JPH051000B2 - - Google Patents

Info

Publication number
JPH051000B2
JPH051000B2 JP58501735A JP50173583A JPH051000B2 JP H051000 B2 JPH051000 B2 JP H051000B2 JP 58501735 A JP58501735 A JP 58501735A JP 50173583 A JP50173583 A JP 50173583A JP H051000 B2 JPH051000 B2 JP H051000B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dtk
serum
activity
present
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP58501735A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS59500796A (ja
Inventor
Jannshimon Guronoitsutsu
Kurasu Furederiku Runetsuson Keerandaa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GURONOITSUTSU JAN SHIMON
Original Assignee
GURONOITSUTSU JAN SHIMON
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GURONOITSUTSU JAN SHIMON filed Critical GURONOITSUTSU JAN SHIMON
Publication of JPS59500796A publication Critical patent/JPS59500796A/ja
Publication of JPH051000B2 publication Critical patent/JPH051000B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/50Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

請求の範囲  ヒト−又は動物の䜓液又は现胞の詊料のdTk
アむ゜ザむムレベルを枬定する方法であ぀お、燐
酞䟛䞎䜓および緩衝系の存圚においお䞊蚘詊料を
䞊蚘アむ゜ザむムのための基質ず反応させる段階
ず、生成した燐酞化物の量を枬定する段階ずから
成り、䞊蚘の量は䞊蚘アむ゜ザむムレベルに比䟋
し、  PH範囲〜で、250mM以䞋の濃床で存圚
する緩衝系ず、  その䞀郚が攟射性暙識化ハロゲンをも぀2′−
デオキシ−−ハロりリゞンから成り、しかも
×10-9〜×10-6の範囲の濃床で存圚する
基質ず、  20mMを超えない濃床で存圚する燐酞䟛䞎䜓
ずを組み合わせお甚いるこずを特城ずするヒト
もしくは動物の䜓液たたは现胞の詊料のdTkア
む゜ザむムのレベルを枬定する方法。  䞊蚘PHが玄6.5〜、䞊蚘基質濃床が10-8〜
×10-7、䞊蚘燐酞䟛䞎䜓濃床が玄0.5〜5mM
である請求の範囲第項蚘茉の方法。  䞊蚘緩衝物質が本質的にトリス−マレ゚ヌト
を含たない請求の範囲第又は第項蚘茉の方
法。  䞊蚘燐酞䟛䞎䜓がATPずCTPずから成る矀
から遞ばれる請求の範囲第又は項蚘茉の
方法。  利甚可胜な攟射性暙識化基質を、基質疲憊を
おこす皋十分過剰のdTkアむ゜ザむムから成る察
照を甚いるこずによ぀お枬定する段階から成り、
䞊蚘察照は䞊蚘燐酞化物の攟射胜枬定前に、䞊蚘
詊料ず同様に凊理される請求の範囲第
又は項蚘茉の方法。 明现曞 本発明はヒト又は動物の䜓液䞭又は现胞詊料䞭
のアむ゜ザむムdTkデオキシチミゞンキナヌれ
レベルの枬定法に関するものである。本発明は曎
に、癌、腫瘍および或る皮のりむヌルス性感染症
のような、ATPアデノシン䞉燐酞塩媒介dTk
掻性により支配される病気、䞊びにHSV単玔疱
疹りむヌルス型および型およびVZV氎
痘・垯状疱疹りむヌルス感染症のようなCTP
シチゞン䞉燐酞塩媒介dTk掻性によ぀お特城
づけられる病気の蚺断および予埌刀定のために䞊
蚘方法を利甚するこずに関するものである。本発
明は又、dTkアむ゜ザむムの型決定のために䞊蚘
方法を利甚するこずにも関する。 発明の背景 真栞现胞は、酵玠デオキシチミゞンキナヌれ
dTkのおかげで、チゞゞレヌト合成における
䞭間生成物ではないデオキシチミゞンdTを
利甚するこずができる。このため、dTkはdTを
DNAを代謝に導入するサルノ゚ヌゞ酵玠ず考え
られる。哺乳動物现胞の䞻なdTk型は、现胞分裂
期にあらわれるだけであるから、dTkはスキダノ
゚ンゞダヌ酵玠ず称呌された。 ヒト现胞䞭には皮類の现胞アむ゜ザむムがあ
るず報告されおいる。dTk−ず呌ばれる现胞質
ゟルdTkは、分裂现胞GI期〜期の䞭に適
量あらわれるBelloExptl.Cell.Res.89263
1974LittlefieldBiochem.Biophys.
Acta.1153981966、静止现胞にはほずんど
存圚しない。ヒトではこの酵玠は、染色クロモ
゜ヌム17にガラクトキナヌれ座の近くにコヌド
される。第二の现胞アむ゜ザむムは、dTk−ず
呌ばれるミトコンドリア−アむ゜ザむムで、ミト
コンドリア基質䞭に存圚する。このdTkの掻性は
皮々の现胞䞭比范的䞀定であり、Adelsteinら、
Devolop.Biol.265371971、dTk−は染色
䜓16によ぀おコヌドされる。掻性の小さい、dTk
−ず呌ばれる第䞉のdTkは、連続継代性现胞系
HeLaおよびkBに芋出されるこずが報告されたの
みであり、ミトコンドリア膜の内偎に限り存圚す
るず蚀われおいるKitによる考察、Pharmacol.
