JPH051000B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ ヒト−又は動物の体液又は細胞の試料のdTk
アイソザイムレベルを測定する方法であつて、燐
酸供与体および緩衝系の存在において上記試料を
上記アイソザイムのための基質と反応させる段階
と、生成した燐酸化物の量を測定する段階とから
成り、上記の量は上記アイソザイムレベルに比例
し、 ａ PH範囲５〜９で、250mM以下の濃度で存在
する緩衝系と、 ｂ その一部が放射性標識化ハロゲンをもつ2′−
デオキシ−５−ハロウリジンから成り、しかも
２×10^-9〜５×10^-6Ｍの範囲の濃度で存在する
基質と、 ｃ 20mMを超えない濃度で存在する燐酸供与体
とを組み合わせて用いることを特徴とするヒト
もしくは動物の体液または細胞の試料のdTkア
イソザイムのレベルを測定する方法。 ２ 上記PHが約6.5〜８、上記基質濃度が10^-8〜
５×10^-7Ｍ、上記燐酸供与体濃度が約0.5〜5mM
である請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 上記緩衝物質が本質的にトリス−マレエート
を含まない請求の範囲第１又は第２項記載の方
法。 ４ 上記燐酸供与体がATPとCTPとから成る群
から選ばれる請求の範囲第１，２又は３項記載の
方法。 ５ 利用可能な放射性標識化基質を、基質疲憊を
おこす程十分過剰のdTkアイソザイムから成る対
照を用いることによつて測定する段階から成り、
上記対照は上記燐酸化物の放射能測定前に、上記
試料と同様に処理される請求の範囲第１，２，３
又は４項記載の方法。 明細書 本発明はヒト又は動物の体液中又は細胞試料中
のアイソザイムdTk（デオキシチミジンキナーゼ）
レベルの測定法に関するものである。本発明は更
に、癌、腫瘍および或る種のウイールス性感染症
のような、ATP（アデノシン三燐酸塩）媒介dTk
活性により支配される病気、並びにHSV（単純疱
疹ウイールス）型および型およびVZV（水
痘・帯状疱疹ウイールス）感染症のようなCTP
（シチジン三燐酸塩）媒介dTk活性によつて特徴
づけられる病気の診断および予後判定のために上
記方法を利用することに関するものである。本発
明は又、dTkアイソザイムの型決定のために上記
方法を利用することにも関する。 発明の背景 真核細胞は、酵素デオキシチミジンキナーゼ
（dTk）のおかげで、チジジレート合成における
中間生成物ではないデオキシチミジン（dT）を
利用することができる。このため、dTkはdTを
DNAを代謝に導入するサルヴエージ酵素と考え
られる。哺乳動物細胞の主なdTk型は、細胞分裂
期にあらわれるだけであるから、dTkはスキヤヴ
エンジヤー酵素と称呼された。 ヒト細胞中には３種類の細胞アイソザイムがあ
ると報告されている。dTk−Ｆと呼ばれる細胞質
ゾルdTkは、分裂細胞（GI期〜Ｓ期）の中に適
量あらわれる（Bello，Exptl.Cell.Res.89：263，
1974；Littlefield，Biochem.Biophys.
Acta.115：398，1966）、静止細胞にはほとんど
存在しない。ヒトではこの酵素は、染色（クロモ
ソーム）17にガラクトキナーゼ座の近くにコード
される。第二の細胞アイソザイムは、dTk−Ａと
呼ばれるミトコンドリア−アイソザイムで、ミト
コンドリア基質中に存在する。このdTkの活性は
種々の細胞中比較的一定であり、（Adelsteinら、
Devolop.Biol.26：537，1971）、dTk−Ａは染色
体16によつてコードされる。活性の小さい、dTk
−Ｂと呼ばれる第三のdTkは、連続継代性細胞系
HeLaおよびkBに見出されることが報告されたの
みであり、ミトコンドリア膜の内側に限り存在す
ると言われている（Kitによる考察、Pharmacol.
