JPH0491786A - 完全合成培地 - Google Patents
完全合成培地Info
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- JPH0491786A JPH0491786A JP1329454A JP32945489A JPH0491786A JP H0491786 A JPH0491786 A JP H0491786A JP 1329454 A JP1329454 A JP 1329454A JP 32945489 A JP32945489 A JP 32945489A JP H0491786 A JPH0491786 A JP H0491786A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、細胞を培養するための培地で、タンパク質、
ホルモン、ステロイド成分および細胞成長因子をまった
く含有せず、既知の化学物質のみで構成される完全合成
培地に関するものである。
ホルモン、ステロイド成分および細胞成長因子をまった
く含有せず、既知の化学物質のみで構成される完全合成
培地に関するものである。
（従来の技術）
動物細胞の培養には、通常数％〜２０％程度の動物血清
（例えばウシ胎児血清）を基本合成培地に添加した培養
液が用いられる。この血清培地には、高濃度の血清タン
パク質が存在し、それらタンパク質は多種多様な物理・
化学的性質を有し、きわめて広範な分子量分布を示す。
（例えばウシ胎児血清）を基本合成培地に添加した培養
液が用いられる。この血清培地には、高濃度の血清タン
パク質が存在し、それらタンパク質は多種多様な物理・
化学的性質を有し、きわめて広範な分子量分布を示す。
そのため、動物細胞培養によって、例えばハイブリドー
マから単クローン抗体、又は遺伝子組換え体（細胞）か
ら組換え産物を産生させる場合、血清培養では産生物を
高純度に精製することは非常に困難であり、精製工程に
多大の労力と費用を必要とする。また、動物血清は製造
ロフト毎に品質の差があることは避けられず、また、供
給が不安定で高価であるという欠点がある。したがって
、単クローン抗体あるいは遺伝子組換え産物を動物細胞
に産生させる場合には、培養液として無血清培地が多用
されている。
マから単クローン抗体、又は遺伝子組換え体（細胞）か
ら組換え産物を産生させる場合、血清培養では産生物を
高純度に精製することは非常に困難であり、精製工程に
多大の労力と費用を必要とする。また、動物血清は製造
ロフト毎に品質の差があることは避けられず、また、供
給が不安定で高価であるという欠点がある。したがって
、単クローン抗体あるいは遺伝子組換え産物を動物細胞
に産生させる場合には、培養液として無血清培地が多用
されている。
無血清培地は、血清培地と異なりすべて既知の成分から
構成されており、製造ロット毎の品質差がなく供給も安
定である。しかし、通常血清アルブミン、トランスフェ
リン等のタンパク質あるいは分子量致方程度の成長因子
類（例えばインスリン）などが含まれており、培地中の
総タンパク量は数十μｇ／ｍｌから数ｍｇ／ｍ ＋ に
も達する。この濃度は、血清培地と較べれば十分低いも
のの、培地中から単クローン抗体又は遺伝子組換え産物
を精製する場合にはかなり高濃度であり、高純度に精製
する場合には精製工程が複雑になり易い。また、培地の
価格は血清培地よりも安価ではあるか、例えば単クロー
ン抗体を生産するのにハイブリドーマをマウス腹腔内で
培養する方法と比較すると生産コストはかなり高くなっ
てしまう。また、単クローン抗体（特にヒト型抗体）あ
るいは遺伝子組換え産物を直接人体に投与する場合には
、目的物質以外のタンパク質成分および発熱物質（パイ
ロジエン）を完全に除去する必要かあり、非常に高度の
精製技術を必要とする。
構成されており、製造ロット毎の品質差がなく供給も安
定である。しかし、通常血清アルブミン、トランスフェ
リン等のタンパク質あるいは分子量致方程度の成長因子
類（例えばインスリン）などが含まれており、培地中の
総タンパク量は数十μｇ／ｍｌから数ｍｇ／ｍ ＋ に
も達する。この濃度は、血清培地と較べれば十分低いも
のの、培地中から単クローン抗体又は遺伝子組換え産物
を精製する場合にはかなり高濃度であり、高純度に精製
