JPH0486558A - 抗体の検出方法及び試験片 - Google Patents
抗体の検出方法及び試験片Info
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- JPH0486558A JPH0486558A JP2201860A JP20186090A JPH0486558A JP H0486558 A JPH0486558 A JP H0486558A JP 2201860 A JP2201860 A JP 2201860A JP 20186090 A JP20186090 A JP 20186090A JP H0486558 A JPH0486558 A JP H0486558A
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- JP
- Japan
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- antigens
- component
- electrophoresis
- mixed
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、被検試料中の抗体を検出する方法及び該方法
に用いられる試薬に関する。
に用いられる試薬に関する。
［従来の技術］
ウェスタンプロット法（以下ＷＢ法ということがある）
は、抗原であるタンパク質をゲル電気泳動で分画した後
、電気泳動パターンを維持したまま分画されたタンパク
質をニトロセルロース膜のような担体上に転写し、次い
で抗体を反応させて担体上の抗原と結合した抗体を検出
し、被検試料中の抗体がどの抗原に特異的に反応したか
を調べる方法であり、感度が高いので感染症の血清学的
診断、作製した抗体の特異性の決定あるいは遺伝子工学
的に生産した産物の同定等のために広く用いられている
技術である。
は、抗原であるタンパク質をゲル電気泳動で分画した後
、電気泳動パターンを維持したまま分画されたタンパク
質をニトロセルロース膜のような担体上に転写し、次い
で抗体を反応させて担体上の抗原と結合した抗体を検出
し、被検試料中の抗体がどの抗原に特異的に反応したか
を調べる方法であり、感度が高いので感染症の血清学的
診断、作製した抗体の特異性の決定あるいは遺伝子工学
的に生産した産物の同定等のために広く用いられている
技術である。
例えば、後天性免疫不全症候群ウィルス（ＨＩ Ｖ）や
ヒト成人Ｔ細胞白血病つィルス■型（ＨＴＬＶ−１＋に
感染しているか否かもＷＢ法を用いて調べられている。
ヒト成人Ｔ細胞白血病つィルス■型（ＨＴＬＶ−１＋に
感染しているか否かもＷＢ法を用いて調べられている。
これらの方法では、先ず、ウィルスをイオン性あるいは
非イオン性界面活性剤等で部分分解したものを抗原とし
てゲル電気泳動にかける。ウィルスはコアタンパク質や
エンベロープタンパク質のような複数のタンパク質を含
んでいるので、上記抗原は混合抗原であり、それぞれの
抗原はその分子量や電荷に基づいて電気泳動により分画
される。次いで、抗原の電気泳動パターンを維持したま
ま抗原をニトロセルロースフィルターのような担体上に
転写し、これと被検試料中の抗体とを反応させ、抗原と
結合した抗体を検出し、それによって特定の抗原に結合
する抗体の存否を調べる。ウィルスのどの成分抗原と結
合する抗体が試料中に存在するかを知ることは、偽陽性
を排除して的確な診断を行なうために重要である。
非イオン性界面活性剤等で部分分解したものを抗原とし
てゲル電気泳動にかける。ウィルスはコアタンパク質や
エンベロープタンパク質のような複数のタンパク質を含
んでいるので、上記抗原は混合抗原であり、それぞれの
抗原はその分子量や電荷に基づいて電気泳動により分画
される。次いで、抗原の電気泳動パターンを維持したま
ま抗原をニトロセルロースフィルターのような担体上に
転写し、これと被検試料中の抗体とを反応させ、抗原と
結合した抗体を検出し、それによって特定の抗原に結合
する抗体の存否を調べる。ウィルスのどの成分抗原と結
合する抗体が試料中に存在するかを知ることは、偽陽性
を排除して的確な診断を行なうために重要である。
従来のこのようなＷＢ法では、混合抗原が電気泳動によ