Ther.4：501，1979）。 この３種類の細胞dTkは、生化学的性質がそれ
ぞれ異る。dTk−ＦとdTk−Ｂは、非常に似てい
るが、位置の他に、等電点電気泳動によつて（異
なる等電点pIをもつため）、又電気泳動移動度に
よつて区別される。dTk−ＦおよびdTk−Ｂとは
違つて、dTk−Ａはシチジン−三燐酸塩（CTP）
を燐酸供与体として受け容れ、dTTP（デオキシ
チミジン三燐酸塩）−フイードバツク阻害に対し
て他の二者ほど敏感でない。dTk−Ａは又、デオ
キシシチジン（dC）を燐酸化し、dCTPによつて
阻害される（Kitによる考察、Pharmacol.
Ther.4：501、1979）。 ウイールスに関して言えば、ウイールスゲノム
によつて規定される特異的なアイソザイムが、ヘ
ルペス群およびポツクス群のウイールスによる感
染後に、細胞中に見出される。酵素的には、ヒト
ウイールスに特異的ないくつかの種類のdTkは、
ワクシニアdTkを除けばdTk−Ａに似ている；ワ
クシニアdTkはCTPを燐酸供与体として利用す
ることができず、デオキシシチジンを燐酸化する
こともできない。このdTkは、電気泳動によつて
容易にヒト細胞dTkと区別される（Kitら、
Progr.Med.Virol.21：13，Karger Basel 1975）。
HSV dTksもVZV dTkも、広い燐酸供与体ス
ペクトラムを有し、種々のピリミジンおよびピリ
ミジン同族体を基質として受け容れる（Cheng
ら、Biochem.Biophys.Acta，452：370，1976、
およびJ.Virol.31：172，1979）。dTkアイソザイ
ムが介在するdTのdTmp（デオキシチミジン−燐
酸）への変換が、dT同族体である2′−デオキシ
−５−ヨードウリジン（IUdR）によつて競合的
ブロツクを受けることは以前から知られていた。
ウイールスdTks試験において高い感度を得るた
めに、放射性標識化IUdRを直接、基質として用
い得ることを我々は示した（Gronowitz ＆
Kallander，Infec.Immun.29：425，1980）。 前述のように、細胞中にdTk−Ｆが出現するの
は細胞増殖の時であり、分化した細胞には多かれ
少かれ存在しない（Munch−Peterson ＆
Tyrsted，Biochim.Biophys.478：364，1977）。
移植可能のマウス腫瘍におけるdTk活性の研究に
よれば、増殖速度に応じてdTk活性が高くなるこ
とが明らかにされた（Bresnicket al.Cancer
Res.29：1969、およびCancer Res.31：743，
1971）。最近の報告によると、悪性非ホジキン性
リンパ腫およびリンパ性白血病に罹つている若干
の患者の抹消血液リンパ球に、dTk−Ｆが増加し
ている（Ellims et al，Cancer Res.41：691およ
びBrit.J.Haemtol）。高濃度の³H−dT（５×10^-6
Ｍ）を用いる従来のdTk試験法によると、dTk活
性は、病気の進んだ小数の患者に見出されるに過
ぎなかつた。その他には、dTk−ＦとdTk−Ａの
鑑別分析を行つた場合に限り、dTk活性を予後マ
ーカー（指示物）として測定することができた。 このように、従来は、ATPを燐酸供与体とし
て用いる、³H−又は¹⁴C−標識dTのdTmpへの変
換を追跡することにより、dTk活性を測定してき
た。最近、我々は、ウイールスdTkアイソザイム
のための進歩したdTkアツセイ（検定）システム
を考案した。そこでは、基質として¹²⁵I−ヨード
デオキシウリジン（IUdR）が用いられる。この
方法では、感度が高まるため25HSV−感染細胞
のような小さい細胞からdTkを検出することがで
きるようになつた。それと比較して、³H−dTを
通常10^-5Ｍ濃度で用いる従来のアツセイでは、少
くとも450倍多くの酵素が必要とされる。しかし、
ウイールスdTksの研究に有用であるとはいえ、
この進歩したアツセイシステムも、この酵素が不
安定なためもあつて、長期に互る細胞dTk−Ｆア
ツセイには不適当であつた。この方法では血清中
の微量のdTkの存在を検出することができないと
いうことも、ウイールスdTk阻止抗体（dTk−
ab）の出現に関する諸研究から容易に導き出せ
る。これらの研究では、275以上のヒト血清につ
いてdTk−abアツセイが行われたが、血清dTk
活性の阻止は２例に見出されただけであつた
（Gronowitz ＆ Ka¨llander，Infec.
