体に含まれる標識の量を計測することにより標
的核酸の量を求めることが出来る。

他にも、例えば試料核酸を適当な固相に結合させ、標識
プローブをこれに加えた後に洗浄し、標識プローブとハ
イブリッド体を形成する標的核酸が存在するか否かを測
定する方法もあるが、試料核酸を固相に結合させる等の
前処理の容易さ、バックグラウンドの低減化が可能であ
るという側面から、サンドイッチハイブリダイゼーショ
ン測定法がより高感度化に適すると考えられている。

以上のような測定法では、試料として動物細胞例えば白
血球細胞、腎細胞、肝細胞等、また細菌、ウィルス等の
微生物、さらには植物細胞等の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）
を使用する。これらの試料からフェノール法、チオシア
ン酸グアニジン法等を用いて核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を
抽出することができる（生化学実験講座−核酸の化学２
、東京化学同人）。

しかし、この様な方法で抽出した試料をそのまま用いた
場合、標的核酸が数キロから数百キロベースと長いため
、ハイブリッド体（捕捉プローブ・・・標的核酸、捕捉
プローブ・・・標的核酸・・・標識プローブ）の形成に
数時間から十数時間かかり、結果を得るまでに長い時間
を要し、しかも感度が上がらないという課題がある。

（課題を解決するための手段）本発明者は、従来技術にみられる課題を解決すべく鋭意
研究を行った結果、試料に含まれる核酸に超音波処理を
施すことにより、ハイブリッド体（捕捉プローブ・・・
標的核酸、捕捉プローブ・・・標的核酸・・・標識プロ
ーブ）の形成が数分から１時間以内で行われることを見
出した。

即ち本発明は、核酸ハイブリダイゼーションの試料とし
て超音波処理を施した核酸を用いることを特徴とする方
法である。以下本発明の詳細な説明する。

超音波処理により核酸は数百ベースから数キロベースに
細断されるので、細断された核酸断片に捕捉プローブ及
び／又は標識プローブがハイブリダイズするように塩基
配列を選択することが必要である。長さが数百ベースの
核酸を試料とする場合には、元来ハイブリッド体の形成
効率が良いので超音波をかけても、数キロから数百キロ
ベースの核酸に超音波をかけた場合より効果は小さいか
ら、本発明は好ましくは数キロベースの核酸を対象とす
るものである。

サンドイッチハイブリダイゼーションにおいては、捕捉
プローブと標識プローブの間が離れているとその間で超
音波処理により裁断されてしまいハイブリッド体（捕捉
プローブ・・・標的核酸・・・標識プローブ）が形成さ
れなくなる可能性があるため、捕捉プローブと標識プロ
ーブの認識部位の間を近くしておくと良い。標的核酸の
捕捉プローブに相補的な部分と標識プローブに相補的な
部分の間の距離が数キロベース以内であることが好まし
く、より好ましくは数百ベース以内である。また測定に
おいて感度を上昇させるには、１種の捕捉プローブと２
種以上の標識プローブを組み合わせたり、数種の捕捉プ
ローブと数種の標識プローブを組み合わせると良い。

本発明は、サンドイッチハイブリダイゼーション測定法
のみに適用するものではなく、標識プローブのみを使用
するハイブリダイゼーション測定法等に対しても適用す
ることが出来る。また、その他の測定法であっても、核
酸と核酸のハイブリダイゼーションを伴うものであれば
制限はない。

超音波処理は、ヒートシステム　ウルトラソニツクス　
（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ
）　、トミー（Ｔｏｗｙ）、ラピデイス（Ｒａｐｉｄｉ
ｓ）　、レイセオン（Ｒａｙｔｈｅｏｎ）、ムラルド（
Ｍｕｌｌａｒｄ）およびブランソン（ＢＲＡＮＳＯＮ）
等の市販の装置を使用して行なうことが出来る。なお、
入手可能な市販の超音波処理装置には次の２つのモード
の内のどちらかか使われている。即ち、■振動プローブ
の試料内への直接浸せき、■試料を包含する容器の振動
トランスデユーサ−の接触した浴内への浸せきである。