り明確に分離される場合はよいが、２種以上の抗原の移
動度が近接しているために電気泳動のバンドがほとんど
重なってしまうような場合には、抗体がどちらの抗原と
結合しているのが判定に苦しむことになる。混合抗原中
のある成分抗原の量が他の抗原に比べて少ない場合も同
様である。例えば、ＨＴＬＶ−Ｉウィルスに感染してい
るが否かの診断において、エンベロープ（ｅｎｖｌタン
パク質の１つであるｇｐ４６は、診断上重要な抗原であ
るが、その電気泳動の移動度がコアタンパク質であるＰ
５３の移動度と近接しているため、電気連動によっては
Ｐ５３と明瞭に分画されない。従って、従来のＷＢ法に
よってＨＴＬＶ−Ｉウィルスの感染を調べる場合に、抗
ｇｐ４６抗体の存否を明瞭に判定することが困難であり
、ひいてはＨＴＬ〜Ｉウィルスに感染しているか否かの
判定も困難になっている。
り明確に分離される場合はよいが、２種以上の抗原の移
動度が近接しているために電気泳動のバンドがほとんど
重なってしまうような場合には、抗体がどちらの抗原と
結合しているのが判定に苦しむことになる。混合抗原中
のある成分抗原の量が他の抗原に比べて少ない場合も同
様である。例えば、ＨＴＬＶ−Ｉウィルスに感染してい
るが否かの診断において、エンベロープ（ｅｎｖｌタン
パク質の１つであるｇｐ４６は、診断上重要な抗原であ
るが、その電気泳動の移動度がコアタンパク質であるＰ
５３の移動度と近接しているため、電気連動によっては
Ｐ５３と明瞭に分画されない。従って、従来のＷＢ法に
よってＨＴＬＶ−Ｉウィルスの感染を調べる場合に、抗
ｇｐ４６抗体の存否を明瞭に判定することが困難であり
、ひいてはＨＴＬ〜Ｉウィルスに感染しているか否かの
判定も困難になっている。
［発明が解決しようとする問題、屯］
従って、本発明の目的は、混合抗原中の２以上の成分抗
原の電気泳動移動度が近接している場合又は混合抗原中
の少な（とも１つの成分抗原の量が他の抗原に比べて少
ない場合等であっても、そのような成分抗原に対して特
異的な抗体が被検試料中に存在するか否かを明確に知る
ことができる抗体の検出方法及びそのための試薬を提供
することである。
原の電気泳動移動度が近接している場合又は混合抗原中
の少な（とも１つの成分抗原の量が他の抗原に比べて少
ない場合等であっても、そのような成分抗原に対して特
異的な抗体が被検試料中に存在するか否かを明確に知る
ことができる抗体の検出方法及びそのための試薬を提供
することである。
［問題点を解決するための手段］
本願発明者らは、鋭意研究の結果、このような他の成分
抗原と電気泳動移動度が近接している抗原（以下、移動
度近接抗原ということがある）や量の少ない抗原（以下
、少量抗原ということがある）を精製濃縮したものを、
電気ン水動の途中で加えることにより上記問題点を解決
することができることを見出し本発明を完成した。
抗原と電気泳動移動度が近接している抗原（以下、移動
度近接抗原ということがある）や量の少ない抗原（以下
、少量抗原ということがある）を精製濃縮したものを、
電気ン水動の途中で加えることにより上記問題点を解決
することができることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、混合抗原をゲル電気泳動にかける
工程と、混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲルに
加え、さらに電気泳動を続ける工程と、電気泳動パター
ンを維持したまま、電気泳動により分離された抗原を担
体に転写する工程と、担体上に転写された抗原と被検試
料中に含まれる、前記混合抗原に対する抗体とを反応さ
せる工程と、抗原と結合した抗体を検出する工程とを含
む、被検試料中の抗体の検出方法を提供する。
工程と、混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲルに
加え、さらに電気泳動を続ける工程と、電気泳動パター
ンを維持したまま、電気泳動により分離された抗原を担
体に転写する工程と、担体上に転写された抗原と被検試
料中に含まれる、前記混合抗原に対する抗体とを反応さ
せる工程と、抗原と結合した抗体を検出する工程とを含
む、被検試料中の抗体の検出方法を提供する。