Immun.29：425，1980；Gronowitz ＆
Ka¨llander，J.Med.Virol.8：177，1981；
Ka¨llander et al.Infec.Immun.36：30，1982）。 発明の概要 本発明の目的は、種々の目的における悪性腫瘍
の監視を含む、或る種のウイールス性感染症およ
び悪性腫瘍の診断のための手段を提供することに
ある。 本発明の他の目的は、ヒトおよび動物の体液お
よび細胞試料−例えば血清、疱疹分泌液、髄液、
小水疱液およびこの種の臨床標本−中にある微量
のdTkを検出できる高感度のアツセイシステム
で、しかも細胞dTk−Ａの寄与が最小になるよう
に考案されたアツセイシステムを提供することに
ある。 本発明のさらに他の目的は、腫瘍疾患の発見お
よび予後のために使用し、病気の変化を監視し、
再発を発見するためのdTk−Ｆアツセイ法を提供
することにある。 本発明のさらに他の目的は、燕麦細胞型肺癌と
関連した転移を調べる場合に、上記アツセイ法を
利用することにある。 本発明の別の目的は、脳−脊髄系に転移がある
場合、髄液中のdTkの測定によつて、白血病を調
べるために上記アツセイ法を利用することにあ
る。 本発明のさらに別の目的は、ウイールス性疾患
と関連した或る種の感染症のための、群特異的マ
ーカーとしての上記アツセイ法の利用にある。 本発明のさらに他の目的は、血清又は小水疱液
等に存在する、ヘルペスウイールスに特異的な
dTksを特異的に検出するために上記アツセイ法
の変法を利用することにある。 本発明の上記およびその他の目的は、本発明に
よるアツセイ法およびその適用に関する下記の記
述により、詳細に説明される。 本発明は、このように、血清等に存在するdTk
レベル、特にdTk−Ｆレベル測定のための進歩し
たアツセイ法を提供する。このアツセイシステム
は、従来技術のシステムよりかなり感度が高い。
そして感度が非常に高いために、非常に簡単に実
施できるこのアツセイシステムを、病的dTkレベ
ルのみをならず健常者の正常レベルでさえ測定す
るのに用いることができることが判明した（第１
図と第６図を比較参照）。このアツセイシステム
は、非常に実際的で、２時間以上も直線性ターン
オーバーを与えて、再現性のあるdTk−Ｆ測定値
を示すことがわかつただけでなく、ウイールス
dTksに関する従来技術のシステムより２〜６倍
高いターンオーバーを与えることもわかつた。従
来のアツセイシステムと比較して重要なもう一つ
の利点は、dTk−Ａのターンオーバーが比較的小
さいことであり、未精製試料中でdTk−Ｆ又はウ
イールスdTkを測定する場合、このアイソザイム
は極くわずか寄与するのみである。 燐酸供与体としてATPの代りにCTPを用いる
このアツセイシステムの変法は、分析すべき試料
を、抗ヘルペスウイールスdTk阻止血清と共にに
あらかじめインキユベートしたときに、ヘルペス
ウイールス誘導dTkを特異的に検出するのに有用
であることがわかつた。 本文中に記載された好都合のまた期待以上の技
術的効果は、本発明によれば、低濃度および低イ
オン強度の緩衝系、特異的種類の放射性標識化基
質（その濃度は低い）および低濃度の燐酸供与体
とを組合わせて用いることにより得られる。 広い見地からみて、本発明は、ヒト又は動物の
体液又は細胞試料中のdTkアイソザイムレベルを
測定する方法であつて、上記試料を燐酸供与体お
よび緩衝系の存在下で上記アイソザイムのための
基質と反応させ、生成した燐酸化物の量を測定
し、この量は上記アイソザイムレベルと比例する
という方法に関するものである。本発明による上