する場合には精製工程が複雑になり易い。また、培地の
価格は血清培地よりも安価ではあるか、例えば単クロー
ン抗体を生産するのにハイブリドーマをマウス腹腔内で
培養する方法と比較すると生産コストはかなり高くなっ
てしまう。また、単クローン抗体（特にヒト型抗体）あ
るいは遺伝子組換え産物を直接人体に投与する場合には
、目的物質以外のタンパク質成分および発熱物質（パイ
ロジエン）を完全に除去する必要かあり、非常に高度の
精製技術を必要とする。
したかって、細胞を用いて有用な生理活性物質を生産し
ようとする場合、使用する培地は蛋白質、細胞成長因子
、ホルモン、ステロイドを含まず、構成成分かすべて既
知の化成品からなっており、しかもそれら成分がいずれ
も低分子物質（例えば分子量２０００以下）であること
が理想とされる。
ようとする場合、使用する培地は蛋白質、細胞成長因子
、ホルモン、ステロイドを含まず、構成成分かすべて既
知の化成品からなっており、しかもそれら成分がいずれ
も低分子物質（例えば分子量２０００以下）であること
が理想とされる。
このような培地を開発できれば、無血清培地のように、
大量入手が困難なタンパク質、成長因子類等を含有して
いないため、大量の無タンパク質培地を調製し工業的規
模で細胞の大量培養を行うことも極めて容易となる。
大量入手が困難なタンパク質、成長因子類等を含有して
いないため、大量の無タンパク質培地を調製し工業的規
模で細胞の大量培養を行うことも極めて容易となる。
近年、こうした無タンパク質培地はわずかに報告されて
いるが（例えばＪａｎ Ｋｏｖａｒ ｅｔ、 ａｌ。
いるが（例えばＪａｎ Ｋｏｖａｒ ｅｔ、 ａｌ。
Ｂｉｏｔｅｃｈ、 ｌｅｔ、、 ９（１９８７）２５９
−２６４ 、Ｙｖｅｓ−ＪａｃｑｕｃｓＳＣｈｎｅｉｄ
ｅｒ、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ、、 １１Ｂ
（１９８９）６５−７７など）、いずれも、高濃度のク
エン酸鉄、エタノールアミン、アスコルビン酸（ビタミ
ンＣ）、ｆｆ（量元素類、およびホルモン類（エストラ
ジオール等）を従来の基本培地に添加したもので、マウ
スハイブリドーマの培養を可能としたが、組成が非常に
複雑である。
−２６４ 、Ｙｖｅｓ−ＪａｃｑｕｃｓＳＣｈｎｅｉｄ
ｅｒ、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈ、、 １１Ｂ
（１９８９）６５−７７など）、いずれも、高濃度のク
エン酸鉄、エタノールアミン、アスコルビン酸（ビタミ
ンＣ）、ｆｆ（量元素類、およびホルモン類（エストラ
ジオール等）を従来の基本培地に添加したもので、マウ
スハイブリドーマの培養を可能としたが、組成が非常に
複雑である。
（発明か解決しようとする課題）
この発明の目的は、動物細胞用の培地としてタンパク質
成分および細胞成長因子、ホルモン類をまったく含有せ
ず、既知の化学物質（化成品）のみで構成される無タン
パク質完全合成培地の構成成分を提供することにある。
成分および細胞成長因子、ホルモン類をまったく含有せ
ず、既知の化学物質（化成品）のみで構成される無タン
パク質完全合成培地の構成成分を提供することにある。
また医学・生物学的研究用のみならず工業用にも利用で
きる安価でかつマウスハイブリドーマ、ヒト−ヒトハイ
ブリトーマ、ヒト癌細胞等の種々の動物細胞に適した無
タンパク質培地の調製法を提供することにある。
きる安価でかつマウスハイブリドーマ、ヒト−ヒトハイ
ブリトーマ、ヒト癌細胞等の種々の動物細胞に適した無
タンパク質培地の調製法を提供することにある。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、従来の細胞用基本合成培地に新規に既知
の低分子の化学物質（化成品）を添加するだけで、通常
の血清培地あるいは無血清培地と比較して十分使用可能
な無タンパク質完全合成培地を構成するような物質を検
索し、なるべく単純な組成の刊み合わせを検討した結果
、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、 ａ：クエン酸鉄、 ｂ＝エタノールアミン 及び Ｃ：リノール酸、オレイン酸またはタウリンを含有し、
蛋白質、細胞成長因子、ホルモン、ステロイドを含有し
ない細胞培養用完全合成培地である。