第一モードは、試料から試料へと試料の持越しを招くと
いう点で不都合であり、従って臨床試験のために本発明
を実施する場合には課題がある。第二モードを使用する
と、浴内の液体は容器内の試料に超音波振動を伝達する
ために働くと共に、また試料温度を冷却や制御するため
にも役立つので第二モードを使用することが好ましい。

本発明の試料核酸としては、動物細胞例えば白血球細胞
、腎細胞、肝細胞等、また細菌、ウィルス等の微生物、
さらには植物細胞等から抽出した核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ
）を例示することが出来るが、核酸未抽出の細胞等に直
接超音波処理を施しても良い。

本発明の核酸ハイブリダイゼーションで使用する捕捉プ
ローブ及び／又は標識プローブは、化学合成によって合
成されるので合成収率および標的核酸への特異性を考慮
すると１００塩基以内の長さの合成りＮＡで良い。捕捉
プローブ又は標的核酸等を固定化する固相としては、フ
ィルターやゲルを用いることが出来る。標識プローブの
標識には、ラジオアイソトープ、螢光色素、酵素などを
用いることが出来る。

以下に、試料核酸を溶液中で超音波処理を施すことによ
り核酸を核酸断片化する工程を組み込んだサンドイッチ
ハイブリダイゼーション測定法について詳述する。

（１）試料核酸を溶液中で超音波処理を施すことにより
核酸を核酸断片に断片化する工程（以下ａとする）の際
、試料核酸を熱あるいは変性剤処理により一本鎖核酸に
変換する。変性は工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時
にまたは工程（ａ）の後に行えば良い。変性剤として水
酸化ナトリウム、ホルムアミドなどを用いることが出来
る。

次に該核酸断片を、捕捉プローブとと接触させる工程（
以下すとする）を行う。試料中に標的核酸が存在すれば
捕捉プローブ・・・標的核酸の様に三者が結合したハイ
ブリッド体が形成される。

次に捕捉プローブに捕捉されなかった核酸断片を除去す
る第１の洗浄工程（ｃ）を行う。捕捉プローブがフィル
ターに固定化されている場合は、フィルターを洗浄溶液
中で洗浄することができる。

捕捉プローブがゲルに固定化されている場合は、ゲルを
フィルター上で濾過するか、または遠心により集めて捕
捉プローブに捕捉されなかった遊離の核酸断片と除去す
ることが出来る。

次に捕捉プローブに捕捉された核酸断片を、標識プロー
ブと接触させる工程（以下ｄとする）を行い、捕捉プロ
ーブ・・・標的核酸・・・標識プローブの様に三者が結
合したｌ＼イブリッド体を形成させる。

次にハイブリッド体を形成しなかった遊離標識プローブ
を洗浄する第２の洗浄工程（以下ｅとする）を第１の洗
浄工程（ｃ）と同様に行う。

最後に標識の存在を直接的あるいは間接的に検出する工
程（以下ｆとする）を行う。

（２）（ａ）の工程及びその際の変性については、前述
の（１）と同様である。次に該核酸断片を、捕捉プロー
ブと一定時間接触させた後、標識プローブと接触させる
工程（ｂ゛）を行い、ノ＼イブリッド体（捕捉プローブ
・・・標的核酸・・・標識プローブ）を形成させる。

次に捕捉プローブに捕捉されなかった核酸断片および捕
捉されなかった標識プローブを除去する第１の洗浄工程
（Ｃ′）を行う。捕捉プローブがフィルターに固定化さ
れている場合は、フィルターを洗浄溶液中で洗浄するこ
とができる。捕捉プローブがゲルに固定化されている場
合は、ゲルをフィルター上で濾過するか、または遠心に
より集めて捕捉プローブに捕捉されなかった遊離の核酸
断片及び標識プローブを除去することが出来る。

最後に標識の存在を直接的あるいは間接的に検出する工
程（ｆ）を行う。

（３）（ａ）の工程及びその際の変性については、前述
の（１）と同様である。次に該核酸断片に捕捉プローブ
および標識プローブを同時に接触させる工程（ｂ′）を
行い、ハイブリッド体（捕捉プローブ・・・標的核酸・
・・標識プローブ）を形成させる。