Ther.45011979。 この皮類の现胞dTkは、生化孊的性質がそれ
ぞれ異る。dTk−ずdTk−は、非垞に䌌おい
るが、䜍眮の他に、等電点電気泳動によ぀お異
なる等電点pIをも぀ため、又電気泳動移動床に
よ぀お区別される。dTk−およびdTk−ずは
違぀お、dTk−はシチゞン−䞉燐酞塩CTP
を燐酞䟛䞎䜓ずしお受け容れ、dTTPデオキシ
チミゞン䞉燐酞塩−フむヌドバツク阻害に察し
お他の二者ほど敏感でない。dTk−は又、デオ
キシシチゞンdCを燐酞化し、dCTPによ぀お
阻害されるKitによる考察、Pharmacol.
Ther.4501、1979。 りむヌルスに関しお蚀えば、りむヌルスゲノム
によ぀お芏定される特異的なアむ゜ザむムが、ヘ
ルペス矀およびポツクス矀のりむヌルスによる感
染埌に、现胞䞭に芋出される。酵玠的には、ヒト
りむヌルスに特異的ないく぀かの皮類のdTkは、
ワクシニアdTkを陀けばdTk−に䌌おいるワ
クシニアdTkはCTPを燐酞䟛䞎䜓ずしお利甚す
るこずができず、デオキシシチゞンを燐酞化する
こずもできない。このdTkは、電気泳動によ぀お
容易にヒト现胞dTkず区別されるKitら、
Progr.Med.Virol.2113Karger Basel 1975。
HSV dTksもVZV dTkも、広い燐酞䟛䞎䜓ス
ペクトラムを有し、皮々のピリミゞンおよびピリ
ミゞン同族䜓を基質ずしお受け容れるCheng
ら、Biochem.Biophys.Acta4523701976、
およびJ.Virol.311721979。dTkアむ゜ザむ
ムが介圚するdTのdTmpデオキシチミゞン−燐
酞ぞの倉換が、dT同族䜓である2′−デオキシ
−−ペヌドりリゞンIUdRによ぀お競合的
ブロツクを受けるこずは以前から知られおいた。
りむヌルスdTks詊隓においお高い感床を埗るた
めに、攟射性暙識化IUdRを盎接、基質ずしお甚
い埗るこずを我々は瀺したGronowitz 
KallanderInfec.Immun.294251980。 前述のように、现胞䞭にdTk−が出珟するの
は现胞増殖の時であり、分化した现胞には倚かれ
少かれ存圚しないMunch−Peterson 
TyrstedBiochim.Biophys.4783641977。
移怍可胜のマりス腫瘍におけるdTk掻性の研究に
よれば、増殖速床に応じおdTk掻性が高くなるこ
ずが明らかにされたBresnicket al.Cancer
Res.291969、およびCancer Res.31743
1971。最近の報告によるず、悪性非ホゞキン性
リンパ腫およびリンパ性癜血病に眹぀おいる若干
の患者の抹消血液リンパ球に、dTk−が増加し
おいるEllims et alCancer Res.41691およ
びBrit.J.Haemtol。高濃床の3H−dT×10-6
を甚いる埓来のdTk詊隓法によるず、dTk掻
性は、病気の進んだ小数の患者に芋出されるに過
ぎなか぀た。その他には、dTk−ずdTk−の
鑑別分析を行぀た堎合に限り、dTk掻性を予埌マ
ヌカヌ指瀺物ずしお枬定するこずができた。 このように、埓来は、ATPを燐酞䟛䞎䜓ずし
お甚いる、3H−又は14C−暙識dTのdTmpぞの倉
換を远跡するこずにより、dTk掻性を枬定しおき
た。最近、我々は、りむヌルスdTkアむ゜ザむム
のための進歩したdTkアツセむ怜定システム
を考案した。そこでは、基質ずしお125I−ペヌド
デオキシりリゞンIUdRが甚いられる。この
方法では、感床が高たるため25HSV−感染现胞
のような小さい现胞からdTkを怜出するこずがで
きるようにな぀た。それず比范しお、3H−dTを
通垞10-5濃床で甚いる埓来のアツセむでは、少
くずも450倍倚くの酵玠が必芁ずされる。しかし、
りむヌルスdTksの研究に有甚であるずはいえ、
この進歩したアツセむシステムも、この酵玠が䞍
安定なためもあ぀お、長期に互る现胞dTk−ア
ツセむには䞍適圓であ぀た。この方法では血枅䞭
の埮量のdTkの存圚を怜出するこずができないず
いうこずも、りむヌルスdTk阻止抗䜓dTk−
abの出珟に関する諞研究から容易に導き出せ
る。これらの研究では、275以䞊のヒト血枅に぀
いおdTk−abアツセむが行われたが、血枅dTk
掻性の阻止は䟋に芋出されただけであ぀た
Gronowitz  KašllanderInfec.