の低分子の化学物質（化成品）を添加するだけで、通常
の血清培地あるいは無血清培地と比較して十分使用可能
な無タンパク質完全合成培地を構成するような物質を検
索し、なるべく単純な組成の刊み合わせを検討した結果
、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、 ａ：クエン酸鉄、 ｂ＝エタノールアミン 及び Ｃ：リノール酸、オレイン酸またはタウリンを含有し、
蛋白質、細胞成長因子、ホルモン、ステロイドを含有し
ない細胞培養用完全合成培地である。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明の細胞培養用培地は、通常の細胞培養に用いられ
る無血清基本合成培地で、蛋白質、細胞成長因子、ホル
モン、ステロイドを含有しないものであれば特に限定は
ない。長期培養する場合あるいは高密度で培養する場合
にはアミノ酸類およびビタミン類を高濃度に含有した培
地、例えば市販品で汎用されているものとしてはＥ−Ｒ
ＤＦ培地（Ｈｉｒｏｋｉ Ｍｕｒａｋａｍｉ、 Ｎ１ｐ
ｐｏｎ Ｎｏｕｇｅｉｋａｇａｋｕｋａｊｓｈ４５ｇ（
１９８４）５７５−５８３） 、ＲＰ Ｍ Ｉ −１６
４０／ＤＭＥ／Ｆ −１，２（２二 １ ： １ ）
培地、 ＤＭＥ／Ｆ−１２（１： １）培地が適して
いる。
る無血清基本合成培地で、蛋白質、細胞成長因子、ホル
モン、ステロイドを含有しないものであれば特に限定は
ない。長期培養する場合あるいは高密度で培養する場合
にはアミノ酸類およびビタミン類を高濃度に含有した培
地、例えば市販品で汎用されているものとしてはＥ−Ｒ
ＤＦ培地（Ｈｉｒｏｋｉ Ｍｕｒａｋａｍｉ、 Ｎ１ｐ
ｐｏｎ Ｎｏｕｇｅｉｋａｇａｋｕｋａｊｓｈ４５ｇ（
１９８４）５７５−５８３） 、ＲＰ Ｍ Ｉ −１６
４０／ＤＭＥ／Ｆ −１，２（２二 １ ： １ ）
培地、 ＤＭＥ／Ｆ−１２（１： １）培地が適して
いる。
本発明の培地に添加するクエン酸鉄の濃度はＪａｎ Ｋ
ｏｖａｒ （ｌｔＹＢＲＩＤＯＭＡ、 ７（１９Ｈ）２
５５−２６３）の報告と異なり、１０〜５００μＭ程度
が好適であり、２５〜１００μＭが最も望ましい。
ｏｖａｒ （ｌｔＹＢＲＩＤＯＭＡ、 ７（１９Ｈ）２
５５−２６３）の報告と異なり、１０〜５００μＭ程度
が好適であり、２５〜１００μＭが最も望ましい。
添加するエタノールアミンの濃度は村上ら（特許公告昭
６３−１８４６３）の報告と異なり、２０〜５００μＭ
程度か好適であり、５０〜２００μＭか最も望ましい。
６３−１８４６３）の報告と異なり、２０〜５００μＭ
程度か好適であり、５０〜２００μＭか最も望ましい。
さらに、本発明の培地に添加する場合、リノール酸また
はオレイン酸の濃度は、０．１〜１μｇ／屈１程度か好
適で、０．２〜０．７μｇ／ｍｌか最も望ましい。
はオレイン酸の濃度は、０．１〜１μｇ／屈１程度か好
適で、０．２〜０．７μｇ／ｍｌか最も望ましい。
また、本発明の培地に添加する場合、タウリンの濃度は
、４〜１０００μＭ程度が好適で、５〜１００μＭか最
も望ましい。
、４〜１０００μＭ程度が好適で、５〜１００μＭか最
も望ましい。
以上のような添加成分の中で、クエン酸およびエタノー
ルアミンと共にリノール酸とタウリン、またはオレイン
酸とタウリンを添加するのか最も好ましい。細胞の培養
に最も適しているからである。
ルアミンと共にリノール酸とタウリン、またはオレイン
酸とタウリンを添加するのか最も好ましい。細胞の培養
に最も適しているからである。
またこれらの添加成分のほかに蛋白質、細胞成長因子、
ホルモン、ステロイド以外の第三成分を添加してもよい
。
ホルモン、ステロイド以外の第三成分を添加してもよい
。
（発明の効果）
本発明に示すように、基本合成培地にクエン酸鉄、エタ
ノールアミン、およびリノール酸、オレイン酸、又はタ
ウリンを添加すれば、細胞の培養に適した無タンパク質
完全合成培地を容易に調製することかできる。しかも、
従来の無タンパク質培地と異なり、成分組成が非常に簡
単であり、ヒト由来細胞を含めて種々の動物細胞を培養
できる。
ノールアミン、およびリノール酸、オレイン酸、又はタ
ウリンを添加すれば、細胞の培養に適した無タンパク質
完全合成培地を容易に調製することかできる。しかも、
従来の無タンパク質培地と異なり、成分組成が非常に簡