さらにまた、本発明は、混合抗原をゲル電気泳動にかけ
、次いで混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲルに
加えてさらに電気泳動を続け、電気泳動パターンを維持
したまま電気泳動により分離された抗原を担体に転写し
たものから成る、被検試料中の前記混合抗原に対する抗
体を検出するための試薬を提供する。
、次いで混合抗原中の成分である成分抗原を上記ゲルに
加えてさらに電気泳動を続け、電気泳動パターンを維持
したまま電気泳動により分離された抗原を担体に転写し
たものから成る、被検試料中の前記混合抗原に対する抗
体を検出するための試薬を提供する。
［発明の効果］
本発明により、混合抗原中の２種以上の成分抗原の電気
泳動移動度が近接している場合又は混合抗原中の少なく
とも】っの成分抗原の量が他の抗原に比べて小さい場合
等であっても、そのような成分抗原に対して特異的な抗
体が被検試料中に存在するか否かを明確に知ることがで
きる抗体の検出方法及びそのための試薬が提供された。
泳動移動度が近接している場合又は混合抗原中の少なく
とも】っの成分抗原の量が他の抗原に比べて小さい場合
等であっても、そのような成分抗原に対して特異的な抗
体が被検試料中に存在するか否かを明確に知ることがで
きる抗体の検出方法及びそのための試薬が提供された。
本発明の方法によると、精製した移動度近接抗原や少量
抗原を、電気泳動の途中で別途ゲルに加えるので、本来
のバンドとは異なった位置に抗原のバンドが形成される
ので、他の抗原のバンドとほとんど重なってしまうこと
を防止することができ、また、精製濃縮した成分抗原を
別途加えるので、少量抗原であっても明確なバンドが形
成される。
抗原を、電気泳動の途中で別途ゲルに加えるので、本来
のバンドとは異なった位置に抗原のバンドが形成される
ので、他の抗原のバンドとほとんど重なってしまうこと
を防止することができ、また、精製濃縮した成分抗原を
別途加えるので、少量抗原であっても明確なバンドが形
成される。
従って、本発明の方法によると、移動度近接抗原や少量
抗原に特異的な抗体も明確に検出することができる。
抗原に特異的な抗体も明確に検出することができる。
［発明の詳細な説明］
本発明の方法に供される混合抗原は、複数の成分抗原を
含むものであればいかなるものでもよ（、例えば、ＨＩ
ＶやＨＴＬＶ−１のようなウィルスを陰イオン性界面活
性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）あるい
は非イオン性界面活性剤（例えばノニデットＰ−４０（
商品名）及びトライトンＸ−１００（商品名））で常法
に基づき処理したもの等を挙げることができる。
含むものであればいかなるものでもよ（、例えば、ＨＩ
ＶやＨＴＬＶ−１のようなウィルスを陰イオン性界面活
性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）あるい
は非イオン性界面活性剤（例えばノニデットＰ−４０（
商品名）及びトライトンＸ−１００（商品名））で常法
に基づき処理したもの等を挙げることができる。
混合抗原のゲル電気泳動は、従来のＷＢ法と全（同様に
して行なうことができる。例えば、ラエムリの方法に基
づき、ＳＤＳで処理した後にポリアクリルアミドゲル中
で電気体動させる（ ５ＤＳＰＡＧＥ）ことにより行な
うことができる。
して行なうことができる。例えば、ラエムリの方法に基
づき、ＳＤＳで処理した後にポリアクリルアミドゲル中
で電気体動させる（ ５ＤＳＰＡＧＥ）ことにより行な
うことができる。
次いで、電気泳動中に、上記混合抗原中に含まれる成分
抗原であって、使の成分抗原と電気泳動移動度が近接し
ている抗原（すなわち上記移動度近接抗原）又は抗原量
が少ないために対応抗体の検出が困難となる抗原（すな
わち上記少量抗原）をゲルに加え、さらに電気泳動を続
ける。これらの成分抗原は、通常のＷＢ法によれば、他
の抗原のバンドとほとんど重なってしまうが又は量が少
ないためにその対応抗体の検出が困難又は不正確になる
おそれがある抗原である。これらの成分抗原を添加する
時期は特に限定されるものではないが、電気泳動後に成
分抗原のバンドが重なり合わない条件を選択する。この
