JPH05115294A - ピチア・パストリスにおけるヒト血清アルブミンの発現 - Google Patents
ピチア・パストリスにおけるヒト血清アルブミンの発現Info
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- JPH05115294A JPH05115294A JP4055518A JP5551892A JPH05115294A JP H05115294 A JPH05115294 A JP H05115294A JP 4055518 A JP4055518 A JP 4055518A JP 5551892 A JP5551892 A JP 5551892A JP H05115294 A JPH05115294 A JP H05115294A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 組換え発現系においてヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）の収率を高める方法を提供する。 【構成】 ＨＳＡを発現しうるピチア・パストリス細胞
を、ＨＳＡの発現と同時期にｐＨを約５．７−約６．４
に維持して培養することにより、ピチア・パストリス細
胞においてＨＳＡを産生させる方法。
（ＨＳＡ）の収率を高める方法を提供する。 【構成】 ＨＳＡを発現しうるピチア・パストリス細胞
を、ＨＳＡの発現と同時期にｐＨを約５．７−約６．４
に維持して培養することにより、ピチア・パストリス細
胞においてＨＳＡを産生させる方法。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は組換えＤＮＡバイオテクノロジーの分野に関す
るものである。１観点においては本発明はピチア・パス
トリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における分
泌ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）発現の改良法に関する
ものである。
るものである。１観点においては本発明はピチア・パス
トリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における分
泌ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）発現の改良法に関する
ものである。
【０００２】背景 ヒト血清アルブミンは成人の最も豊富な血漿蛋白質であ
る。アルブミンの濃度は４０ｍｇ／ｍｌ、すなわち７０
Ｋｇの成人男子につき人体を循環するアルブミンは１６
０ｇである。この蛋白質は浸透圧を維持し、銅、ニッケ
ル、カルシウム（弱く、結合部位２−３個）、ビリルビ
ンおよびプロトポルフィリン、長鎖脂肪酸、プロスタグ
ランジン、ステロイドホルモン（これらのホルモンと弱
く結合して、膜を通るそれらの伝達を促進する）、チロ
キシン、トリヨードチロニン、クリスチンおよびグルタ
チオンの結合および輸送において機能する。ピーターお
よびリード（Ｐｅｔｅｒ，Ｔ．，Ｒｅｅｄ，Ｒ．
Ｇ．），Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，（ピ
ーターおよびショルム（Ｐｅｔｅｒ，Ｔ．，Ｓｊｏｈｏ
ｌｍ，Ｊ．）編）１９７７，ｐ．１１−２０によれば、
米国内だけで年間１０，０００ｋｇ以上の精製アルブミ
ンが循環不全またはアルブミン欠乏を伴う患者に投与さ
れている。
る。アルブミンの濃度は４０ｍｇ／ｍｌ、すなわち７０
Ｋｇの成人男子につき人体を循環するアルブミンは１６
０ｇである。この蛋白質は浸透圧を維持し、銅、ニッケ
ル、カルシウム（弱く、結合部位２−３個）、ビリルビ
ンおよびプロトポルフィリン、長鎖脂肪酸、プロスタグ
ランジン、ステロイドホルモン（これらのホルモンと弱
く結合して、膜を通るそれらの伝達を促進する）、チロ
キシン、トリヨードチロニン、クリスチンおよびグルタ
チオンの結合および輸送において機能する。ピーターお
よびリード（Ｐｅｔｅｒ，Ｔ．，Ｒｅｅｄ，Ｒ．
Ｇ．），Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，（ピ
ーターおよびショルム（Ｐｅｔｅｒ，Ｔ．，Ｓｊｏｈｏ
ｌｍ，Ｊ．）編）１９７７，ｐ．１１−２０によれば、
米国内だけで年間１０，０００ｋｇ以上の精製アルブミ
ンが循環不全またはアルブミン欠乏を伴う患者に投与さ
れている。
【０００３】現在唯一の商業的ＨＳＡ源は分画血液から
のものである。血液由来の汚染物質および病原体の危険
性がありうることを考慮すると、ＨＳＡ調製のための別
法を開発することは商業的ＨＳＡ製造に著しく寄与する
と思われる。組換えＤＮＡ法の出現により現在ではＨＳ
Ａを別法により製造することができる。
のものである。血液由来の汚染物質および病原体の危険
性がありうることを考慮すると、ＨＳＡ調製のための別
法を開発することは商業的ＨＳＡ製造に著しく寄与する
と思われる。組換えＤＮＡ法の出現により現在ではＨＳ
Ａを別法により製造することができる。
【０００４】ＨＳＡはエッチェベリー（Ｅｔｃｈｅｖｅ
ｒｒｙ）ら，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８６
年８月，ｐ．７２６およびアージャム・シン（Ａｒｊｕ
ｍＳｉｎｇｈ）の欧州特許出願公開第１２３，５４４号
明細書に示されるように、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においても発
現される。エッチェベリーは濃度約６ｍｇ／ｌの細胞内
ＨＳＡ発現、および細胞会合状態にあるＨＳＡの分泌に
つき示している。アージャム・シンもビール酵母菌にお
いてα−因子およびシグナル配列と合わせたＨＳＡ発現
につき示している。シンは細胞内産生水準約２５ｍｇ／
ｌおよび分泌産生水準３ｍｇ／ｌを達成し得たと思われ
る。欧州特許出願公開第３４４，４５９号明細書に示さ
れるように、ピチア・パストリスもＨＳＡの発現に用い
られている。ピチア・パストリスにおいて産生されたＨ
ＳＡの濃度は、ＨＳＡ約８９ｎｇ／蛋白質ｍｇであると
思われる。組換え発現系においてＨＳＡを製造するため
の方法はこれらの実験により確立されたが、可能な最大
ＨＳＡ製造を達成するためにはこれらの方法を最適なも
のにすることが望ましいと思われる。
ｒｒｙ）ら，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８６
年８月，ｐ．７２６およびアージャム・シン（Ａｒｊｕ
ｍＳｉｎｇｈ）の欧州特許出願公開第１２３，５４４号
明細書に示されるように、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においても発
現される。エッチェベリーは濃度約６ｍｇ／ｌの細胞内
ＨＳＡ発現、および細胞会合状態にあるＨＳＡの分泌に
つき示している。アージャム・シンもビール酵母菌にお
いてα−因子およびシグナル配列と合わせたＨＳＡ発現
につき示している。シンは細胞内産生水準約２５ｍｇ／
ｌおよび分泌産生水準３ｍｇ／ｌを達成し得たと思われ
る。欧州特許出願公開第３４４，４５９号明細書に示さ
れるように、ピチア・パストリスもＨＳＡの発現に用い
られている。ピチア・パストリスにおいて産生されたＨ
ＳＡの濃度は、ＨＳＡ約８９ｎｇ／蛋白質ｍｇであると
思われる。組換え発現系においてＨＳＡを製造するため
の方法はこれらの実験により確立されたが、可能な最大
ＨＳＡ製造を達成するためにはこれらの方法を最適なも
のにすることが望ましいと思われる。
【０００５】従ってピチア・パストリスなどの微生物に
おけるＨＳＡの組換え発現によるＨＳＡの収率を高める
方法を提供することは、当技術分野に著しく寄与すると
思われる。
おけるＨＳＡの組換え発現によるＨＳＡの収率を高める
方法を提供することは、当技術分野に著しく寄与すると
思われる。
【０００６】従って本発明の目的は、組換え発現系にお
いて産生されるＨＳＡの収率を高める方法を提供するこ
とである。
いて産生されるＨＳＡの収率を高める方法を提供するこ
とである。
【０００７】発明の要約 従って本発明者らは、ピチア・パストリス細胞において
ＨＳＡの分泌発現を改良するための下記よりなる方法を
見出した： （ａ）ＨＳＡを発現しうる形質転換したピチア・パスト
リス細胞を、発酵ブロス中において、該ピチア・パスト
リス細胞の生存を維持するのに適した条件下で、該ピチ
ア・パストリス細胞によるＨＳＡの発現に適した条件下
に培養し、そして（ｂ）ＨＳＡの発現と同時期に、該発
酵ブロスのｐＨを約５．７−約６．４のｐＨに保持す
る。
ＨＳＡの分泌発現を改良するための下記よりなる方法を
見出した： （ａ）ＨＳＡを発現しうる形質転換したピチア・パスト
リス細胞を、発酵ブロス中において、該ピチア・パスト
リス細胞の生存を維持するのに適した条件下で、該ピチ
ア・パストリス細胞によるＨＳＡの発現に適した条件下
に培養し、そして（ｂ）ＨＳＡの発現と同時期に、該発
酵ブロスのｐＨを約５．７−約６．４のｐＨに保持す
る。
【０００８】詳細な説明 一般にピチア・パストリスはｐＨ約４．８−約５．２に
おいて最適状態で増殖する。このｐＨ範囲で適切な栄養
培地を供給されたピチア・パストリスは旺盛な増殖を示
す。このｐＨ範囲は数種類の異種蛋白質、たとえば肝炎
Ｂ表面抗原をも高度に発現すると思われる。このｐＨ範
囲はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）についても高度に発
現すると思われた。たとえば５′側調節領域（すなわち
プロモーター）および３′側ターミネーション配列にオ
ペラブル結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）
ＨＳＡ構造遺伝子を含むベクターにより形質転換された
増殖中のピチア・パストリス細胞については、得られた
ＨＳＡ発現水準は発酵ブロス中のＨＳＡ約．７１−．８
１ｇ／ｌであった。しかし本発明者らは、発酵ブロスの
ｐＨを約５．２から約５．７−約６．４、好ましいｐＨ
範囲約５．７−約６．０、極めて好ましいｐＨ範囲約
５．７５−約５．８５に移行させるという前例のない工
程を採用することにより、この収率をさらに少なくとも
５０％増大させることができた。このｐＨ範囲の上限
（すなわちｐＨ６．０−６．４）において得られる増加
した分泌水準が振盪試験管内での最適化試験において確
認され、これは酵母エキスおよびペプトンの存在が通気
と共に振盪試験管中で最適ＨＳＡ分泌をもたらすことを
示す。しかしｐＨを連続的に監視しうる大規模発酵にお
いては酵母エキス、ペプトンおよび過度の通気は不必要
であると考えられる。この比較的高いｐＨ水準は、プロ
モーター、ならびにシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白
質をコードする構造遺伝子を含む発現カセットにより形
質転換されたいずれのピチア・パストリス株の収率をも
増大させると思われる。さらにこの結果は、シグナル配
列および成熟異種蛋白質をコードする種々の異種構造遺
伝子に適用しうると思われる。この方法で比較的高い水
準において発現しうる適切な異種蛋白質には、組織プラ
スミノーゲン活性化物質、アルブミン（たとえばヒト血
清アルブミン）、リソチーム（たとえばウシリソチー
ム）、インターフェロン（たとえばガンマ−インターフ
ェロンおよびベータ−インターフェロン）およびインベ
ルターゼよりなる群から選ばれる異種蛋白質が含まれる
が、これらに限定されない。本発明に用いられる異種構
造遺伝子はそれぞれ、成熟蛋白質を分泌するためには成
熟異種蛋白質をコードする配列の５′末端にオペラブル
結合したシグナル配列を含まなければならない。たとえ
