JPH0510626B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は感作効率の高い免疫分析用マイクロカ
プセルの製造法に関する。 抗原又は抗体を免疫学的に検査する方法として
従来から赤血球凝集反応が行われている。またポ
リスチレンラテツクスを担体とするラテツクス凝
集反応もすでに実用化されている。しかしながら
これら従来法においては非特異凝集が起りやす
い、感度が不充分である、長期保存性が悪い、判
定までに長時間を要する等の欠点がある。 このような赤血球やラテツクスなどの代りに、
マイクロカプセルを担体として使用する方法が提
案された。（特開昭55−94636、同57−19661、同
57−19662等）。 この方法においては、動物由来の担体（赤血
球）に固有の前記欠点やラテツクス等の合成担体
が有する不都合は解消されており、このマイクロ
カプセル担体法を適用すれば、感度上昇、簡便な
操作、オン・オフの確実な判別など、従来法に比
べてより改善された効果が得られると共に、従来
法では実用上不可能であつた新しい検査も開拓さ
れつつある。 本発明者らは免疫検査用担体としてのマイクロ
カプセルの性能についてさらに種々検討を重ねて
いたところ、芯物質、壁材及び添加剤の特定の組
合せでマイクロカプセル化を行なうと、感度の高
い免疫検査試薬を与えるマイクロカプセルが得ら
れることを見出した。 すなわち本発明はポリビニルアルコールとポリ
スチレンスルホン酸とを含む水溶液に多価イソシ
アネートと油性物質からなる油性物質液を添加し
ポリビニルアルコールとポリスチレンスルホン酸
との共存下に乳化分散し、ついで水溶性多価アミ
ノ化合物を前記乳化分散液に加えて前記多価イソ
シアネートと重合させることを特徴とする免疫分
析用マイクロカプセルの製造法に関する。 本発明のマイクロカプセルは以下の工程により
製造される。 (1) 芯を形成する油性物質に油溶性の多価イソシ
アネート、イソチオシアネートまたはそれらの
プレポリマー（以下イソシアネートで両者を代
表する。）を溶解し油性物質液を調製する。 (2) PVA，PSSの両者を溶解した水溶液（PVA
−PSS水溶液ということがある）を調製する。 (3) PVA−PSS水溶液に油性物質液を添加し、
PVAとPSSとの共存下に乳化分散する。 (4) 乳化分散液に多価アミノ化合物を加える。 (5) 熱重合を行なう（60〜90℃程度、通常約70℃
で１時間以上、普通２時間位加熱する）。 以上の工程によりマイクロカプセル化が完了す
る。縮重合反応の進行が遅い多価イソシアネート
と多価アミノ化合物との組合せでは(4)の工程は(2)
の工程に合併することができるが望ましいことで
はない。PVAとPSSとは多価イソシアネートの
乳化分散に際して必ず共存した状態でなければな
らない。例えばどちらか一方で乳化分散を行ない
他方をその後加えて共存系を構成しても本発明の
マイクロカプセルは得られない。 こうして得られたマイクロカプセルは抗原又は
抗体を感作したマイクロカプセル試薬とした場
合、凝集反応において非常に高い検出感度を示
す。本発明のマイクロカプセルは前記の組合せ条
件においてのみ製造することができ、どの一つが
欠けても所期のマイクロカプセルは得られない。
その理由は必ずしも明らかではないが、PVA−
PSSの共存下では界面での重合が極めて巧妙にコ
ントロールされるものと思われる、しかも壁表面
の凹凸が多く従つて壁の表面積が大きくなつてい
ることが寄与しているものと思われる。 PVAは通常200〜1500程度の重合度をもつもの
が使用される。重合度があまり低いと乳化分散力
が弱く、高すぎると抗原又は抗体が結合しにく
い。PVAは油性物質に対し４〜16重量％程度使
用するのが望ましい。感圧紙用マイクロカプセル
で観祭されている（特開昭55−132631）ようなけ
ん化度との相関は特にないが、実用的には約85％
以上のものがよい。 PSSは10万から200万程度の分子量のものが適
しており、好ましくは20万〜100万、実用上は50
