JPH0499489A - 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ - Google Patents
耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼInfo
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- JPH0499489A JPH0499489A JP7723090A JP7723090A JPH0499489A JP H0499489 A JPH0499489 A JP H0499489A JP 7723090 A JP7723090 A JP 7723090A JP 7723090 A JP7723090 A JP 7723090A JP H0499489 A JPH0499489 A JP H0499489A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
1)産業上の利用分野
本発明は、耐熱性プルラナーゼ遭仏子、それを含有する
組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼに関し、そ
の産業上への利用を計るものである。
組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼに関し、そ
の産業上への利用を計るものである。
2)従来技術とその課題
耐熱性プルラナーゼは本発明6客によって発見された耐
熱性が良好なプルラナーゼであり、プルランを加水分解
し最終的にマルトトリオースを生じるN%である(特願
昭63−174037またはApDlied and
EnvironIental Hicrobiolo
gy、第54巻、第2881頁、(1988年))。
熱性が良好なプルラナーゼであり、プルランを加水分解
し最終的にマルトトリオースを生じるN%である(特願
昭63−174037またはApDlied and
EnvironIental Hicrobiolo
gy、第54巻、第2881頁、(1988年))。
プルラナーゼはプルランや、でん粉中のα−1゜6−グ
ルコシド結合を分解する酵素であるが、分岐オリゴ糖や
多糖類のII4造決定に多用されている。
ルコシド結合を分解する酵素であるが、分岐オリゴ糖や
多糖類のII4造決定に多用されている。
この他プルラナーゼはでん粉より貢性化糖を生産する工
程のうち、グルコースを生産する段階においてグルコア
ミラーゼとともに使用すれば、ブドウ糖の収率が向上し
、またでん粉よりマルトースを生産する場合β−アミラ
ーゼとともに使用すればマルトースの収率が向上して有
利である。これらの反応は60℃以上の高温で行うこと
が望ましく、この温度においても安定かつ活性をもつ耐
熱性プルラナーゼは工業的に有用である。従来この温度
で耐熱性を示づプルラナーゼはほとんどなかったため、
本発明者等によって、耐熱性プルラナーゼの応用研究が
進められている。
程のうち、グルコースを生産する段階においてグルコア
ミラーゼとともに使用すれば、ブドウ糖の収率が向上し
、またでん粉よりマルトースを生産する場合β−アミラ
ーゼとともに使用すればマルトースの収率が向上して有
利である。これらの反応は60℃以上の高温で行うこと
が望ましく、この温度においても安定かつ活性をもつ耐
熱性プルラナーゼは工業的に有用である。従来この温度
で耐熱性を示づプルラナーゼはほとんどなかったため、
本発明者等によって、耐熱性プルラナーゼの応用研究が
進められている。
また耐熱性プルラナーゼの遺伝子を組み込んだプラスミ
ドも既に本発明者等により光間されているが(vI願昭
63−174037) 、当該酵素遺伝子についての詳
細な知見がないため、耐熱性プルラナーゼを大量に生産
させるべき遺伝子工学的手段を講じることやタンパク賀
工学的手法による当該#11素自身の改良を行うことが
困ガであった。
ドも既に本発明者等により光間されているが(vI願昭
63−174037) 、当該酵素遺伝子についての詳
細な知見がないため、耐熱性プルラナーゼを大量に生産
させるべき遺伝子工学的手段を講じることやタンパク賀
工学的手法による当該#11素自身の改良を行うことが
困ガであった。
3)課題解決の手段
本発明者等は、これらの課題を解決すべくバチナーゼ遺
伝子を含む2371塩基対のDNA断ハの全塩基配列を
決定し、耐熱性プルラナーゼ遺伝子のmlを明らかにす
