JPH05113442A

JPH05113442A - 免疫比濁測定方法

Info

Publication number: JPH05113442A
Application number: JP33640591A
Authority: JP
Inventors: Hideo Motonaga; 秀夫本永
Original assignee: SHINOTESUTO KK; Shino Test Corp
Current assignee: SHINOTESUTO KK; Shino Test Corp
Priority date: 1991-10-22
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 1993-05-07

Abstract

(57)【要約】【目的】免疫比濁測定方法において、測定感度を高め
る。【構成】免疫比濁測定方法により試料中の抗原濃度を
測定するのに、試料中の抗原性物質を認識する抗体のＦ
ｃ部分と特異的に結合する抗体を試薬中に至適濃度で含
有させることを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床診断の一助とするた
めに、生体の抗原性物質を免疫学的測定方法によって測
定することに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の中で生体中の抗原性物質を測
定することは日常的に行われている。この検査法は免疫
学的な方法が主流である。免疫学的な測定方法としては
ＳＲＩＤ法、凝集反応法、免疫比濁法、免疫比ろう法、
酵素免疫測定法、およびＲＩＡなどである。（以下、免
疫比濁法および免疫比ろう法を併せて免疫比濁測定方法
と記す。）これらの中で検出系に比色計を搭載した汎用
の自動分析機で容易に利用できる方法はラテックス凝集
反応法と免疫比濁測定方法である。ラテックス凝集反応
法は免疫比濁測定方法よりも測定感度が高いことから近
年好んで利用されるようになった。しかし、ラテックス
凝集反応法は高度に精製した抗体を必要とすることや、
自然凝集の少ない均一な粒径のラテックスが必要なこと
から、試薬コストが高くなることが問題である。この
点、免疫比濁測定方法は精製度の低い抗体を利用できる
し、ほかに高価な材料を必要としないことから前者より
も試薬のコストを下げることが容易である。このよう
に、試薬の製造の煩雑さやコストの面ではラテックス凝
集反応法よりも免疫比濁測定方法の方が有利ではある
が、測定感度は免疫比濁測定方法は必ずしも十分とは言
えないことがある。

【０００３】ラテックス凝集反応法を汎用の自動分析機
に適用すると生体試料中の抗原濃度が数百μｇ／ｄｌ存
在すれば測定できるのに対し、免疫比濁測定方法では数
ｍｇ／ｄｌなければ精密な測定は望めない。従って、免
疫比濁測定方法では生体試料中に割合多く含まれている
物質、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミン、ト
ランスフェリン、βリポプロテイン、αリポプロテイ
ン、補体Ｃ４、補体Ｃ３、Ｃレアクテブプロテイン（Ｃ
ＲＰ）、α１アシドグリコプロテイン、セルロプラスミ
ン、血清アミロイドＰプロテイン（ＳＡＰ）、およびハ
プトグロビンの測定に適している。しかし、この中でも
補体Ｃ４、ＣＲＰ、セルロプラスミン、およびＳＡＰな
どは濃度が低いために免疫比濁測定方法では精密に測定
できない試料が存在する。

【０００４】免疫比濁測定方法試薬の一般的な組成は、
例えば、特開昭５９−４３３６２号公報では生理的濃度
の食塩水、＃６，０００のポリエチレングリコールを４
％から８％、および非特異的な混濁を防止する目的で非
イオン性界面活性剤を至適濃度含む溶液に抗体を溶解し
たものを提示している。また、特開昭６４−１５６５６
号公報では、前記の処方に適量の緩衝剤と防腐剤を添加
したものを提案している。食塩（塩化ナトリウム）の濃
度は抗体の安定性と抗原抗体反応の特異性に、緩衝液は
抗体の安定性と反応の至適に、ポリエチレングリコール
は反応の速度と感度に、界面活性剤は高脂血清を試料と
したときの濁りの防止や反応の感度や速度に影響を与え
ている。抗体の濃度は測定の感度と測定の上限に影響す
るので適量を実験によって求めている

