JPH0810225B2 - 非ａ非ｂ型ウィルス性肝炎抗体およびそれを利用した前記肝炎の検出試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、新規な非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎抗体お
よびそれを利用した前記肝炎の検出試薬に関する。

（ロ）従来の技術と問題点 非Ａ非Ｂ型肝炎は、肝炎Ａ型ウイルス（HAV）、肝炎
Ｂ型ウイルス（HBV）、またはサイトメガロウイルス（c
ytomegalovirus）、エプスタイン−バールウイルス（Ep
stein−Barr virus）もしくは黄熱病ウィルス（yellow
fever virus）のようなその他の公知のヒト肝炎ウィ
ルスに基因しないウィルス感染性肝炎と定義されてい
る。非Ａ非Ｂ型肝炎は、数種の異なるウイルスによる一
群の疾病のようである。

ヨーロッパと北米において、輸血による肝炎のケース
の95％は、E.Tabor（Lancet,1985,i:743〜745）および
D.G.Wongら（Lancet,1980,ii:876〜879）に報告されて
いるように、Ｂ型肝炎と同様に非経口で伝染される感染
源によるものである。

最近の疫学的データは、Ａ型肝炎のように糞便−経口
ルートにより伝染され事実上輸血では伝染されない型の
非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎（NANBH）が存在することを
示した。この種の流行病は、いくつか報告されてきた
（M.S.Balayanら、Intervirology.1983,20:23−31;E.H.
Belabbesら,J.Med,Virol.,1985,16:257−263;M.A.Kane
ら,JAMA,1984,252:3140〜3145;M.S.Khuroo,Am.J.Med.,1
980,68:818〜824）。これらの流行病は、糞便−経口モ
ードの伝染をする上水道が原因であり患者の糞から得た
試料中に、27μｍのウイルス粒子が電子顕微鏡で観察さ
れた（M.S.Balayanら,Intervirology,1983,20:23−31;
M.A.Kaneら,JAMA,1984,252,3140−3145）。

非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスが、肝硬変、非樹立の悪性肝
癌などのような重篤な肝臓病を引起こすことは知られて
いる。従ってこれらのウイルスの同定や、これらのウイ
ルスに関連する抗原・抗体系の検出を行うことが、早期
に診断したり適切な予防を速やかに行うのに最も重要で
ある。

この発明で特に提案される診断試薬や診断法には、輸
血中に伝染される非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関連する抗
原の検出法が含まれる。

SHIRASHIら（The Lancet,1978年10月21日,853−856
頁）は、逆電気泳動法（counterelectrophoresis）によ
って、輸血が原因の非Ａ非Ｂ型肝炎にかかっているヒト
に抗原・抗体系を検出し、1979年５月21日付米国特許願
第40921号の優先権を主張する1980年５月20日出願のPCT
国際出願公開第80102598号によって、（NANBH）に関連
する抗原を検出する免疫学的試験法を特許請求してい
る。この試験法では、感染していると考えられる哺乳類
由来の血清の試料を、NANBHに感染していることが分か
っているドナー哺乳類の血清由来の抗体と反応させて、
NANBH抗原の存在を、逆電気泳動法で形成された免疫沈
降素によって間接的に検出するか、又はラジオイムノア
ッセイ、ゲロースゲル中の拡散法、ラテックス上での受
身血球凝集法や受身凝集法、補体結合法もしくはELISA
試験法のような直接法で検出する。

さらにPCT国際出願第WO 82/00205号明細書は、直径
が約40nmの核を有し非Ａ非Ｂ型肝炎を起こす原因である
といわれる直径が50〜60nmのウイルス粒子を開示してい
る。このウイルス粒子を含有する４つの試料が、ザ ア
メリカン タイプ カルチャー コレクション（the A
merican Type Culture Collection）に寄託番号VR−
2011,VR−2012,VR−2013およびVR−2014で寄託されてい
る。

