JPH0565157B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、多糖体を構成しているグルコース
のα−1.6結合を加水分解する能力を有するプル
ラナーゼのうち耐熱性が良好であるもの（以下、
耐熱性プルラナーゼという）を製造する方法と、
かかる酵素遺伝子を含むプラスミド並びにそのプ
ラスミドを有する枯草菌にかかわるものである。 従来の技術及び本発明が解決しようとする課
題 プルラナーゼはプルランやでん粉中のα−1.6
結合を分解する酵素であるが、分岐オリゴ糖や多
糖類の構造決定に多用されている。 またプルラナーゼはでん粉より異性化糖を生産
する行程のうち、グルコースを生産する段階にお
いて、グルコアミラーゼとともに使用すれば、ブ
ドウ糖の収率が向上して有利である。この作用条
件は60℃〜65℃であるので耐熱性プルラナーゼと
はこの温度に耐える耐熱性をもつた酵素である。
従来この温度で耐熱性を示すプルラナーゼはほと
んどなく、バチルス ステアロサーモフイルス
TRS128株の場合は酵素は安定であるが生産量が
少い。このため濃縮して産業用酵素とすると付属
する酵素による副反応がいちぢるしく、実用的で
ない。 この発明ではかかる現状に鑑み、耐熱性プルラ
ナーゼの遺伝子を常温菌である枯草菌に遺伝子工
学的手法により組み込むことにより、純度の高い
耐熱性プルラナーゼを容易に調製できるようにし
たものである。 耐熱性プルラナーゼ又はその関連酵素の遺伝子
をクローン化した例としては、サーモアネロビウ
ム ブロツキー（Thermoanaerobium brockii）
のデブランチング エンザイム（debranching
enzyme）遺伝子の大腸菌と枯草菌中でのクロー
ン化（ジヤーナル オブ バクテリオロジー
（Journal of Bacteriology）第169巻、第4302〜
4307頁、1987年）とサーマス スペシーズ
（Thermus sp.）のプルラナーゼの大腸菌中での
クローン化（エフ イー エム エス マイクロ
バイオロジー レターズ（FEMS Microbiolgy
Letters）第49巻、第385388頁1988年）とが知ら
れているのみである。 一方、本発明の特色は安全性がもつとも高いと
考えられる枯草菌を宿主としており、更にB.
subtilisに菌学的に類似したB.
stearothermophilusより遺伝子を得た点である。
すなわち本発明によつて作成した酵素製剤はこれ
まで公知のものに比べて安全性が高く、食品加工
に使用できる点である。 課題解決のための手段及び作用 本発明の耐熱性プルラナーゼを生産するバチル
ス ステアロサーモフイルスTRS128は、本発明
者等により大阪市城東区の土壌より分離された好
熱菌であるが、次のような菌学的性質を有してい
る。 一、形態学的性質（肉汁寒天培地中） １ 細胞の形及び大きさ……（0.6〜0.8）×（1.5〜
3.0）μの桿菌。連鎖性なく莢膜は少い。加糖
肉汁寒天培地では肉汁寒天培地と同一の桿菌の
形態を示す。 ２ 運動性……あり。 ３ 胞子……（0.4〜0.5）×（0.5〜0.6）μの長円
形で末端付近に存在し膜壁はうすい。60℃・16
時間で形成するものが多い。胞子のうのふくら
みは認められる。 ４ グラム染色性……陽性。 二、生育状態 １ 肉汁寒天平板培養……生育良好。表面はやや
乾き白色に近い。 ２ 肉汁寒天斜面培養……拡布状となり表面の光
沢なし。 ３ 肉汁液体培養……生育良好。液は混濁する。 ４ ゼラチン穿刺培養……ゼラチンを液化する。 ５ 食塩肉汁液内培養……７％の食塩水濃度では
生育しない。 ６ グルコース・アスパラギン寒天培地……生育
不良。 ７ グルコース・ナイトレイト寒天培地……僅か
に生育。 ８ 肉汁液体培養……PH6.8で生育、PH5.7で生育