単であり、ヒト由来細胞を含めて種々の動物細胞を培養
できる。
これらの添加成分はいずれも、安価で入手が非常に容易
であり、かつ分子量か小さく無タンパク質培地を構成す
る成分として、無血清培地に含有されるタンパク質、成
長因子類にはない多くの望ましい特性を有している。
であり、かつ分子量か小さく無タンパク質培地を構成す
る成分として、無血清培地に含有されるタンパク質、成
長因子類にはない多くの望ましい特性を有している。
動物細胞を無血清培養して生理活性物質を産生させる場
合には、無血清培地中に含まれる数十μｇ／ｍｌから数
Ｂ／ｍｌ ７μ度のタンパク質から、細胞によって生産
された物質を精製しなければならず、生産物を高純度に
精製する場合には精製工程か複雑になり易いという問題
点がある。それに対して本発明の構成成分を添加して調
製された無タンノくり質培地を用いて生理活性物質を生
産すれば、培地自体は低分子量の成分で構成されており
タンパク質成分をまったく含有していないため、容易に
生産物を高純度に精製することか可能である。また、生
産した物質を人体に投与する場合には、目的物質以外の
タンパク質成分および発熱物質（パイロジエン）を完全
に除去する必要があるか、本発明のように低分子物質の
みから構成される無タンパク質培地であれば無血清培地
と異なり予め／くイロジェンを含まない培地を調製する
ことも容易である。
合には、無血清培地中に含まれる数十μｇ／ｍｌから数
Ｂ／ｍｌ ７μ度のタンパク質から、細胞によって生産
された物質を精製しなければならず、生産物を高純度に
精製する場合には精製工程か複雑になり易いという問題
点がある。それに対して本発明の構成成分を添加して調
製された無タンノくり質培地を用いて生理活性物質を生
産すれば、培地自体は低分子量の成分で構成されており
タンパク質成分をまったく含有していないため、容易に
生産物を高純度に精製することか可能である。また、生
産した物質を人体に投与する場合には、目的物質以外の
タンパク質成分および発熱物質（パイロジエン）を完全
に除去する必要があるか、本発明のように低分子物質の
みから構成される無タンパク質培地であれば無血清培地
と異なり予め／くイロジェンを含まない培地を調製する
ことも容易である。
本発明の培地を用いれば、これらの構成成分かいずれも
非常に安価なため、通常の無血清培地と比較して非常に
安価な無タンパク質培地を容易に調製することかでき、
細胞を大量培養して物質生産を行う場合には原材料費の
大幅なコストダウンを可能にする。
非常に安価なため、通常の無血清培地と比較して非常に
安価な無タンパク質培地を容易に調製することかでき、
細胞を大量培養して物質生産を行う場合には原材料費の
大幅なコストダウンを可能にする。
しかも、本発明の添加成分は、無血清培地に含有される
タンパク質、成長因子類等の生体由来物質をまったく含
まずすべて化成品であるため、これらの添加物を用いて
調製する無タンパク質完全合成培地は調製毎のロット開
蓋を生じることがなく、常に均質の培地を得ることが可
能である。
タンパク質、成長因子類等の生体由来物質をまったく含
まずすべて化成品であるため、これらの添加物を用いて
調製する無タンパク質完全合成培地は調製毎のロット開
蓋を生じることがなく、常に均質の培地を得ることが可
能である。
さらに、これらの添加成分は、無血清培地に含有される
タンパク質、成長因子類等と異なりいずれも大量に入手
することが容易であるとともに、従来の培地に較べて組
成が極めて単純なため、工業的規模で細胞の大量培養を
行う場合でも大量の培地調製は非常に容易である。
タンパク質、成長因子類等と異なりいずれも大量に入手
することが容易であるとともに、従来の培地に較べて組
成が極めて単純なため、工業的規模で細胞の大量培養を
行う場合でも大量の培地調製は非常に容易である。
本発明の培地を用いることにより、マウスハイブリドー
マ、ヒト−ヒトハイブリドーマ、さらにはヒトがん細胞
等種々の細胞の継代培養か可能であり、ハイブリドーマ
による単クローン抗体の生産等に十分使用できる。
マ、ヒト−ヒトハイブリドーマ、さらにはヒトがん細胞
等種々の細胞の継代培養か可能であり、ハイブリドーマ
による単クローン抗体の生産等に十分使用できる。
（実施例）
以下に、実施例を示、す。しかし本発明はこれら実施例