ような条件は、ルーチンな予備実験により容易に選択す
ることができるが、通常、電気泳動の末期に添加すれば
、添加された成分抗原は、体動時間が短いために移動距
離が少なく、他の成分抗原と容易かつ明瞭に分画される
ことが多い。また、必ずしも必要ではないが、添加され
る成分抗原は精製されていることが好ましい。もつとも
、成分抗原添加後の電気泳動により明確に分画されるの
であれば、２種以上の成分抗原の混合物を添加すること
も可能である。後述の実施例においては、ＨＴＬＶ−１
ウイルスに対する抗体の分析において、ＨＴＬＶ−１ウ
イルスのｅｎｖ抗原を添加している。
抗原であって、使の成分抗原と電気泳動移動度が近接し
ている抗原（すなわち上記移動度近接抗原）又は抗原量
が少ないために対応抗体の検出が困難となる抗原（すな
わち上記少量抗原）をゲルに加え、さらに電気泳動を続
ける。これらの成分抗原は、通常のＷＢ法によれば、他
の抗原のバンドとほとんど重なってしまうが又は量が少
ないためにその対応抗体の検出が困難又は不正確になる
おそれがある抗原である。これらの成分抗原を添加する
時期は特に限定されるものではないが、電気泳動後に成
分抗原のバンドが重なり合わない条件を選択する。この
ような条件は、ルーチンな予備実験により容易に選択す
ることができるが、通常、電気泳動の末期に添加すれば
、添加された成分抗原は、体動時間が短いために移動距
離が少なく、他の成分抗原と容易かつ明瞭に分画される
ことが多い。また、必ずしも必要ではないが、添加され
る成分抗原は精製されていることが好ましい。もつとも
、成分抗原添加後の電気泳動により明確に分画されるの
であれば、２種以上の成分抗原の混合物を添加すること
も可能である。後述の実施例においては、ＨＴＬＶ−１
ウイルスに対する抗体の分析において、ＨＴＬＶ−１ウ
イルスのｅｎｖ抗原を添加している。
このように、移動度近接抗原又は少量抗原を電気泳動の
途中でゲルに添加してさらに電気泳動を続けると、添加
された成分抗原は、その後の電気泳動の時間が最初から
電気泳動されている他の成分抗原よりも短いので、移動
距離が短く、従って、電気泳動後、本来の位置とは異な
る位置にバンドが形成される。従って、本来のバンドが
他のバンドとほとんど重なるような場合でも、全く異な
る位置に明確なバンドを形成することができるので、そ
れに対応する抗体の検出も明瞭に行なうことができる。
途中でゲルに添加してさらに電気泳動を続けると、添加
された成分抗原は、その後の電気泳動の時間が最初から
電気泳動されている他の成分抗原よりも短いので、移動
距離が短く、従って、電気泳動後、本来の位置とは異な
る位置にバンドが形成される。従って、本来のバンドが
他のバンドとほとんど重なるような場合でも、全く異な
る位置に明確なバンドを形成することができるので、そ
れに対応する抗体の検出も明瞭に行なうことができる。
また、少量抗原の場合も、該抗原を後から別途加えるの
であるから、対応抗原の検出のために十分な量の抗原を
添加することができ、従って対応する抗体の検出も明瞭
に行なうことができる。
であるから、対応抗原の検出のために十分な量の抗原を
添加することができ、従って対応する抗体の検出も明瞭
に行なうことができる。
次いで、上記電気泳動によるン水動パターンを維持した
まま、電気泳動により分離された成分抗原を担体に転写
する。この工程は通常のＷＢ法と全く同様に行なうこと
ができる。すなわち、分画された成分抗原を、ニトロセ
ルロースフィルタやナイロンメンブレンフィルターのよ
うな従来から常用されている担体に、従来法に従い電気
ン水動的にゲル中の成分抗原を担体上に移行させること
により行なうことができる。なお、このようにして担体
上に転写したものは本発明の試薬を構成する。
まま、電気泳動により分離された成分抗原を担体に転写
する。この工程は通常のＷＢ法と全く同様に行なうこと
ができる。すなわち、分画された成分抗原を、ニトロセ
ルロースフィルタやナイロンメンブレンフィルターのよ
うな従来から常用されている担体に、従来法に従い電気
ン水動的にゲル中の成分抗原を担体上に移行させること
により行なうことができる。なお、このようにして担体
上に転写したものは本発明の試薬を構成する。