Immun.294251980Gronowitz 
KašllanderJ.Med.Virol.81771981
Kašllander et al.Infec.Immun.36301982。 発明の抂芁 本発明の目的は、皮々の目的における悪性腫瘍
の監芖を含む、或る皮のりむヌルス性感染症およ
び悪性腫瘍の蚺断のための手段を提䟛するこずに
ある。 本発明の他の目的は、ヒトおよび動物の䜓液お
よび现胞詊料−䟋えば血枅、疱疹分泌液、髄液、
小氎疱液およびこの皮の臚床暙本−䞭にある埮量
のdTkを怜出できる高感床のアツセむシステム
で、しかも现胞dTk−の寄䞎が最小になるよう
に考案されたアツセむシステムを提䟛するこずに
ある。 本発明のさらに他の目的は、腫瘍疟患の発芋お
よび予埌のために䜿甚し、病気の倉化を監芖し、
再発を発芋するためのdTk−アツセむ法を提䟛
するこずにある。 本発明のさらに他の目的は、燕麊现胞型肺癌ず
関連した転移を調べる堎合に、䞊蚘アツセむ法を
利甚するこずにある。 本発明の別の目的は、脳−脊髄系に転移がある
堎合、髄液䞭のdTkの枬定によ぀お、癜血病を調
べるために䞊蚘アツセむ法を利甚するこずにあ
る。 本発明のさらに別の目的は、りむヌルス性疟患
ず関連した或る皮の感染症のための、矀特異的マ
ヌカヌずしおの䞊蚘アツセむ法の利甚にある。 本発明のさらに他の目的は、血枅又は小氎疱液
等に存圚する、ヘルペスりむヌルスに特異的な
dTksを特異的に怜出するために䞊蚘アツセむ法
の倉法を利甚するこずにある。 本発明の䞊蚘およびその他の目的は、本発明に
よるアツセむ法およびその適甚に関する䞋蚘の蚘
述により、詳现に説明される。 本発明は、このように、血枅等に存圚するdTk
レベル、特にdTk−レベル枬定のための進歩し
たアツセむ法を提䟛する。このアツセむシステム
は、埓来技術のシステムよりかなり感床が高い。
そしお感床が非垞に高いために、非垞に簡単に実
斜できるこのアツセむシステムを、病的dTkレベ
ルのみをならず健垞者の正垞レベルでさえ枬定す
るのに甚いるこずができるこずが刀明した第
図ず第図を比范参照。このアツセむシステム
は、非垞に実際的で、時間以䞊も盎線性タヌン
オヌバヌを䞎えお、再珟性のあるdTk−枬定倀
を瀺すこずがわか぀ただけでなく、りむヌルス
dTksに関する埓来技術のシステムより〜倍
高いタヌンオヌバヌを䞎えるこずもわか぀た。埓
来のアツセむシステムず比范しお重芁なもう䞀぀
の利点は、dTk−のタヌンオヌバヌが比范的小
さいこずであり、未粟補詊料䞭でdTk−又はり
むヌルスdTkを枬定する堎合、このアむ゜ザむム
は極くわずか寄䞎するのみである。 燐酞䟛䞎䜓ずしおATPの代りにCTPを甚いる
このアツセむシステムの倉法は、分析すべき詊料
を、抗ヘルペスりむヌルスdTk阻止血枅ず共にに
あらかじめむンキナベヌトしたずきに、ヘルペス
りむヌルス誘導dTkを特異的に怜出するのに有甚
であるこずがわか぀た。 本文䞭に蚘茉された奜郜合のたた期埅以䞊の技
術的効果は、本発明によれば、䜎濃床および䜎む
オン匷床の緩衝系、特異的皮類の攟射性暙識化基
質その濃床は䜎いおよび䜎濃床の燐酞䟛䞎䜓
ずを組合わせお甚いるこずにより埗られる。 広い芋地からみお、本発明は、ヒト又は動物の
䜓液又は现胞詊料䞭のdTkアむ゜ザむムレベルを
枬定する方法であ぀お、䞊蚘詊料を燐酞䟛䞎䜓お
よび緩衝系の存圚䞋で䞊蚘アむ゜ザむムのための
基質ず反応させ、生成した燐酞化物の量を枬定
し、この量は䞊蚘アむ゜ザむムレベルず比䟋する
ずいう方法に関するものである。本発明による䞊
蚘方法は、  PH範囲〜、濃床250mM以䞋の緩衝系ず、  䞀郚は攟射性暙識化−−ハロゲンを有する
2′−デオキシ−−ハロりリゞンから成り、そ
の濃床が×10-9〜×10-6である基質ず、  20mM以䞋の濃床で存圚する燐酞䟛䞎䜓ずを
組み合わせお甚いるずいう特城を有する。 基質ずしお125I−IUdRを甚いる以前に報告さ
れたアツセむシステムず違぀お、本発明によるア
ツセむシステムでは现胞dTk−のための基質が
時間以䞊も盎線性タヌンオヌバヌを䞎え、第
図に芋られるように怜出感床が劇的に増加した。
この図は本発明によるアツセむ系−○−○−
○ず䞊蚘先行技術のアツセむ系−△−△−△
−ずの比范であるGronowitz 
KallanderInfec.Immun.294251980。
癜血病患者に由来するヒトdTk−を含む血
枅。现胞培逊起源のHSV型2dTk。利甚可胜
の総125I−IUdRは550×103cpmであ぀た。
【図面の簡単な説明】
第および図は、時間に察しおプロツトし
た酵玠掻性を瀺し、最も近い先行技術に比范し
お、本発明方法の感床が劇的に進歩しおいるこず
を瀺すグラフである。 第および図は、−薄局クロマトグラフに
よ぀お−本発明による奜たしい基質125I−IUdR
の攟射化孊的玔床の貯蔵䞭における枛少を瀺すグ
ラフである。 第図は、内郚基質コントロヌル察照を甚
いる時酵玠掻性を単䜍で蚈算するこずを説明する
グラフである。 第図は、dTk枬定においお血枅䞭の高濃床の
阻止的圱響を瀺すグラフである。 第図は、異なる臚床暙本におけるりむヌルス
dTkの型決定タむピングを、グラフによ぀お
瀺す。 第図は、䟛血者および劊婊におけるdTk掻性
の正垞分垃を瀺す図である。 第図は、䌝染性単栞症患者の血枅䞭で本発明
に䟝぀お枬定したdTk掻性を、病気発生埌の経過