万位のもので、スルホン化度が40〜99％の範囲で
使用される。使用量はPVAに対し10〜100重量％
の範囲が適当である。 本発明のマイクロカプセルにおいて壁材の成分
として使用される多価アミノ化合物は、水溶性の
第１級アミノ化合物である。例えば直鎖ジアミン
（エチレン−、テトラメチレン−、ヘキサメチレ
ン−、オクタメチレンジアミン等）、ジエチレン
トリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエ
チルペンタミン、芳香族ジアミン（フエニレン
−、キシレンジアミン、ジアミノ安息香酸、アミ
ノフエニルエチルアミン等）、異節環ジアミン
（ジアミノ−ピリジン、−トリアゾール、−ピリミ
ジン、−メルカプトピリミジン等）、塩基性アミノ
酸（アルギニン、リジン、ヒドロキシリジン、オ
ルニチン、シトルリン、グルタミン、アスパラギ
ン等）トリアミン（トリアミノ−プロパン、−ベ
ンゼン、−ピリミジン等）があり、中でも直鎖ジ
アミン及び塩基性アミノ酸、特にヘキサメチレン
ジアミンとリジンが好ましい。 カプセルの芯物質となる油性物質としては天然
鉱物油、動物油、植物油および合成油があげられ
る。これら芯物質は、表面がカプセル壁で完全に
おおわれるため、抗原や抗体への直接の影響はな
いと思われるが、生化学的に活性なものは、避け
た方が好ましい。 鉱物油の例として、ケロシン、ナフサ、パラフ
イン油があり、動物油の例では、魚油、ラード
油、がある。植物油の例は、落花生油、亜麻仁
油、大豆油、ひまし油及びとうもろこし油等があ
る。合成油の例としては、ビフエニル化合物
（例；イソプロピルビフエニル、イソアミルビフ
エニル）、ターフエニル化合物、ナフタレン化合
物（例；ジイソプロピルナフタレン）、アルキル
化ジフエニルアルカン（例；２，４−ジメチルジ
フエニルメタン）、フタル酸化合物（例；ジエチ
ルフタレート、ジブチルフタレート、ジオクチル
フタレート）、塩化パラフイン等が挙げられる。
多価イソシアナート、多価イソチオシアネート又
はこれらのプレポリマーとは、２個以上のイソシ
アナート基又はイソチオシアナート基を有し、か
つ油性物質に可溶の化合物を指す。具体例として
は、ｍ−フエニレンジイソシアナート、ｐ−フエ
ニレンジイソシアナート、２，６−トリレンジイ
ソシアナート、２，４−トリレンジイソシアナー
ト、ナフタレン−１，４−ジイソシアナート、ジ
フエニルメタン−４，4′−ジイソシアナート、
３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエニルジイソ
シアナート、３，3′ジメチルジフエニルメタン−
４，4′−ジイソシアナート、キシリレン−１，４
−ジイソシアナート、キシリレン−１，３−ジイ
ソシアナート、４，4′−ジフエニルプロパンジイ
ソシアナート、トリメチレンジイソシアナート、
ヘキサメチレンジイソシアナート、プロピレン−
１，２−ジイソシアナート、ブチレン−１，２−
ジイソシアナート、エチリジンジイソシアナー
ト、シクロヘキシレン−１，２−ジイソシアナー
ト、シクロヘキシレン−１，４−ジイソシアナー
ト、ｐ−フエニレンジイソチオシアナート、キシ
リレン−１，４−ジイソチオシアナート、エチリ
ジンジイソチオシアナート等のジソシアナート又
はジイソチオシアナート；４，4′，4″−トリフエ
ニルメタントリイソシアナート、トルエン−２，
４，６−トリイソシアナート、ポリメチレンポリ
フエニルトリイソシアナート、１，１，１−トリ
ス〔（３−イソシアナート−４−メチルフエニル）
カルバモイルオキシメチル〕プロパンの如きトリ
イソシアナート；４，4′−ジメチルジフエニルメ
タン−２，2′，５，5′−テトライソシアナートの
如きテトライソシアナート；ヘキサメチレンジイ
ソシアナートとヘキサントリオールの付加物、
２，４−トリレンジイソシアナートとブレンツカ
テコールの付加物、トリレンジイソシアナートと
ヘキサントリオールの付加物、トリレンジイソシ
アナートとトリメチロールプロパンの付加物、キ
シリレンジイソシアナートとトリメチロールプロ