【０００５】免疫比濁測定方法の感度を向上させる方法
として、特開平３−１８７５８号公報は抗体を化学的架
橋剤で重合させて大きくする方法を提案している。この
方法によって抗体の分子サイズを数倍に増大させて感度
の上昇を確認した。しかし、この化学的架橋法による重
合は抗体の活性部分を障害することが起こる。このため
に抗体の調製収率が低下する。また、架橋の工程や余剰
の架橋剤の除去工程等が追加されることによっても製造
コストが上昇する。このことは免疫比濁測定方法の重要
な特徴である経済性に重大な問題を引き起こすことにな
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】以上の通り免疫比濁測
定方法は安価ではあるが測定感度が低いために測定でき
ない物質が数多く存在する。本発明が解決しようとする
課題は、試料中の抗原性物質を認識する抗体を溶解した
試薬に抗原を含む試料を添加し、生じた免疫複合体によ
る混濁を光学的に測定する免疫比濁測定方法において、
免疫比濁測定方法の測定感度、即ち、試料中の抗原の濃
度に対して生成する混濁の吸光度または散乱光強度の割
合を、高めることである。この結果、試薬コストの安価
な免疫比濁測定方法においても、精度良く測定が行える
ようになり、また、低濃度の物質をも測定することが出
来るようになる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】免疫比濁測定方法は抗原
に対して十分量の抗体を反応させたときに生成する沈降
物の量が抗原の濃度に対応して変化することを利用して
抗原の測定を行っている。この沈降物の濃度を比濁測定
方法によって測定する。

【０００８】比濁測定方法は沈降物を含有する懸濁溶液
に光を照射し、散乱または通過する光を光電子増倍管等
で電気信号に変換して測定する。例えば透過光（Ｔ）を
吸光度（−ｌｏｇＴ）として測定する場合は次の理論式
に従うことが知られている。Ａ＝Ｈ×Ｍ×Ｍ×Ｃただし、Ａは吸光度、Ｍは粒子サイズ、Ｃは粒子の濃
度、Ｈは比例定数である。

【０００９】免疫複合体による沈降物を粒子と考えれ
ば、上記の式から、粒子の濃度が一定ならば吸光度は粒
子のサイズが大きいほど（粒子サイズの２乗に比例し
て）吸光度が高くなることが分かる。一方、比濁測定方
法における吸光度は粒子によって入射光が散乱されるた
めに起こる現象であって、吸光度は散乱強度に比例する
ので、吸光度の代わりに散乱光を測定することも可能で
ある。

【００１０】粒子のサイズは免疫複合体、即ち、抗原あ
るいは抗体の分子量、試薬に含まれる分散剤の種類や濃
度に依存している。分散剤としてはポリエチレングリコ
ールや非イオン性界面活性剤が利用されている。一般に
はポリエチレングリコールの＃６，０００を２％から６
％の範囲内で使用しているが、この濃度や種類を変更し
ても測定感度に関して明瞭な効果は期待できない。

【００１１】抗体のＦｃ部分は抗体活性に影響を及ぼさ
ない領域である。本発明者は鋭意検討の結果、Ｆｃ部分
と特異的に結合する抗体を少量混合して試薬とする方法
を見出した。

【００１２】抗体分子はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉｇ
ＥおよびＩｇＤの５種類に分類されるが、免疫比濁測定
方法の抗体として利用できるのはＩｇＧ、ＩｇＭおよび
ＩｇＡである。中でもＩｇＧは最も安定しているので大
部分の試薬キットに利用されている。

【００１３】ＩｇＧの分子量は動物種やクローンによっ
て若干の差はあるものの、おおよそ１６万である。Ｉｇ
Ｇは短いペプタイドのＬ鎖と長いペプタイドのＨ鎖が１
組（Ｈ−Ｌ鎖）となり、さらにこのＨ−Ｌ鎖のＨ鎖側が
２組結合した構造をとっている。Ｌ鎖とＨ鎖のＮ末端側
の高次構造が抗原分子を認識する活性部位でこの反対側
の２本のＨ鎖の一部のみで構成される部分をＦｃ部分と
呼んでいる。

【００１４】このＦｃ部分と特異的に結合する抗体は既
知の方法（山村雄一監修、医化学実験講座第４巻免疫
化学、１９７２年、中山書店発行、または、蛋白質核酸
酵素編集部編、免疫の化学、１９６７年、共立出版発
行）により容易に調製することができる。例えば試料中
の抗原性物質を認識する抗体がＩｇＧであれば、このＩ
ｇＧを硫酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリウム等で塩
析するか、またはイオン交換クロマトグラフイー等で精
製するか、あるいはこれらを組み合わせて精製するなど
最適な方法で純化する。純化されたＩｇＧを適当な緩衝
液の中でペプシンあるいはパパイン等の酵素で処理して
Ｆｃ部分（ペプタイド）とＦ（ａｂ）’２部分を分離す
る。Ｆｃ部分はイオン交換クロマトグラフイーやゲルク
ロマトグラフイー等最適な方法で純化する。