次いで、抗原が転写された担体と、被検試料中の抗体を
反応させる。被検試料としては、例えば、ウィルス等の
感染を調べる場合には血清等の体液を挙げることができ
、その他、ハイブリドマにより産生される抗体の対応抗
原を調べたり、遺伝子工学的に動物細胞等により生産さ
れるタンパク質の同定をするような場合にはハイブリド
マや動物細胞等の培養上清又は細胞破砕物等を挙げるこ
とができる。もっとも、被検試料はこれらに限定される
ものではな（、成分抗原に対する抗体を検出しようとす
るいかなる試料であってもよい。担体上の抗原と抗体と
の反応は従来のＷＢ法と全く同様にして行なうことがで
きる。
反応させる。被検試料としては、例えば、ウィルス等の
感染を調べる場合には血清等の体液を挙げることができ
、その他、ハイブリドマにより産生される抗体の対応抗
原を調べたり、遺伝子工学的に動物細胞等により生産さ
れるタンパク質の同定をするような場合にはハイブリド
マや動物細胞等の培養上清又は細胞破砕物等を挙げるこ
とができる。もっとも、被検試料はこれらに限定される
ものではな（、成分抗原に対する抗体を検出しようとす
るいかなる試料であってもよい。担体上の抗原と抗体と
の反応は従来のＷＢ法と全く同様にして行なうことがで
きる。
次いで、成分抗原と特異的に結合した抗体を検出する。
これも、従来のＷＢ法と全く同様にして行なうことがで
き、例えば、非特異的に担体に吸着している抗体を洗浄
除去した後、ビオチン又はペルオキシダーゼ等の酵素で
標識した第２抗体を反応させ、通常のビオチン−アビジ
ン法又は酵素免疫分析法の手法により検出することがで
きる。
き、例えば、非特異的に担体に吸着している抗体を洗浄
除去した後、ビオチン又はペルオキシダーゼ等の酵素で
標識した第２抗体を反応させ、通常のビオチン−アビジ
ン法又は酵素免疫分析法の手法により検出することがで
きる。
本発明の方法は、例えばＨＴＬＩＩやＨＩＶのようなウ
ィルス等の感染症の診断のみならず、ハイブリドーマに
より産生される抗体の対応抗原を調べたり、遺伝子工学
的に動物細胞等により生産されるタンパク質の同定をす
るような場合にも適用することができ、極めて応用範囲
の広い基本的な技術である。
ィルス等の感染症の診断のみならず、ハイブリドーマに
より産生される抗体の対応抗原を調べたり、遺伝子工学
的に動物細胞等により生産されるタンパク質の同定をす
るような場合にも適用することができ、極めて応用範囲
の広い基本的な技術である。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。
い。
［実施例１
［１１ＨＴＬＶ−Ｉウィルス抗原の調製ＨＴＬＶ−１産
生株化細胞であるＴＣＬ−Ｋａｎ細胞（ＩＪ。
生株化細胞であるＴＣＬ−Ｋａｎ細胞（ＩＪ。
Ｋａｎｎａｇｉら、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、、、
１３０ ｆ６） ２９４２−２９４６ｆ１９８３＋
を、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６
４０培地に接種し、５％炭酸ガスを含む空気中で３７℃
で培養した。この培養液を連続ローターを用いて遠心し
て細胞を除去し、上清液を得た。この上清液から連続ロ
ーターを用いるシヨ等密度勾配超遠心法でウィルスを回
収した。これに終濃度０５％の非イオン性界面活性剤（
ノニデットＰ−４０（商品名）を加え、ＨＴＬＶ−Ｉウ
ィルス抗原を得た。
１３０ ｆ６） ２９４２−２９４６ｆ１９８３＋
を、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６
４０培地に接種し、５％炭酸ガスを含む空気中で３７℃
で培養した。この培養液を連続ローターを用いて遠心し
て細胞を除去し、上清液を得た。この上清液から連続ロ
ーターを用いるシヨ等密度勾配超遠心法でウィルスを回
収した。これに終濃度０５％の非イオン性界面活性剤（
ノニデットＰ−４０（商品名）を加え、ＨＴＬＶ−Ｉウ
ィルス抗原を得た。
（２）アフィニティークロマトグラフィーによるＨＴＬ
Ｖ−１ｅｎｖ抗原の精製 上記ｉｌ＋ で得たＨＴＬＶ−Ｉウィルス抗原をマウス
に免疫し、ケーラーとミルシュタインの常法に従ってマ