パンの付加物、ヘキサメチレンジイソシアナート
とトリメチロールプロパンの付加物の如きポリイ
ソシアナートプレポリマー；又はこれ等に類似す
る任意の適当なポリイソシアナート又はポリイソ
チオシアナートが挙げられる。これら二種以上を
併用することも可能である。使用量は油性物質液
100部に対し0.1〜20部程度、特に１〜10部程度が
好ましい。 本発明のマイクロカプセルの製造方法に適用し
うるマイクロカプセル化のその他の条件等は近藤
朝士著「マイクロカプセル」日刊工業新聞社刊
（昭和45年）、特開昭56−72346等に詳記されてい
る。 本発明のマイクロカプセルの比重は芯物質を変
えることによつて自在に変えることができるが、
免疫検査としての用途から一般には0.85−1.25の
範囲内のものが適当である。 マイクロカプセルの平均サイズは、0.5μｍ〜
20μｍ、好ましくは、1μｍ〜10μｍの範囲から選
択するのが望ましい。 本発明のマイクロカプセルは非常に高い感作効
率を示すので、免疫検査試薬の担体として極めて
有用である。また非常にＳ／Ｎ比の高い高感度の
免疫検査用試薬を与えるので製造コストの点で極
めて有利である。 以下実施例により本発明をさらに詳細に説明す
る。 実施例 １ ジイソプロピルナフタレン8.4ｇと塩素化パラ
フイン（トヨパラツクス150、東洋曹達社製塩素
化度50％）16.6ｇとの混合油（比重約1.14）に油
溶性赤色螢光染料オレオゾール・レツドBB
Oleosol Red BB（住友化学製C.I 26105）0.25ｇ
を溶解した。得られた溶液に１，１，１−トリス
〔（３−イソシアナト−４−メチルフエニル）カル
バモイルオキシメチル〕プロパン（バーノツクＤ
−750、大日本インキ社製）1.6ｇをメチルエチル
ケトン２ｇに溶解した溶液を混合した。この油性
物質液をポリビニルアルコール、PVA−105（ク
ラレ社製、ケン化度98％、重合度500）２ｇとポ
リスチレンスルホン酸の一部ナトリウム塩（プロ
クター・ギヤンブル社製、VERSA、TL−500、
平均分子量50万）１ｇとを水75mlに溶解した溶液
の中に加えて、撹拌、乳化し、油滴の平均サイズ
を約5μｍに調製した。これにヘキサメチレンジ
アミン2.6ｇを水25mlに溶解した溶液を加え、水
75mlで希釈した後、70℃で２時間反応させてマイ
クロカプセル化を行なつた。 マイクロカプセル生成後、生理食塩水で遠沈洗
浄して未反応残存物を除去し、マイクロカプセル
粒子濃度が10％になるように生理食塩水に分散し
た。 比較用マイクロカプセルＡ： ポリビニルアルコール、PVA−105の代わりに
ポリビニルアルコール、PVA−117（クラレ社製、
ケン化度98％、重合度1700）を用いる他は実施例
１と同じ条件でマイクロカプセルＡを調製した。 比較用マイクロカプセルＢ： ポリスチレンスルホン酸は使用しないで、ポリ
ビニルアルコール、PVA−105を３ｇ用い、その
他は実施例１と同じ条件でマイクロカプセルＢを
調製した。 比較用マイクロカプセルＣ： ポリビニルアルコール、PVA−105を使用しな
いで、ポリスチレンスルホン酸２ｇを用い、その
他は実施例１と同じ条件でマイクロカプセルＣを
調製した。 以上４種類のマイクロカプセルを使用して以下
の操作によりマイクロカプセル試薬を作成し、そ
れぞれの感度を比較した。 マイクロカプセル試薬の調製及びその評価 本発明のマイクロカプセルによる試薬甲 実施例１で調製した本発明のマイクロカプセ
ル1.5ｇを分取し、生理食塩水8.5mlに希釈分散
した。次に25％グルタルアルデヒド水溶液を生
理食塩水で100倍に希釈した液10mlを希釈マイ
クロカプセル液に加え、37℃で45分反応させ
た。反応終了後、遠沈洗浄し10mlの生理食塩水
に再分散した。この２mlを分取しアフイニテイ
クロマト精製抗ヒトIgG抗体（ヒツジ免疫、和
光純薬社製、１％液）を生理食塩水で200倍に
希釈した液２mlを加え、37℃で120分インキユ
ベートした。次いで0.2％グリシン含有0.15M
リン酸緩衝生理食塩水（PBS，PH＝7.2）で３
回遠沈洗浄を行なつた後、３％ウシ血清アルブ