時間ず関連づけお瀺した図である。 第図は、皮々のりむヌルス性感染症、マむコ
プラズマ肺炎およびオりム病にかか぀た患者の血
枅䞭に芋出されるdTk掻性を明らかにする図であ
る。 第および図は、本発明に埓぀お枬定し
た血枅dTk掻性ず、NHL患者の病期ずの間の盞
関関係を瀺す図である。 第および図は、NHL患者の生存
の確率ず、本発明に埓぀お枬定した血枅dTkレベ
ルずの関係を瀺す。 第および図は、皮々の臚床的経過を蟿
぀たNHL患者の血枅dTkレベルの経過研究を説
明する図である。 奜たしい態様の説明 本発明の奜たしい態様においおは、䞊蚘緩衝系
は玄150mM以䞋、特に奜たしくは玄100mMの濃
床である。緩衝液の奜たしいPHは6.5〜の範囲
で、特に玄7.4が奜たしい。マレむン酞塩を含有
しない緩衝液、反応性に富むアミノ基又は第䞀ア
ミノ基を欠く緩衝液、特にトリス−マレ゚ヌトを
実質的に含有しない緩衝液で最も良い結果が埗ら
れ、HEPES緩衝液が特に奜たしい。 基質は攟射性暙識化チミゞン同族䜓、特に2′−
デオキシ−−ハロゲン−りリゞンであるべき
で、その堎合その暙識は反応性ハロゲン同䜍元玠
であるこずが奜たしい。奜たしい基質は125I−
2′−デオキシ−−ペヌドりリゞンである。奜た
しい基質濃床は×10-8〜×10-7の範囲内、特
に玄10-7である。 dTk−枬定のために奜たしい燐酞䟛䞎䜓は
ATPで、りむヌルスdTk枬定のために奜たしい
燐酞䟛䞎䜓はCTPである。燐酞䟛䞎䜓の奜たし
い濃床は玄10mM以䞋、特に玄0.5〜5mMであ
る。本来ATPおよびCTPず同様のアむ゜ザむム
特異性をも぀こずが知られおいる燐酞䟛䞎䜓を甚
いおもよい。 Mg2+は燐酞䟛䞎䜓ず少くずも等モル濃床で存
圚するのが奜たしい。ゞチオスレむトヌルのよう
な還元剀が存圚するのが奜たしい。 燐酞化生成物は本来知られおいる方法によ぀お
枬定できる䟋えばGronowitzずKallander
Infec.Immun.294251980参照。 䟋えば血枅又は疱疹分泌物のような臚床暙本に
おけるdTk掻性を怜出するために本発明によるア
ツセむシステムを適甚するこずは、或る皮のりむ
ヌルス感染症および悪性腫瘍の蚺断のための新し
い手段をもたらす。前述した方法による単䞀の
dTkアツセむで埗られた異垞な血枅dTkレベル
䟋えば、10単䜍は、予埌蚺断的に䜿甚する堎
合、すぐれたマヌカヌになるこずが刀明し、たた
同様に連続dTk倀も悪性疟患の進行又は退行を監
芖する堎合のすぐれたマヌカヌになるこずが刀明
した。曎に、これらの患者では血枅dTkレベルが
再発のマヌカヌずしお、又治療効果を評䟡する䞊
で圹に立぀。これらすべおを以䞋に䟋蚌する。 以䞋に報告するテストを行う堎合に実際に採甚
された奜たしい態様においおは、125I−IUdRが基
質ずしお甚いられる。奜たしいアツセむシステム
の組成、比率および最終濃床を第衚に蚘す。
【衚】
【衚】  䞀぀の倍詊料の比率はアツセむ混合物
51.5Ό、基質溶液6Ό125I−IUdRの最終濃
床×10-7、130〜160CimM、酵玠溶液
䟋えば血枅2.5Ό反応開始時に加わえ
る、最終容量は60Όずなる。  HEPES−ヒドロキシ゚チルピペラゞ
ン−−゚タンスルホン酞 䞀般に、51.5Ό反応溶液を䜿甚盎前に6Ό基
質溶液ず混合しお、䞀぀の倍詊料を調補する。
2.5Ό酵玠溶液䟋えば血枅詊料の添加によ぀
お反応が始たる。党量60Όずいうこの暙準容量
から25Όづ぀回詊料をずる。異なるむンキナ
ベヌシペン時間をおいお採取される数組の倍詊
料から成る実隓のためのアツセむ混液の組成は、
暙準溶液䞭の成分の量に、倍詊料の所望数を乗
ずるこずによ぀お蚈算される。アツセむは37℃で
行われ、反応開始の前に分間党成分をあらかじ
めあたためる。詊料をピペツトで、90〜100℃に
保たれたcm2のWhatman DEAE−81玙片䞊に眮
くこずによ぀お、酵玠反応は終る。生成物を基質
から分離するために、その玙を6mM蟻酞アンモ
ニりム溶液で回、蒞溜氎で回、最埌にメタノ
ヌルで掗う。掗浄は、磁気攪拌噚にずり぀けられ
たのガラス容噚䞭で行われる。10〜15枚の円
圢の玙片を過噚に入れお、同時に凊理する。そ
の過噚を分おきに新しい掗浄槜に移すのであ
る。最埌にその円圢玙を自動ガンマ蚈数管でカり
ントする。 dTkアツセむにおける経日倉動を排陀するため
に、埗られた反応速床を単䜍に蚈算し盎した。酵
玠量を定めるのに単䜍を䜿う理由は、垂販の125I
−IUdRの生物孊的厩壊が芋出されたこずず関連
しお最初の攟射化孊的玔床に倉動があるためであ
る。生物孊的厩壊は、詊料毎に加えた総攟射胜
を、酵玠掻性の蚈算に無関係なものにしおした
う。第図は、予備コヌテむングしたシリカゲル
プレヌトMerck 60F254を甚いお行぀た薄局
クロマトグラフむヌにおける垂販の125I−IUdR
バツチの分離を瀺す。溶出液ずしお15メタノヌ
ル、85クロロホルムを甚いた。入手日にお
ける性状、攟射化孊的玔床62を瀺す。150
日冷蔵庫に貯蔵埌の同䞀バツチ。補造業者の䞻匵
では、最初の攟射化孊玔床は90である。その
代り、易感受性攟射胜を枬定する生物孊的内郚コ
ントロヌル察照を各アツセむに含めた。この
察照はHSV2型dTkを100倍も倚く含むものであ
぀お、倧芏暡な基質疲憊を招いた。時間アツセ
むにおいお、この察照により挿入される攟射胜の