記方法は、 ａ PH範囲５〜９、濃度250mM以下の緩衝系と、 ｂ 一部は放射性標識化−５−ハロゲンを有する
2′−デオキシ−５−ハロウリジンから成り、そ
の濃度が２×10^-9〜５×10^-6Ｍである基質と、 ｃ 20mM以下の濃度で存在する燐酸供与体とを
組み合わせて用いるという特徴を有する。 基質として¹²⁵I−IUdRを用いる以前に報告さ
れたアツセイシステムと違つて、本発明によるア
ツセイシステムでは細胞dTk−Ｆのための基質が
２時間以上も直線性ターンオーバーを与え、第１
図に見られるように検出感度が劇的に増加した。
この図は本発明によるアツセイ系（−○−○−
○）と上記先行技術のアツセイ系（−△−△−△
−）との比較である（Gronowitz ＆
Kallander，Infec.Immun.29：425，1980）。Ａ＝
白血病患者に由来するヒトdTk−Ｆを含む２血
清。Ｂ＝細胞培養起源のHSV型2dTk。利用可能
の総¹²⁵I−IUdRは550×10³cpmであつた。

【図面の簡単な説明】

第１ＡおよびＢ図は、時間に対してプロツトし
た酵素活性を示し、最も近い先行技術に比較し
て、本発明方法の感度が劇的に進歩していること
を示すグラフである。 第２ＡおよびＢ図は、−薄層クロマトグラフに
よつて−本発明による好ましい基質¹²⁵I−IUdR
の放射化学的純度の貯蔵中における減少を示すグ
ラフである。 第３図は、内部基質コントロール（対照）を用
いる時酵素活性を単位で計算することを説明する
グラフである。 第４図は、dTk測定において血清中の高濃度の
阻止的影響を示すグラフである。 第５図は、異なる臨床標本におけるウイールス
dTkの型決定（タイピング）を、グラフによつて
示す。 第６図は、供血者および妊婦におけるdTk活性
の正常分布を示す図である。 第７図は、伝染性単核症患者の血清中で本発明
に依つて測定したdTk活性を、病気発生後の経過
時間と関連づけて示した図である。 第８図は、種々のウイールス性感染症、マイコ
プラズマ肺炎およびオウム病にかかつた患者の血
清中に見出されるdTk活性を明らかにする図であ
る。 第９ａおよび９ｂ図は、本発明に従つて測定し
た血清dTk活性と、NHL患者の病期との間の相
関関係を示す図である。 第１０ａおよび１０ｂ図は、NHL患者の生存
の確率と、本発明に従つて測定した血清dTkレベ
ルとの関係を示す。 第１１および１２図は、種々の臨床的経過を辿
つたNHL患者の血清dTkレベルの経過研究を説
明する図である。 好ましい態様の説明 本発明の好ましい態様においては、上記緩衝系
は約150mM以下、特に好ましくは約100mMの濃
度である。緩衝液の好ましいPHは6.5〜８の範囲
で、特に約7.4が好ましい。マレイン酸塩を含有
しない緩衝液、反応性に富むアミノ基又は第一ア
ミノ基を欠く緩衝液、特にトリス−マレエートを
実質的に含有しない緩衝液で最も良い結果が得ら
れ、HEPES緩衝液が特に好ましい。 基質は放射性標識化チミジン同族体、特に2′−
デオキシ−５−ハロゲン−ウリジンであるべき
で、その場合その標識は反応性ハロゲン同位元素
であることが好ましい。好ましい基質は¹²⁵I−
2′−デオキシ−５−ヨードウリジンである。好ま
しい基質濃度は１×10^-8〜５×10^-7の範囲内、特
に約10^-7Ｍである。 dTk−Ｆ測定のために好ましい燐酸供与体は
ATPで、ウイールスdTk測定のために好ましい
燐酸供与体はCTPである。燐酸供与体の好まし
い濃度は約10mM以下、特に約0.5〜5mMであ