ウス牌細胞とミエローマ細胞とを融合し、ＨＴＬＶ−Ｔ
ｅｎｖ抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ
を選択してクローン化し、該ハイブリドーマをマウス腹
腔内に接種してマウス腹水より硫安分画法及びＤＥＡＥ
イオン交換クロマトグラフィー法により抗ＨＴＬＶ−Ｉ
ｅｎｖ抗原モノクローナル抗体を得た。このモノクロ
ーナル抗体は、ＨＴＬＶ−１感染細胞には反応するが、
非感染細胞には反応しないこと、この対応する抗原の分
子量が６８０００及び４６０００ダルトンであること、
また、遺伝子工学的に作製したりコンビナンドＨＴＬＶ
−１ｅｎｖタンパク質と強く反応することを確認済であ
る。
Ｖ−１ｅｎｖ抗原の精製 上記ｉｌ＋ で得たＨＴＬＶ−Ｉウィルス抗原をマウス
に免疫し、ケーラーとミルシュタインの常法に従ってマ
ウス牌細胞とミエローマ細胞とを融合し、ＨＴＬＶ−Ｔ
ｅｎｖ抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ
を選択してクローン化し、該ハイブリドーマをマウス腹
腔内に接種してマウス腹水より硫安分画法及びＤＥＡＥ
イオン交換クロマトグラフィー法により抗ＨＴＬＶ−Ｉ
ｅｎｖ抗原モノクローナル抗体を得た。このモノクロ
ーナル抗体は、ＨＴＬＶ−１感染細胞には反応するが、
非感染細胞には反応しないこと、この対応する抗原の分
子量が６８０００及び４６０００ダルトンであること、
また、遺伝子工学的に作製したりコンビナンドＨＴＬＶ
−１ｅｎｖタンパク質と強く反応することを確認済であ
る。
このモノクローナル抗体を臭化シアンで活性化したセフ
ァロース４Ｂゲル（ファルマシア社製）に常法通り２
ｍｇ／ｍｌゲルの割合で結合させてアフィニティ用カラ
ムを作製した。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７，
５の５ｍ１Ｊトリス塩酸緩衝液で平衡化したカラムに先
の培養上清を流し、十分にＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖを結合さ
せた後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭトリス塩
酸緩衝液で洗浄した。非結合成分が認められなくなった
後、ｐｌ＋２．５の０．１Ｍ乳酸緩衝液を流し、結合し
ている成分を回収し、直ちに０１５Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．１ Ｍリン酸緩衝Ｍ（ｐＨ７５）に対して透析
した。得られた結合成分より精製ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ
抗原を得た。
ァロース４Ｂゲル（ファルマシア社製）に常法通り２
ｍｇ／ｍｌゲルの割合で結合させてアフィニティ用カラ
ムを作製した。０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７，
５の５ｍ１Ｊトリス塩酸緩衝液で平衡化したカラムに先
の培養上清を流し、十分にＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖを結合さ
せた後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５ｍＭトリス塩
酸緩衝液で洗浄した。非結合成分が認められなくなった
後、ｐｌ＋２．５の０．１Ｍ乳酸緩衝液を流し、結合し
ている成分を回収し、直ちに０１５Ｍ塩化ナトリウムを
含む０．１ Ｍリン酸緩衝Ｍ（ｐＨ７５）に対して透析
した。得られた結合成分より精製ＨＴＬＶ−Ｉ ｅｎｖ
抗原を得た。
（３）抗原転写ニトロセルロース膜（ＮＣ膜）の調製
は）で得たＨＴＬＶ−Ｉウィルス抗原を２−メルカプ１
−エタノール存在下で沸騰水中９０秒間ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）処理した後に、ゲル濃度１２５％（
濃縮ゲル１ｃｍ、分離ゲル５．５ ｃｍｌで５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（５Ｏ５−ＰＡＧＥ）を
