JPS6035268A - 免疫反応用マイクロカプセル試薬及びこれを用いる検査法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は高い比重を示す感作マイクロカフ０セルと低い
比重を示す感作マイクロカプセルとを混合して使用する
マイクロカプセル試薬群及びこの試薬を用いて抗原又は
抗体を検出する検査法に関する。

抗原抗体反応を簡便に行なう方法として、抗原もしくは
抗体を、水不溶性の担体に担持させ、抗原抗体反応にも
とづく凝集状態を肉眼で観察する免疫学的凝集方法が広
く用いられている。しかしながら従来法においては動物
由来の担体が使用されるので非特異的凝集が起ったシあ
るいは動物の個体差にもとづいて性能がばらつく、経時
変質を起し易い、コスト高である等の不都合があった。

−力、ポリスチレンラテックスを担体とする（ラテック
ス凝集反応）方法では動物に由来する１ＮｉＪ述の欠点
は除かれているものの、赤血球凝集反応に比べて感度が
低いばかりでなく、長期保存性が悪かったり、′−１だ
、抗原抗体反応によらない自然凝集反応を起し易いなど
の欠点がある。

このような赤血球やラテックスなどの代シに。

マイクロカプセルを担体として使用する方法が提案さ扛
た。（特開昭５５−９４６３６　、同５７−１９６（ｉ
ｌ、同５７−１９６６２等）。

この方法においては、動物由来の担体に固廂の前記欠点
やラテックス等の合成担体が有する不都合は解消されて
おり、このマイクロカプセル担体法全適用すれば、感度
上昇、簡便な操作、オン・オフの確実な判別など、従来
法に比べてより改善不可能であった新しい検査も開拓さ
れつつある。

特開昭５６−７２３４６には比重１０７から１．１６の
範囲内のマイクロカプセル試薬が記載されている。

今、この範囲をはずれるような比較的高い比重をもつマ
イクロカプセル試薬と比較的低い比重をもつマイクロ試
薬を混合して抗原抗体反応に使用すると得られた凝集像
が改善され凝集移行像が明瞭に観察できるようになるこ
とがわかった。

本発明は、汎原又は抗体全感作した。高い比重ｔ３ｚｋ
示すマイクロカプセルと低い比重ｄ！を示すマイクロカ
プセルとからなるマイクロカシセル試薬であって、比重
ｄ１及び比重ｄ２が下記式を満足することを特徴とする
高低比重マイクロカプセル試薬に関する。

ｄ１≧１０３　・（１） ｄｌ＜１．３　・・（２） ０．０８≦ｄ２−ｄｉ（０，：３　・（３）ｄｌ　→−
ｄ２ １０８≦□≦］、、１８　・・（４） 本発明は又そのようなマイクロカプセル試薬を抗原抗体
反応に使用することを特徴とする抗体又は抗原の検査法
に関する。

本発明において高い比重ｄｚ’ｔもつマイクロカプセル
は上限で１３より小さいものであればよく。

壕だ低い比＆ｄ＋にもつマイクロカプセルは１０３以上
のものであればよい。ただし式（３）に示すように、ｄ
ｌ−ｄ、を０．０８以上０３より小さい範囲にする必要
があり、さらには混合したマイクロカッセル全体として
のみかけの比重が式（４）に示すように１．０８以上１
１８以下で攻ければｋらない。

高い比重ｄｚ’ｔもつマイクロカプセルは反応速度が早
く従って反応容器の底部へより早く到達し易く、抗原抗
体反応を充分起こさない傾向が大である。１だ凝集反応
容器はその底部が中心部へ集束する形で傾斜しているの
が普通であるが、高い比重ｄ　２のマイクロカプセル試
薬による凝集物はその傾斜面を集束する中心部へ向かっ
てころげ落ちることがあり、凝集像に乱れが生じがちで
ある。

しかしながら、これに低い比重ｄ、の一マイクロカプセ
ルを混合してやると、主として高い比重ｄ２のマイクロ
カシセル試薬で形成さ゛れた粗い凝集像の空隙を埋める
ように比重ｄｌのマイクロカプセル試薬による凝集像が
形成づれる。従って中間程度の比重をもつ一種類のマイ
クロカシセル試薬のみで形成された凝集像にくらべると
１周縁部にきざぎざのない明瞭でシャープな凝集像が得
られる。