ば組織プラスミノーゲン活性化物質、ヒト血清アルブミ
ン、ウシリソチーム、ベータ−インターフェロンおよび
ガンマ−インターフェロンおよびインベルターゼ蛋白質
はすべて、天然のシグナル配列を用いて分泌しうる。さ
らにこれらの蛋白質は、ピチア・パストリスからの分泌
シグナル配列、たとえば米国特許出願第０７／６２７，
５３９号明細書（１９９０年１２月１４日出願、リチャ
ード・バックホルツによる、フィリップス・ペトロリウ
ム・カンパニーに譲渡）（ここに参考として引用する）
に示されるアシドホスファターゼシグナル配列、または
ビール酵母からのアルファ−交配因子シグナル配列を用
いて分泌させることもできる。
おいて最適状態で増殖する。このｐＨ範囲で適切な栄養
培地を供給されたピチア・パストリスは旺盛な増殖を示
す。このｐＨ範囲は数種類の異種蛋白質、たとえば肝炎
Ｂ表面抗原をも高度に発現すると思われる。このｐＨ範
囲はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）についても高度に発
現すると思われた。たとえば５′側調節領域（すなわち
プロモーター）および３′側ターミネーション配列にオ
ペラブル結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）
ＨＳＡ構造遺伝子を含むベクターにより形質転換された
増殖中のピチア・パストリス細胞については、得られた
ＨＳＡ発現水準は発酵ブロス中のＨＳＡ約．７１−．８
１ｇ／ｌであった。しかし本発明者らは、発酵ブロスの
ｐＨを約５．２から約５．７−約６．４、好ましいｐＨ
範囲約５．７−約６．０、極めて好ましいｐＨ範囲約
５．７５−約５．８５に移行させるという前例のない工
程を採用することにより、この収率をさらに少なくとも
５０％増大させることができた。このｐＨ範囲の上限
（すなわちｐＨ６．０−６．４）において得られる増加
した分泌水準が振盪試験管内での最適化試験において確
認され、これは酵母エキスおよびペプトンの存在が通気
と共に振盪試験管中で最適ＨＳＡ分泌をもたらすことを
示す。しかしｐＨを連続的に監視しうる大規模発酵にお
いては酵母エキス、ペプトンおよび過度の通気は不必要
であると考えられる。この比較的高いｐＨ水準は、プロ
モーター、ならびにシグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白
質をコードする構造遺伝子を含む発現カセットにより形
質転換されたいずれのピチア・パストリス株の収率をも
増大させると思われる。さらにこの結果は、シグナル配
列および成熟異種蛋白質をコードする種々の異種構造遺
伝子に適用しうると思われる。この方法で比較的高い水
準において発現しうる適切な異種蛋白質には、組織プラ
スミノーゲン活性化物質、アルブミン（たとえばヒト血
清アルブミン）、リソチーム（たとえばウシリソチー
ム）、インターフェロン（たとえばガンマ−インターフ
ェロンおよびベータ−インターフェロン）およびインベ
ルターゼよりなる群から選ばれる異種蛋白質が含まれる
が、これらに限定されない。本発明に用いられる異種構
造遺伝子はそれぞれ、成熟蛋白質を分泌するためには成
熟異種蛋白質をコードする配列の５′末端にオペラブル
結合したシグナル配列を含まなければならない。たとえ
ば組織プラスミノーゲン活性化物質、ヒト血清アルブミ
ン、ウシリソチーム、ベータ−インターフェロンおよび
ガンマ−インターフェロンおよびインベルターゼ蛋白質
はすべて、天然のシグナル配列を用いて分泌しうる。さ
らにこれらの蛋白質は、ピチア・パストリスからの分泌
シグナル配列、たとえば米国特許出願第０７／６２７，
５３９号明細書（１９９０年１２月１４日出願、リチャ
ード・バックホルツによる、フィリップス・ペトロリウ
ム・カンパニーに譲渡）（ここに参考として引用する）
に示されるアシドホスファターゼシグナル配列、または
ビール酵母からのアルファ−交配因子シグナル配列を用
いて分泌させることもできる。
【０００９】本発明によれば、発酵ブロスのリットル当
たり真正ＨＳＡ約１−３ｇのＨＳＡ分泌水準が得られ
た。従って本発明は高水準のＨＳＡ分泌手段を提供す
る。１−３ｇ／ｌの水準では高純度のＨＳＡを高収率で
採取することができるので、このＨＳＡ産生水準が達成
されたことは先行技術による産生水準より著しい前進で
ある。
たり真正ＨＳＡ約１−３ｇのＨＳＡ分泌水準が得られ
た。従って本発明は高水準のＨＳＡ分泌手段を提供す
る。１−３ｇ／ｌの水準では高純度のＨＳＡを高収率で
採取することができるので、このＨＳＡ産生水準が達成
されたことは先行技術による産生水準より著しい前進で
ある。
【００１０】ＨＳＡ構造遺伝子を発現するためには遺伝
子は５′側調節領域および３′側ターミネーション配列
にオペラブル結合していなければならず、これが宿主
（通常は微生物）内へベクター（たとえばプラスミドま
たは線状の部位特異性インテグラティブベクター）によ
り挿入される発現カセットを形成する。ここで用いるオ
ペラブル結合とは、５′側調節領域、構造遺伝子、およ
び３′側ターミネーション配列がそれらの正常な機能を
果たしうる状態で結合および構成された並置状態を意味
する。ここで用いる５′側調節領域またはプロモーター
とは、種々の刺激に反応して、高い割合のｍＲＮＡ転写
をもたらすＤＮＡ配列を意味する。３′側ターミネーシ
ョン配列は構造遺伝子の終止コドンに対して３′側の配
列であり、これはこの配列がオペラブル結合している遺
伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化する機能をもつ（たと
えばポリアデニル化の引き金となる配列）。本発明を実
施するためには、構造遺伝子のＡＴＧが可能な限り少な
い介在デオキシリボヌクレオチドにより、好ましくは約
１１以下のデオキシリボヌクレオチド、極めて好ましく
は約８以下のデオキシリボヌクレオチドにより、５′側
調節領域の３′末端に結合することが好ましい。介在デ
オキシリボヌクレオチドのアデニンおよびチミン含量が
約５５−約６４％であることも好ましい。さらに、ある
特定の位置についてはヌクレオチド優位性があると思わ
れる。構造遺伝子のＡＴＧコドンから左へ数えて左側の
最初の位置を−１位とすると、アデニンまたはシトシン
が極めて好ましいデオキシリボヌクレオチドであり、−
２位において極めて好ましいデオキシリボヌクレオチド
はアデニンまたはチミンであり、−３位において極めて
好ましいデオキシリボヌクレオチドはアデニンまたはチ
ミンであり、−４位において極めて好ましいヌクレオチ
ドはアデニン、チミンまたはシトシンである。現在では
図３および４の制限地図をもつＡＯＸ１もしくはＤＡＳ
１ ５′側調節領域、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ；１およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ；２がそれらの配列の
３′末端においてＨＳＡ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドン
に結合していることが好ましい。ＡＯＸ１ ５′側調節
領域の適切な結合の１例を下記に示す：
子は５′側調節領域および３′側ターミネーション配列
にオペラブル結合していなければならず、これが宿主
（通常は微生物）内へベクター（たとえばプラスミドま
たは線状の部位特異性インテグラティブベクター）によ
り挿入される発現カセットを形成する。ここで用いるオ
ペラブル結合とは、５′側調節領域、構造遺伝子、およ
び３′側ターミネーション配列がそれらの正常な機能を
果たしうる状態で結合および構成された並置状態を意味
する。ここで用いる５′側調節領域またはプロモーター
とは、種々の刺激に反応して、高い割合のｍＲＮＡ転写
をもたらすＤＮＡ配列を意味する。３′側ターミネーシ
ョン配列は構造遺伝子の終止コドンに対して３′側の配
列であり、これはこの配列がオペラブル結合している遺
伝子のｍＲＮＡ転写産物を安定化する機能をもつ（たと
えばポリアデニル化の引き金となる配列）。本発明を実
施するためには、構造遺伝子のＡＴＧが可能な限り少な
い介在デオキシリボヌクレオチドにより、好ましくは約
１１以下のデオキシリボヌクレオチド、極めて好ましく
は約８以下のデオキシリボヌクレオチドにより、５′側
調節領域の３′末端に結合することが好ましい。介在デ
オキシリボヌクレオチドのアデニンおよびチミン含量が
約５５−約６４％であることも好ましい。さらに、ある
特定の位置についてはヌクレオチド優位性があると思わ
れる。構造遺伝子のＡＴＧコドンから左へ数えて左側の
最初の位置を−１位とすると、アデニンまたはシトシン
が極めて好ましいデオキシリボヌクレオチドであり、−
２位において極めて好ましいデオキシリボヌクレオチド
はアデニンまたはチミンであり、−３位において極めて
好ましいデオキシリボヌクレオチドはアデニンまたはチ
ミンであり、−４位において極めて好ましいヌクレオチ
ドはアデニン、チミンまたはシトシンである。現在では
図３および４の制限地図をもつＡＯＸ１もしくはＤＡＳ
１ ５′側調節領域、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ；１およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ；２がそれらの配列の
３′末端においてＨＳＡ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドン
に結合していることが好ましい。ＡＯＸ１ ５′側調節
領域の適切な結合の１例を下記に示す：
【表１】 ＡＴＧ開始コドンの ＡＯＸ１に関する 前に介在する 構造表示 ５′側調節領域の末端 デオキシリボヌクレオチド ｐＨＳＡ４１３ ５′−ＴＴＣＧＡＡＡＣＧ ５′−無 数種類の５′側調節領域が解明され、これらをピチア・
パストリスにおいてＨＳＡの発現に関連して用いること
ができる。５′側調節領域の例は、ピチア・パストリス
由来の第一アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）、ジヒ
ドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）、グリセルア
ルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子
（ＧＡＰ）、アシドホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ
１）、およびｐ４０調節領域などである。ＡＯＸ１
５′側調節領域、ＤＡＳ１ ５′側調節領域、およびｐ
４０ ５′側調節領域は米国特許第４，８５５，２３１
号明細書に記載されており、ここに参考として引用す
る。ＧＡＰ ５′側調節領域は欧州特許出願公開第３７
４，９１３号明細書（１９９０年６月２７日公開）に示
されており、ここに参考として引用する。ＰＨＯ１
５′側調節領域は米国特許出願第０７／６７２，５３９
号明細書（１９９０年１２月１４日出願、フィリップス
・ペトロリウム・カンパニーに譲渡）に示されている。
本発明の実施に際して用いられる現在好ましい５′側調
節領域は、それらがメタノール含有培地に反応しうるこ
とを特色とするもの、たとえばＡＯＸ１およびＤＡＳ１
よりなる群から選ばれる調節領域である。本発明の実施
に際して用いられる極めて好ましい５′側調節領域はＡ
ＯＸ１ ５′側調節領域である。
パストリスにおいてＨＳＡの発現に関連して用いること
ができる。５′側調節領域の例は、ピチア・パストリス
由来の第一アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）、ジヒ
ドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ１）、グリセルア
ルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子
（ＧＡＰ）、アシドホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ
１）、およびｐ４０調節領域などである。ＡＯＸ１
５′側調節領域、ＤＡＳ１ ５′側調節領域、およびｐ
４０ ５′側調節領域は米国特許第４，８５５，２３１
号明細書に記載されており、ここに参考として引用す
る。ＧＡＰ ５′側調節領域は欧州特許出願公開第３７
４，９１３号明細書（１９９０年６月２７日公開）に示
されており、ここに参考として引用する。ＰＨＯ１
５′側調節領域は米国特許出願第０７／６７２，５３９
号明細書（１９９０年１２月１４日出願、フィリップス
・ペトロリウム・カンパニーに譲渡）に示されている。
本発明の実施に際して用いられる現在好ましい５′側調
節領域は、それらがメタノール含有培地に反応しうるこ
とを特色とするもの、たとえばＡＯＸ１およびＤＡＳ１
よりなる群から選ばれる調節領域である。本発明の実施
に際して用いられる極めて好ましい５′側調節領域はＡ
ＯＸ１ ５′側調節領域である。
【００１１】前記の発現カセット中に３′側ターミネー
ション配列を使用すべきである。３′側ターミネーショ
ン配列は遺伝子にオペラブル結合している場合、構造遺
伝子によりコードされるメッセンジャーＲＮＡを終結さ
せ、ポリアデニル化し、および／または安定化する機能
をもつが、特定の３′側ターミネーション配列が本発明
の実施に際して重要であるとは思われない。本発明の実
施に際して用いられる３′側ターミネーション配列の具
体的供給源の数例にはハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａ
ｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびピチア
・パストリスの３′側ターミネーション配列が含まれる
が、これらに限定されない。好ましいものはピチア・パ
ストリス由来のもの、たとえばＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ
１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＨＯ１遺伝
子およびＨＩＳ４遺伝子の３′側ターミネーション配列
よりなる群から選ばれるものである。特に好ましいもの
はＡＯＸ１遺伝子の３′側ターミネーション配列であ
る。
ション配列を使用すべきである。３′側ターミネーショ
ン配列は遺伝子にオペラブル結合している場合、構造遺
伝子によりコードされるメッセンジャーＲＮＡを終結さ
せ、ポリアデニル化し、および／または安定化する機能
をもつが、特定の３′側ターミネーション配列が本発明
の実施に際して重要であるとは思われない。本発明の実
施に際して用いられる３′側ターミネーション配列の具
体的供給源の数例にはハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａ
ｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびピチア
・パストリスの３′側ターミネーション配列が含まれる
が、これらに限定されない。好ましいものはピチア・パ
ストリス由来のもの、たとえばＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ
１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＨＯ１遺伝
子およびＨＩＳ４遺伝子の３′側ターミネーション配列
よりなる群から選ばれるものである。特に好ましいもの
はＡＯＸ１遺伝子の３′側ターミネーション配列であ
る。
【００１２】ピチア・パストリスは種々のＨＳＡ構造遺
伝子により形質転換することができる（ここで述べる本
発明による形質転換体において、ＨＳＡ構造遺伝子はシ
グナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質の双方をコードす
る）。ＨＳＡ構造遺伝子はローン（Ｌａｗｎ）ら，Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：６１０５（１９８１）お
よびドゥガイチク（Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ）ら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：７１
（１９８２）により配列決定された。これらの遺伝子は
ローンらおよびドゥガイチクらの方法による遺伝子の再
単離によっても得られ、またはインビトロで一般の遺伝
子製造業者、たとえばブリティッシュ・バイオテクノロ
ジー社により合成される。ＨＳＡ遺伝子を得るための可
能な１方法は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをオリゴ
ヌクレオチドプローブによりスクリーニングするか、ま
たはヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを抗−ＨＳＡ抗
血清によりスクリーニングして、ＨＳＡを発現するｃＤ
ＮＡを同定することである。適切なＨＳＡ構造遺伝子の
一例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に提示される。ＨＳＡ
に対する構造遺伝子が採取されると、その遺伝子をさら
に調整する必要がある。ＨＳＡ構造遺伝子を単離したの
ち、その遺伝子を適切なピチア・パストリスベクター、
たとえばプラスミドまたは線状の部位特異性インテグラ
ティブベクターに挿入する。
伝子により形質転換することができる（ここで述べる本
発明による形質転換体において、ＨＳＡ構造遺伝子はシ
グナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質の双方をコードす
る）。ＨＳＡ構造遺伝子はローン（Ｌａｗｎ）ら，Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：６１０５（１９８１）お
よびドゥガイチク（Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ）ら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：７１
（１９８２）により配列決定された。これらの遺伝子は
ローンらおよびドゥガイチクらの方法による遺伝子の再
単離によっても得られ、またはインビトロで一般の遺伝
子製造業者、たとえばブリティッシュ・バイオテクノロ
ジー社により合成される。ＨＳＡ遺伝子を得るための可
能な１方法は、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーをオリゴ
ヌクレオチドプローブによりスクリーニングするか、ま
たはヒト肝臓ｃＤＮＡ発現ライブラリーを抗−ＨＳＡ抗
血清によりスクリーニングして、ＨＳＡを発現するｃＤ
ＮＡを同定することである。適切なＨＳＡ構造遺伝子の
一例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に提示される。ＨＳＡ
に対する構造遺伝子が採取されると、その遺伝子をさら
に調整する必要がある。ＨＳＡ構造遺伝子を単離したの
ち、その遺伝子を適切なピチア・パストリスベクター、
たとえばプラスミドまたは線状の部位特異性インテグラ
ティブベクターに挿入する。
【００１３】プラスミド型ベクターは長年、組換えＤＮ
Ａ法に用いられる基本的要素の１つであった。プラスミ
ドは微生物に見られる環状の染色体外２本鎖ＤＮＡであ
る。プラスミドは細胞当たり単一または多重コピーで生
じることが認められている。プラスミドＤＮＡに含まれ
るものはプラスミド再生に必要な情報、すなわち自動複
製配列、たとえばジェームス・Ｍ．クレグにより米国特
許４，８３７，１４８第号明細書（１９８９年６月６日
発行）に示されたものであり、これをここに参考として
引用する。さらに、形質転換した細胞においてプラスミ
ドの遺伝表現型を選択するための１または２以上の手段
もプラスミドにおいてコードされる情報に含まれる。
Ａ法に用いられる基本的要素の１つであった。プラスミ
ドは微生物に見られる環状の染色体外２本鎖ＤＮＡであ
る。プラスミドは細胞当たり単一または多重コピーで生
じることが認められている。プラスミドＤＮＡに含まれ
るものはプラスミド再生に必要な情報、すなわち自動複
製配列、たとえばジェームス・Ｍ．クレグにより米国特
許４，８３７，１４８第号明細書（１９８９年６月６日
発行）に示されたものであり、これをここに参考として
引用する。さらに、形質転換した細胞においてプラスミ
ドの遺伝表現型を選択するための１または２以上の手段
もプラスミドにおいてコードされる情報に含まれる。
【００１４】本発明の実施に際して用いられる適切なイ
ンテグラティブベクターは、ジェームス・Ｍ．クレグに
より米国特許４，８８２，２７９第号明細書（１９８９
年１１月２１日発行）に示された線状の部位特異性イン
テグラティブベクターであり、これをここに参考として
引用する。これらのベクターは少なくとも１）第１挿入
性ＤＮＡフラグメント；２）選択性マーカー遺伝子；お
よび３）第２挿入性ＤＮＡフラグメントの順次整列した
配列からなる。異種構造遺伝子を含む発現カセットが、
このベクターの第１挿入性ＤＮＡフラグメントと第２挿
入性ＤＮＡフラグメントの間に、マーカー遺伝子の前ま
たは後において挿入される。あるいは構造遺伝子がオペ
ラブル結合しうる挿入性フラグメントの１つに調節領域
すなわちプロモーターが含まれる場合、発現カセットを
インサイチューで形成することができる。
ンテグラティブベクターは、ジェームス・Ｍ．クレグに
より米国特許４，８８２，２７９第号明細書（１９８９
年１１月２１日発行）に示された線状の部位特異性イン
テグラティブベクターであり、これをここに参考として
引用する。これらのベクターは少なくとも１）第１挿入
性ＤＮＡフラグメント；２）選択性マーカー遺伝子；お
よび３）第２挿入性ＤＮＡフラグメントの順次整列した
配列からなる。異種構造遺伝子を含む発現カセットが、
このベクターの第１挿入性ＤＮＡフラグメントと第２挿
入性ＤＮＡフラグメントの間に、マーカー遺伝子の前ま
たは後において挿入される。あるいは構造遺伝子がオペ
ラブル結合しうる挿入性フラグメントの１つに調節領域
すなわちプロモーターが含まれる場合、発現カセットを
インサイチューで形成することができる。
【００１５】第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメント
はそれぞれ少なくとも約２００ヌクレオチドの長さであ
り、形質転換される種のゲノムＤＮＡの部分と相同なヌ
クレオチド配列をもつ。インテグラティブベクターの種
々の成分は、発現カセットおよび選択性マーカー遺伝子
が第１挿入性ＤＮＡフラグメントの３′末端と第２挿入
性ＤＮＡフラグメントの５′末端の間に配置された状態
で、順次整列して線状のＤＮＡフラグメントを形成す
る。第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントは順次整
列した線状フラグメント中において、それらが母体ゲノ
ム中で配向しているものに従って互いに配向する。
はそれぞれ少なくとも約２００ヌクレオチドの長さであ
り、形質転換される種のゲノムＤＮＡの部分と相同なヌ
クレオチド配列をもつ。インテグラティブベクターの種
々の成分は、発現カセットおよび選択性マーカー遺伝子
が第１挿入性ＤＮＡフラグメントの３′末端と第２挿入
性ＤＮＡフラグメントの５′末端の間に配置された状態