る。本来ATPおよびCTPと同様のアイソザイム
特異性をもつことが知られている燐酸供与体を用
いてもよい。 Mg²⁺は燐酸供与体と少くとも等モル濃度で存
在するのが好ましい。ジチオスレイトールのよう
な還元剤が存在するのが好ましい。 燐酸化生成物は本来知られている方法によつて
測定できる（例えばGronowitzとKallander，
Infec.Immun.29：425，1980参照）。 例えば血清又は疱疹分泌物のような臨床標本に
おけるdTk活性を検出するために本発明によるア
ツセイシステムを適用することは、或る種のウイ
ールス感染症および悪性腫瘍の診断のための新し
い手段をもたらす。前述した方法による単一の
dTkアツセイで得られた異常な血清dTkレベル
（例えば、＞10単位）は、予後診断的に使用する場
合、すぐれたマーカーになることが判明し、また
同様に連続dTk値も悪性疾患の進行又は退行を監
視する場合のすぐれたマーカーになることが判明
した。更に、これらの患者では血清dTkレベルが
再発のマーカーとして、又治療効果を評価する上
で役に立つ。これらすべてを以下に例証する。 以下に報告するテストを行う場合に実際に採用
された好ましい態様においては、¹²⁵I−IUdRが基
質として用いられる。好ましいアツセイシステム
の組成、比率および最終濃度を第１表に記す。

【表】

【表】 ａ 一つの２倍試料の比率は：アツセイ混合物
51.5μ、基質溶液6μ（¹²⁵I−IUdRの最終濃
度１×10^-7Ｍ、130〜160Ci／mM）、酵素溶液
（例えば血清）2.5μ（反応開始時に加わえ
る）、最終容量は60μとなる。 ｂ HEPES＝Ｎ−２ヒドロキシエチルピペラジ
ンＮ−２−エタンスルホン酸 一般に、51.5μ反応溶液を使用直前に6μ基
質溶液と混合して、一つの２倍試料を調製する。
2.5μ酵素溶液（例えば血清試料）の添加によつ
て反応が始まる。全量60μというこの標準容量
から25μづつ２回試料をとる。異なるインキユ
ベーシヨン時間をおいて採取される数組の２倍試
料から成る実験のためのアツセイ混液の組成は、
標準溶液中の成分の量に、２倍試料の所望数を乗
ずることによつて計算される。アツセイは37℃で
行われ、反応開始の前に２分間全成分をあらかじ
めあたためる。試料をピペツトで、90〜100℃に
保たれた１cm²のWhatman DEAE−81紙片上に置
くことによつて、酵素反応は終る。生成物を基質
から分離するために、その紙を6mM蟻酸アンモ
ニウム溶液で４回、蒸溜水で１回、最後にメタノ
ールで洗う。洗浄は、磁気攪拌器にとりつけられ
た１のガラス容器中で行われる。10〜15枚の円
形の紙片を過器に入れて、同時に処理する。そ
の過器を５分おきに新しい洗浄槽に移すのであ
る。最後にその円形紙を自動ガンマ計数管でカウ
ントする。 dTkアツセイにおける経日変動を排除するため
に、得られた反応速度を単位に計算し直した。酵
素量を定めるのに単位を使う理由は、市販の¹²⁵I
−IUdRの生物学的崩壊が見出されたことと関連
して最初の放射化学的純度に変動があるためであ
る。生物学的崩壊は、試料毎に加えた総放射能
を、酵素活性の計算に無関係なものにしてしま
う。第２図は、予備コーテイングしたシリカゲル
プレート（Merck 60F₂₅₄）を用いて行つた薄層
クロマトグラフイーにおける市販の¹²⁵I−IUdR
バツチの分離を示す。溶出液として15％メタノー
ル、85％クロロホルムを用いた。Ａ＝入手日にお
ける性状、放射化学的純度62％を示す。Ｂ＝150
日冷蔵庫に貯蔵後の同一バツチ。製造業者の主張