、泳動の先端が上端より２／３に達するまで（約２時間
）行なった。次いで（２）で精製したＨＴＬＶ−１ｅｎ
ｖ抗原を加えさらに泳動の先端が下端より１ｃｍに達す
るまで（１時間）電気泳動を続けた。泳動終了後、ポリ
アクリルアミドゲルをトービンらの方法（特公昭６２−
４４６１２号）に従って電気的にＮＣ膜に転写を行なっ
た後、３％ウシ血清アルブミン中、４℃で一晩ブロック
し、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原転写ＮＣ膜（以下、本発明ＮＣ膜
という）を得た。一方、対照のため、精製したＨＴＬＶ
４ｅｎｖ抗原を加えないことを除いて上記と同様に作製
したＮＣ膜（以下、従来法ＮＣ膜と言う）を作製した。
−エタノール存在下で沸騰水中９０秒間ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）処理した後に、ゲル濃度１２５％（
濃縮ゲル１ｃｍ、分離ゲル５．５ ｃｍｌで５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（５Ｏ５−ＰＡＧＥ）を
、泳動の先端が上端より２／３に達するまで（約２時間
）行なった。次いで（２）で精製したＨＴＬＶ−１ｅｎ
ｖ抗原を加えさらに泳動の先端が下端より１ｃｍに達す
るまで（１時間）電気泳動を続けた。泳動終了後、ポリ
アクリルアミドゲルをトービンらの方法（特公昭６２−
４４６１２号）に従って電気的にＮＣ膜に転写を行なっ
た後、３％ウシ血清アルブミン中、４℃で一晩ブロック
し、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原転写ＮＣ膜（以下、本発明ＮＣ膜
という）を得た。一方、対照のため、精製したＨＴＬＶ
４ｅｎｖ抗原を加えないことを除いて上記と同様に作製
したＮＣ膜（以下、従来法ＮＣ膜と言う）を作製した。
（４）血清中のＨＴＬＶ−Ｉ抗体の測定上記（３） で
作製した本発明ＮＣ膜と従来法ＮＣ膜との比較を、ＨＴ
ＬＶ −Ｉ抗体陽性血清及び陰性血清を用いＨＴＬＶ−
Ｉ抗体の測定を行なった。測定は、３０倍に希釈した各
血清を用い、室温で１時間反応させた後ビオチン標識抗
ヒト抗体を１時間、さらにペルオキシダーゼ標識アビジ
ンを１時間反応させ、４−クロロ−１−ナフトールを用
い発色させて行なった。洗浄液には０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０を含む０．０１ Ｍ ＰＢＳ （ｐＨ７，４）
を使用した。結果を第１図に示す。
作製した本発明ＮＣ膜と従来法ＮＣ膜との比較を、ＨＴ
ＬＶ −Ｉ抗体陽性血清及び陰性血清を用いＨＴＬＶ−
Ｉ抗体の測定を行なった。測定は、３０倍に希釈した各
血清を用い、室温で１時間反応させた後ビオチン標識抗
ヒト抗体を１時間、さらにペルオキシダーゼ標識アビジ
ンを１時間反応させ、４−クロロ−１−ナフトールを用
い発色させて行なった。洗浄液には０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０を含む０．０１ Ｍ ＰＢＳ （ｐＨ７，４）
を使用した。結果を第１図に示す。
第１図から明らかなように、本発明ＮＣ膜を用いて分析
を行なった場合には、陽性血清の分析において、ｇｐ４
６抗原に対応するバンドが移動度の小さな位置上端に対
応する位置に明確に認められた。一方、従来法ＮＣ膜を
用いた場合には、陽性血清の分析において、ｇｐ４６抗
原に対応するバンドがｐ５３抗原に対応するバンドとほ
とんど重なってしまい、抗ｇｐ４６抗体が血清中に存在
するのか否かが明確に判定できなかった。
を行なった場合には、陽性血清の分析において、ｇｐ４
６抗原に対応するバンドが移動度の小さな位置上端に対
応する位置に明確に認められた。一方、従来法ＮＣ膜を
用いた場合には、陽性血清の分析において、ｇｐ４６抗
原に対応するバンドがｐ５３抗原に対応するバンドとほ
とんど重なってしまい、抗ｇｐ４６抗体が血清中に存在
するのか否かが明確に判定できなかった。
第１図は、本発明ＮＣ膜及び従来法ＮＣ膜を用いてＨＴ
ＬＶ −Ｉ抗体陽性血清を用いて抗体の検出を行なった
結果を示す図である。 特許出願人 冨士レビオ株式会社