ると共に、耐熱性プルラナーゼ蛋白の構造(アミノ酸配
列)を明らかにし、本発明を完成するに至った。以下に
、本発明の具体的な手段を実施例により説明する。
伝子を含む2371塩基対のDNA断ハの全塩基配列を
決定し、耐熱性プルラナーゼ遺伝子のmlを明らかにす
ると共に、耐熱性プルラナーゼ蛋白の構造(アミノ酸配
列)を明らかにし、本発明を完成するに至った。以下に
、本発明の具体的な手段を実施例により説明する。
4)実施例
A)耐熱性プルラナーゼ遺伝子の取得
耐熱性プルラナーゼ遺伝子の材料としては、発明@等に
よるpTPI <特願昭63−174037またはAp
plied and Environnental H
icrobiology、第54巻、第2881頁(1
988))を用いた。本プラスミドには、前述のBac
illus 5tearother11ophilu
sTR5128株由来の耐熱性プルラナーゼ遺伝子が組
み込まれており、その作成方法については上記明細出、
または報文において述べたのと同様な手段によった。
よるpTPI <特願昭63−174037またはAp
plied and Environnental H
icrobiology、第54巻、第2881頁(1
988))を用いた。本プラスミドには、前述のBac
illus 5tearother11ophilu
sTR5128株由来の耐熱性プルラナーゼ遺伝子が組
み込まれており、その作成方法については上記明細出、
または報文において述べたのと同様な手段によった。
3 ) DNA塩基配列の決定
プラスミドplP1を各種制限酵素を用いて分解し、プ
ラスミドpUc118/119に組み込んだ後、ヘルパ
ー71−ジ H13KO7により一本#DNへを調製し
、dideoxy法で塩基配列の決定した。
ラスミドpUc118/119に組み込んだ後、ヘルパ
ー71−ジ H13KO7により一本#DNへを調製し
、dideoxy法で塩基配列の決定した。
(第1図)。決定された塩基配列は2371塩基対より
なり、耐熱性プルラナーゼ遺伝子(匣)の全領域を含ん
でいる。第1図の塩基配列中には、78番目のITGと
、24949番目1Gの2つの翻訳開始コドン候補が存
在したが、下記において述べる方法により、後者が開始
コドンであると決定した。この24949番目TGから
始まり、2223番目の■ΔAで終わる。1974塩基
対のオーブンリーディングフレームが耐熱性プルラナー
ゼに対応する。
なり、耐熱性プルラナーゼ遺伝子(匣)の全領域を含ん
でいる。第1図の塩基配列中には、78番目のITGと
、24949番目1Gの2つの翻訳開始コドン候補が存
在したが、下記において述べる方法により、後者が開始
コドンであると決定した。この24949番目TGから
始まり、2223番目の■ΔAで終わる。1974塩基
対のオーブンリーディングフレームが耐熱性プルラナー
ゼに対応する。
ATG開始コドンの6塩基rJにAGGAGのリボツム
パインディングサイトが存在する。ブロモター領域の−
35,−10については、10番目にTTGCACと3
6番目にTATGAIが見いだされる。また、オーブン
リーディングフレームに対応するペプチドのC末端から
103塩基下流には転写におけるターミネータ−として
機能しうる逆方向反復配列が認められりた。
パインディングサイトが存在する。ブロモター領域の−
35,−10については、10番目にTTGCACと3
6番目にTATGAIが見いだされる。また、オーブン
リーディングフレームに対応するペプチドのC末端から
103塩基下流には転写におけるターミネータ−として
機能しうる逆方向反復配列が認められりた。
C)翻訳開始コドンの決定
前述のように、第1図の塩基配列中には、78番目のT
TG(11)24949番目TG(12)の2つのII
翻訳開始コドン候補存在した。どちらが翻訳開始コドン
か決定するため、11のけ化コドンへの変異f11−.
TAG→丁^G ) 、 Jl及びj2の停廿コドン
ヘノq 巽(XX幻112 )Q、TlcX−TAG、
AIG −TAG)、11の停止コドンへの変異及び1
1と12の間に存在づるリボソームパインディング勺イ
トの直Ijへの−jg基挿入(11−F、TTG −T
^G、 23030番目^の挿入)の各貢変をもつ遺伝
子を通常の部位特興的変興操作により作成したく第2図
)。
TG(11)24949番目TG(12)の2つのII
翻訳開始コドン候補存在した。どちらが翻訳開始コドン
か決定するため、11のけ化コドンへの変異f11−.