量は完党な125I−IUdRの玄85であるこずがわ
か぀た薄局クロマトグラフむヌから蚈算しお。
生物孊的察照で芋出されたそのレベル85を
考慮しお、酵玠単䜍は、蚘茉せる条件䞋で
時間に぀き基質4.3×10-15モルを倉換する酵玠
量ずなる。単䜍ず、抂算モル・タヌンオヌバヌず
の間のこの関係は、通垞甚いられる同䜍元玠量の
堎合、単䜍が実際䞊玄1000cpmずしおあらわさ
れるように遞択された第衚参照。この生物
孊的同䜍元玠察照を、詊隓詊料ず同様な方法で凊
理しお甚いる堎合のもう䞀぀の利点は、生産物回
収率の倉動によりおこり埗る単䜍の倉動が回避さ
れるこずである。単䜍蚈算の手順は第図に䟋瀺
する。詊料−○−○−および察照−△−△
−䞡方の倀を瀺す。は内郚察照の倀をcpmで
あらわしおあるこれは利甚可胜の総攟射性暙識
化基質に比䟋する。は被隓詊料により生成した
産物の数倀をcpmhourであらわしたものであ
る。 単䜍×××5.3×10-15、ここ
では 基質濃床、は詊料の量である。 血枅掻性の枬定 血枅dTkの定量をミクロタむタヌ・プレヌトで
行な぀た。20血枅詊料毎に、バツクグラりンド察
照ず内郚基質察照䞊蚘参照が含たれ、その䞀
組をナニツトしお凊理した。甚いた血枅詊料の量
は最終容量120Όあたり5Ό又はそれ以䞋
であ぀たそれ以䞊の血枅は阻止的に働くかも知
れない。第図参照。120分埌にサンプリングを
行぀おdTk掻性を枬定した。酵玠掻性を、詊料
60Όあたりの血枅濃床に察しおプロツトした。
○−○NHLに眹぀た個䜓からの血枅、△−
△掻性CLLにかか぀た個䜓からの血枅。䞊蚘
の阻止的圱響は、倚分、䟋えばチミゞン、チミゞ
ン䞉燐酞塩のような、ヌクレオチド又はヌクレオ
シドの存圚、又は或る血枅䞭には存圚する分解甚
酵玠によるものであろう。60分埌ず120分埌に二
重に詊料を採取した。バツクグラりンドを補正し
た埌、時間および25Ό詊料に぀いおの培地タ
ヌンオヌバヌを、各二倍詊料から別別に蚈算し
た。それから60分および120分サンプリングの平
均速床倀を枬定し、倉動が20であ぀た堎合は
その平均速床倀をその埌の蚈算に甚いた。 髄液䞭のdTk掻性の枬定 本質的には血枅の堎
合ず同じ方法を甚いた。125I−IUdRの比攟射胜を
箄320CimMに増加させた。酵玠枬定の前に髄
液を濃瞮しおもよい。 dTkアむ゜ザむムの定性詊隓 dTk掻性を含
む、䟋えば小氎疱液、血枅のような臚床暙本を、
アむ゜ザむムに特異的なdTk阻止抗䜓ず共にあら
かじめむンキナベヌトし、残りの酵玠掻性を䞊述
の方法によ぀お枬定した。アツセむ混液䞭の
ATPをCTPに代えた。その結果dTk−掻性は
陀かれる。詊隓すべき暙本を反応溶液で段階的二
倍皀釈を行い普通はで開始する、そし
お皀釈液から15Όづ぀、ミクロタむタヌプレヌ
トの぀の凹みに移す。こうしお同䞀皀釈の怜
䜓が組ずなる。 あらかじめ皀釈したVZV dTk−阻止血枅25
mlを぀の凹みに加え、HSV 型dTk阻止血
枅を番目の凹みに、HSV2型dTk阻止血枅を
番目の凹みに、マむナス血枅を番目の凹みに加
えた。その混合物を37℃で90分間むンキナベヌト
し、酵玠−抗䜓反応を行わせた。その埌残留酵玠
掻性を枬定した。基質溶液6Όおよび反応溶液
14Όから成る混合液20Όを加えるこずにより
反応は開始した。各皀釈毎に異なる抗䜓の存圚䞋
で埗られた数倀を、マむナス血枅で埗られた数倀
のパヌセンテヌゞずしお蚈算し盎した。そのよう
な残留酵玠掻性を、暙本のlog2皀釈に察しおプロ
ツトした䟋を第図に瀺すここでは抗−VZV
dTk血枅△−△、抗−HSV 型dTk血枅
●−●および抗−HSV 型血枅○−○
ず共にむンキナベヌシペンした埌の残留掻性ず、
マむナス血枅ず共にむンキナベヌシペンした察照
ずの比を、次の詊料の皮々の皀釈に察しおプロツ
トしたHSV 型感染症にかか぀た固䜓か
らの小氎疱液VZV感染症にかか぀た個䜓
からの小氎疱液HSV 型感染症にかか぀た個
䜓からの小氎疱液VZV感染症にかか぀た個䜓
からの血枅。阻止パタヌンから、dTkの型が容易
に定められる以䞋の第衚も参照。
【衚】 こうしお、本発明の重芁な特城の䞀぀は、劇的
に増加した怜出感床である。このおかげで第図
から刀るように第図は99人の䟛血者の血枅䞭
に芋出されたdTk掻性の分垃癜柱ず、ケ月
以内の劊婊22人の血枅䞭のそれの分垃斜線柱
ずを瀺す、健垞者の血枅䞭の正垞なdTk−レ
ベルの枬定さえ可胜ずなる。平均倀は2.4単䜍
Ό、暙準偏差は1.25である。 感染性疟患にかか぀た個䜓から埗た血枅詊料を
研究するこずによ぀お、或る皮のりむヌルス性疟
患䟋えば䌝染単栞症、颚疹−、麻疹−りむヌルス
感染症の急性期における患者の血枅䞭dTkレベル
は10〜40倍䞊昇しおいるこずが発芋された。第
図は、䌝染性単栞症患者の血枅䞭に生成するdTk
掻性Όを、その病気の発生埌の時間経過ず関
連づけお瀺したものである。同䞀文字を付した○
印は同䞀患者からの血枅を瀺し、点線は健垞者の
正垞倀を瀺す。第図は皮々のりむヌルス感染
症、マむコプラズマ肺炎、およびオりム病にかか
぀た患者の急性期●および回埩期○の血
枅䞭に芋出されるdTk掻性Όを瀺す。点線
は、健垞者の正垞倀の倍の数倀を瀺す。 この結果によるず、ヘルペスりむヌルスに関し
おは原感染症のために血枅dTk掻性が䞊昇するこ
ずが瀺される。他の感染症に関しおは、その結果
ずしおおこるdTk掻性の䞊昇10単䜍は芋出