で、順次整列して線状のＤＮＡフラグメントを形成す
る。第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントは順次整
列した線状フラグメント中において、それらが母体ゲノ
ム中で配向しているものに従って互いに配向する。
【００１６】第１および第２挿入性ＤＮＡフラグメント
として有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾が起こる
べき天然ゲノム部位の別個の部分と相同のヌクレオチド
配列である。たとえばゲノム修飾がアルコールオキシダ
ーゼ遺伝子の座で起こるべきである場合、用いられる第
１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントはアルコールオ
キシダーゼ遺伝子の座の別個の部分と相同である。第１
および第２挿入性ＤＮＡフラグメントとして使用しうる
ヌクレオチド配列の例は、ピチア・パストリスアルコー
ルオキシダーゼ（ＡＯＸ１）遺伝子、ジヒドロキシアセ
トンシンターゼ（ＤＡＳ１）遺伝子、ｐ４０遺伝子、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰ）遺伝子、アシドホスファターゼ（ＰＨＯ１）
遺伝子、およびＨＩＳ４遺伝子よりなる群から選ばれる
デオキシリボヌクレオチド配列である。ＡＯＸ１遺伝
子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝
子は米国特許第４，８５５，２３１および４，８８５，
２４２号明細書に記載されており、両者をここに参考と
して引用する。ＤＡＳ１という表示は米国特許第４，８
５５，２３１および４，８８５，２４２号明細書におい
て最初に用いられたＤＡＳという表示と等しい。ＧＡＰ
遺伝子は欧州特許出願公開第３７４，９１３号明細書
（１９９０年６月２７日公開）に示されており、ここに
参考として引用する。ＰＨＯ１遺伝子は米国特許出願第
０７／６７２，５３９号明細書（１９９０年１２月１４
日出願、フィリップス・ペトロリウム・カンパニーに譲
渡）に示されており、ここに参考として引用する。
として有用なヌクレオチド配列は、ゲノム修飾が起こる
べき天然ゲノム部位の別個の部分と相同のヌクレオチド
配列である。たとえばゲノム修飾がアルコールオキシダ
ーゼ遺伝子の座で起こるべきである場合、用いられる第
１および第２挿入性ＤＮＡフラグメントはアルコールオ
キシダーゼ遺伝子の座の別個の部分と相同である。第１
および第２挿入性ＤＮＡフラグメントとして使用しうる
ヌクレオチド配列の例は、ピチア・パストリスアルコー
ルオキシダーゼ（ＡＯＸ１）遺伝子、ジヒドロキシアセ
トンシンターゼ（ＤＡＳ１）遺伝子、ｐ４０遺伝子、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰ）遺伝子、アシドホスファターゼ（ＰＨＯ１）
遺伝子、およびＨＩＳ４遺伝子よりなる群から選ばれる
デオキシリボヌクレオチド配列である。ＡＯＸ１遺伝
子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝
子は米国特許第４，８５５，２３１および４，８８５，
２４２号明細書に記載されており、両者をここに参考と
して引用する。ＤＡＳ１という表示は米国特許第４，８
５５，２３１および４，８８５，２４２号明細書におい
て最初に用いられたＤＡＳという表示と等しい。ＧＡＰ
遺伝子は欧州特許出願公開第３７４，９１３号明細書
（１９９０年６月２７日公開）に示されており、ここに
参考として引用する。ＰＨＯ１遺伝子は米国特許出願第
０７／６７２，５３９号明細書（１９９０年１２月１４
日出願、フィリップス・ペトロリウム・カンパニーに譲
渡）に示されており、ここに参考として引用する。
【００１７】第１挿入性ＤＮＡフラグメントは発現カセ
ットに用いられる調節領域からなるオペラブル調節領域
を含むことができる。第１挿入性ＤＮＡフラグメントを
発現カセットの調節領域として用いることは、本発明の
好ましい形態である。図１は第１挿入性ＤＮＡフラグメ
ントをカセットの調節領域として用いたベクターの図を
提示する。図１に示すように、所望により挿入部位１ま
たは２以上、および３′側ターミネーション配列を第１
挿入性ＤＮＡフラグメントの３′側に直接に配置するこ
とができる。この線状の部位特異性インテグラティブベ
クターの配置は、適合性３′側ターミネーション配列を
別個に付加する必要なしに構造遺伝子を挿入するために
用意された部位を提供するという付加的な利点をもつ。
ットに用いられる調節領域からなるオペラブル調節領域
を含むことができる。第１挿入性ＤＮＡフラグメントを
発現カセットの調節領域として用いることは、本発明の
好ましい形態である。図１は第１挿入性ＤＮＡフラグメ
ントをカセットの調節領域として用いたベクターの図を
提示する。図１に示すように、所望により挿入部位１ま
たは２以上、および３′側ターミネーション配列を第１
挿入性ＤＮＡフラグメントの３′側に直接に配置するこ
とができる。この線状の部位特異性インテグラティブベ
クターの配置は、適合性３′側ターミネーション配列を
別個に付加する必要なしに構造遺伝子を挿入するために
用意された部位を提供するという付加的な利点をもつ。
【００１８】第１挿入性ＤＮＡフラグメントが調節領域
を含まない場合、オペラブル発現カセットを提供するた
めには適切な調節領域を構造遺伝子に結合した状態で挿
入する必要がある。また挿入部位に発現カセットを完成
する３′側ターミネーション配列が供給されていない場
合、３′側ターミネーション配列を構造遺伝子の３′末
端にオペラブル結合させることができる。
を含まない場合、オペラブル発現カセットを提供するた
めには適切な調節領域を構造遺伝子に結合した状態で挿
入する必要がある。また挿入部位に発現カセットを完成
する３′側ターミネーション配列が供給されていない場
合、３′側ターミネーション配列を構造遺伝子の３′末
端にオペラブル結合させることができる。
【００１９】宿主株を形質転換するために用いられるＤ
ＮＡ中に少なくとも１個の選択性マーカー遺伝子が含ま
れることも極めて望ましい。これにより、形質転換用Ｄ
ＮＡを取り込んだ微生物の選択および単離が容易にな
る。マーカー遺伝子は形質転換生物に宿主がもたなかっ
た表現型上の特徴を与える。たとえば形質転換されてい
ない宿主株が特定のアミノ酸生合成経路を欠如している
場合、その特定のアミノ酸を産生する能力を回復させ、
または抗生物質などに対する耐性を与える。選択性マー
カー遺伝子の例は、ピチア・パストリスおよびビール酵
母からのＨＩＳ４遺伝子（米国特許第４，８８５，２４
２号明細書に記載）およびＡＲＧ４遺伝子（米国特許第
４，８１８，７００号明細書に記載されており、ここに
参考として引用する）、ビール酵母からのインベルター
ゼ遺伝子（ＳＵＣ２）（米国特許第４，８５７，４６７
号明細書に記載されており、ここに参考として引用す
る）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトランスポジシ
ョン可能な要素Ｔｎ６０１もしくはＴｎ９０３からのＧ
４１８R／カナマイシン耐性遺伝子よりなる群から選ば
れる。
ＮＡ中に少なくとも１個の選択性マーカー遺伝子が含ま
れることも極めて望ましい。これにより、形質転換用Ｄ
ＮＡを取り込んだ微生物の選択および単離が容易にな
る。マーカー遺伝子は形質転換生物に宿主がもたなかっ
た表現型上の特徴を与える。たとえば形質転換されてい
ない宿主株が特定のアミノ酸生合成経路を欠如している
場合、その特定のアミノ酸を産生する能力を回復させ、
または抗生物質などに対する耐性を与える。選択性マー
カー遺伝子の例は、ピチア・パストリスおよびビール酵
母からのＨＩＳ４遺伝子（米国特許第４，８８５，２４
２号明細書に記載）およびＡＲＧ４遺伝子（米国特許第
４，８１８，７００号明細書に記載されており、ここに
参考として引用する）、ビール酵母からのインベルター
ゼ遺伝子（ＳＵＣ２）（米国特許第４，８５７，４６７
号明細書に記載されており、ここに参考として引用す
る）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトランスポジシ
ョン可能な要素Ｔｎ６０１もしくはＴｎ９０３からのＧ
４１８R／カナマイシン耐性遺伝子よりなる群から選ば
れる。
【００２０】本発明の実施に際して用いられるベクター
に付加的なＤＮＡ配列、たとえば細菌性プラスミドＤＮ
Ａ、バクテリオファージＤＮＡなどをも取り込ませうる
ことは当業者に自明である。これらの配列は細菌性宿主
においてこれらのベクターを増幅および維持しうるもの
である。
に付加的なＤＮＡ配列、たとえば細菌性プラスミドＤＮ
Ａ、バクテリオファージＤＮＡなどをも取り込ませうる
ことは当業者に自明である。これらの配列は細菌性宿主
においてこれらのベクターを増幅および維持しうるもの
である。
【００２１】適切なベクター中へのＨＳＡ構造遺伝子の
挿入は、選ばれたベクターを適切な１または２以上の部
位で開裂し、そしてＨＳＡ構造遺伝子を含む少なくとも
１個のオペラブル発現カセットをベクター中に存在させ
る適切な方法により行うことができる。ＨＳＡ構造遺伝
子のリゲーションはいずれか適切なリゲーション法によ
り、たとえばＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行うことが
できる。
挿入は、選ばれたベクターを適切な１または２以上の部
位で開裂し、そしてＨＳＡ構造遺伝子を含む少なくとも
１個のオペラブル発現カセットをベクター中に存在させ
る適切な方法により行うことができる。ＨＳＡ構造遺伝
子のリゲーションはいずれか適切なリゲーション法によ
り、たとえばＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行うことが
できる。
【００２２】ＨＳＡ構造遺伝子およびベクターのリゲー
ション混合物の初期選択、増殖、および所望により増幅
は、好ましくは混合物を細菌性宿主、たとえば大腸菌中
へ形質転換することにより行われる（リゲーション混合
物を宿主酵母中へ直接に形質転換することもできるが、
形質転換率が極めて低い）。大腸菌に関する適切な形質
転換法は当技術分野で周知である。さらに、選択マーカ
ー、および細菌性宿主におけるベクターの維持に必要な
細菌性複製開始点も当技術分野で周知である。発現系内
にＨＳＡ構造遺伝子を含む目的のプラスミドの単離およ
び／または精製は、宿主ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを
分離するためのいずれか適切な手段により行うことがで
きる。同様に、リゲーションにより形成されたベクター
を、好ましくは増殖後に試験して、ＨＳＡ遺伝子の存
在、ならびに調節領域および ３′側ターミネーション
配列へのそれのオペラブル結合を立証することができ
る。これはエンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動また
はサザーンハイブリダイゼーションを含めた種々の方法
により行うことができるが、これらに限定されない。
ション混合物の初期選択、増殖、および所望により増幅
は、好ましくは混合物を細菌性宿主、たとえば大腸菌中
へ形質転換することにより行われる（リゲーション混合
物を宿主酵母中へ直接に形質転換することもできるが、
形質転換率が極めて低い）。大腸菌に関する適切な形質
転換法は当技術分野で周知である。さらに、選択マーカ
ー、および細菌性宿主におけるベクターの維持に必要な
細菌性複製開始点も当技術分野で周知である。発現系内
にＨＳＡ構造遺伝子を含む目的のプラスミドの単離およ
び／または精製は、宿主ＤＮＡからプラスミドＤＮＡを
分離するためのいずれか適切な手段により行うことがで