せず。 三、生理学的性質 １ 硝酸塩の還元……陽性。 ２ でん粉の加水分解……陽性。 ３ クエン酸の醗酵性……陽性。 ４ カタラーゼの生成……陽性。 ５ 生育の範囲……トリプトン、酵母エキス、食
塩を含む培地で70℃まで生育。最適生育温度は
65℃。 ６ 糖の醗酵性……グルコース、ラクトース、し
よ糖から酸を形成。ただし、ガス発生を伴わな
い。 ７ アセチルメチルカルビノールの生成……陽
性。 ８ ゼラチンの分解……陽性。 以上の結果をバージエーのマニアル・オブ・シ
ステマテイツク・バクテリオロジー第２巻
（Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology Vol.2（1986））と照合して、本菌は
バチルス ステアロサーモフイルス（Bacillus
stearothermophilus）と同定した。 つぎに本菌株の生産する酵素を詳細に説明す
る。 一 作用及び基質特異性 本酵素はプルランのα−1.6グルコシド結合を
切断して最終的にはマルトトリオースを生成す
る。 アミロペクチンやグリコーゲンに作用させても
ヨード呈色反応の増加は認められないが、β−ア
ミラーゼと併用するとマルトースの生産量が増加
する。 イソマルトース、パノース、イソマルトトリオ
ースには作用しない。 これらの結果から、プルラン並びに側鎖が短く
なつたアミロペクチンやグリコーゲンに作用し、
そのα−1.6グルコシド結合を切断するプルラナ
ーゼであると考えられる。 二 作用PH PH4.5〜8.0（0.05M酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液
（PH４〜６）又はリン酸２ナトリウム−リン酸１
カリウム緩衝液（PH６〜８））で0.5％プルラン中
で60℃・15分間反応させる。生成還元糖はDNS
法で測定。 三 作用最適PH 前記二の条件下でおよそPH5.5。 四 作用温度 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）、0.5％プルラン中
で各種温度下15分間反応させたところ、75℃まで
反応した。 五 最適作用温度 前記四の条件下、65℃である。 六 熱安定性 0.2M酢酸緩衝液（PH6.0）中で各種温度で60分
間加熱し、残存活性を測定したところ6.5℃にお
いても90％以上の活性が残存していた。 七 PH安定性 ほぼPH6.0〜9.0で安定であり、酸性側よりアル
カリ側で比較的安定（各種緩衝液を用い60℃・60
分間放置後、PHを7.0に調製し、残存活性を測定
した）。 八 精製方法 培養上澄液を硫安分画（35〜55％飽和）した
後、沈でん物を少量の水に溶解。純水に対して透
析後、DEAE−セルロース、ゲル過、アフイニ
テイクロマトグラフイーにより、SDS−PAGEで
単一バンドを示す酵素を得た。 九 分子量 83000（SDS−PAGEによる）。 十 生産物 プルランからは最終的にはすべてマルトトリオ
ースが得られた。 十一 力価測定法 プルランを基質とする下記の方法・条件により
測定した。 １％プルラン（0.2M酢酸緩衝液PH5.6）0.25ml
に酵素液0.25mlを加え、60℃・15分間反応させ、
生ずる還元力の増加をDNS法により定量した。 上記反応で１分間当り1μmolのマルトトリオー
スに相当する還元力を生成する酵素量を１単位と
した。 以上の理化学的性質から、本酵素は従来知られ
ていない耐熱性を有する新規なプルラナーゼであ
ると考えられる。 本発明では、かかる耐熱性の高いプルラナーゼ
の遺伝子をバチルス ステアロサーモフイルス、
特にバチルス ステアロサーモフイルスTRS128
の染色体DNAを制限酵素Hindを用いて切断す
ることにより調製する。Hindを使用するのは、
酵素の分子量や生産蛋白質の細胞外への分泌に必
要なキヤリアー蛋白質に相当する遺伝情報などを