されなか぀た第図。芋出された血枅掻性を
特城づけるず、これたでに氎痘−垯状疱疹りむヌ
ルスVZV−特異的−dTk第衚および现
胞dTk−の存圚が蚌明された。本発明方法は、
感染症を速かに蚺断するために小氎疱液䞭に存圚
するりむヌルス特異的−dTkを決定するために甚
いるこずができるこずも蚌明された第衚。
りむヌルス感染症ず関連しお芋出されるすべおの
血枅dTk掻性は、埐々に消倱し、〜週間以内
に正垞レベルに達する。 悪性疟患患者に関しおは、本発明に䟝るアツセ
む法を甚いた限られた研究の結果、リンパ球−増
殖系に起因する悪性腫瘍にかか぀おいる患者のみ
ならず、その他の现胞の悪性腫瘍にかかり、リン
パ球増殖系に転移した患者においおも血枅dTkレ
ベルの䞊昇が蚌明された第衚参照。 非ホゞキン性リンパ腫NHL、ホゞキン病
HD、慢性掻性化リンパ性癜血病CLLおよ
び骚髄腫のような、リンパ球増殖症にかか぀おい
る患者から、十分に確認された倧量の血枅詊料を
埗お、これを甚いお倧芏暡な研究を行぀た。
NHL矀の詳现な結果は次のようであ぀た。正垞
な血枅dTkレベルず、皮々の皋床に䞊昇したdTk
レベルが発芋された。これらのdTkレベルは病気
ず関連しおいた第図参照、この図は、未凊眮
のNHL患者155人の血枅䞭dTkを病期ず関連づけ
お瀺す、即ち病気が進行すればする皋dTk倀は
高くなる。
【衚】
【衚】 dTkレベルを腫瘍现胞の悪性化ず関連づけお芋
る時キヌル・システムによる分類、高いdTk
レベルず悪性化の間には十分な盞関関係が認めら
れた。第図参照、期に分けられた悪性腫瘍
の第〜期のNHL患者101人における血枅dTk
を瀺す。 本発明によるアツセむ法を予埌を知る目的のた
めに䜿甚し埗るこずが蚌明された。それは、枬定
したdTk倀が10単䜍であるか、10単䜍である
かによ぀お分類した患者矀の間で、生存期間に高
床に有意な差があらわれたからである。第
図は、あらかじめ枬定した血枅dTkが10単䜍
−○−○−50又は10単䜍−●−●
−51を瀺した〜期のNHL患者の生
存確率を瀺す。カツコ内の数字は、32ケ月埌の芳
察時に生き残぀おいる人数を瀺す。第図
は、“高床に”悪性化した腫瘍をも぀た〜期
のNHL患者に぀いおの生存確率を瀺す。あらか
じめ枬定したdTkレベル10単䜍−○−○
−11および10単䜍−●−●−
27。カツコ内の数字は32ケ月埌の芳察時に残぀
おいる人数である。 曎に、NHL患者の血枅dTkレベルの経時研究
は、病気の倉化に盞関した倉化をあらわした。即
ち病気の回埩でそのレベルは䜎くなり、病気の亢
進で高くなり、定垞状態では倉化しない。第
図のは、亢進期の病気の患者の血枅dTkレベ
ル枬定倀の倉化、は治療しお幟分緩解した患
者、は治療しお完党に緩解した患者における
それを瀺しおいる。第図では、病気の亢進
も回埩も䞡方共おこ぀た患者においお血枅dTk
を瞊に远跡した。は亢進性疟患の患者を瀺
し、圌等は治療法を倉えた埌、幟分緩解し、その
埌再び病気は亢進した。は治療しお緩解した
患者のものであるA.H.E.L.は幟分緩解、
G.E.は完党に緩解。圌等党員はその埌再発した。
A.H.はもう䞀床その治療に短期間反応した。以
䞊の結果は、治療効果を監芖できるこず、そしお
治療䞭にも治療埌にも、dTk倀の増加によ぀お、
再発の早期発芋ができるこずを明らかに瀺しおい
る。 本発明によるアツセむ法をその他の䞊蚘リンパ
球増殖性疟患ず関係づけお甚いた堎合、血枅dTk
レベルの倉動が芋出された、䟋えば慢性CLLは
正垞倀が芋出されたが、半掻性化CLLでは䜎い、
病的数倀10単䜍ずなり、掻性CLLは高い
数倀を䞎えた。NHLで瀺したようなdTkレベル
の利甚の仕方はCLLにもあおはたる。その䞊、
癜血病患者から採取した髄液の研究により、癜血
病现胞が脳−背髄液䞭にある時にはdTkが存圚す
るこずが刀぀た。 圓然、悪性疟患患者においおも䞊蚘のりむヌル
ス性感染症による−過性の血枅dTkレベルの䞊昇
がおこり埗るこずに、気が぀かなければならな
い。しかしながらこれらのりむヌルス性疟患に関
しおは、子䟛の頃に免疫を獲埗しおいるのが普通
である。䞀方、悪性腫瘍疟患は、普通、成人にお
こる。䞊述の目的のために血枅dTkレベルを利甚
するこずが理に叶うもう䞀぀の理由は、未確定の
病気をも぀た患者から採取した蚺断的目的のため
に連続的に埗た非遞択的血枅詊料の研究で、dTk
掻性䞊昇は皀にしかおこらないこずである。これ
らの患者およびその他の患者に関する医孊的蚘録
を調べるず、肝機胜怜査の病的数倀も血枅球増倚
症も普通は血枅dTkレベルの䞊昇を䌎わないこず
が刀明した。
JP58501735A 1982-05-14 1983-05-10 アむ゜ザむム掻性の枬定法ずその利甚 Granted JPS59500796A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8203041A SE453514B (sv) 1982-05-14 1982-05-14 Sett att bestemma deoxitymidinkinas-dtk-isoenzymnivaer i kroppsvetska eller cellprov och anvendningen av forfarandet for isoenzymtypning
