JPH0499489A - 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ - Google Patents

耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ

Info

Publication number
JPH0499489A
JPH0499489A JP7723090A JP7723090A JPH0499489A JP H0499489 A JPH0499489 A JP H0499489A JP 7723090 A JP7723090 A JP 7723090A JP 7723090 A JP7723090 A JP 7723090A JP H0499489 A JPH0499489 A JP H0499489A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
heat
pullulanase
resistant pullulanase
resistant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP7723090A
Other languages
English (en)
Inventor
Shigetaka Okada
岡田 茂孝
Tadayuki Imanaka
忠行 今中
Takashi Kuriki
隆 栗木
Hiroki Takada
洋樹 高田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ezaki Glico Co Ltd
Original Assignee
Ezaki Glico Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ezaki Glico Co Ltd filed Critical Ezaki Glico Co Ltd
Priority to JP7723090A priority Critical patent/JPH0499489A/ja
Publication of JPH0499489A publication Critical patent/JPH0499489A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 1)産業上の利用分野 本発明は、耐熱性プルラナーゼ遭仏子、それを含有する
組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼに関し、そ
の産業上への利用を計るものである。
2)従来技術とその課題 耐熱性プルラナーゼは本発明6客によって発見された耐
熱性が良好なプルラナーゼであり、プルランを加水分解
し最終的にマルトトリオースを生じるN%である(特願
昭63−174037またはApDlied and 
EnvironIental  Hicrobiolo
gy、第54巻、第2881頁、(1988年))。
プルラナーゼはプルランや、でん粉中のα−1゜6−グ
ルコシド結合を分解する酵素であるが、分岐オリゴ糖や
多糖類のII4造決定に多用されている。
この他プルラナーゼはでん粉より貢性化糖を生産する工
程のうち、グルコースを生産する段階においてグルコア
ミラーゼとともに使用すれば、ブドウ糖の収率が向上し
、またでん粉よりマルトースを生産する場合β−アミラ
ーゼとともに使用すればマルトースの収率が向上して有
利である。これらの反応は60℃以上の高温で行うこと
が望ましく、この温度においても安定かつ活性をもつ耐
熱性プルラナーゼは工業的に有用である。従来この温度
で耐熱性を示づプルラナーゼはほとんどなかったため、
本発明者等によって、耐熱性プルラナーゼの応用研究が
進められている。
また耐熱性プルラナーゼの遺伝子を組み込んだプラスミ
ドも既に本発明者等により光間されているが(vI願昭
63−174037) 、当該酵素遺伝子についての詳
細な知見がないため、耐熱性プルラナーゼを大量に生産
させるべき遺伝子工学的手段を講じることやタンパク賀
工学的手法による当該#11素自身の改良を行うことが
困ガであった。
3)課題解決の手段 本発明者等は、これらの課題を解決すべくバチナーゼ遺
伝子を含む2371塩基対のDNA断ハの全塩基配列を
決定し、耐熱性プルラナーゼ遺伝子のmlを明らかにす
ると共に、耐熱性プルラナーゼ蛋白の構造(アミノ酸配
列)を明らかにし、本発明を完成するに至った。以下に
、本発明の具体的な手段を実施例により説明する。
4)実施例 A)耐熱性プルラナーゼ遺伝子の取得 耐熱性プルラナーゼ遺伝子の材料としては、発明@等に
よるpTPI <特願昭63−174037またはAp
plied and Environnental H
icrobiology、第54巻、第2881頁(1
988))を用いた。本プラスミドには、前述のBac
illus  5tearother11ophilu
sTR5128株由来の耐熱性プルラナーゼ遺伝子が組
み込まれており、その作成方法については上記明細出、
または報文において述べたのと同様な手段によった。
3 ) DNA塩基配列の決定 プラスミドplP1を各種制限酵素を用いて分解し、プ
ラスミドpUc118/119に組み込んだ後、ヘルパ
ー71−ジ H13KO7により一本#DNへを調製し
、dideoxy法で塩基配列の決定した。
(第1図)。決定された塩基配列は2371塩基対より
なり、耐熱性プルラナーゼ遺伝子(匣)の全領域を含ん
でいる。第1図の塩基配列中には、78番目のITGと
、24949番目1Gの2つの翻訳開始コドン候補が存
在したが、下記において述べる方法により、後者が開始
コドンであると決定した。この24949番目TGから
始まり、2223番目の■ΔAで終わる。1974塩基
対のオーブンリーディングフレームが耐熱性プルラナー
ゼに対応する。
ATG開始コドンの6塩基rJにAGGAGのリボツム
パインディングサイトが存在する。ブロモター領域の−
35,−10については、10番目にTTGCACと3
6番目にTATGAIが見いだされる。また、オーブン
リーディングフレームに対応するペプチドのC末端から
103塩基下流には転写におけるターミネータ−として
機能しうる逆方向反復配列が認められりた。
C)翻訳開始コドンの決定 前述のように、第1図の塩基配列中には、78番目のT
TG(11)24949番目TG(12)の2つのII
翻訳開始コドン候補存在した。どちらが翻訳開始コドン
か決定するため、11のけ化コドンへの変異f11−.
 TAG→丁^G ) 、 Jl及びj2の停廿コドン
ヘノq 巽(XX幻112 )Q、TlcX−TAG、
AIG −TAG)、11の停止コドンへの変異及び1
1と12の間に存在づるリボソームパインディング勺イ
トの直Ijへの−jg基挿入(11−F、TTG −T
^G、 23030番目^の挿入)の各貢変をもつ遺伝
子を通常の部位特興的変興操作により作成したく第2図
)。
11−及び11ゴではプルラナーゼ生産性に変化は認め
られなかったが、1l−I2−ではプルラナーゼ生産性
が完全に消失した。これらのことより、翻訳開始コドン
はI2であることが決定された。
5)発明の効果 本発明により耐熱性プルラナーゼを適当な宿主で大量生
産することや、タンパク質工学的手洗により酊素を改良
することなどの手段が講じられることとなった。
D)アミノ酸配列(式■)及びアミノ酸組成決定された
耐熱性プルラナーゼ遺伝子の塩基配列より推定されるア
ミノ酸配列から耐熱性プルラナーゼは658のアミノ酸
残塁からなる分子175.375ダルトンのM素である
と考えられた。
実際にr#製した耐熱性プルラナーゼの分子量はSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約83.000
と推定されており(^pHied and Envir
nr+nental Hicrobiology、第5
4巻、第2881頁(1988))、誤差の範囲内でほ
ぼ一致していた。
手 続 補 正 書 方 式) %式% 1、事件の表示 平成2年特許願第77230号 補正をする者 事件との関係 特許出願人 〒555 代表取締役  江 崎 勝 久 −3 = 電話 06−472−1221 1>(il 4、補正命令の日付(発送口) 平成3年10月22日 5、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明及び図面 6、補正の内容 本願明細書の第16頁の上から第6行以下に次の文を追
加する。
【図面の簡単な説明】
図J ・・・ 制御領域を含む耐熱性プルラナーゼ遺伝
子の塩基配列 図2 ・・・ 開始コドン決定のための部位特異的変異
操作を行った制御 領域を含む耐熱性プルラナー ゼ遺伝子の塩基配列    j 本願明細書に添付された6枚の図面を本手続補正書に添
付された6枚の図面に差し替える。 7 添付書類の目録 第1図その1、第1図その2、第1図その3第1図その
4、第1図その5及び第2図。 史