きる。同様に、リゲーションにより形成されたベクター
を、好ましくは増殖後に試験して、ＨＳＡ遺伝子の存
在、ならびに調節領域および ３′側ターミネーション
配列へのそれのオペラブル結合を立証することができ
る。これはエンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動また
はサザーンハイブリダイゼーションを含めた種々の方法
により行うことができるが、これらに限定されない。
【００２３】宿主酵母中へのプラスミドまたは線状ベク
ターの形質転換は下記により教示されるものを含めた適
切な形質転換法により行うことができるが、これらに限
定されない：クレグおよびバリンガー，米国特許第４，
９２９，５５５号明細書；ヒネン（Ｈｎｎｅｎ）ら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５（１９７
８）１９２９；イトー（Ｉｔｏ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１５３（１９８３）１６３；クレグ（Ｃｒｅｇ
ｇ）ら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．５（１９８５），
ｐ．３３７６；Ｄ．Ｗ．ストローマンら，米国特許第
４，８７９，２３１号明細書（１９８９年１１月７日発
行）；またはスリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎ
ａ）ら，Ｇｅｎｅ，５９（１９８７），ｐ．１１５。本
発明を実施するために好ましいものはクレグら（１９８
５）の方法である。本発明を実施するためには、過剰の
線状ベクターを用い、サザーンハイブリダイゼーション
により多数の挿入配列を選択することが望ましい。
ターの形質転換は下記により教示されるものを含めた適
切な形質転換法により行うことができるが、これらに限
定されない：クレグおよびバリンガー，米国特許第４，
９２９，５５５号明細書；ヒネン（Ｈｎｎｅｎ）ら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５（１９７
８）１９２９；イトー（Ｉｔｏ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１５３（１９８３）１６３；クレグ（Ｃｒｅｇ
ｇ）ら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．５（１９８５），
ｐ．３３７６；Ｄ．Ｗ．ストローマンら，米国特許第
４，８７９，２３１号明細書（１９８９年１１月７日発
行）；またはスリークリシュナ（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎ
ａ）ら，Ｇｅｎｅ，５９（１９８７），ｐ．１１５。本
発明を実施するために好ましいものはクレグら（１９８
５）の方法である。本発明を実施するためには、過剰の
線状ベクターを用い、サザーンハイブリダイゼーション
により多数の挿入配列を選択することが望ましい。
【００２４】形質転換に用いる宿主酵母はいずれか適切
なメチロトロフィック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉ
ｃ）酵母であってもよい。適切なメチロトロフィック酵
母にはハンセヌラ属およびピチア属よりなる群から選ば
れる、メタノール上で増殖しうる酵母が含まれるが、こ
れらに限定されない。この群の酵母の例である特定の種
のリストはアンソニー（Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ），Ｔｈｅ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔ
ｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見られる。現在好ま
しいものは下記のピチア属メチロトロフィック酵母であ
る：たとえば栄養要求性ピチア・パストリスＧＳ１１５
（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）；ピチア・パストリスＧ
Ｓ１９０（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４）、米国特許第
４，８１８，７００号明細書に記載；ピチア・パストリ
スＰＰＦ１（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７）、米国特許第
４，８１２，４０５号明細書に記載。栄養要求性ピチア
・パストリス株はそれらの選択の容易さにおいても本発
明の実施に有利である。野生型ピチア・パストリス株
（たとえばＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０およびＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３１）も、適切な形質転換マーカー遺伝子を
選ぶならば、たとえばＳＵＣ２を用いてピチア・パスト
リスを蔗糖上で増殖しうる株に形質転換するか、または
抗生物質耐性マーカー、たとえばＧ４１８を用いる場
合、同様に有効に採用しうる。上記の株はすべて米国農
務省、ノーザーン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リーから入手される。
なメチロトロフィック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉ
ｃ）酵母であってもよい。適切なメチロトロフィック酵
母にはハンセヌラ属およびピチア属よりなる群から選ば
れる、メタノール上で増殖しうる酵母が含まれるが、こ
れらに限定されない。この群の酵母の例である特定の種
のリストはアンソニー（Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ），Ｔｈｅ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔ
ｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）に見られる。現在好ま
しいものは下記のピチア属メチロトロフィック酵母であ
る：たとえば栄養要求性ピチア・パストリスＧＳ１１５
（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）；ピチア・パストリスＧ
Ｓ１９０（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１４）、米国特許第
４，８１８，７００号明細書に記載；ピチア・パストリ
スＰＰＦ１（ＮＲＲＬ Ｙ−１８０１７）、米国特許第
４，８１２，４０５号明細書に記載。栄養要求性ピチア
・パストリス株はそれらの選択の容易さにおいても本発
明の実施に有利である。野生型ピチア・パストリス株
（たとえばＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０およびＮＲＲＬ
Ｙ−１１４３１）も、適切な形質転換マーカー遺伝子を
選ぶならば、たとえばＳＵＣ２を用いてピチア・パスト
リスを蔗糖上で増殖しうる株に形質転換するか、または
抗生物質耐性マーカー、たとえばＧ４１８を用いる場
合、同様に有効に採用しうる。上記の株はすべて米国農
務省、ノーザーン・リージョナル・リサーチ・ラボラト
リーから入手される。
【００２５】形質転換したピチア・パストリス細胞はそ
れ以前は栄養要求性であった細胞を形質転換後に、要求
される（細胞の栄養要求性のため）生化学的物質の不在
下で培養し、新たな表現型（″メタノールスロー″）を
選択および検出する方法、または形質転換体に含まれる
耐性遺伝子の不在下では酵母にとって有毒である抗生物
質の存在下で培養する方法を含めた適宜な方法により選
択することができるが、これらに限定されない。
れ以前は栄養要求性であった細胞を形質転換後に、要求
される（細胞の栄養要求性のため）生化学的物質の不在
下で培養し、新たな表現型（″メタノールスロー″）を
選択および検出する方法、または形質転換体に含まれる
耐性遺伝子の不在下では酵母にとって有毒である抗生物
質の存在下で培養する方法を含めた適宜な方法により選
択することができるが、これらに限定されない。
【００２６】単離した形質転換ピチア・パストリス細胞
は適宜な発酵法、たとえば振盪フラスコ発酵法、高密度
発酵法、またはクレグ（Ｃｒｅｇｇ）ら，メチロトロフ
ィック酵母、ピチア・パストリスにおける肝炎Ｂ表面抗
原の高水準発現および効果的アセンブリー ５ Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７９（１９８７）に示され
る方法により培養される。単離体はＨＳＡ産生をアッセ
イして、最大ＨＳＡ産生水準をもつ単離体を同定するこ
とによりスクリーニングすることができる。
は適宜な発酵法、たとえば振盪フラスコ発酵法、高密度
発酵法、またはクレグ（Ｃｒｅｇｇ）ら，メチロトロフ
ィック酵母、ピチア・パストリスにおける肝炎Ｂ表面抗
原の高水準発現および効果的アセンブリー ５ Ｂｉｏ
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４７９（１９８７）に示され
る方法により培養される。単離体はＨＳＡ産生をアッセ
イして、最大ＨＳＡ産生水準をもつ単離体を同定するこ
とによりスクリーニングすることができる。
【００２７】形質転換したピチア・パストリスの培養は
水性連続式またはバッチ供給式で、種々の炭素エネルギ
ー源および／または栄養源を用いて行うことができる。
本発明の実施にはバッチ供給式発酵法が好ましい。ピチ
ア・パストリスを増殖させるのに適した炭素エネルギー
源にはメタノール、グリセリン、ソルビトール、グルコ
ース、フルクトースおよびそれらのうち１または２以上
の組み合わせよりなる群から選ばれる炭素エネルギー源
が含まれるが、これらに限定されない。ピチア・パスト
リスを増殖させるための好ましい炭素エネルギー源はメ
タノール、グリセリンおよびそれらの組み合わせよりな
る群から選ばれる炭素エネルギー源である。ピチア・パ
ストリスに適した栄養源または培地には、少なくとも１
種類の窒素源、少なくとも１種類のホスフェート源、少
なくとも１種類の無機質源、たとえば鉄、銅、亜鉛、マ
グネシウム、マンガン、カルシウム、および他の微量元
素、ならびにビタミン（たとえばビオチン、パントテン
酸、および必要に応じてチアミン）が含まれる。
水性連続式またはバッチ供給式で、種々の炭素エネルギ
ー源および／または栄養源を用いて行うことができる。
本発明の実施にはバッチ供給式発酵法が好ましい。ピチ
ア・パストリスを増殖させるのに適した炭素エネルギー
源にはメタノール、グリセリン、ソルビトール、グルコ
ース、フルクトースおよびそれらのうち１または２以上
の組み合わせよりなる群から選ばれる炭素エネルギー源
が含まれるが、これらに限定されない。ピチア・パスト
リスを増殖させるための好ましい炭素エネルギー源はメ
タノール、グリセリンおよびそれらの組み合わせよりな
る群から選ばれる炭素エネルギー源である。ピチア・パ
ストリスに適した栄養源または培地には、少なくとも１
種類の窒素源、少なくとも１種類のホスフェート源、少
なくとも１種類の無機質源、たとえば鉄、銅、亜鉛、マ
グネシウム、マンガン、カルシウム、および他の微量元
素、ならびにビタミン（たとえばビオチン、パントテン
酸、および必要に応じてチアミン）が含まれる。
【００２８】少なくとも１種類の炭素エネルギー源およ
び栄養素の適切な供給源は種々の供給源から得られる
か、または単一供給源からなるものでもよい。しかし好
ましいものは特性が定まった少なくとも１種類の炭素エ