SE8203041-2 1982-05-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS59500796A JPS59500796A (ja) 1984-05-10
JPH051000B2 true JPH051000B2 (ja) 1993-01-07

Family

ID=20346817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP58501735A Granted JPS59500796A (ja) 1982-05-14 1983-05-10 アむ゜ザむム掻性の枬定法ずその利甚

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4637977A (ja)
EP (1) EP0094923B1 (ja)
JP (1) JPS59500796A (ja)
AT (1) ATE33504T1 (ja)
AU (1) AU551176B2 (ja)
CA (1) CA1199858A (ja)
DE (1) DE3376272D1 (ja)
DK (1) DK167692B1 (ja)
ES (1) ES8402876A1 (ja)
FI (1) FI77895C (ja)
SE (1) SE453514B (ja)
WO (1) WO1983004054A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816410A (en) * 1986-10-29 1989-03-28 Coulter Corporation Control slide for immunoassay kit and method of making same
DE60217665T2 (de) * 2002-07-27 2007-10-11 Diasorin Ab Verfahren zur Bestimmung der AktivitÀt von Thymidinkinase-1 und dessen Verwendung
KR101275585B1 (ko) 2005-02-25 2013-06-19 뢎넀륎볌 읞터낎셔널 아베 티믞딘 킀나아제 활성을 결정하는 방법 및 킀튞 및 귞의용도
JP7560482B2 (ja) * 2019-05-06 2024-10-02 アロセル ゚ヌビヌ 呌吞噚感染の怜出および分類

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4302535A (en) * 1979-09-27 1981-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Assay for mutagenesis in heterozygous diploid human lymphoblasts
US4317877A (en) * 1980-06-05 1982-03-02 Sloan Kettering Institute Process for detecting the presence of malignant and pre-malignant cells in humans
IE64317B1 (en) * 1989-10-26 1995-07-26 Walbro Corp Fuel metering method and apparatus

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INFEC IMMUN=1980 *
INFEC IMMUN=1982 *
J.BIOL CHEM=1979 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP0094923A2 (en) 1983-11-23
EP0094923B1 (en) 1988-04-13
DK16384D0 (da) 1984-01-13
SE8203041L (sv) 1983-11-15
DK16384A (da) 1984-01-13
FI840134A7 (fi) 1984-01-13
ATE33504T1 (de) 1988-04-15
AU1554083A (en) 1983-12-02
JPS59500796A (ja) 1984-05-10
AU551176B2 (en) 1986-04-17
US4637977A (en) 1987-01-20
FI77895C (fi) 1989-05-10
ES522376A0 (es) 1984-03-01
CA1199858A (en) 1986-01-28
FI840134A0 (fi) 1984-01-13
FI77895B (fi) 1989-01-31
ES8402876A1 (es) 1984-03-01
SE453514B (sv) 1988-02-08
WO1983004054A1 (en) 1983-11-24
EP0094923A3 (en) 1985-07-24
DE3376272D1 (en) 1988-05-19
DK167692B1 (da) 1993-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chan et al. Effectiveness of sodium fluoride as a preservative of glucose in blood.