のみに限定されるものではない。
のみに限定されるものではない。
実施例１
３０ ｕ ｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Ｓ ｉ ｇ
ｍａ）（以下Ｔｆと略す）、２０μＭエタノールアミン
（ナカライテスク）、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（
ナカライテスク）、１．２ｇノｌ炭酸水素ナトリウムを
それぞれ添加して調製したＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬）
（以下、ＴＥＳ培地と略す）で継代していたマウスハイ
ブリドーマＡ２、Ｃ７、■７細胞を用いて、クエン酸鉄
の細胞増殖に及ぼす影響を検討した。
ｍａ）（以下Ｔｆと略す）、２０μＭエタノールアミン
（ナカライテスク）、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリウム（
ナカライテスク）、１．２ｇノｌ炭酸水素ナトリウムを
それぞれ添加して調製したＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬）
（以下、ＴＥＳ培地と略す）で継代していたマウスハイ
ブリドーマＡ２、Ｃ７、■７細胞を用いて、クエン酸鉄
の細胞増殖に及ぼす影響を検討した。
まず、クエン酸第二鉄（ナカライテスクンを純水に溶か
し、さらに４Ｎ水酸化ナトリウムを加えｐＨ６〜８に調
整して１００ｍＭクエン酸鉄溶液を調整した。ついで、
ＴＢＳ培地からトランスフェリンを除いて調整したＥＳ
培地に、リノール酸０−１μｇ／ｍｌ及び最終濃度０〜
５ｏｏμＭクエン酸鉄になるように１００ｍＭクエン酸
鉄溶液を添加した培地およびコントロールとして１０％
ウシ胎児血清あるいは最終濃度３０μｇ／ＦＩＴ ｆを
添加した培地に、ＴＥＳ培地で継代していたハイブリド
ーマを１ ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ａｔ 濃度でデイ
ツシュに植え込み、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、継代
３日日に生細胞数を計数して細胞の増殖を調べた。
し、さらに４Ｎ水酸化ナトリウムを加えｐＨ６〜８に調
整して１００ｍＭクエン酸鉄溶液を調整した。ついで、
ＴＢＳ培地からトランスフェリンを除いて調整したＥＳ
培地に、リノール酸０−１μｇ／ｍｌ及び最終濃度０〜
５ｏｏμＭクエン酸鉄になるように１００ｍＭクエン酸
鉄溶液を添加した培地およびコントロールとして１０％
ウシ胎児血清あるいは最終濃度３０μｇ／ＦＩＴ ｆを
添加した培地に、ＴＥＳ培地で継代していたハイブリド
ーマを１ ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ａｔ 濃度でデイ
ツシュに植え込み、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、継代
３日日に生細胞数を計数して細胞の増殖を調べた。
結果を図１に示す。
図１から明らかなように、１０〜５００μＭクエン酸鉄
を培地に添加することによりハイブリト−マは十分な増
殖を示し、濃度としては５０μＮ１か至適であった。
を培地に添加することによりハイブリト−マは十分な増
殖を示し、濃度としては５０μＮ１か至適であった。
そこで、５０μＭクエン酸鉄及び０．１ μｇ ／ ｍ
！リノール酸をＥＳ培地に加えて調製した培地（以下Ｆ
ＥＳ培地と略す）で、上記ハイブリドーマのうちＡ２、
Ｃ７細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一週間継代したのち、
最終濃度３０μｇ／ｎ＋ｒｔを添加したＦＥＳ培地での
増殖性を未添加の場合と比較した。Ｉ Ｘ １．０５ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ濃度で植え込み、継代３日日の細胞数を
表１に示す。明らかに、ハイブリトーマはいずれもＦＥ
Ｓ培地で十分増殖し、Ｔｆを添加した場合と差が認めら
れず、また図１の〕０９６血清添加の例に匹敵する増殖
を示した。
！リノール酸をＥＳ培地に加えて調製した培地（以下Ｆ