開示されている粒子は、検出試験に用いるため、放射
能標識することができる。

他の著者らは、NANBHに関連する抗原を単離し、この
単離した抗原を用いて非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎のウイ
ルスによって起る感染症を診断する試薬を製造しようと
試みてきた。特に、出願人がトレポ（TREPO）の1981年
３月20日付けフランス特許第8106385号は、血清もしく
は肝エキスを超遠心分離し、得られた遠心残留物を非イ
オン性界面活性剤で処理し、次いで分画して純粋なNANB
c抗原を含有するフラクションを単離する（適切な場
合、次いでイオン性界面活性剤で処理してAgNANBeを単
離する）ことによって新規なNANBH抗原を単離する方法
を開示している。またこのフランス特許におけるひとつ
の変形に対応する別の提案によれば、上記のように超遠
心分離を行ない、存在するウイルス粒子をすべて除去し
た後、ガンマーグロブリンを除去し、AgNANBeを沈澱さ
せて濃縮し、得られたAgNANBe含有の濃縮フラクション
を、ヘパリンを固着した支持体のクロマトグラフィに付
して、AgNANBeを溶離して集めている。トレポのフラン
ス特許による診断用試薬は、少なくともひとつのNANBC,
NANBeもしくはNANBs抗原および／又は少なくともひとつ
の抗−NANBc、抗−NANBeもしくは抗−NANBs特異性の抗
体が固着された固体支持体からなっており、特にその診
断用試薬の支持体が抗−（ヒトガンマグロブリン）抗体
を持っている場合、その抗原は、その支持体から分離さ
れ、被検血清中に対応する抗体が存在するならば、その
抗体によってのみ固定される。

同様に、1981年６月２日の日本国の優先権を主張す
る、出願人がEISAIで1982年６月２日付出願のヨーロッ
パ特許出願公開第66296号は、NANB肝炎で死亡した患者
の検死解剖によって得た肝臓から、超遠心分離法を含む
蛋白質分画の通常の方法で精製することよってNANB肝炎
関連の抗原を分離する方法を開示し、この抗原をその物
理化学的性質で定義している。このヨーロッパ特許願の
抗原は、羊の赤血球のような受身血球凝集反応に適切な
基質の粒子、ラジオイムノアッセイ用のトレーサー同位
体またはELISA試験法を行うのに適切な酵素からなる物
質と接合される。

しかし、現在まで、流行性NANB肝炎が関連する抗原・
抗体系の同定を可能にするいかなる手段も提案されてい
ないようである。

（ハ）問題点を解決するための手段と作用 この発明の目的は、非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎抗体お
よび流行性非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎の検出を可能にす
る試薬を提供することにある。

この発明は、流行性NANBウイルス性肝炎にかかってい
ることが分かっている患者の糞便のエキスで人工的に感
染させたサルの血清から単離したIgMからなる抗−NANBH
抗体に関する。

またこの発明は、流行性NANB肝炎にかかっている患者
の糞便のエキスを摂取させて人工的に感染させたサルの
血清から抗−NANBH抗体を単離する方法であって、前記
血清を、0.1MトリスNaCl緩衝液pH8.0中のデキストラン
ゲルのカラムを用いるクロマトグラフィで処理して抗−
NANBH IgMを単離することからなる方法に関する。

この発明による抗−NANBHIgMの単離法の態様では、用
いられる人工的に感染させたサルの血清は、接種して27
日経過以後に採取される。

またこの発明は、固体支持体の特にポリ塩化ビニル
（PVC）板に固定された抗−NANBH IgMからなる、流行
性NANBウイルス性肝炎を検出可能にする試薬に関する。

またこの発明は、この発明によって単離された抗−NA
NBH IgMを1mlのリン酸緩衝液（PBS）当り50μｇ程度の
蛋白質濃度で、固体支持体の特にPVC板に４℃で18〜24
時間接触させることによって、前記支持体に前記IgMを
固定することからなる流行性NANBウイルス性肝炎が検出
可能な試薬の製造方法に関する。

この発明による、流行性NANBウイルス性肝炎検出用試
薬の製造方法の一態様では、抗−NANBH IgMで被覆され
たPVCプレートが0.1％のウシ血清アルブミン（BSA）と
0.1％のツィーン20（Tween 20）を含有するPBSの層で
覆われる。