では、最初の放射化学純度は＞90％である。その
代り、易感受性放射能を測定する生物学的内部コ
ントロール（対照）を各アツセイに含めた。この
対照はHSV2型dTkを100倍も多く含むものであ
つて、大規模な基質疲憊を招いた。１時間アツセ
イにおいて、この対照により挿入される放射能の
量は完全な¹²⁵I−IUdRの約85％であることがわ
かつた（薄層クロマトグラフイーから計算して）。
生物学的対照で見出されたそのレベル（85％）を
考慮して、酵素１単位は、（記載せる条件下で）
１時間につき基質4.3×10^-15モルを変換する酵素
量となる。単位と、概算モル・ターンオーバーと
の間のこの関係は、通常用いられる同位元素量の
場合、１単位が実際上約1000cpmとしてあらわさ
れるように選択された（第１表参照）。この生物
学的同位元素対照を、試験試料と同様な方法で処
理して用いる場合のもう一つの利点は、生産物回
収率の変動によりおこり得る単位の変動が回避さ
れることである。単位計算の手順は第３図に例示
する。試料（−○−○−）および対照（−△−△
−）両方の値を示す。Ａは内部対照の値をcpmで
あらわしてある；これは利用可能の総放射性標識
化基質に比例する。Ｂは被験試料により生成した
産物の数値をcpm／hourであらわしたものであ
る。 単位（Ｕ）＝Ｂ×（Ｓ）×ｖ／Ａ×5.3×10^-15、ここ
で（Ｓ）は 基質濃度（Ｍ）、ｖは試料の量（）である。 血清ｄＴｋ活性の測定 血清dTkの定量をミクロタイター・プレートで
行なつた。20血清試料毎に、バツクグラウンド対
照と内部基質対照（上記参照）が含まれ、その一
組をユニツトして処理した。用いた血清試料の量
は最終容量120μあたり5μ（又はそれ以下）
であつた：それ以上の血清は阻止的に働くかも知
れない。第４図参照。120分後にサンプリングを
行つてdTk活性を測定した。酵素活性を、試料
60μあたりの血清濃度に対してプロツトした。
（○−○）＝NHLに罹つた個体からの血清、（△−
△）＝活性CLLにかかつた個体からの血清。上記
の阻止的影響は、多分、例えばチミジン、チミジ
ン三燐酸塩のような、ヌクレオチド又はヌクレオ
シドの存在、又は或る血清中には存在する分解用
酵素によるものであろう。60分後と120分後に二
重に試料を採取した。バツクグラウンドを補正し
た後、１時間および25μ試料についての培地タ
ーンオーバーを、各二倍試料から別別に計算し
た。それから60分および120分サンプリングの平
均速度値を測定し、変動が＜20％であつた場合は
その平均速度値をその後の計算に用いた。 髄液中のdTk活性の測定 本質的には血清の場
合と同じ方法を用いた。¹²⁵I−IUdRの比放射能を
約320Ci／mMに増加させた。酵素測定の前に髄
液を濃縮してもよい。 dTkアイソザイムの定性試験 dTk活性を含
む、例えば小水疱液、血清のような臨床標本を、
アイソザイムに特異的なdTk阻止抗体と共にあら
かじめインキユベートし、残りの酵素活性を上述
の方法によつて測定した。アツセイ混液中の
ATPをCTPに代えた。その結果dTk−Ｆ活性は
除かれる。試験すべき標本を反応溶液で段階的二
倍稀釈を行い（普通は１：６で開始する）、そし
て稀釈液から15μづつ、ミクロタイタープレー
トの４つの凹みに移す。こうして同一稀釈の４検
体が１組となる。 あらかじめ稀釈したVZV dTk−阻止血清（25
ml）を１つの凹みに加え、HSV １型dTk阻止血
清を２番目の凹みに、HSV2型dTk阻止血清を３
番目の凹みに、マイナス血清を４番目の凹みに加
えた。その混合物を37℃で90分間インキユベート