ＬＶ −Ｉ抗体陽性血清を用いて抗体の検出を行なった
結果を示す図である。 特許出願人 冨士レビオ株式会社
Claims (4)
- （１）混合抗原をゲル電気泳動にかける工程と、混合抗
原中の成分である成分抗原を上記ゲルに加え、さらに電
気泳動を続ける工程と、電気泳動パターンを維持したま
ま、電気泳動により分離された抗原を担体に転写する工
程と、担体上に転写された抗原と被検試料中に含まれる
、前記混合抗原に対する抗体とを反応させる工程と、抗
原と結合した抗体を検出する工程とを含む、被検試料中
の抗体の検出方法。 - （２）前記混合抗原はＨＴＬＶ−Ｉウィルス抗原であり
、ゲルに添加される前記成分抗原はＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ
抗原である請求項１記載の方法。 - （３）混合抗原をゲル電気泳動にかけ、次いで混合抗原
中の成分である成分抗原を上記ゲルに加えてさらに電気
泳動を続け、電気泳動パターンを維持したまま電気泳動
により分離された抗原を担体に転写したものから成る、
被検試料中の前記混合抗原に対する抗体を検出するため
の試薬。 - （４）前記混合抗原はＨＴＬＶ−Ｉウィルス抗原であり
、ゲルに添加される前記成分抗原はＨＴＬＶ−Ｉｅｎｖ
抗原である請求項３記載の試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2201860A JP2971537B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 抗体の検出方法及び試験片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2201860A JP2971537B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 抗体の検出方法及び試験片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0486558A true JPH0486558A (ja) | 1992-03-19 |
| JP2971537B2 JP2971537B2 (ja) | 1999-11-08 |
Family
ID=16448089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2201860A Expired - Lifetime JP2971537B2 (ja) | 1990-07-30 | 1990-07-30 | 抗体の検出方法及び試験片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2971537B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2335981A (en) * | 1998-03-31 | 1999-10-06 | Zetatronics Ltd | Rapid method for detecting micro-organisms |
-
1990
- 1990-07-30 JP JP2201860A patent/JP2971537B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2335981A (en) * | 1998-03-31 | 1999-10-06 | Zetatronics Ltd | Rapid method for detecting micro-organisms |
| GB2335981B (en) * | 1998-03-31 | 2000-06-21 | Zetatronics Ltd | Rapid method for detecting micro-organisms and evaluating antimicrobial activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2971537B2 (ja) | 1999-11-08 |
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