ＥＳ培地と略す）で、上記ハイブリドーマのうちＡ２、
Ｃ７細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一週間継代したのち、
最終濃度３０μｇ／ｎ＋ｒｔを添加したＦＥＳ培地での
増殖性を未添加の場合と比較した。Ｉ Ｘ １．０５ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌ濃度で植え込み、継代３日日の細胞数を
表１に示す。明らかに、ハイブリトーマはいずれもＦＥ
Ｓ培地で十分増殖し、Ｔｆを添加した場合と差が認めら
れず、また図１の〕０９６血清添加の例に匹敵する増殖
を示した。
表１
３日日に生細胞数を計数して細胞の増殖を調べた。
結果を図２に示す。図２から明らかなように、添加した
すべての濃度域においてハイブリドーマは十分な増殖を
示し、濃度としては１００μＭが至適であった。
すべての濃度域においてハイブリドーマは十分な増殖を
示し、濃度としては１００μＭが至適であった。
実施例２
実施例１のＦＥＳ培地で継代していたマウスハイブリド
ーマＣ７、Ｄ３細胞を用いて、エタノールアミンの細胞
増殖に及はす影響を検討した。
ーマＣ７、Ｄ３細胞を用いて、エタノールアミンの細胞
増殖に及はす影響を検討した。
まず、エタノールアミン（ナカライテスク）を純水に溶
かし、８０ｍＭエタノールアミン溶液を調整した。つい
でＦＥＳ培地に、最終濃度２０〜４２０μＭになるよう
に８０ｍＭエタノールアミン溶液を添加した培地に、Ｆ
ＥＳ培地で継代していたハイブリドーマをＩ Ｘ １．
０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ 濃度でデイツシュに植え込み
、３７℃、５％ＣＯ２て継代実施例３ 実施例１のＦＥＳ培地で継代していたマウスハイブリド
ーマＡ２、Ｃ７、■７細胞を用いて、リノール酸の細胞
増殖に及はす影響を検討した。
かし、８０ｍＭエタノールアミン溶液を調整した。つい
でＦＥＳ培地に、最終濃度２０〜４２０μＭになるよう
に８０ｍＭエタノールアミン溶液を添加した培地に、Ｆ
ＥＳ培地で継代していたハイブリドーマをＩ Ｘ １．
０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ 濃度でデイツシュに植え込み
、３７℃、５％ＣＯ２て継代実施例３ 実施例１のＦＥＳ培地で継代していたマウスハイブリド
ーマＡ２、Ｃ７、■７細胞を用いて、リノール酸の細胞
増殖に及はす影響を検討した。
まず、リノール酸（ナカライテスク）をエタノールに溶
かし、２００ ｍｇ／ｍｌ リノール酸溶液を調整し
た。ついで、ＦＥＳ培地に最終濃度０．０２〜２０μｇ
／ｍｌにな乞ようにリノール酸溶液を添加した培地に、
ＦＥＳ培地で継代していたハイブリドーマをＩ Ｘ １
０５ｃｅｌｌｓノｍｌ ｆａ度でデイツシュに植え込
み、３７℃、５％ＣＯ２で継代３日日に生細胞数を計数
して細胞の増殖を調べた。結果を図３に示す。ハイブリ
ドーマは十分な増殖を示し、濃度としては０．５μｇ／
ｍ ｌが至適であった。
かし、２００ ｍｇ／ｍｌ リノール酸溶液を調整し
た。ついで、ＦＥＳ培地に最終濃度０．０２〜２０μｇ
／ｍｌにな乞ようにリノール酸溶液を添加した培地に、
ＦＥＳ培地で継代していたハイブリドーマをＩ Ｘ １
０５ｃｅｌｌｓノｍｌ ｆａ度でデイツシュに植え込
み、３７℃、５％ＣＯ２で継代３日日に生細胞数を計数
して細胞の増殖を調べた。結果を図３に示す。ハイブリ
ドーマは十分な増殖を示し、濃度としては０．５μｇ／
ｍ ｌが至適であった。
実施例４
実施例１のＦＥＳ培地で継代していたマウスハイブリド
ーマＡ２、Ｃ７，１７細胞を用いて、タウリンの細胞増
殖に及ぼす影響を検討した。まず、タウリン（ナカライ
テスク）を純水に溶かし、２００ｍＭタウリン溶液を調
整した。ついで、５０μＭクエン鉄を加えたＥＳ培地に
最終濃度Ｏ〜１０００μＭになるようにタウリン溶液を
添加した培地に、ＦＥＳ培地で継代していたハイブリド
ーマをＩ Ｘ １．０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度でデイツ
シュに植え込み、３７℃、５％ＣＯ２で継代３日目に生
細胞数を計数して細胞の増殖を調べた。結果を図４に示
す。明らかに、添加したすべての濃度域においてハイブ