本発明の混合系マイクロカプセル試薬を使用する場合は
このようにきれいな凝集像が鮮明に得られるので、凝集
像と沈降との判別が何ら熟練を要することなく簡単に識
別判定できる。

本発明の好ましい二煎様を具体的に説明すると。

高比重のマイクロカプセルとして比重１２のもの全用意
する。壁厚は粒子径の高々２％であるので比重は芯を形
成する油性物質の比重でほぼ決するから、比重１２を与
える油性物質を適宜選択する。

同様にして比重１，０４のマイクロカッ０セルを作成し
、高比重マイクロカプセルと混合する。高低比重マイク
ロカプセルを混合した状態で、千畑一部著「固定化酵素
」講談社（昭和５０年）、特開昭５７−１９６６１等に
記載の方法に従い抗原又は抗体を感作する。なお高比重
、低比重のマイクロカプセルそれぞれを感作した後混合
してもよい。

本発明において担体として使用するマイクロカプセルは
油性物質の芯（芯物質）とこれを包囲する壁材（水およ
び芯物質に不溶）とからなり、一般に次の操作により調
製する。芯を形成する油性物質をこれと混合しない液中
に機械的に乳化分散し、水中油滴型エマルジョンを形成
する。油性物質と混合しない液は乳化を助け、油滴の分
散をよくする作用全もち、一般には高分子水溶液が用い
られる。

こうして得られた油滴表面に水および油性物質液に不溶
の高分子皮膜壁を形成してマイクロカプセル化を達成す
る。

油性物質を乳化分散する方法としては各種の乳化機や分
散機を用いることができる。

高分子皮膜形成の典型的な方法には、■化学的方法、■
物理化学的方法、■物理的方法がある。

マイクロカプセルの壁材としては、抗原又は抗体を失活
させることなく化学的に結合しつるもので、マイクロカ
プセル化が可能なものであればとくに限定はない。例え
ば、アミノ基又はイミノ基を有する壁材として、蛋白質
（例えばコラーゲン。

ゼラチン、カゼインなど）やポリアミノ酸、ポリアクリ
ルアミド、ポリアミド、ポリウレタン。

ポリウレア等の樹脂：水酸基を有する壁材として。

セルロース及びその銹導体（例えば、メチルセルロース
、エチルセルロー人、カル？キシメチルセルロースなト
）、アラビアコゞム、デンゾン等が挙げられる。

マイクロカプセルの芯物質となる油性物質としては、天
然の鉱物油、動物油、植物油及び合成油が挙げられる。

これら芯物質は、その表面が壁材で完全におおわれるた
め、抗原や抗体への直接の影響はないが、生化学的に活
性なものは避けた方が好ましい。芯物質の具体例は特開
昭５６−７２３４７　。

同５７−１９６６２等に記載されている。またマイクロ
カプセルの製造その他詳細については１例えば近藤朝士
著「マイクロカプセル」日刊工業新聞社（昭和４５年）
に記載されている。