またこの発明は、この発明の抗−NANBH IgMに関連し
て、流行性NANBウイルス性肝炎を検出するために用いら
れる、酵素で標識を付けた、流行性NANB肝炎から回復中
の患者の血清由来のIgGに関する。

さらにこの発明は、これらIgGの製造法に関し、すな
わち、流行性NANBHから回復中の患者の血清を、DEAE−
トリスアクリル（Trisacryl）のカラムのクロマトグラ
フィに対して精製し、このようにして単離されたIgGを
適切な酵素、好ましくはβ−グラクトシダーゼで公知の
方法により標識を付けることからなるIgGの製造法であ
る。

上記の事項以外のこの発明に含まれる他の事項は下記
の記載によって明らかになるであろう。

この発明の物質の製造法を示す下記の実施例によって
この発明がより明確に理解されるであろう。

しかし、この実施例は単に、この発明の目的を例証す
るためのものであって、この発明を何等限定するもので
はない。

（ニ）実施例 １ 出発物質として使用される肝炎ウイルスのNANB特性
の測定 急性の流行性NANBウイルス性肝炎にかかっていると推
定される37人の患者（象牙海岸のTORTIYA地区）から黄
疸になった第１週に、血清の試料を採取した。

これらの試料は、ウイルスのNANB特性を確実に立証す
るために下記の検出試験に付した。

市販のELISAキット〔アボット・ラボラトリイズ（ABB
OTT Laboratories）、シカゴ、イリノイ州〕を利用し
て肝炎Ａ型ウイルスと肝炎Ｂ型ウイルスとを検出する試
験、すなわち 抗−Ａ型ウイルスIgG又はIgMを検出するHAVAB試験； AgHBsを検出する“AUSZYME"試験； AgHBeを検出するHBe−EIA試験； 肝炎Ｂ型ウイルスのキャプシドに対応する全抗体を測
定する“CORZYME"試験； 肝炎Ｂ型ウイルスのキャプシドに対応する特異的IgM
を測定する“CORZYME M"試験； CMVに対応する抗体を測定するためのSchmitzらの［J.
Gen.Virol.,1980,50:p59〜68］の免疫酵素試験； Gardnerら著“Rapid virus diagnosis:application
of immunofluorescence",Butterworths発行，ロンド
ン,1980年，第276〜278頁の免疫蛍光分析法によるエプ
スタイン−バール ウイルスに対応するIgMの測定；お
よび LhuillierらのAnn.Virol.（Inst.Pastur）,1983年,13
4E,第349〜359頁の技術の免疫捕獲法（immunocapture）
による抗−黄熱病IgMの測定である。

NANBHにかかっていると考えられる患者由来の、試験
された血清の37の試料のすべてに、抗−VHA抗体が含有
されていたが、上記IgMの類に属する抗−VHA特異性抗体
は含有されていなかった。

37の血清中の32は抗−HBc抗体（肝炎Ｂ型ウイルスの
キヤプシドの抗原に対応する抗体）を有していたが、上
記IgM免疫グロブリンの類に属する抗−HBc特異性抗体は
もっていなかった。

２人の患者は、Ｂ型肝炎の表面抗原（AgHBs）の検出
試験で陽性であったがＢ型肝炎に特異的なAgHBe抗原の
検出試験では陰性であった。

これらの血清学的結果は、肝炎Ａ型ウイルスもしくは
肝炎Ｂ型ウイルスが、上記患者が犠牲になった流行病の
原因であるということを否定し、また上記のIgM、抗−C
MV、抗−エプスタイン−バールウイルスもしくは抗−黄
熱病の類に属することが知られている抗体に特異的では
なかった。

２ 糞便エキスの製造 2.1 37人の患者の内の10人から、病気の徴候が現われ
た最初の数日間に大便の試料を採取した。これらの試料
を、10％糞便エキスを含有する、１％のヒト血清アルブ
ミン含有PBSを製造するのに用いた。これらの糞便エキ
スをホモジナイズし次いで遠心分離に付して透明にし
た。