【００１５】このＦｃ部分で動物を免疫してＦｃ部分に
対する抗血清を作製する。免疫動物は、ヤギ、ウシ、ウ
マ、ブタ、ネズミ、モルモット、ウサギ等、抗原性物質
を認識する抗体の由来の動物と異なる動物であれば特に
限定される必要はないが、効率的には大動物の方が好ま
しい。Ｆｃ部分に対する抗血清はこのまま原料として使
用してもよいが、硫酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリ
ウムなどで塩析または他の最適な方法で部分精製して使
用する方が好ましい。

【００１６】また、Ｆｃ部分と特異的に結合する抗体は
モノクローナル抗体として作製してもよい。モノクロー
ナル抗体の作製は既知の方法（岩崎辰夫ほか著、単クロ
ーン抗体ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、１９８３年、
講談社サイエンティフィク発行）を利用することが可能
である。Ｆｃ部分に対する抗血清は市販されているもの
もあるので、これらを利用することも可能である。この
ようにして調製されたＦｃ部分と特異的に結合する抗体
を試料中の抗原を認識する抗体を含む試薬に最適量含有
させるのみで測定試薬が調製できる。またＦｃ部分と特
異的に結合する抗体を２−メルカプトエタノール等の還
元剤で処理して１価抗体（Ｈ−Ｌ鎖）として使用するこ
とも可能である。Ｆｃ部分と特異的に結合する抗体がモ
ノクローナル抗体であったり、また還元処理した１価の
抗体である場合には濃度を増加させても試薬盲検値が極
端に上昇することはないので好都合ではある。

【００１７】Ｆｃ部分と特異的に結合する抗体の試薬中
での濃度は特に限定されないが試薬盲検値が極端に上昇
しない濃度を選ぶ方が好ましい。理論的には試料中の抗
原を認識する抗体と、その抗体のＦｃ部分と特異的に結
合する抗体が等モルで抗体分子サイズは２倍になる。経
験的にはベッカー単位でほぼ等濃度となるように含有さ
せるのが望ましいが、実際には、測定すべき抗原の種
類、抗原性物質を認識する抗体の種類、および、この抗
体のＦｃ部分と特異的に結合する抗体の種類によって至
適な濃度は変わるので、その時の測定条件に応じて至適
濃度は決定されるものである。

【００１８】また、本発明法は市販の測定キット製品の
抗体の動物種が明かであれば、その抗体のＦｃ部分と特
異的に結合する抗体を用意して単に適量を含有させるの
みで調製することが可能である。

【００１９】また、本発明において、試料としては、ヒ
トあるいは動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、
汗、腹水、羊水、ヒトあるいは動物の細胞あるいは臓器
の抽出液等が対象となる。

【００２０】抗原としては、免疫比濁測定方法により測
定可能なものであればいかなるものも対象となるが、例
としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミン、トラ
ンスフェリン、βリポプロテイン、αリポプロテイン、
補体Ｃ４、補体Ｃ３、Ｃレアクテブプロテイン（ＣＲ
Ｐ）、α１アシドグリコプロテイン、セルロプラスミ
ン、血清アミロイドＰプロテイン（ＳＡＰ）、およびハ
プトグロビンなどが挙げられる。

【００２１】試料中の抗原性物質を認識する抗体として
は、抗原性物質を特異的に認識する抗体であれば良い。

【００２２】本発明の免疫比濁測定方法の試薬中には、
緩衝剤、防腐剤、免疫反応促進剤、安定化剤、内因性物
質干渉抑制剤、非特異的反応抑制剤等を含有していても
構わないものである。

【００２３】

【実施例】以下、実施例に従って本発明を説明するが、
本発明はこの実施例によって何等限定されるものではな
い。

【００２４】実施例１以下の組成から成るヒトＣＲＰの免疫比濁測定試薬を調
製した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃６，０００３．５％トリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム０．９％抗ヒトＣＲＰヤギ抗体（ベッカー単位）０．０８ｍｇ／ｍＬ