（４）工程（ａ）及びその際の変性については、前述の
（１）と同様であるが、これらの工程を補足プローブ及
び標識プローブの存在下で行なう。ただし、標識プロー
ブの標識に、螢光色素、酵素を用いた場合は、核酸変性
の際に施す熱あるいは変性剤により分解または失活しな
い条件を選択する。次に捕捉プローブに捕捉されなかっ
た核酸断片および捕捉されなかった標識プローブを除去
する第１の洗浄工程（ｃ）を行う。捕捉プローブがフィ
ルターに固定化されてしする場合１ｉ、フィルターを洗
浄溶液中で洗浄することかできる。

捕捉プローブがゲルに固定化されている場合は、ゲルを
フィルター上で濾過するか、または遠心により集めて捕
捉プローブに捕捉されなかった遊離の核酸断片及び標識
プローブを除去することが出来る。

最後に標識の存在を直接的あるいは間接的１こ検出する
工程（ｆ）を行う。

（発明の効果）本発明によりハイブリッド体（捕捉プローブ・・・標的
核酸、捕捉プローブ・・・標的核酸・・・標識プローブ
）を形成する時間を短縮することが出来る。

これによりサンドイッチハイブリダイゼーション測定等
の、核酸ハイブリダイゼーションを利用する測定法等を
より効率的に実施することが可能となる。即ち、このよ
うな測定においてハイブリッドを形成する時間が短縮さ
れれば一定時間に処理出来る検体（試料）を増加させる
ことが可能である。

また、本発明によればハイブリッド体の形成効率が上昇
するから、核酸ハイブリダイゼーションを利用した核酸
の測定法における感度の上昇を達成することも可能とな
る。

（実施例）以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１゜ ■超音波によるプラスミツドＤＮＡの断片化試料として
Ｂ型肝炎ウィルスを組み込んだプラスミツドＤ　Ｎ　Ａ
　Ｃｐｌａｓｍｊｄ　Ｈｅｐａｔｊｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒ
ｕｓ　。

以下ｐＨＢＶと略する；　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ
、ＬＩＳＡ、７８巻２６０２−２６１０頁、１９８１年
）を使用した。ｐＨＢＶは７．６キロベースの環状ＤＮ
Ａである。

純水２０ｕｌにｐ　ＨＢ　Ｖ　８００ｎｇを含む溶液を
微量遠心チューブに分注後、水酸化ナトリウム水溶液（
０，６Ｍ）を２０ｕ１加え二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡ
に変性した。上記の微量遠心チューブをヴエルヴオソニ
ック超音波洗浄器（ＶＳ−２０型、本多電子（株）製、
定格消費電力３２ワツト、定格周波数５０／６０ヘルツ
）で常温、１分間超音波処理をした。なお、１％アガロ
ース電気泳動を行なった結果、２００から４００ベース
のＤＮＡ断片に細断されていることが確認された。

■サンドイッチハイブリダイゼーション測定■で調製し
たｐＨＢＶ断片を捕捉プローブ及び標識プローブに接触
させサンドイッチハイブリダイゼーション測定を行った
。

ｐＨＢＶに対する捕捉プローブ（合成りＮＡ。

２１ｍｅ　ｒ、５−−ＴＧＴＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＣ
ＣＣＣＡＡＴ−３−）を固定化したゲル（非多孔質担体
Ｎ　Ｐ　Ｒ、２、５ｕｍ、東ソー（株）製）１ｍｇを、
５０℃に加温したハイブリダイゼーション緩衝液（Ｎａ
ＣＩ　７５ｏｍＭ、５ｏｄｉｕｌｌｃｉｔｒａｔｅ　ｄ
ｉｈｙｄｒａｔｅ　７５ｍＭ、Ｂｏｖｊｎｅ　ｓｅｒｕ
ＩＩｌａｌｕｂｕｍｉｎ　０．５％、Ｐｏ１ｙｖｊｎｙ
ｐｙｒｏｌｊｄｏｎｅ　０．５％、Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏ
ｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ　１％）に懸濁し、■で調
製したｐＨＢＶ断片を２Ｍ　Ａｔｐｍｎｉｕｇ　Ａｃｅ
ｔａｔｅで中和後、ｐＨＢＶ断片を１ｏｏｐｇ　〜１１
００ｎ加え１０分間反応させた。１０分後この混合液に
アルカリフォスファターゼで標識した標識プローブ（合
成りＮＡ部分、２１ｍｅｒ、５−−ＱＧＴＡＡＣＡＧＣ
ＧＧＴＡＴＡＡＡＧＧＧＡＣ３′、捕捉プローブと９ベ
ース離れている）を加えさらに５０℃、１０分間ハイブ
リダイズさせた。