2.2 透明化した糞便エキスを0.45μｍミリポアー（mil
lipore）フィルターで瀘過し、次いで0.22μｍのHA型メ
ンブレンディスクからなるフィルターで瀘過し、その
後、下記2.3.項に記載したのと同様にして感染させたサ
ルの血清由来のIgMフラクションの等容積と、37℃で１
時間次いで４℃で一夜反応させた。得られた反応混合物
を20,000gで20分間遠心分離し、残渣をPBS中に懸濁され
た。得られた製剤の一部を蒸溜水に透析し、pH7.2にて
リンタングステン酸でネガティブ染色し、次いでジーメ
ンス社製電子顕微鏡で試験した。

2.3. 透明化した糞便エキスを水で濃度10％まで希釈し
て接種物を作製し、これを麻酔をかけた４頭のアフリカ
ザル〔３頭のセロピテクス・エティオプス（Ceropithec
us aethiops）と１頭のエリスロセブス・パタス（Eryt
hrocebus patas）〕に2mlづつ経口投与した。

これらのサル由来の血清と糞便の試料を、上記接種物
投与前と、投与して27日後に採取した。

3. 抗−NANBHIgMの製造 3.1 上記2.3.項に記載したのと同様にして感染させた
サルの血清を、0.1Mトリス−NaCl緩衝液pH8.0中のセフ
ァデックスＧ−200（ファーマシア社製のアガロースゲ
ル）のクロマトグラフィに付して、抗−NANBHIgMを単離
した。

3.2. 単離した抗−NANBHIgMを、PBS1ml当り50μｇの蛋
白質濃度でPVC板（NUNC−IMMUNO−PLATES社、デンマー
ク供給）に、４℃で24時間接触させてこの板に固定し
た。

このように処理したプレートを0.1％のBSAと0.1％のT
ween20含有のPBSで覆った。

４ 流行性NANB肝炎に関連する抗原・抗体系を同定する
ためのIgGフラクションの製造 NANBHから回復しつつある患者の血清を、DEAE−トリ
スアクリルのカラムのクロマトグラフィに付して精製す
ることによってひとつのIgGフラクションを得、得られ
た精製IgGをβ−ガラクトシダーゼで標識を付けた。

５ NANBH診断試験 5.1. 摂取前に採取したサルの血清から単離したIgMを
用いてPVC板を被覆し、対照物として利用した。

5.2. NANB肝炎の診断法を確立するこころみがなされた
患者の糞便から上記2.1.項に記載したのと同様にして作
製された糞便エキス（1:20v/v）を、上記3.2.項に記載
したのと同様にして抗−NANBHIgMで覆ったプレート上で
37℃にて１時間培養し、次いで展開発色基質としてのオ
ルソニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの存
在下、上記４項に記載したのと同様にして得た、β−ガ
ラクトシダーゼで標識をつけたIgGのフラクション（200
μg/ml）と共に培養した。

5.3. サルに接種して27日後に採取したサル血清から単
離した特異的IgMは、NANB肝炎にかかっている患者の糞
便中に存在する抗原と特異的に結合し、このように結合
した抗原は、前記の、酵素で標識を付されたIgGによっ
て検出される。

６ 試験結果 前記第2.1項に記載したのと同様にして作製した、NAN
BHにかかっていると考えられる患者から採取した糞便の
エキス10個のうちの５個のなかに、NANBHに関連する抗
原を検出することができたが、他の胃腸伝染病にかかっ
ているヨーロッパの患者由来の糞便のエキス30個のいず
れにも検出することができなかった（後記表参照）。接
種して27日後に単離されたIgMを用いる免疫酵素試験で
陽性であった試料はすべて、接種前に採取した血清から
単離したIgMを用いた対照系では陰性であることが分か
った。恐らくウイルス粒子と考えられる凝集物が、４人
の患者の血清から単離したIgM抗体と、同じ患者由来と
糞便エキスとの反応後、電子顕微鏡下で観察された。