TAG→丁^G ) 、 Jl及びj2の停廿コドン
ヘノq 巽(XX幻112 )Q、TlcX−TAG、
AIG −TAG)、11の停止コドンへの変異及び1
1と12の間に存在づるリボソームパインディング勺イ
トの直Ijへの−jg基挿入(11−F、TTG −T
^G、 23030番目^の挿入)の各貢変をもつ遺伝
子を通常の部位特興的変興操作により作成したく第2図
)。
11−及び11ゴではプルラナーゼ生産性に変化は認め
られなかったが、1l−I2−ではプルラナーゼ生産性
が完全に消失した。これらのことより、翻訳開始コドン
はI2であることが決定された。
られなかったが、1l−I2−ではプルラナーゼ生産性
が完全に消失した。これらのことより、翻訳開始コドン
はI2であることが決定された。
5)発明の効果
本発明により耐熱性プルラナーゼを適当な宿主で大量生
産することや、タンパク質工学的手洗により酊素を改良
することなどの手段が講じられることとなった。
産することや、タンパク質工学的手洗により酊素を改良
することなどの手段が講じられることとなった。
D)アミノ酸配列(式■)及びアミノ酸組成決定された
耐熱性プルラナーゼ遺伝子の塩基配列より推定されるア
ミノ酸配列から耐熱性プルラナーゼは658のアミノ酸
残塁からなる分子175.375ダルトンのM素である
と考えられた。
耐熱性プルラナーゼ遺伝子の塩基配列より推定されるア
ミノ酸配列から耐熱性プルラナーゼは658のアミノ酸
残塁からなる分子175.375ダルトンのM素である
と考えられた。
実際にr#製した耐熱性プルラナーゼの分子量はSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約83.000
と推定されており(^pHied and Envir
。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約83.000
と推定されており(^pHied and Envir
。
nr+nental Hicrobiology、第5
4巻、第2881頁(1988))、誤差の範囲内でほ
ぼ一致していた。
4巻、第2881頁(1988))、誤差の範囲内でほ
ぼ一致していた。
手
続
補
正
書
方
式)
%式%
1、事件の表示
平成2年特許願第77230号
補正をする者
事件との関係 特許出願人
〒555
代表取締役 江 崎 勝 久 −3
=
電話 06−472−1221
1>(il
4、補正命令の日付(発送口)
平成3年10月22日
5、補正の対象
明細書の図面の簡単な説明及び図面
6、補正の内容
本願明細書の第16頁の上から第6行以下に次の文を追
加する。
加する。
図J ・・・ 制御領域を含む耐熱性プルラナーゼ遺伝
子の塩基配列 図2 ・・・ 開始コドン決定のための部位特異的変異
操作を行った制御 領域を含む耐熱性プルラナー ゼ遺伝子の塩基配列 j 本願明細書に添付された6枚の図面を本手続補正書に添
付された6枚の図面に差し替える。 7 添付書類の目録 第1図その1、第1図その2、第1図その3第1図その
4、第1図その5及び第2図。 史
子の塩基配列 図2 ・・・ 開始コドン決定のための部位特異的変異
操作を行った制御 領域を含む耐熱性プルラナー ゼ遺伝子の塩基配列 j 本願明細書に添付された6枚の図面を本手続補正書に添
付された6枚の図面に差し替える。 7 添付書類の目録 第1図その1、第1図その2、第1図その3第1図その
4、第1図その5及び第2図。 史
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)下記の式 I で表された塩基配列、またはそれと実
質的に同等な配列を有する耐熱性プルラナーゼ遺伝子。 2)下記の式 I で表される耐熱性プルラナーゼ遺伝子
、またはそれと実質的に同等な遺伝子を含有する組換え
プラスミド。 3)下記の式IIで表されるアミノ酸配列またはそれと実
質的に同等なアミノ酸配列を有する耐熱性プルラナーゼ
。 式 I 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 式II 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7723090A JPH0499489A (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7723090A JPH0499489A (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0499489A true JPH0499489A (ja) | 1992-03-31 |
Family
ID=13628060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7723090A Pending JPH0499489A (ja) | 1990-03-27 | 1990-03-27 | 耐熱性プルラナーゼ遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性プルラナーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0499489A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0223872A (ja) * | 1988-07-12 | 1990-01-26 | Ezaki Glico Co Ltd | 組換えプラスミド,それにより形質転換された枯草菌及びそれによる耐熱性プルラナーゼの製造法 |
-
1990
- 1990-03-27 JP JP7723090A patent/JPH0499489A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0223872A (ja) * | 1988-07-12 | 1990-01-26 | Ezaki Glico Co Ltd | 組換えプラスミド,それにより形質転換された枯草菌及びそれによる耐熱性プルラナーゼの製造法 |
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