【００２５】この試薬を対照試薬として、更にこの試薬
に抗ヤギＦｃウサギ抗体をベッカー単位で０．０８ｍｇ
／ｍＬとなるように含有させたものを本発明試薬とし
た。対照試薬および本発明試薬を７５０μＬずつ採取
し、０から１９０ｍｇ／Ｌまでの７濃度のＣＲＰ標準液
をそれぞれ２８μＬずつ添加し、３７℃で１５分後に波
長３４０ｎｍで吸光度を測定した。各測定値から試薬盲
検値（０ｍｇ／ＬのＣＲＰの値）を差し引いて真の測定
値とした。この検量線を図１に示した。ＣＲＰの濃度に
よっても異なるが、対照に対して感度（吸光度）を２０
％から２００％程度上昇させることができた。

【００２６】実施例２以下の組成から成るヒトＣＲＰの免疫比濁測定試薬を調
製した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃６，０００３．５％トリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム０．９％抗ヒトＣＲＰウサギ抗体（ベッカー単位）０．１０ｍｇ／ｍＬ

【００２７】この試薬を対照試薬として、更にこの試薬
に抗ウサギＦｃヤギ抗体をベッカー単位で０．０９ｍｇ
／ｍＬとなるように含有させたものを本発明試薬とし
た。対照試薬および本発明試薬を７５０μＬずつ採取
し、０から１９０ｍｇ／Ｌまでの７濃度のＣＲＰ標準液
をそれぞれ２８μＬずつ添加し、３７℃で１５分後に波
長３４０ｎｍで吸光度を測定した。各測定値から試薬盲
検値（０ｍｇ／ＬのＣＲＰの値）を差し引いて真の測定
値とした。この検量線を図２に示した。ＣＲＰの濃度に
よっても異なるが、対照に対して感度（吸光度）を２４
％から２００％程度上昇させることができた。

【００２８】実施例３以下の組成から成るヒト補体Ｃ４の免疫比濁測定試薬を
調製した。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃６，０００３．５％トリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム０．９％抗ヒトＣ４ヤギ抗体（ベッカー単位）０．１ｍｇ／ｍＬ

【００２９】この試薬を対照試薬として、更にこの試薬
に抗ヤギＦｃウサギ抗体をベッカー単位で０．０９ｍｇ
／ｍＬとなるように含有させたものを本発明試薬とし
た。対照試薬および本発明試薬を８００μＬずつ採取
し、０から４２２ｍｇ／Ｌまでの７濃度のＣ４標準液を
それぞれ５μＬずつ添加し、３７℃で１５分後に波長３
４０ｎｍで吸光度を測定した。各測定値から試薬盲検値
（０ｍｇ／ＬのＣ４の値）を差し引いて真の測定値とし
た。この検量線を図３に示した。Ｃ４の濃度によっても
異なるが、対照に対して感度（吸光度）を２５％から２
００％程度上昇させることができた。

【００３０】

【発明の効果】試料中の抗原性物質を認識する抗体を溶
解した試薬に抗原を含む試料を添加し、生じた免疫複合
体による混濁を光学的に測定する免疫比濁測定方法にお
いて、試薬中に試料中の抗原性物質を認識する抗体のＦ
ｃ部分と特異的に結合する抗体を至適濃度で含有させる
ことによって測定の感度を実用的に充分な程度まで高め
得た。これにより、試薬コストの安価な免疫比濁測定方
法においても、精度良く測定が行えるようになり、ま
た、低濃度の物質をも測定することが出来るようになっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法によりＣＲＰを測定した時の検量線
を示した図である。

【図２】本発明方法によりＣＲＰを測定した時の検量線
を示した図である。

【図３】本発明方法により補体Ｃ４を測定した時の検量
線を示した図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の抗原性物質を認識する抗体を溶
解した試薬に抗原を含む試料を添加し、生じた免疫複合
体による混濁を光学的に測定する免疫比濁測定方法にお
いて、試料中の抗原性物質を認識する抗体のＦｃ部分と
特異的に結合する抗体を試薬中に至適濃度で含有させる
ことを特徴とする免疫比濁測定方法。