下記表に示したように、感染患者の糞便内に存在する
流行性NANB肝炎の抗原と、肝炎Ａ型ウイルスもしくは肝
炎Ｂ型の抗原との間に血清学的関係は全くない。この表
は事実、糞便試料中のNANB抗原の存在を検出する免疫酵
素試験で得た試験結果を示している。すなわち、実験的
に感染させたサルの血清から単離し、固相（PVC板）に
固定された４つのIgM抗体の中の３つは、流行性のNANB
肝炎にかかっている患者由来の糞便の試料中に存在する
抗原を特異的に固定する。

流行性NANB肝炎から回復中の患者の血清から単離され
たIgGフラクションをβ−ガラクトシダーゼで標識をつ
け展開剤として用いた（＊第２のフラクションで得られ
た結果は第１のフラクションで得られた結果と一致して
いた）。下記表で照合した試験結果は、P/N比で表わさ
れている（P/N比は、陰性の対照試料の平均の吸収に対
する試験された試料の吸収の比である）。正常な糞便の
６つの異なるエキスを陰性対照試料として用いた。接種
前のサルの血清から単離したIgMで被覆したプレート上
で行った対照試験では陰性の試験結果（P/N＜2.1）が得
られた。

この発明が基礎としている流行性NANB肝炎のウイルス
の同定法によって、この型の肝炎の病因学的原因と考え
られたものが肝炎Ａ型ウイルスと肝炎Ｂ型ウイルスの両
者と無関係であり、それが輸血によって伝染されるNANB
肝炎の２つのタイプと異なることが示された。

この発明によれば、感染動物の血清から単離されたIg
Mによって、流行性NANB肝炎にかかっている患者の糞便
中に存在するNANBHウイルスに関連する抗原を免疫酵素
的に特定することによりNANB肝炎の診断試験を行うこと
ができる。

上記のことから明らかなように、この発明はすでに明
確に記載した実施方法、実施態様および利用法に限定さ
れるものではなく、この発明の範囲を逸脱することな
く、当業者ならば成しうるこれらの変形もすべて含むも
のである。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】流行性非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎にかかっ
   ていることが知られている患者由来の糞便のエキスによ
   って人工的に感染させたサルの血清から単離したIgMか
   らなる流行性非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎に特異的な抗原
   に対する抗−非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎抗体。
2. 【請求項２】前記サルの血清からのIgMの単離が、0.1M
   トリスNaCl緩衝液（pH8.0）中のデキストランゲルのカ
   ラムのクロマトグラフィで行われている特許請求の範囲
   第１項記載の抗−非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎抗体。
3. 【請求項３】前記サルの血清が、前記糞便エキスを接種
   して27日以後に採取された血清である特許請求の範囲第
   １項記載の抗−非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎抗体。
4. 【請求項４】固体支持体とそれに固定された流行性非Ａ
   非Ｂ型ウイルス性肝炎にかかっていることが知られてい
   る患者由来の糞便のエキスによって人工的に感染させた
   サルの血清から単離したIgMからなる流行性非Ａ非Ｂ型
   ウイルス性肝炎に特異的な抗原に対する抗−非Ａ非Ｂ型
   ウイルス性肝炎IgMとからなる、流行性非Ａ非Ｂ型ウイ
   ルス性肝炎の検出に用いうる試薬。
5. 【請求項５】前記IgMが、リン酸緩衝液の1ml当り50μｇ
   のオーダーの蛋白質濃度で、特にポリ塩化ビニル板のご
   とき固体支持体に接触させ、固定されてなる特許請求の
   範囲第４項記載の試薬。
6. 【請求項６】固体支持体に固定された前記IgMが、0.1％
   のウシ血清アルブミンと0.1％のツィーン20とを含有す
   るリン酸緩衝溶液の層で被覆されている特許請求の範囲
   第４項記載の試薬。
7. 【請求項７】前記試薬が、β−ガラクトシダーゼのよう
   な酵素で標識が付された、流行性非Ａ非Ｂ型ウイルス性
   肝炎から回復中の患者の血清由来のIgGと組合せて用い
   られる特許請求の範囲第４項記載の試薬。
8. 【請求項８】前記試薬が、酵素反応を展開するための少
   なくともひとつの適切な基質と組合せたキットの形態で
   ある特許請求の範囲第７項記載の試薬。