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)下記の式 I で表された塩基配列、またはそれと実
    質的に同等な配列を有する耐熱性プルラナーゼ遺伝子。 2)下記の式 I で表される耐熱性プルラナーゼ遺伝子
    、またはそれと実質的に同等な遺伝子を含有する組換え
    プラスミド。 3)下記の式IIで表されるアミノ酸配列またはそれと実
    質的に同等なアミノ酸配列を有する耐熱性プルラナーゼ
    。 式 I 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 式II 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
JP7723090A 1990-03-27 1990-03-27 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ Pending JPH0499489A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7723090A JPH0499489A (ja) 1990-03-27 1990-03-27 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7723090A JPH0499489A (ja) 1990-03-27 1990-03-27 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0499489A true JPH0499489A (ja) 1992-03-31

Family

ID=13628060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP7723090A Pending JPH0499489A (ja) 1990-03-27 1990-03-27 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH0499489A (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0223872A (ja) * 1988-07-12 1990-01-26 Ezaki Glico Co Ltd 組換えプラスミド,それにより形質転換された枯草菌及びそれによる耐熱性プルラナーゼの製造法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0223872A (ja) * 1988-07-12 1990-01-26 Ezaki Glico Co Ltd 組換えプラスミド,それにより形質転換された枯草菌及びそれによる耐熱性プルラナーゼの製造法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Frandsen et al. Site-directed mutagenesis of the catalytic base glutamic acid 400 in glucoamylase from Aspergillus niger and of tyrosine 48 and glutamine 401, both hydrogen-bonded to the. gamma.-carboxylate group of glutamic acid 400
Prakash et al. α-Amylase: an ideal representative of thermostable enzymes
Hennig et al. Crystal structure at 2.0 Å resolution of phosphoribosyl anthranilate isomerase from the hyperthermophile Thermotoga maritima: possible determinants of protein stability
JP2582787B2 (ja) キメラ酵素
Beier et al. Conversion of the maltogenic α-amylase Novamyl into a CGTase
CA2112028A1 (fr) Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci
JP2010154865A (ja) グルコアミラーゼ変異体
Fierobe et al. Mutational modulation of substrate bond-type specificity and thermostability of glucoamylase from Aspergillus awamori by replacement with short homologue active site sequences and thiol/disulfide engineering
JP2002519054A (ja) 澱粉枝切り酵素
JPH03501925A (ja) 合成遺伝子
Vihinen et al. C-terminal truncations of a thermostable Bacillus stearothermophilus α-amylase
CN103805579B (zh) 一种热稳定的淀粉酶突变体及其制备方法和应用
JPH0499489A (ja) 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ
JPH10501694A (ja) ピロジクチウム・キシラナーゼ、アミラーゼ及びプルラナーゼ
CN101189331A (zh) 包含淀粉结合部位的重组蛋白质及其用途
CA2352046A1 (en) Glucoamylases with n-terminal extensions
JP3124655B2 (ja) 超好熱性古細菌由来α−アミラーゼ
Jenness et al. Genetic characterization of the folding domains of the catalytic chains in aspartate transcarbamoylase.
KR100898384B1 (ko) 내열성 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 당전이효소 및 이를이용한 분지 사이클로덱스트린의 제조방법
Diderichsen et al. Cloning and expression of an amylase gene from Bacillus stearothermophilus
DE69429479T2 (de) Dna fragment welches ein gen für eine alkaline pullulanase beinhaltet
JPH0565157B2 (ja)
CN114196656A (zh) 一种蛋白酶k突变体及其表达载体的构建和应用
JP3036002B2 (ja) キャンデイダ・ユテイリス由来のade1遺伝子を含有するdna断片
JPH03251183A (ja) デンプン分解活性酵素遺伝子の創製方法及び創製された遺伝子