有効に保持した遺伝子の断片が得られるからであ
る。切断処理の方法は常法による。 切断した染色体DNA断片をシヨツトガン方式
でベクタープラスミドたとえばpTB522（ジヤー
ナル オブ ジエネラル マイクロバイオロジー
（Journal of General Microbiology）第131巻
第1757頁、（1985年））に組換え、枯草菌を宿主と
して複製維持できる組換えプラスミドを作成す
る。目的とするプラスミド中の耐熱プルラナーゼ
生産能をもつHindによるDNA断片は、分子量
約2.7MDaであり、各種の制限酵素に対する切断
個所及び切断により生じたDNA断片の分子量が
夫々 (a) バムエイチＩ（BamHI）で２ケ所、断片は
夫々0.40，0.85及び1.45MDa (b) エコアールＩ（EcoRI）で２ケ所、断片は
夫々0.20，1.10及び1.40MDa (c) ピーヴイユー（Pvu）で１カ所、断片は
夫々0.90，1.80MDa である。さらに具体的には、該DNA断片を前記
のpTB522に組込み、本発明者等によつてpTP1
と命名された組換えプラスミドは、遺伝子工学的
な手法により、目的物質生産を可能とするための
所望性質（たとえばコピー数、薬剤耐性の種類、
各種制限酵素の切断箇所など）を有する。このプ
ラスミドpTP1の制限酵素地図は添付の第１図の
通りである。 本発明ではベクターとしてpTB522を使用した
が、市販のベクターであるpUB110，J.
Bact.1981Vol.146p1091に記載されている
pTB53，J.Bact.1982Vol.149p824に記載のある
pTB90と命名されたプラスミドなども同様に使
用できる。本発明に使用するプラスミドは
pTB522に限られるものではない。 本願の第２発明（特許請求の範囲の記載のも
のを第２発明、同に記載のものを第３発明とい
う。以下おなじ）は、前述の組換えプラスミドで
形質転換された新規の微生物である。この場合、
宿主枯草菌はプルラナーゼ生産能をもたない通常
の枯草菌であれば菌株の如何を問わず利用できる
が、望ましくは、アミラーゼ及び中性プロテアー
ゼ欠損株であるバチルス ズブチリスNA−１
（ジヤーナル オブ バクテリオロジー 第170
巻、第1554頁，1988年）を用いれば耐熱性プルラ
ナーゼの生産及び精製を著しく容易にする点で好
ましい。 なおB.subtilisNA−１は通常入手できるB.
subtilis Marburg株を起源として通常の変異処理
によりamylase，protease活性を消失せしめた菌
株である。amylaseの欠損はプルラナーゼを導入
したときの判定を容易にするためであり、又
proteaseは集積したpullulanaseの分解を防ぐ目
的である。B.subtilisNA−１株はamylase，
protease活性を示さない点を除いて、B.subtilis
Marburg株の菌学的性質を保有している。 第３発明は、第２発明の枯草菌を使用した耐熱
プルラナーゼの製造法に関するものである。即
ち、第２発明になる宿主菌を栄養培地に接種し、
PH6.5〜7.3，37℃で24〜72時間通気攪拌培養する
などの常法により、耐熱性プルラナーゼを生成蓄
積せしめる。更にこの培養物から耐熱性プルラナ
ーゼを硫安分画、沈でん、アルコール沈でん、膜
濃縮法などの常法に従つて回収・精製する。 実施例 実施例１ （組換えプラスミドの作成と枯草菌の
形質転換及びクローン株の選択） まず、バチルス ステアロサーモフイルス
TRS128の染色体DNAを以下により調製する。 バチルス ステアロサーモフイルスTRS128を
100mlＬ培地を含む500ml容フラスコ中で一夜、60
℃で溶媒した。これを遠心集菌し、20mlのTE緩
衝液（10mMトリス、1mM・EDTA，PH8.5）で
洗浄し、３mlの15％しよ糖−50mMトリス（PH