又、マイクロカプセルの平均サイズ（直径）は０．５μ
ｍ〜２０μｍ、好ましくは、１μｍ〜１０μｍの範囲か
ら選択するのが望ましい。

マイクロカプセル担体は固型分として通常１〜３重量係
程度の範囲内で使用するのが望ましい。

以下実施例によシ本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ ノイソゾロビルナフタレン４．５ｇと塩素化／′ｔ′ラ
フイン（塩Ｉ化度５０％、トヨパラノクス１５０　）２
０５ｇとの混合油（比重約１２０）に油溶性赤色染料オ
レオノール・レッドＢＢ（住友化学製）０、２５　、！
７　ｋ溶解した。得られた油性物質液を、無水マレイン
酸−メチルビニルエーテル共重合体（ＧＡＮＴＲＥＺ　
ＡＮ　−１’４．９　、ゼネラルアニリンアンドフィル
ム社製）２．５．９’！ｉ＝水７５ｍ１に溶解した溶液
に加えた。攪拌、乳化し、コールタ−カウンターＴＡ−
Ｉｔ型で油滴のサイズを測定し平均サイズが約５μｍと
なるように調製した。これに尿素、２５ｇとレゾルシン
０．２５　ｇ　、！：塩化アンモニウム０．３　ｇとを
水２５ｍ１に溶解した溶液を加えた。さらに水５ｏｍｌ
＋加えて希釈し、３７％ホルムアルデヒド水溶液７　ｍ
ｌ　ｆ加えた後、６０℃で２時間反応させてマイクロカ
プセル化を行なった。その後ＩＮ水酸化ナトリウム水溶
液を加えｐＨｉ　９．０に調整してマイクロカプセル全
作成した。

このようにして作成したマイクロカプセルを生理食塩水
で遠沈洗浄することにより、未反応残存物を除去した。

マイクロカプセル粒子濃度が１０チになるように生理食
塩水に分散し、これをマイクロカプセルＡとした。

ノイソゾロビルナフタレン］、　４．７９と塩素化・ぐ
ラフイン（塩素化度４．０％、トヨノＺラックスＡ−４
０）１０３ｇとの混合油（比重１０４）を用いる他はマ
イクロカプセルＡｆ作成する場合と同じ条件でマイクロ
カプセルＢ’（ｚ作成した。

比較用マイクロカプセルＣの作成− ジイソゾロビルナフタレン１０．１ｇと塩Ｘ化パラフィ
ン（塩素化度５０％、）ヨパラックス１５０）１４９ｇ
との混合油（比重約１．、１２　）’を用いる他はマイ
クロカプセルＡを作成する場合と同じ条件でマイクロカ
プセルｃ１作成した。

カラムに比重液を多段に積層した重層法でマイクロカプ
セルの比重を測定したところ、マイクロカプセルＡ、Ｂ
、Ｃの比重はそれぞれ１．２１゜１．０６，１．１３で
あった。

感作マイクロカシセル試薬甲の作成： レゾトスビラ菌オータムナリス欲皮Ａ株をコルトフ培地
（１０％正常ワサギ血清を含む）で増殖させ、培養６〜
１０日目の培養菌液を９．００Ｏｒｐｍで２０分（５℃
）遠心分離し、沈渣を生理食塩水で２回洗浄後、生理食
塩水に再分散し、２０ｋＨｚの音波破砕器（犬岳製作所
製）で１０分破砕処理全行ない１分光光度計で２８０ｎ
ｍの波長の光学濃度が０．２になるように調製し抗原液
とした。

実施例１で作成したマイクロカプセルＡ、Ｂｉそれぞれ
１．５ｇとυ、混合して生理食塩水２０ｍ１に分散した
。次に２５％グルタルアルデヒド水溶液を生理食塩水で
１００倍に希釈した液２０ｍＮｒ：加え、３７℃４５分
反応後、遠沈洗浄し２（３ｍｌの生理食塩水に再分散し
た。アルデヒド処理したマイクロカプセル２　ｍｌに抗
原液２ｍｌを加えて３７℃で９０分インキュベートした
後、４℃の冷蔵庫に１８時間静置した。次に０．２％グ
リシン含有生理食塩水で３回洗浄後、２ｍｌの３％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）およびチッ化ナトリウム００
１％含有０１５Ｍリン酸緩衝生理水（ＰＢＳ　、　ｐｉ
−（＝＝　７．２　）に再分散し、感作マイクロカプセ
ル試薬甲を得た。

比較用感作マイクロカプセル試薬色： 比較用マイクロカプセルＣ＝ｉ　１．５　ｇとり、生理
食塩水１０ｍ１に分散した。この分散液に２５％グルタ
ルアルデヒド水溶液を生理食塩水で１００倍に希釈した
液１０ｍ１２加え、３７℃で４５分間反応させた。反応
終了後遠沈洗浄し、１０ｍ／！の生理食塩水に再分散し
た。その後の操作は実施例１の条件に従って行ない、感
作マイクロカシセル試薬色を得た。