次に遊離の標識プローブを分離するために、混合物を遠
心（遠心機ＭＲ−１５０＜トミー社（株）製））シゲル
を沈降させ上滑を捨てた。ゲルを５０℃に加温した洗浄
液（ＫＳＣＮ　０．１５Ｍ、Ｓｏｄｉｕｍ　ｃｕｒａｔ
ｅ　ｄＩｈｙｄｒａｔｅ　１５５Ｍ、　Ｔｖｅｅｎ２Ｄ
　１％）に懸濁し、再び遠心しゲルを沈降させ上清を捨
てた。この洗゛浄操作を５回繰り返した。さらにゲルを
酵素反応用緩衝液（２−Ａｍｊｎｏ−２−ｎｅｔｈｙｌ
−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ　０゜５Ｍ、　ｐＨ９，０）、
に懸濁し、懸濁液に同緩衝液に溶解したアルカリフォス
ファターゼの蛍光基質（４−メチルウンベリフェリル−
ホスフェート、２１Ｍ）溶液を等量加え蛍光基質の分解
速度を３７℃で測定した（ＡＩＡ−１２００（東ソー（
株）製））。

結果を図１に示す。

比較例１゜超音波処理の効果をみるため、対照として超音波処理を
していないｐＨＢＶについて実施例１と同様の実験を行
った。図１に結果を示す。

図１によれば、超音波処理したｐＨＢＶをサンプルとし
た方が未処理のものより蛍光基質の分解速度が１０倍以
上早く、また分解速度もサンプル量依存性が良いことが
分かる。

実施例２゜実施例１で調製したｐＨＢＶ断片を捕捉プローブ及び３
種類の標識プローブに別々に接触させサンドイッチハイ
ブリダイゼーション測定を行った。

捕獲プローブ、ゲル、ハイブリダイゼーション緩衝液、
洗浄液等は実施例１同様のものを使用した。

ｐＨＢＶに対する捕捉プローブを固定化したゲル１ｍｇ
を、５０℃に加温したハイブリダイゼーション緩衝液に
懸濁し、実施例１で調製したｐＨＢＶ断片を２Ｍ　Ａｍ
ｍｎｉｕｍ　Ａｃｅｔａｔｅで中和後、ｐＨＢＶ断片を
１１００ｎ加え１０分間反応させた。１０分後この混合
液にアルカリフォスファターゼで標識した標識プローブ
１、標識プローブ２、標識プローブ３を別々に加えさら
に１０分間反応させた。

標識プローブは以下の通りである。

標識プローブ１（合成りＮＡ部分、２１ｍｅｒ、５−−
ＴＧＧＣＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＣＡ−３−１
捕捉プローブと６５ベース離れている）標識プローブ２（合成りＮＡ部分、２１ｍａｒ。

５　″　−ＧＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴ
Ｔ−３−１捕捉プローブと２７７ベース離れている）標識プローブ３（合成りＮＡ部分、２１ｍｅｒ。

５＝−ＡＴＴＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＧＡ−
３−１捕捉プローブと４７９ベース離れている）次に遊離の標識プローブを分離するために、混合物を遠
心しゲルを沈降させ上清を捨てた。ゲルを５０℃に加温
した洗浄液に懸濁し、再び遠心しゲルを沈降させ上清を
捨てた。この洗浄操作を５回繰り返した。実施例１と同
様にさらにゲルを酵素反応用緩衝液に懸濁し、蛍光基質
溶液を等量加え蛍光基質の分解速度を３７℃で測定した
。