ネルギー源および／または栄養源である。効果が証明さ
れた炭素エネルギー源および／または栄養素の組成物の
一例は下記のものである：
び栄養素の適切な供給源は種々の供給源から得られる
か、または単一供給源からなるものでもよい。しかし好
ましいものは特性が定まった少なくとも１種類の炭素エ
ネルギー源および／または栄養源である。効果が証明さ
れた炭素エネルギー源および／または栄養素の組成物の
一例は下記のものである：
【表２】炭素エネルギー源および栄養素 水１リットル当たりの成分 炭素エネルギー源 ５０．０ ｇ／ｌ （グリセリン） Ｈ3ＰＯ4（８５％） ２１ ｍｌ／ｌ ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ ｇ／ｌ Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ ｇ／ｌ ＫＯＨ ３．９ ｇ／ｌ ペプトン １０．０ ｇ／ｌ 1酵母エキス ５．０ ｇ／ｌ 2無機質および微量金属 １．０ ｍｌ／ｌ 1 酵母エキスはアンベレックス（Ａｍｂｅｒｅｘ）（商
標）１００３であり、これはユニバーサル・フーズ・コ
ーポレーション（ウィスコンシン州ミルウォーキー）か
ら入手され、その商標である。2 無機質および微量金属はＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６５．
０ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ６．０ｇ／ｌ、ＺｎＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4 ３．０ｇ／
ｌ、およびＨ2ＳＯ4 ５．Ｏｍｌ／ｌである。
標）１００３であり、これはユニバーサル・フーズ・コ
ーポレーション（ウィスコンシン州ミルウォーキー）か
ら入手され、その商標である。2 無機質および微量金属はＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６５．
０ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ６．０ｇ／ｌ、ＺｎＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ4 ３．０ｇ／
ｌ、およびＨ2ＳＯ4 ５．Ｏｍｌ／ｌである。
【００２９】本発明に用いられる酵母エキスには、アン
ベレックス（商標）１００３およびバクト（Ｂａｃｔ
ｏ）（商標）酵母エキス（ディフコ・ラボラトリーズ・
インコーポレーティッド）よりなる群から選ばれる酵母
エキスが含まれるが、これらに限定されない。あるいは
窒素源として酵母エキスの代わりにコーン・スチープ・
リカーを用いることができる。
ベレックス（商標）１００３およびバクト（Ｂａｃｔ
ｏ）（商標）酵母エキス（ディフコ・ラボラトリーズ・
インコーポレーティッド）よりなる群から選ばれる酵母
エキスが含まれるが、これらに限定されない。あるいは
窒素源として酵母エキスの代わりにコーン・スチープ・
リカーを用いることができる。
【００３０】本発明に用いられる微量金属は、酵母の増
殖に一般に用いられる微量金属であり、ピチア・パスト
リスの増殖速度またはＨＳＡ産生を制限しない十分な量
で供給され、これにはコバルト、モリブデン、鉄、銅、
亜鉛およびマンガンよりなる群から選ばれる微量金属が
含まれるが、これらに限定されない。
殖に一般に用いられる微量金属であり、ピチア・パスト
リスの増殖速度またはＨＳＡ産生を制限しない十分な量
で供給され、これにはコバルト、モリブデン、鉄、銅、
亜鉛およびマンガンよりなる群から選ばれる微量金属が
含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】発酵温度は一般に約２０−約３５℃、好ま
しくは約３０℃である。
しくは約３０℃である。
【００３２】発酵をバッチ供給式で行う発酵容器内の溶
存酸素含量は、飽和の約２０−約８０％、好ましくは飽
和の約３０−約６０％である。
存酸素含量は、飽和の約２０−約８０％、好ましくは飽
和の約３０−約６０％である。
【００３３】ＨＳＡ構造遺伝子を含むベクターで形質転
換したピチア・パストリス株を高密度になるまで培養し
たのち、形質転換した株を約５．７−約６．０のｐＨで
誘導してＨＳＡを発現させる。たとえばメタノール誘導
性調節領域を含む線状発現カセットで形質転換された株
につきこの方法を採用する場合、培養物をまず最少塩
類、ビオチンおよび５重量％グリセリン上で目的密度に
なるまで増殖させる。約３０℃の温度および飽和の約２
０％の溶存酸素濃度において、ｐＨを約５．８に調整す
べきである（アンモニアにより）。グリセリンが消費さ
れたのち、メタノールを徐々に供給し始めることにより
プロモーターが誘導される。この供給は、少なくとも培
養物の生存を維持するのに十分に量であり、ただし培養
物と接触するメタノールの最大濃度約５．０重量％を越
えてはならない。メタノールの供給に際して無細胞ブロ
ス中に存在するＨＳＡをサンプリングすることによりＨ
ＳＡ分泌を監視することができる。産生されたＨＳＡの
量を定量するのに適した試験法は当業者に既知のもの、
たとえば流動ポリアクリルアミドゲルである。メタノー
ルの供給はＨＳＡ濃度が受容しうる水準に達するまで継
続すべきである。一般にＨＳＡの産生はメタノール供給
の約１２０時間後にピークとなるであろう。
換したピチア・パストリス株を高密度になるまで培養し
たのち、形質転換した株を約５．７−約６．０のｐＨで
誘導してＨＳＡを発現させる。たとえばメタノール誘導
性調節領域を含む線状発現カセットで形質転換された株
につきこの方法を採用する場合、培養物をまず最少塩
類、ビオチンおよび５重量％グリセリン上で目的密度に
なるまで増殖させる。約３０℃の温度および飽和の約２
０％の溶存酸素濃度において、ｐＨを約５．８に調整す
べきである（アンモニアにより）。グリセリンが消費さ
れたのち、メタノールを徐々に供給し始めることにより
プロモーターが誘導される。この供給は、少なくとも培
養物の生存を維持するのに十分に量であり、ただし培養
物と接触するメタノールの最大濃度約５．０重量％を越
えてはならない。メタノールの供給に際して無細胞ブロ
ス中に存在するＨＳＡをサンプリングすることによりＨ
ＳＡ分泌を監視することができる。産生されたＨＳＡの
量を定量するのに適した試験法は当業者に既知のもの、
たとえば流動ポリアクリルアミドゲルである。メタノー
ルの供給はＨＳＡ濃度が受容しうる水準に達するまで継
続すべきである。一般にＨＳＡの産生はメタノール供給
の約１２０時間後にピークとなるであろう。
【００３４】ピチア・パストリス細胞をｐＨ制御式発酵
槽の代わりに振盪試験管または振盪フラスコで増殖させ
る場合、分泌蛋白質、たとえばＨＳＡの最大収率を保証
するために追加工程を採用すべきである。詳細には、用
いる培地を発酵槽で用いたものから複合培地に変更し、
通気量を増加させることが推奨される。振盪フラスコお
よび振盪試験管に用いる複合培地は、追加アミノ酸を含
有すべきである。アミノ酸はグルタミン酸、メチオニ
ン、リジン、ロイシン、イソロイシンおよび他のアミノ
酸を含有する特定の培地に含まれていてもよく、または
複合培地への補充物、たとえば酵母エキスもしくはカザ
ミノ酸によるものであってもよい。添加アミノ酸の相対
濃度は一般に約２．５−約１０ｍｇ／ｌであり、好まし
い範囲はグルタミン酸、メチオニン、リジン、ロイシン
およびイソロイシンについては約４−約６ｍｇ／ｌ、他
のアミノ酸については約０．５−約３ｍｇ／ｌである
（ただし添加アミノ酸からヒスチジンは完全に排除しう
る）。添加アミノ酸の代わりに酵母エキスを用いる場
合、酵母エキスが約１−約１５ｇ／ｌの濃度で供給され
るように使用することが好ましく、酵母エキスが約１０
ｇ／ｌの濃度で供給されることが極めて好ましい。振盪
試験管および振盪フラスコにおける分泌を改善するため
に、培地にペプトンを添加するのが望ましいことも認め
られた。最適分泌のためにはこのペプトンは酵母エキス
と共に約１−約５０ｇ／ｌの濃度で、極めて好ましくは
約２０ｇ／ｌの濃度で用いられる。指針として、一般に
ペプトン濃度は酵母エキス濃度の２倍であることが推奨
される。
槽の代わりに振盪試験管または振盪フラスコで増殖させ
る場合、分泌蛋白質、たとえばＨＳＡの最大収率を保証
するために追加工程を採用すべきである。詳細には、用
いる培地を発酵槽で用いたものから複合培地に変更し、
通気量を増加させることが推奨される。振盪フラスコお
よび振盪試験管に用いる複合培地は、追加アミノ酸を含
有すべきである。アミノ酸はグルタミン酸、メチオニ
ン、リジン、ロイシン、イソロイシンおよび他のアミノ
酸を含有する特定の培地に含まれていてもよく、または
複合培地への補充物、たとえば酵母エキスもしくはカザ
ミノ酸によるものであってもよい。添加アミノ酸の相対
濃度は一般に約２．５−約１０ｍｇ／ｌであり、好まし
い範囲はグルタミン酸、メチオニン、リジン、ロイシン
およびイソロイシンについては約４−約６ｍｇ／ｌ、他
のアミノ酸については約０．５−約３ｍｇ／ｌである
（ただし添加アミノ酸からヒスチジンは完全に排除しう
る）。添加アミノ酸の代わりに酵母エキスを用いる場
合、酵母エキスが約１−約１５ｇ／ｌの濃度で供給され
るように使用することが好ましく、酵母エキスが約１０
ｇ／ｌの濃度で供給されることが極めて好ましい。振盪
試験管および振盪フラスコにおける分泌を改善するため
に、培地にペプトンを添加するのが望ましいことも認め
られた。最適分泌のためにはこのペプトンは酵母エキス
と共に約１−約５０ｇ／ｌの濃度で、極めて好ましくは
約２０ｇ／ｌの濃度で用いられる。指針として、一般に
ペプトン濃度は酵母エキス濃度の２倍であることが推奨
される。
【００３５】形質転換したピチア・パストリスの振盪フ
ラスコおよび振盪試験管培養における通気は最適分泌を
得るのに重要なパラメーターであると思われる。適切な
分泌を保証するために、振盪試験管またはフラスコが通
気性キュップで蓋をした大きな開口を備えていることが
推奨される。適切な通気性キュップは粗い濾材、たとえ
ばチーズークロスで作成しうる。本発明に適した振盪フ
ラスコの一例はチューンエア（Ｔｕｎａｉｒ）振盪フラ
スコである。一般に過度の発泡を避けるために低バフル
振盪フラスコも推奨される。通気のための振盪機速度は
約２５０−約３００ｒｐｍであることが推奨される。
ラスコおよび振盪試験管培養における通気は最適分泌を
得るのに重要なパラメーターであると思われる。適切な
分泌を保証するために、振盪試験管またはフラスコが通
気性キュップで蓋をした大きな開口を備えていることが
推奨される。適切な通気性キュップは粗い濾材、たとえ
ばチーズークロスで作成しうる。本発明に適した振盪フ
ラスコの一例はチューンエア（Ｔｕｎａｉｒ）振盪フラ
スコである。一般に過度の発泡を避けるために低バフル
振盪フラスコも推奨される。通気のための振盪機速度は
約２５０−約３００ｒｐｍであることが推奨される。
【００３６】振盪フラスコまたは振盪試験管において適
切な細胞密度に達したのち、細胞を採取し、次いで蛋白
質の分泌を誘導するために、増殖に用いた炭素源の代わ
りにメタノールを含有する培地に再懸濁する。次いで目
的水準の産生が達成された時点を判定するために、振盪
フラスコまたは振盪試験管を常法により監視する。
切な細胞密度に達したのち、細胞を採取し、次いで蛋白
質の分泌を誘導するために、増殖に用いた炭素源の代わ
りにメタノールを含有する培地に再懸濁する。次いで目
的水準の産生が達成された時点を判定するために、振盪
フラスコまたは振盪試験管を常法により監視する。
【００３７】本発明を以下の実施例においてより詳細に
説明するが、これらは限定ではない。
説明するが、これらは限定ではない。
【００３８】