実施例２ 実施例１で調製したマイクロカプセル試薬の性能につい
ては以下に述べる抗血清を用いマイクロタイター法によ
り得られた抗体価で評価した。

（抗血清の調製） レゾトスピン菌オータムナリス欲皮Ａ株でウサギ’（ｆ
’ｉ％度免疫して抗血清を作成した。欲皮Ａ株のコルト
フ培地培養菌液を遠心分離し、沈殿した菌体を生理食塩
水に浮遊した。これを４〜５日間隔酔 で２回ウサギに皮下注射し、更に４〜５日間で９回静脈
注射を行なった。最初の皮下注射から７〜８週経過し、
所定の抗体価をもったことを確認した後、全採血を行な
い、抗血清を作成した。

（マイクロタイター法によるテスト） 実施例１で作成した試薬についてマイクロタイター法に
よシ抗体価をめた。すなわち、明らかな凝集を認めた管
を陽性とし、陽性を示す血清の最高希釈倍数をめてそれ
全抗体価とした。

マイクロプレートの各管孔に、２５μｔの抗血清の１０
０倍希釈液を１％牛血清アルブミン含有０、１５　Ｍ　
リン酸緩衝生理食塩水で更に２倍間隔に希釈した倍数希
釈列を作成した。

次に実施例１で作成したマイクロカプセル試薬甲の２５
μ７ｔドロノ・ぐ−で採取し、マイクログレートの抗血
清希釈列の管孔に順次滴下した。マイクロプレート全５
分間振動して抗原抗体反応を進めて後、４℃の冷蔵庫に
１８時間静置した。その後とり出し、ライトテーブル上
にマイクログレート’６置いて管底の凝集像を観察した
。

比較マイクロカプセル試薬色についても同様方操作を行
ない本発明のマイクロカプセル試薬と比較した。

凝集を示した血清の最高希釈倍数で得た抗体価の値を第
１表に示す。

Ｍ１表 高低比重のマイクロカプセルを混合波感作し／こ本発明
のマイクロカプセル試薬甲により生成する凝集像は比較
用のマイクロカプセル試薬乙に比へざらつきの少ない、
きれいなパターンを示すの１見易く判定を誤ることがな
い。又本発明による１イクロカプセル試薬甲は検出感度
も高かった。

以上 特許出願人：富士写真フィルム株式会社代理人：弁理士
　砂　川　五　部　（他１名）手続袖正古（自発） 昭和　５８年８月５日出願の特許願（３）事件との関係
：特許出願人 ｆＪＥ　ｒ’ｌ！　神奈川県南足柄市中沼２１０番地ッ
、ヵ＋　（５２０）富士写真フィルム株式会社氏　名（
名称） 代表者　大　西　實 ４、代理人 ５　補正命令の日付　自　発 ６−→肘しｍ軸−一一糾に１知 ７、補正の対象 ５頁１２行目に続けて行を改めて欠配章句を挿入する。

［本発明において高い比重ｄｚｉ持つマイクロカプセル
と低い比重ｄ＋に持つマイクロカプセルとの混合比率は
混合後の比重が式（４）全満足する範囲内で、１ 可能であり一般に１＝３乃至１．了、好ましくは１：２
乃至ｌ：↓の範囲である。」 以と

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原または抗体を感作した。高い比重ｄ２を示すマ
   イクロカプセルと低い比重ｄｌを示すマイクロカプセル
   とからなるマイクロカプセル試薬であって、比重ｄ、及
   び比重ｄ２が下記式を満足することを特徴とする免疫反
   応用マイクロカプセル試薬。 ｄ１≧１．０３ ａ２（ｉ３ ０．０８≦ｄ　２　ｄ　１＜　０．３ ２　抗原または抗体を感作した。高い比重ｄ２を示すマ
   イクロカプセルと低い比重ｄ１を示すマイクロカプセル
   とからなるマイクロカプセル試薬であって、比重ｄ１及
   び比重ｄ２が下記式を満足するマイクロカプセルを抗原
   抗体反応に使用することを特徴とする抗体または抗原の
   検査法。 ｄ１≧１０３ ｄｚ＜１．３ ０．０８≦ｄ２ｄｔ＜０．３