8.5）−50M・EDTA−１mg／mlリゾチームに懸濁
し、氷中で30分間静置した。これに３mlの１％ザ
ルコシル−50mMトリス（PH8.5）−50mM・
EDTAを添加し、混合した。ついで5.4gCsClを
加え0.3mlのエチジウムブロマイド液（10mg／ml）
を加え、RP65Tローター（日立製作所製）で超
遠心場で分離した。超遠心終了後、DNA区分を
注射針で抜き取り、ｎ−ブタノールで３回抽出を
繰り返してエチジウムブロマイドを除去した。こ
のDNA試料を10mMトリス（PH7.5）−0.1mM・
EDTA中で透析し４℃で保存した。 次いで以下の通りに制限酵素及びリガーゼで処
理して組換えプラスミドを調製する。即ち、一方
では枯草菌を宿主として複製維持できるベクター
プラスミドpTB522（テトラサイクリン耐性）を
常法により調製し、次いでバチルス ステアロサ
ーモフイルスTRS128の染色体DNA及びpTB522
を制限酵素Hindで切断する。その反応条件は
次の通りである。 (A) TRS128DNA 30μl 10×Hind緩衝液 10μl 牛血清アルブミン（５mg／ml） 2μl 水 56μl Hind溶液 2μl (B) pTB522 10μl 10×Hind緩衝液 10μl 牛血清アルブミン（５mg／ml） 2μl 水 76μl Hind溶液 2μl 表中、10×Hind緩衝液とは、100mMトリス
（PH7.4），100mMMgCl₂，500mMNaCl，10mM
ジチオスレイトールを含む。 上記溶液で37℃・1.5〜２時間反応させる。上
記で得られるＡ，B2種類のDNAを混合し、3M
酢酸カリウム溶液20μlを加え、その後エタノール
0.45mlを加えて遠心し、上澄みを除いた。沈でん
はエタノールで洗浄し、脱水・脱塩し、デシケー
ターで乾燥した。この乾燥物に２×リガーゼ緩衝
液（132mMトリス（PH7.6）−13.2mM・MgCl₂）
100μl，100mMジチオストレイトール20μl，
5mM・ATP20μl、水60μlを加え混合した後、
DNAリガーゼ1μlを加え、８℃・16時間保ち、
DNA溶液とした。 第３段階としては、上述の組換えプラスミドを
枯草菌に導入してクローニングする段階である。 バチルス ズブチリスNA−１は、プルラナー
ゼ非生産性の通常の枯草菌をNTG変異処理等に
より得られるアミラーゼ・中性プロテアーゼ欠損
変異株の１つであるが、これをＬ培地で一夜培養
した後、その１mlを100ml容フラスコ内のTFI培
地20mlに植菌する。 これを37℃で培養し、対数増殖期を外れてから
一時間後、500ml容フラスコ内のTF培地36mlに
４mlを植菌し、1.5時間培養してコンピテント
セルを得る。 TFI，TF培地は夫々以下の通りである。

【表】

【表】

【表】 このコンピテント セル１mlに前述により得ら
れたDNA溶液を混合し、37℃・30分間激しく振
盪培養後、遠心集菌し、Ｌ培地１mlを加えて37
℃・1.5時間振盪培養する。その培養液を100μlづ
つテトラサイクリン25μl／mlを含む寒天平板に塗
抹し、37℃１夜培養し、形質転換体を得た。 この形質転換体をPLL寒天平板（１％プルラ
ン、0.2％トリプトン、0.2％イーストエキス、0.2
％NaCl，1.5％寒天（PH7.3））にレプリカし、37
℃１夜培養後、平板上にエタノールを注ぎ、数時
間放置し、ハローを形成するコロニーを取得し
た。この耐熱性プルラナーゼのクローン株の保持
する組換えプラスミドをpTP1と命名した。 実施例２ （耐熱性プルラナーゼの製造） 実施例１により得られたpTP1を保持するバチ
ルス ズブチリスNA−１を３％可溶性でん粉を
含むＬ培地（25μg／mlテトラサイクリン含有）
にて37℃，24時間培養した。培養液を遠心分離し
て上澄を採り、60℃・15分間加熱処理をした。こ