し、酵素−抗体反応を行わせた。その後残留酵素
活性を測定した。基質溶液6μおよび反応溶液
14μから成る混合液20μを加えることにより
反応は開始した。各稀釈毎に異なる抗体の存在下
で得られた数値を、マイナス血清で得られた数値
のパーセンテージとして計算し直した。そのよう
な残留酵素活性を、標本のlog2稀釈に対してプロ
ツトした例を第５図に示す；ここでは抗−VZV
dTk血清（△−△）、抗−HSV １型dTk血清
（●−●）および抗−HSV ２型血清（○−○）
と共にインキユベーシヨンした後の残留活性と、
マイナス血清と共にインキユベーシヨンした対照
との比を、次の試料の種々の稀釈に対してプロツ
トした：Ａ＝HSV ２型感染症にかかつた固体か
らの小水疱液；Ｂ＝VZV感染症にかかつた個体
からの小水疱液；HSV １型感染症にかかつた個
体からの小水疱液；VZV感染症にかかつた個体
からの血清。阻止パターンから、dTkの型が容易
に定められる（以下の第２表も参照）。

【表】 こうして、本発明の重要な特徴の一つは、劇的
に増加した検出感度である。このおかげで第６図
から判るように（第６図は99人の供血者の血清中
に見出されたdTk活性の分布（白柱）と、３ケ月
以内の妊婦22人の血清中のそれの分布（斜線柱）
とを示す）、健常者の血清中の正常なdTk−Ｆレ
ベルの測定さえ可能となる。平均値は2.4単位／
μ、標準偏差は1.25である。 感染性疾患にかかつた個体から得た血清試料を
研究することによつて、或る種のウイールス性疾
患例えば伝染単核症、風疹−、麻疹−ウイールス
感染症の急性期における患者の血清中dTkレベル
は10〜40倍上昇していることが発見された。第７
図は、伝染性単核症患者の血清中に生成するdTk
活性／μを、その病気の発生後の時間経過と関
連づけて示したものである。同一文字を付した○
印は同一患者からの血清を示し、点線は健常者の
正常値を示す。第８図は種々のウイールス感染
症、マイコプラズマ肺炎、およびオウム病にかか
つた患者の急性期（●）および回復期（○）の血
清中に見出されるdTk活性／μを示す。点線
は、健常者の正常値の４倍の数値を示す。 この結果によると、ヘルペスウイールスに関し
ては原感染症のために血清dTk活性が上昇するこ
とが示される。他の感染症に関しては、その結果
としておこるdTk活性の上昇（＞10単位）は見出
されなかつた（第８図）。見出された血清活性を
特徴づけると、これまでに水痘−帯状疱疹ウイー
ルス（VZV）−特異的−dTk（第２表）および細
胞dTk−Ｆの存在が証明された。本発明方法は、
感染症を速かに診断するために小水疱液中に存在
するウイールス特異的−dTkを決定するために用
いることができることも証明された（第２表）。
ウイールス感染症と関連して見出されるすべての
血清dTk活性は、徐々に消失し、２〜６週間以内
に正常レベルに達する。 悪性疾患患者に関しては、本発明に依るアツセ
イ法を用いた限られた研究の結果、リンパ球−増
殖系に起因する悪性腫瘍にかかつている患者のみ
ならず、その他の細胞の悪性腫瘍にかかり、リン
パ球増殖系に転移した患者においても血清dTkレ
ベルの上昇が証明された（第３表参照）。 非ホジキン性リンパ腫（NHL）、ホジキン病
（HD）、慢性活性化リンパ性白血病（CLL）およ
び骨髄腫のような、リンパ球増殖症にかかつてい
る患者から、十分に確認された大量の血清試料を
得て、これを用いて大規模な研究を行つた。
NHL群の詳細な結果は次のようであつた。：正常
な血清dTkレベルと、種々の程度に上昇したdTk