リドーマは十分な増殖を示し、濃度としては】０μＭが
至適であった。
ーマＡ２、Ｃ７，１７細胞を用いて、タウリンの細胞増
殖に及ぼす影響を検討した。まず、タウリン（ナカライ
テスク）を純水に溶かし、２００ｍＭタウリン溶液を調
整した。ついで、５０μＭクエン鉄を加えたＥＳ培地に
最終濃度Ｏ〜１０００μＭになるようにタウリン溶液を
添加した培地に、ＦＥＳ培地で継代していたハイブリド
ーマをＩ Ｘ １．０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度でデイツ
シュに植え込み、３７℃、５％ＣＯ２で継代３日目に生
細胞数を計数して細胞の増殖を調べた。結果を図４に示
す。明らかに、添加したすべての濃度域においてハイブ
リドーマは十分な増殖を示し、濃度としては】０μＭが
至適であった。
実施例５
実施例１のＥ−ＲＤＦ培地に５０μＭクエン酸第二鉄、
１００μＭエタノールアミン、０．５μｇ／ｎ ｌリノ
ール酸、１０μＭタウリン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリ
ウム、１．２ｇ／Ｉ炭酸水素ナトリウムをそれぞれ添加
して調製無タンパク質培地（以下、ＰＦＣ培地と略す）
で、−週間継代したヒト−ヒトハイブリドーマＣ５細胞
（Ｍｕｒａｋａｆｆｉｉ。
１００μＭエタノールアミン、０．５μｇ／ｎ ｌリノ
ール酸、１０μＭタウリン、２５ｎＭ亜セレン酸ナトリ
ウム、１．２ｇ／Ｉ炭酸水素ナトリウムをそれぞれ添加
して調製無タンパク質培地（以下、ＰＦＣ培地と略す）
で、−週間継代したヒト−ヒトハイブリドーマＣ５細胞
（Ｍｕｒａｋａｆｆｉｉ。
Ｈ，ｅｔ、ａｌ、 Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅ１１． Ｄ
ｅｖｅｌｏｐ、 Ｂｉｏｌ、、 ２１ ：５９３−５９
６ ； １９８５ ）を用いて、１０％ウシ胎児血清を
添加したＰＦＣ培地での増殖性を未添加の場合と比較し
た。
ｅｖｅｌｏｐ、 Ｂｉｏｌ、、 ２１ ：５９３−５９
６ ； １９８５ ）を用いて、１０％ウシ胎児血清を
添加したＰＦＣ培地での増殖性を未添加の場合と比較し
た。
Ｉ Ｘ １０’ ｃｅｌｌｓ／ａｌｌ 濃度でデイツ
シュに植え込み、３７℃、５％ＣＯ２で培養３日目の細
胞数をカウントしたところ血清添加培地では８．０Ｘ１
０’ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、未添加の場合には５． Ｉ Ｘ
１０’ ｃｅｌｌｓ／１１１であった。ＰＦＣ培地中
での０５の増殖は１０％血清を添加した場合に較べ多少
劣るものの、十分増殖することが示された。
シュに植え込み、３７℃、５％ＣＯ２で培養３日目の細
胞数をカウントしたところ血清添加培地では８．０Ｘ１
０’ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、未添加の場合には５． Ｉ Ｘ
１０’ ｃｅｌｌｓ／１１１であった。ＰＦＣ培地中
での０５の増殖は１０％血清を添加した場合に較べ多少
劣るものの、十分増殖することが示された。
実施例６
本発明の培地を用いて、ハイブリドーマによる単クロー
ン抗体の生産が可能か検討するために、実施例５のＰＦ
Ｃ培地を用いて、マウスハイブリドーマＤ３細胞を培養
した。
ン抗体の生産が可能か検討するために、実施例５のＰＦ
Ｃ培地を用いて、マウスハイブリドーマＤ３細胞を培養
した。
ＰＦＣ培地で一週間継代したＤ３細胞をＩ Ｘ １０５
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ 濃度でデイツシュに植え込み、３
７℃、５％ＣＯ２で４日間培養した時の細胞増殖と細胞
が産生じた培地中の抗体濃度を、固相酵素免疫測定法に
より経時的に測定した。結果を図５に示す。
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ 濃度でデイツシュに植え込み、３
７℃、５％ＣＯ２で４日間培養した時の細胞増殖と細胞
が産生じた培地中の抗体濃度を、固相酵素免疫測定法に
より経時的に測定した。結果を図５に示す。
図５から明らかなように細胞数及び抗体量共に増加した
。
。
実施例７
ハイブリドーマ以外の細胞としてヒト結腸癌細胞Ｃ０Ｌ