の段階で耐熱性プルラナーゼ以外の蛋白質は殆ど
変性・沈でんし、非常に純度の高い耐熱性プルラ
ナーゼが容易に得られた。 本発明の効果 本発明では、安全性が高く、かつ酵素を菌体外
に分泌するシステムを持つ枯草菌を宿主として用
いたから、工業的観点から応用価値が高い。 一般に自然界よりスクリーニングした菌株は、
アミラーゼその他の糖質関連酵素に較べプルラナ
ーゼの生産量が低く、精製が困難である。また、
プルラナーゼのうちでも耐熱性の高いものは一層
その傾向が強い。本発明では、中温菌であり、か
つアミラーゼを生産しない枯草菌に耐熱性プルラ
ナーゼ遺伝子を組込みクローン化することによ
り、たとえば培養上澄を60℃・15分間加熱処理を
する程度のことで簡単に耐熱性プルラナーゼを精
製することを可能としたものである。因みに、耐
熱性プルラナーゼ遺伝子をクローン化できたこと
により遺伝子増幅効果やプロモーター活性の増強
等を利用して本酵素の大量生産化も可能ならしめ
ることとなる。

【図面の簡単な説明】

第１図……ベクタープラスミドpTB522を用い
て調製した組換えプラスミドtTP1の制限酵素地
図、図中太線で示した2.7MDaのHind断片に相
当する部分は、バチルス ステアロサーモフイル
スTRS128染色体由来の耐熱性プルラナーゼ遺伝
子を含む部分である。ただし、円内の数字は分子
サイズをMDaで表わしたものである。 Ｅ……EcoRI，Pv……Pva，Ｈ……Hind，
Ｂ……BamI，Ps……PstI。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ バチルス ステアロサーモフイルス
   （Bacillus stearothermophilus）の染色体DNA
   を制限酵素ヒンド（Hind ）により処理し
   て得られる耐熱性プルラナーゼ生産能をもつ
   DNA断片とヒンドで処理して得られたベクタ
   ー断片とを結合させたことを特徴とする組換えプ
   ラスミド。 ２ バチルス ステアロサーモフイルス菌がバチ
   ルス ステアロサーモフイルスTRS128（微工研
   菌寄託第9610号）であることを特徴とする特許請
   求の範囲の１記載の組換えプラスミド。 ３ バチルス ステアロサーモフイルス又はバチ
   ルス ステアロサーモフイルスTRS128をHind
   を処理して得られるDNA断片が分子量約
   2.7MDaであり、かつ各種制限酵素による切断地
   図が第１図に示すものであることを特徴とする特
   許請求の範囲の１記載の組換えプラスミド。 ４ バチルス ステアロサーモフイルスの染色体
   DNAを制限酵素Hindにより処理して得られる
   耐熱性プルラナーゼ生産能をもつDNA断片を有
   するプラスミドを複製保持した宿主であることを
   特徴とする形質転換された枯草菌。 ５ バチルス ステアロサーモフイルス菌がバチ
   ルス ステアロサーモフイルスTRS128であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲の４記載の形質転
   換された枯草菌。 ６ バチルス ステアロサーモフイルスの染色体
   DNAを制限酵素Hindにより処理して得られる
   耐熱性プルラナーゼ生産能をもつDNA断片を有
   するプラスミドを複製保持した枯草菌を栄養培地
   で培養し、その培養物から耐熱性プルラナーゼを
   回収することを特徴とする形質転換された枯草菌
   による耐熱性プルラナーゼの製造法。 ７ バチルス ステアロサーモフイルス菌がバチ
   ルス ステアロサーモフイルスTRS128であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲の６記載の形質転
   換された枯草菌による耐熱性プルラナーゼの製造
   法。