ミン（BSA）含有PBSに分散して、ヒトIgG検
出試薬とした。 比較用マイクロカプセル試薬Ａ，Ｂ及びＣ 比較用マイクロカプセルＡ，Ｂ及びＣそれぞ
れを工程と同様にしてグルタルアルデヒド処
理を行ない、アフイニテイクロマト精製抗ヒト
IgG抗体の50倍希釈液を用い工程と同じ条件
でその後の反応を行ない、比較用試薬Ａ，Ｂ及
びＣを得た。 試薬の評価 ．で作成した試薬甲について以下の操作に
従い、マイクロタイター法を用いて抗原抗体反
応を行なつた。明らかな凝集を認めた管を陽性
とし、陽性を示す血清の最高希釈倍数を求め、
それを抗体価とした。 ヒトIgG（マイルス社製）１％溶液を１％
BSA含有PBSで２万倍に希釈したものおよび
陰性コントロールとして正常ヤギ血清を同じく
１％BSA含有PBSで10倍希釈した。Ｖ字底マ
イクロプレートの各管孔に、それぞれを25μ
づつ採取し、１％BSA含有PBSを用いて２倍
間隔に希釈して倍数希釈列を作成した。 次に．で作成した試薬甲の25μをドロツ
パーで採取し、マイクロプレートの被検液希釈
列の管孔に滴下した。マイクロプレートを５分
間振動し、抗原抗体反応を進めた。室温で３時
間静置後、マイクロプレート管底の凝集像を観
察し、第１表の如き抗体価を得た。 ．で得られた比較用マイクロカプセル試薬
Ａ〜ＣについてヒトIgG1％溶液を１％BSA含
有PBSで100倍に希釈したものを用いる他は試
甲薬についての操作と同じ条件で操作し、第１
表の如き抗体価を得た。

【表】 本発明のマイクロカプセルに抗ヒトIgG抗体
を感作した試薬甲は、比較用試薬Ａに比べ800
倍、抗体価が高いことが見出された。また陰性
コントロールによる非特異凝集性は比較用試薬
Ｂ及びＣより低く、極めてSN比の高い試薬が
得られた。本発明のマイクロカプセルを使用し
て得た試薬は比較用試薬に比べより低い抗体濃
度で充分高い抗体価を与えるので製造コストの
点で極めて有利である。 アフイニテイクロマトグラフイにより精製し
た抗ヒトIgG抗体の代りにアフイニテイクロマ
トグラフイによる精製を行なつていない抗ヒト
IgG抗体（マイルズ社製）を生理食塩水で20倍
希釈して用いる他は工程と同じ条件で反応を
行ない、抗ヒトIgG検出試薬乙を得た。操作
に従い、マイクロタイター法により抗原抗体反
応を進めて抗体価を求め、第２表に示す結果を
得た。

【表】 本発明のマイクロカプセルはこれに市販の抗
体をそのまま固定しても充分高い抗体価を与え
ることが判明した。比較例Ａ〜Ｃのマイクロカ
プセルについて．と同じ条件の操作を行なつ
たが、ヒトIgGの希釈列で凝集像は認められな
かつた。 工程において、希釈マイクロカプセルにグ
ルタルアルデヒド処理を行なうことなくアフイ
ニテイクロマト精製抗ヒトIgG抗体の100倍希
釈液を用いて37℃で90分インキユベートし吸着
反応させた。次いでPBSで遠心洗浄を３回繰
り返し、３％BSA含有PBSに分散してヒトIgG
検出試薬丙を得た。 接作に従い、マイクロタイター法により抗体
価を求めた。得られた結果を第３表に示す。

【表】 本発明のマイクロカプセルにグルタルアルデヒ
ドなどの架橋剤を用いることなく直接抗体を物理
吸着させても充分高い抗体価が得られた。 実施例 ２ ヘキサメチレンジアミンの代りに塩酸DL−リ
ジン1.2ｇを水25mlに溶解し、苛性ソーダ溶液で
中和して用いる他は実施例１と同じ条件でマイク
ロカプセルを調製した。 本実施例で調製したマイクロカプセル1.5ｇを
分取し、生理食塩水8.5mlに希釈分散した。次に
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩0.2重量％含有生理食塩水
10mlを希釈マイクロカプセルに加え、37℃で45分
反応させた。反応終了後、遠沈洗浄し、10mlの生
理食塩水に再分散した。この２mlに以下．の条
件でアフイニテイクロマト精製抗ヒトIgG抗体を
反応させて得られた感作マイクロカプセルをヒト
IgG検出試薬とした。 操作に従い、マイクロタイター法により抗体
価を求めた。得られた結果を第４表に示す。