Ｏ２０１のＰＦＣ培地中での増殖を検討した。１０％ウ
シ胎児血清を添加したＤＭＥ培地を用いて継代していた
Ｃ０ＬＯ２０１細胞をトリプシン溶液で単細胞化してＰ
ＦＣ培地中にＩ Ｘ １０５ｅｅｌ Ｉｓ／ｍｌ ６
度で植え込み、３７℃、５％Ｃ０２で４日間培養した時
の細胞増殖を調べた。
Ｏ２０１のＰＦＣ培地中での増殖を検討した。１０％ウ
シ胎児血清を添加したＤＭＥ培地を用いて継代していた
Ｃ０ＬＯ２０１細胞をトリプシン溶液で単細胞化してＰ
ＦＣ培地中にＩ Ｘ １０５ｅｅｌ Ｉｓ／ｍｌ ６
度で植え込み、３７℃、５％Ｃ０２で４日間培養した時
の細胞増殖を調べた。
結果を図６に示す。
Ｃ０ＬＯ２０１は血清添加培地ではデイツシュに付着し
て増殖するが、ＰＦＣ培地中では浮遊状態で増殖した。
て増殖するが、ＰＦＣ培地中では浮遊状態で増殖した。
図６に示すようにＰＦＣ培地で増殖可能であり、また、
長期間継代可能であった。
長期間継代可能であった。
図１〜４は、それぞれ実施例１〜４において測定した各
成分の濃度と細胞数との関係を表す図である。図５は、
実施例６における抗体量、細胞数の経時変化を示す図で
ある。図６は実施例７における細胞数の経時変化を示す
図である。
成分の濃度と細胞数との関係を表す図である。図５は、
実施例６における抗体量、細胞数の経時変化を示す図で
ある。図６は実施例７における細胞数の経時変化を示す
図である。
Claims (2)
- （１）ａ：クエン酸鉄、 ｂ：エタノールアミン 及び ｃ：リノール酸、オレイン酸またはタウリンを含有し、
蛋白質、細胞成長因子、ホルモン、ステロイドを含有し
ない細胞培養用完全合成培地。 - （２）請求項（１）記載の培地において、リノール酸と
タウリン、またはオレイン酸とタウリンを含有する培地
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1329454A JP2897043B2 (ja) | 1989-12-21 | 1989-12-21 | 完全合成培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1329454A JP2897043B2 (ja) | 1989-12-21 | 1989-12-21 | 完全合成培地 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0491786A true JPH0491786A (ja) | 1992-03-25 |
| JP2897043B2 JP2897043B2 (ja) | 1999-05-31 |
Family
ID=18221559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1329454A Expired - Lifetime JP2897043B2 (ja) | 1989-12-21 | 1989-12-21 | 完全合成培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2897043B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021112215A (ja) * | 2015-08-04 | 2021-08-05 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
-
1989
- 1989-12-21 JP JP1329454A patent/JP2897043B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021112215A (ja) * | 2015-08-04 | 2021-08-05 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
| JP2022162157A (ja) * | 2015-08-04 | 2022-10-21 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2897043B2 (ja) | 1999-05-31 |
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