結果を図２に示す。捕捉プローブと標識プローブ間の距
離が離れるに従い蛍光基質の分解速度が落ちていること
が分かる。

実施例３゜ ■超音波によるプラスミツドＤＮＡの断片化試料として
ヒトのウロキナーゼ遺伝子を組み込んだプラスミツドＤ
ＮＡ　（以下ｐＳＶ２ＵＫと略す；　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、　５２（２）巻、３２９−３３８頁、
１９８８年）を使用した。ｐＳＶ２ＵＫは約６キロベー
スの環状ＤＮＡである。

純水２０ｕ１にｐ　Ｓ　Ｖ　２　Ｕ　Ｋ　４００ｎｇを
含む溶液を微量遠心チューブに分注後、水酸化ナトリウ
ム水溶液（０，６Ｍ）を２０ｕ！加え二本鎖ＤＮＡを一
本鎖ＤＮＡに変性した。上記の微量遠心チューブを実施
例１と同様に常温、１分間超音波処理をした。

なお、１％アガロース電気泳動を行なった結果、２００
から４００ベースのＤＮＡ断片に細断されていることが
確認された。

■サンドイッチハイブリダイゼーション測定■で調製し
たｐＳＶ２ＵＫ断片を捕捉プローブ及び標識プローブに
接触させ、サンドイッチハイブリダイゼーション測定を
実施例１と同様に行った。

ｐＳＶ２ＵＫに対する捕捉プローブ（合成りＮＡ、　　
２１ｍａｒ、　　５−−ＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＴ−
ＴＧＣＧＧＣＣＡ−３−）を固定化したゲル１１１ｇを
、５０℃に加温したハイブリダイゼーション緩衝液に懸
濁し、■で調製したｐＳＶ２ＵＫ断片を２Ｍ＾ｍｍｍｎ
１ｕ　Ａｃｅｔａｔｅで中和後、ｐＳＶ２ＵＫ断片を１
００ｐｇ−１１００ｐ加え１０分間反応させた。

１０分後この混合液にアルカリフォスファターゼで標識
した標識プローブ（合成りＮＡ部分、２１ｍｅｒ、５−
−ＴＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＡＣＴ−３−
１捕捉プローブと４９ベース離れている）を加えさらに
５０℃、１０分間ハイブリダイズさせた。次に遊離の標
識プローブを分離するために、混合物を遠心しゲルを沈
降させ上滑を捨てた。ゲルを５０℃に加温した洗浄液に
懸濁し、再び遠心しゲルを沈降させ上清を捨てた。

この洗浄操作を５回繰り返した。実施例１と同様にさら
にゲルを酵素反応用緩衝液に懸濁し、蛍光基質溶液を等
量論え蛍光基質の分解速度を３７℃で測定した。

結果を図３に示す。

比較例２゜超音波処理の効果をみるため、対照として超音波処理を
していないｐＳＶ２ＵＫについて実施例３と同様の実験
を行った。

図３に実験結果を示す。図３によれば、超音波処理した
ｐＳＶ２ＵＫをサンプルとした方が未処理のものより蛍
光基質の分解速度が１０倍以上早く、また分解速度もサ
ンプル量依存性が良いことが分かる。

図２は実施例２の測定結果を示すものである。

縦軸は図１同様、蛍光基質の分解速度を示し、横軸は捕
捉プローブと標識プローブ間の距離を示す。

図３は実施例３と比較例２の測定結果を示すものである
。縦軸は図１同様、蛍光基質の分解速度を示し、横軸は
試料として加えたサンプルｆｆ１（ｐＳＶ２ＵＫｊ；ｔ
）を示す。実線は超音波処理したｐＳＶ２ＵＫをサンプ
ルとした場合の検量線、破線は未処理の場合の検量線を
示す。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１及び比較例１の測定結果を示すものであ
る。縦軸は標識プローブのアルカリフォスファターゼに
より蛍光基質（４−メチルウンベリフェリル−ホスフェ
ート）の分解速度を示し、横軸は試料として加えたサン
プル量（′ｐＨＢｖｊｌ）を示す。実線は超音波処理し
たｐＨＢＶをサンプルとした場合の検量線、破線は未処
理の場合の検量線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）核酸ハイブリダイゼーションの試料として超音波
処理を施した核酸を用いることを特徴とする方法。