【表】 マイクロカプセルの壁形成のコンポーネントと
してリジンを用いた本発明のマイクロカプセルに
抗体を結合した試薬丁は極めて高い抗体価を与え
た。 実施例 ３ 実施例１で作成したマイクロカプセル1.5ｇを
分取し、生理食塩水8.5mlに希釈分散した液に、
ｎ−プロピルアミン１重量％含有生理食塩水10ml
を混合し、37℃で45分インキユベートした。遠沈
洗浄後、生理食塩水10mlに分散し、これに25％グ
ルタルアルデヒド水溶液を生理食塩水で100倍に
希釈した液10mlを加え、37℃45分反応させた。反
応終了後遠沈洗浄し、10mlの生理食塩水に再分散
した。この２mlをとり工程と同様にアフイニテ
イクロマト精製抗ヒトIgG抗体を反応させヒト
IgG検出試薬とした。 操作に従い、マイクロタイター法により抗体
価を求めた。得られた結果を第５表に示す。

【表】 本発明のマイクロカプセルにアミン化合物を吸
着させ、グルタルアルデヒドなどの架橋剤を用い
て抗体を結合した試薬は非特異凝集性がやゝ強く
なるが、極めて高い抗体価を与えた。 さらに直鎖アミン（ｎ−プロピルアミン及びｎ
−ブチルアミン）、ジアミン（ヘキサメチレンジ
アミン及びオクタメチレンジアミン）及び塩基性
アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒドロキシリジ
ン）を用いて同様の実験を行なつた。得られた試
薬はいずれも極めて高い抗体価を与えた。 参考例 レプトスピラ菌オータムナリス秋疫Ａ株をコル
トフ培地（10％正常ウサギ血清を含む）で増殖さ
せ、培養６〜10日目の培養菌液を9000R.P.M.で
５℃で20分遠心分離した。沈渣を生理食塩水で２
回洗浄後、生理食塩水に再分散し、20kHzの音波
破砕器（大岳製作所製）で10分破砕処理を行なつ
た。これを12000R.P.M.で遠心分離し、沈査を生
理食塩水で原料の10倍に希釈し抗原液イとする。
一方上清は50000R.P.M.で１時間さらに遠心分離
を行ない、その上清を分光光度計で280nmの波長
の光学濃度が0.2になるように調整し、抗原液ロ
とする。 実施例１で調製したマイクロカプセル1.5ｇを
分取し、生理食塩水8.5mlに希釈分散した。この
分散液に25％グルタルアルデヒド水溶液を生理食
塩水で100倍に希釈した液10mlを加え、37℃で45
分反応させた。次いで遠沈洗浄し、10mlの生理食
塩水に再分散した。これを２mlづつとり、上記抗
原液イおよびロをそれぞれ２mlづつ加え、37℃で
120分インキユベートした。次に0.2％グリシン含
有PBSで３回遠沈洗浄を行なつて後、３％BSA
含有PBSに分散して、レプトスビラ秋疫Ａ症検
出試薬イおよびロを得た。 レプトスピラ菌オータムナリス秋疫Ａ株でウサ
ギを高度免疫して抗血清を作成した。秋疫Ａ株の
コルトフ培地培養菌液を遠心分離し、沈殿した菌
体を生理舎塩水に浮遊させた。この浮遊液を４〜
５日間隔で２回ウサギに皮下注射し、更に４〜５
日間隔で９回静脈注射を行なう。最初の皮下注射
から７〜８週経過し、所定の抗体価をもつたこと
を確認した後、全採血を行ない、抗血清を作成し
た。 操作に従い、マイクロタイター法によりレプ
トスピラ秋疫Ａ症検出試薬(イ)および(ロ)を用い上記
抗血清の100倍希釈液で抗体価を求めた。得られ
た結果を第６表に示す。

【表】 水不溶性の抗原と水可溶性の抗原とを分別し、
それぞれ別々に本発明のマイクロカプセルに感作
したところそれぞれの抗体を検出し得る試薬を作
製することができた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ポリビニルアルコールとポリスチレンスルホ
   ン酸とを含む水溶液に多価イソシアネートと油性
   物質からなる油性物質液を添加しポリビニルアル
   コールとポリスチレンスルホン酸との共存下に乳
   化分散し、ついで水溶性多価アミノ化合物を前記
   乳化分散液に加えて前記多価イソシアネートと重
   合させることを特徴とする免疫分析用マイクロカ
   プセルの製造法。