Maloney et al. Distribution of suboptimally induced β-D-Galactosidase in Escherichia coli: the enzyme content of individual cells
JP4901005B2 (ja) 现胞アッセむ、方法及び詊薬
Stewart Sensitive automated methods for phosphate and (Na++ K+)-ATPase
Urdal et al. Effects of Ca, Mg, and EDTA on creatine kinase activity in cerebrospinal fluid.
Marche et al. Metabolism of phosphoinositides in the rat erythrocyte membrane: A reappraisal of the effect of magnesium on the 32P incorporation into polyphosphoinositides
US4080265A (en) Method for the determination of creative phosphokinase enzyme
CN109988816A (zh) 䞀种腺苷脱氚酶测定试剂盒
JPH051000B2 (ja)
JPH0687799B2 (ja) 酵玠阻害によるテオフむリンの分析甚分析玠子組成物および方法
Orfanos et al. A rapid screening test for Duchenne muscular dystrophy using dried blood specimens
Browning Fluorometric enzyme assay for choline and acetylcholine
Karmen et al. Measurement of biliary alkaline phosphatase by mini-column chromatography and by electrophoresis and its application to the detection of liver metastases in patients with breast cancer.
US3801466A (en) Uric acid assay and reagents therefor
US6861225B1 (en) Method and reagent kit for determining activity of 5-nucleotidase
Canbolat et al. The comparison of adenosine deaminase activity values with polymerase chain reaction results in patients with tuberculosis
Lundin et al. Optimized bioluminescence assay of creatine kinase and creatine kinase B-subunit activity.
Fingerman et al. Defective Ca2+ metabolism in Duchenne muscular dystrophy: effects on cellular and viral growth.
Raabo Determination of serum lactic dehydrogenase by the tetrazolium salt method
Rosano et al. Evaluation of adenosine 5'-monophosphate and fluoride as adenylate kinase inhibitors in the creatine kinase assay.
CN111057746B (zh) 䞀种肌酞激酶同工酶测定试剂盒
TWI275795B (en) Novel assay method
CA1070227A (en) Measurement of alkaline phosphatase levels in body fluids
BRPI0609044B8 (pt) método e kit de ensaio para a determinação de atividade de timidina cinase em uma amostra biológica, uso de método e/ou de kit de ensaio, método para uso em diagnóstico, monitoramento e/ou prognóstico de doenças ou distúrbios de proliferação celular, e, método para uso em triagem de compostos
Caines et al. An improved fluorometric coupled enzymatic method for the determination of pyrophosphate in plasma and platelets