レベルが発見された。これらのdTkレベルは病気
と関連していた（第９図参照、この図は、未処置
のNHL患者155人の血清中dTkを病期と関連づけ
て示す）、即ち病気が進行すればする程dTk値は
高くなる。

【表】

【表】 dTkレベルを腫瘍細胞の悪性化と関連づけて見
る時（キール・システムによる分類）、高いdTk
レベルと悪性化の間には十分な相関関係が認めら
れた。（第９図参照、３期に分けられた悪性腫瘍
の第〜期のNHL患者101人における血清dTk
を示す）。 本発明によるアツセイ法を予後を知る目的のた
めに使用し得ることが証明された。それは、測定
したdTk値が＜10単位であるか、＞10単位である
かによつて分類した患者群の間で、生存期間に高
度に有意な差があらわれたからである。第１０ａ
図は、あらかじめ測定した血清dTkが＜10単位
（−○−○−，ｎ＝50）又は＞10単位（−●−●
−，ｎ＝51）を示した〜期のNHL患者の生
存確率を示す。カツコ内の数字は、32ケ月後の観
察時に生き残つている人数を示す。第１０ｂ図
は、“高度に”悪性化した腫瘍をもつた〜期
のNHL患者についての生存確率を示す。あらか
じめ測定したdTkレベル：＜10単位（−○−○
−，ｎ＝11および＞10単位（−●−●−，ｎ＝
27）。カツコ内の数字は32ケ月後の観察時に残つ
ている人数である。 更に、NHL患者の血清dTkレベルの経時研究
は、病気の変化に相関した変化をあらわした。即
ち病気の回復でそのレベルは低くなり、病気の亢
進で高くなり、定常状態では変化しない。第１１
図のＡは、亢進期の病気の３患者の血清dTkレベ
ル測定値の変化、Ｂは治療して幾分緩解した２患
者、Ｃは治療して完全に緩解した４患者における
それを示している。第１２図では、病気の亢進ａ
も回復ｂも両方共おこつた患者において血清dTk
を縦に追跡した。Ａ）は亢進性疾患の２患者を示
し、彼等は治療法を変えた後、幾分緩解し、その
後再び病気は亢進した。Ｂ）は治療して緩解した
３患者のものである（A.H.，E.L.は幾分緩解、
G.E.は完全に緩解）。彼等全員はその後再発した。
A.H.はもう一度その治療に短期間反応した。以
上の結果は、治療効果を監視できること、そして
治療中にも治療後にも、dTk値の増加によつて、
再発の早期発見ができることを明らかに示してい
る。 本発明によるアツセイ法をその他の上記リンパ
球増殖性疾患と関係づけて用いた場合、血清dTk
レベルの変動が見出された、例えば慢性CLLは
正常値が見出されたが、半活性化CLLでは低い、
病的数値（＞10単位）となり、活性CLLは高い
数値を与えた。NHLで示したようなdTkレベル
の利用の仕方はCLLにもあてはまる。その上、
白血病患者から採取した髄液の研究により、白血
病細胞が脳−背髄液中にある時にはdTkが存在す
ることが判つた。 当然、悪性疾患患者においても上記のウイール
ス性感染症による−過性の血清dTkレベルの上昇
がおこり得ることに、気がつかなければならな
い。しかしながらこれらのウイールス性疾患に関
しては、子供の頃に免疫を獲得しているのが普通
である。一方、悪性腫瘍疾患は、普通、成人にお
こる。上述の目的のために血清dTkレベルを利用
することが理に叶うもう一つの理由は、未確定の
病気をもつた患者から採取した診断的目的のため
に連続的に得た非選択的血清試料の研究で、dTk
活性上昇は稀にしかおこらないことである。これ
らの患者およびその他の患者に関する医学的記録
を調べると、肝機能検査の病的数値も血清球増多
症も普通は血清dTkレベルの上昇を伴わないこと
が判明した。