【実施例】実施例に関する一般情報：菌株 ピチア・パストリスＧＳ１１５（ｈｉｓ４）ＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１ 大腸菌ＤＧ７５′（ｈｓｄ１、ｌｅｕ６、ｌａｃＹ、ｔ
ｈｒ−１、ｓｕｐＥ４４、ｔｏｎＡ２１、ｌａｍｂｄａ
- ）緩衝液、溶液および培地 以下の実施例で用いた緩衝液、溶液および培地は下記の
組成をもつ： ｄＨ2Ｏ ミリ−Ｑ（ミリポア）試薬用水
システムで処理した脱イ オン水 １Ｍトリス緩衝液 ８００ｍＬのＨ2Ｏ中にトリスベ
ース１２１．１ｇ；濃（３５％）ＨＣｌ水溶液の添加に
よりｐＨを目的の値に 調整；最終ｐＨ調整
前に溶液を室温に冷却し、最終容量
１Ｌに希釈。
Ｙ−１５８５１ 大腸菌ＤＧ７５′（ｈｓｄ１、ｌｅｕ６、ｌａｃＹ、ｔ
ｈｒ−１、ｓｕｐＥ４４、ｔｏｎＡ２１、ｌａｍｂｄａ
- ）緩衝液、溶液および培地 以下の実施例で用いた緩衝液、溶液および培地は下記の
組成をもつ： ｄＨ2Ｏ ミリ−Ｑ（ミリポア）試薬用水
システムで処理した脱イ オン水 １Ｍトリス緩衝液 ８００ｍＬのＨ2Ｏ中にトリスベ
ース１２１．１ｇ；濃（３５％）ＨＣｌ水溶液の添加に
よりｐＨを目的の値に 調整；最終ｐＨ調整
前に溶液を室温に冷却し、最終容量
１Ｌに希釈。
【００３９】 ＴＥ緩衝液 １．０ｍＭ ＥＤＴＡ ０．０１Ｍ（ｐＨ８．０）トリス緩衝液中 ＳＥＤ １Ｍソルビトール ２５ｍＭ ＥＤＴＡ ５０ｍＭ ＤＴＴ、使用前に添加 −−ｐＨ８に調整 ＳＣＥ ９．１ｇソルビトール １．４７ｇクエン酸ナトリウム ０．１６８ｇ ＥＤＴＡ −−５０ｍｌのｄＨ2Ｏ中でＨＣｌによりｐＨ５．８に
調整し、オートクレーブ処理 ＣａＳ １Ｍソルビトール １０ｍＭ ＣａＣｌ2 −−フィルター滅菌 ＳＯＳ １Ｍソルビトール ０．３×ＹＰＤ １０ｍＭ ＣａＣｌ2 ＰＥＧ ２０％ポリエチレングリコール−
３３５０ １０ｍＭ ＣａＣｌ2 １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４） −−フィルター滅菌 溶液Ａ ０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５） ０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ０．５Ｍ ＮａＣｌ ０．０１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ） 溶液Ｂ ０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５） ０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ０．１Ｍ ＤＴＴ 溶液Ｃ（氷上に保持） ４μｌ 溶液Ｂ ４μｌ １０ｍＭ ｄＡＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ｄＴＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ｄＧＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ｄＣＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ＡＴＰ ５μｌ Ｔ4リガーゼ（２Ｕ／μｌ） １２μｌ Ｈ2Ｏ 溶液Ｃの処方はゾラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｓ
ｍｉｔｈ）のものから改良 ＬＢブロス、１Ｌ ５．０ｇ酵母エキス １０．０ｇトリプトン ５．０ｇ ＮａＣｌ １０×トランスファー緩衝液 ９６．８ｇトリズマ・ベース（Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓ
ｅ） ９．７４ｇグリシン １Ｌとなる量の水 リゲーション緩衝液 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭジチオトレイトール １ｍＭ ＡＴＰ ホスファターゼ緩衝液 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０） １ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＺｎＣｌ2 １ｍＭスペルミジンＢｓｕ３６Ｉ 緩衝液 １００ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡＣｓｐ４５Ｉ 緩衝液 ６０ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ７ｍＭ ＭｇＣｌ2 １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ＲＥａｃｔ１緩衝液 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ＲＥａｃｔ２緩衝液 ＲＥａｃｔ１緩衝液 ＋ ５０ｍＭ ＮａＣｌ ＲＥａｃｔ３緩衝液 ＲＥａｃｔ１緩衝液 ＋ １００ｍＭ ＮａＣｌ ＨＳ緩衝液 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １００ｍＭ ＮａＣｌ １ｍＭ ＤＴＴ １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ １０×基礎塩類 ４２ｍｌリン酸、８５％ １．８ｇ硫酸カルシウム・２Ｈ2Ｏ ２８．６ｇ硫酸カリウム ２３．４ｇ硫酸マグネシウム・７Ｈ2Ｏ ６．５ｇ水酸化カリウム Ｐｔｍ1微量塩類溶液 ６．０ｇ硫酸銅・５Ｈ2Ｏ ０．０８ｇヨウ化ナトリウム ３．０ｇ硫酸マンガン・Ｈ2Ｏ ０．２ｇモリブデン酸ナトリウム・Ｈ2Ｏ ０．０２ｇホウ酸 ０．５ｇ塩化コバルト ２０．０ｇ塩化亜鉛 ６５．０ｇ硫酸第一鉄・Ｈ2Ｏ ０．２０ｇビオチン ５．０ｍｌ硫酸 ＹＰＤ（酵母エキス−ペプトン−デキストロース培地） １０ｇバクト酵母エキス ２０ｇペプトン １０ｇデキストロース １Ｌとなる量の水 ＭＧＹ（最少グリセリン培地） １３．４ｇ酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含有、ア
ミノ酸不含 ４００μｇビオチン １０ｍｌグリセリン １Ｌとなる量の水 ＭＭ（最少メタノール培地） ＭＧＹと同じ、ただし１０ｍｌグリセリンの代わりに５
ｍｌメタノールを使用 ＳＤＲ（デキストロース補給リジェネレーション培地） １３．４ｇ酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含有、ア
ミノ酸不含 ４００μｇビオチン １８２ｇソルビトール １０ｇグルコース ２ｇヒスチジンアッセイミックス（ジブコ） ５０ｍｇグルタミン ５０ｍｇメチオニン ５０ｍｇリジン ５０ｍｇロイシン ５０ｍｇイソロイシン １０ｇアガロース １Ｌとなる量の水 ＢＭＧＲ（緩衝化最少グリセリン富化培地） １００ｍｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） １３．４ｇ／ｌ酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含有 ４００μｇ／ｌビオチン １０ｍｌ／ｌグリセリン アミノ酸 グルタミン酸、メチオニン、リジ
ン、ロイシンおよびイソロイシン：各５ｍｇ／ｌ；ヒス
チジン以外の他のアミノ酸はすべて１ｍｇ／ｌ ヌクレオチド 硫酸アデニン、塩酸グアニン、ウ
ラシルおよびキサンチン、各４０μｇ／ｌ ビタミン 塩酸チアミン、リボフラビンおよ
びパントテン酸カルシウム、各２μｇ／ｌ；塩酸ピリド
キシンおよびニコチン酸、各４μｇ／ｌ；塩酸ピリドキ
サミンおよび塩酸ピリドキサール、各１μｇ／ｌ；パラ
アミノ安息香酸、０．３μｇ／ｌ；葉酸、０．０３μｇ
／ｌ； 微量無機質 硫酸マグネシウム、８００μｇ／
ｌ；硫酸第一鉄、４０μｇ／ｌ；硫酸マンガン、８０μ
ｇ／ｌ；塩化ナトリウム、４０μｇ／ｌ； ＢＭＧＹ（緩衝化最少グリセリン複合培地） １００ｍｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） １３．４ｇ／ｌ酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含
有、アミノ酸不含 ビオチン、４００μｇ／ｌ グリセリン、１０ｍｌ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、２０ｇ／ｌ ＢＭＭＲ（緩衝化最少メタノール富化培地） ＢＭＧＲと同じ、ただしグリセリンの代わりにメタノー
ル５ｍｌ／ｌを添加 ＢＭＭＹ（緩衝化最少メタノール複合培地） ＢＭＧＹと同じ、ただしグリセリンの代わりにメタノー
ル５ｍｌ／ｌを添加方法 組換えＤＮＡ実験室作業に適した方法は多様な文献中に
見られ、それらには以下のものが含まれるがこれらに限
定されない：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ（フロリダ州オルランドー：アカデミック・プレス
社），特にＶｏｌ．１５２、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
バーガーおよびキンメル（Ｂｅｇｅｒ，Ｋｉｍｍｅ
ｌ），（フロリダ州オルランドー：アカデミック・プレ
ス社，１９８７），ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ／Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，第２版（コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社，
１９８９）；これらすべてをここに参考として引用す
る。
調整し、オートクレーブ処理 ＣａＳ １Ｍソルビトール １０ｍＭ ＣａＣｌ2 −−フィルター滅菌 ＳＯＳ １Ｍソルビトール ０．３×ＹＰＤ １０ｍＭ ＣａＣｌ2 ＰＥＧ ２０％ポリエチレングリコール−
３３５０ １０ｍＭ ＣａＣｌ2 １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４） −−フィルター滅菌 溶液Ａ ０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５） ０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ０．５Ｍ ＮａＣｌ ０．０１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ） 溶液Ｂ ０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５） ０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 ０．１Ｍ ＤＴＴ 溶液Ｃ（氷上に保持） ４μｌ 溶液Ｂ ４μｌ １０ｍＭ ｄＡＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ｄＴＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ｄＧＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ｄＣＴＰ ４μｌ １０ｍＭ ＡＴＰ ５μｌ Ｔ4リガーゼ（２Ｕ／μｌ） １２μｌ Ｈ2Ｏ 溶液Ｃの処方はゾラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｓ
ｍｉｔｈ）のものから改良 ＬＢブロス、１Ｌ ５．０ｇ酵母エキス １０．０ｇトリプトン ５．０ｇ ＮａＣｌ １０×トランスファー緩衝液 ９６．８ｇトリズマ・ベース（Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓ
ｅ） ９．７４ｇグリシン １Ｌとなる量の水 リゲーション緩衝液 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭジチオトレイトール １ｍＭ ＡＴＰ ホスファターゼ緩衝液 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０） １ｍＭ ＭｇＣｌ2 １ｍＭ ＺｎＣｌ2 １ｍＭスペルミジンＢｓｕ３６Ｉ 緩衝液 １００ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡＣｓｐ４５Ｉ 緩衝液 ６０ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５） ７ｍＭ ＭｇＣｌ2 １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ＲＥａｃｔ１緩衝液 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ＲＥａｃｔ２緩衝液 ＲＥａｃｔ１緩衝液 ＋ ５０ｍＭ ＮａＣｌ ＲＥａｃｔ３緩衝液 ＲＥａｃｔ１緩衝液 ＋ １００ｍＭ ＮａＣｌ ＨＳ緩衝液 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １００ｍＭ ＮａＣｌ １ｍＭ ＤＴＴ １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ １０×基礎塩類 ４２ｍｌリン酸、８５％ １．８ｇ硫酸カルシウム・２Ｈ2Ｏ ２８．６ｇ硫酸カリウム ２３．４ｇ硫酸マグネシウム・７Ｈ2Ｏ ６．５ｇ水酸化カリウム Ｐｔｍ1微量塩類溶液 ６．０ｇ硫酸銅・５Ｈ2Ｏ ０．０８ｇヨウ化ナトリウム ３．０ｇ硫酸マンガン・Ｈ2Ｏ ０．２ｇモリブデン酸ナトリウム・Ｈ2Ｏ ０．０２ｇホウ酸 ０．５ｇ塩化コバルト ２０．０ｇ塩化亜鉛 ６５．０ｇ硫酸第一鉄・Ｈ2Ｏ ０．２０ｇビオチン ５．０ｍｌ硫酸 ＹＰＤ（酵母エキス−ペプトン−デキストロース培地） １０ｇバクト酵母エキス ２０ｇペプトン １０ｇデキストロース １Ｌとなる量の水 ＭＧＹ（最少グリセリン培地） １３．４ｇ酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含有、ア
ミノ酸不含 ４００μｇビオチン １０ｍｌグリセリン １Ｌとなる量の水 ＭＭ（最少メタノール培地） ＭＧＹと同じ、ただし１０ｍｌグリセリンの代わりに５
ｍｌメタノールを使用 ＳＤＲ（デキストロース補給リジェネレーション培地） １３．４ｇ酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含有、ア
ミノ酸不含 ４００μｇビオチン １８２ｇソルビトール １０ｇグルコース ２ｇヒスチジンアッセイミックス（ジブコ） ５０ｍｇグルタミン ５０ｍｇメチオニン ５０ｍｇリジン ５０ｍｇロイシン ５０ｍｇイソロイシン １０ｇアガロース １Ｌとなる量の水 ＢＭＧＲ（緩衝化最少グリセリン富化培地） １００ｍｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） １３．４ｇ／ｌ酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含有 ４００μｇ／ｌビオチン １０ｍｌ／ｌグリセリン アミノ酸 グルタミン酸、メチオニン、リジ
ン、ロイシンおよびイソロイシン：各５ｍｇ／ｌ；ヒス
チジン以外の他のアミノ酸はすべて１ｍｇ／ｌ ヌクレオチド 硫酸アデニン、塩酸グアニン、ウ
ラシルおよびキサンチン、各４０μｇ／ｌ ビタミン 塩酸チアミン、リボフラビンおよ
びパントテン酸カルシウム、各２μｇ／ｌ；塩酸ピリド
キシンおよびニコチン酸、各４μｇ／ｌ；塩酸ピリドキ
サミンおよび塩酸ピリドキサール、各１μｇ／ｌ；パラ
アミノ安息香酸、０．３μｇ／ｌ；葉酸、０．０３μｇ
／ｌ； 微量無機質 硫酸マグネシウム、８００μｇ／
ｌ；硫酸第一鉄、４０μｇ／ｌ；硫酸マンガン、８０μ
ｇ／ｌ；塩化ナトリウム、４０μｇ／ｌ； ＢＭＧＹ（緩衝化最少グリセリン複合培地） １００ｍｌ／ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０） １３．４ｇ／ｌ酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム含
有、アミノ酸不含 ビオチン、４００μｇ／ｌ グリセリン、１０ｍｌ／ｌ 酵母エキス、１０ｇ／ｌ ペプトン、２０ｇ／ｌ ＢＭＭＲ（緩衝化最少メタノール富化培地） ＢＭＧＲと同じ、ただしグリセリンの代わりにメタノー
ル５ｍｌ／ｌを添加 ＢＭＭＹ（緩衝化最少メタノール複合培地） ＢＭＧＹと同じ、ただしグリセリンの代わりにメタノー
ル５ｍｌ／ｌを添加方法 組換えＤＮＡ実験室作業に適した方法は多様な文献中に
見られ、それらには以下のものが含まれるがこれらに限
定されない：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ（フロリダ州オルランドー：アカデミック・プレス
社），特にＶｏｌ．１５２、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，
バーガーおよびキンメル（Ｂｅｇｅｒ，Ｋｉｍｍｅ
ｌ），（フロリダ州オルランドー：アカデミック・プレ
ス社，１９８７），ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ／Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，第２版（コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社，
１９８９）；これらすべてをここに参考として引用す
る。
【００４０】例１ ５′側イグザクトＨＳＡ発現ベクターｐＨＳＡ３１３の
構成 天然ＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロモーター）の３′
末端とＨＳＡ構造遺伝子の開始コドンとの間のイグザク
ト結合（ｅｘａｃｔ ｌｉｎｋａｇｅ）を含むベクター
を備えたｐＨＳＡ３１３ベクターを構成した。
構成 天然ＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロモーター）の３′
末端とＨＳＡ構造遺伝子の開始コドンとの間のイグザク
ト結合（ｅｘａｃｔ ｌｉｎｋａｇｅ）を含むベクター
を備えたｐＨＳＡ３１３ベクターを構成した。
【００４１】Ａ．ｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成 欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書（ここに参
考として引用する）に示されるｐＨＳＡ１１３（図７参
照）約２００ｎｇを、ＲＥａｃｔ１緩衝液２０μｌ中の
Ｃ１ａＩ １単位により３７℃で１時間消化した。消化
混合物を水で１００μｌとなし、等容量のフェノール：
クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１
Ｖ／Ｖ）で１回抽出し、次いで水層を等容量のクロロ
ホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し
た。ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍに調整し、３容量の冷エタ
ノールを添加することにより、水相中のＤＮＡを沈殿さ
せた。混合物を氷上（４℃）に１０分間放置し、ミクロ
遠心機により４℃において１０，０００×ｇで３０分間
遠心分離することによりＤＮＡ沈殿を採取した。ＤＮＡ
ペレットを７０％冷エタノール水溶液で２回洗浄した。
洗浄したペレットを真空乾燥し、１０μｌの水に溶解
し、これに２μｌの１０×リゲーション緩衝液、２μｌ
の１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、６μｌの水、および１単位の
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを添加した。混合物を４℃で一夜
インキュベートし、１０μｌアリコートを用いて大腸菌
ＤＧ７５′（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら）を形
質転換し、ｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。これはＨＩ
Ｓ４および３′側ＡＯＸ１、ならびにこれらの配列を結
合するのに用いた小範囲のｐＢＲ３２２配列の欠失を示
す。ＨＩＳ４、３′側ＡＯＸ１およびｐＢＲ３２２配列
の欠失により、ｐＨＳＡ１１３ベクター中に存在するＣ
ｓｐ４５Ｉ部位２カ所のうち１カ所が排除される。残り
のＣｓｐ４５Ｉ部位はＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロ
モーター）中にある。
考として引用する）に示されるｐＨＳＡ１１３（図７参
照）約２００ｎｇを、ＲＥａｃｔ１緩衝液２０μｌ中の
Ｃ１ａＩ １単位により３７℃で１時間消化した。消化
混合物を水で１００μｌとなし、等容量のフェノール：
クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１
Ｖ／Ｖ）で１回抽出し、次いで水層を等容量のクロロ
ホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し
た。ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍに調整し、３容量の冷エタ
ノールを添加することにより、水相中のＤＮＡを沈殿さ
せた。混合物を氷上（４℃）に１０分間放置し、ミクロ
遠心機により４℃において１０，０００×ｇで３０分間
遠心分離することによりＤＮＡ沈殿を採取した。ＤＮＡ
ペレットを７０％冷エタノール水溶液で２回洗浄した。
洗浄したペレットを真空乾燥し、１０μｌの水に溶解
し、これに２μｌの１０×リゲーション緩衝液、２μｌ
の１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、６μｌの水、および１単位の
Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを添加した。混合物を４℃で一夜
インキュベートし、１０μｌアリコートを用いて大腸菌
ＤＧ７５′（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら）を形
質転換し、ｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。これはＨＩ
Ｓ４および３′側ＡＯＸ１、ならびにこれらの配列を結
合するのに用いた小範囲のｐＢＲ３２２配列の欠失を示
す。ＨＩＳ４、３′側ＡＯＸ１およびｐＢＲ３２２配列
の欠失により、ｐＨＳＡ１１３ベクター中に存在するＣ
ｓｐ４５Ｉ部位２カ所のうち１カ所が排除される。残り
のＣｓｐ４５Ｉ部位はＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロ
モーター）中にある。
【００４２】Ｂ．ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成 ５μｇのｐＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、ＲＥａｃｔ２緩衝
液１００μｌ中のＢｓｔＥＩＩ １０単位により３７℃
で１時間消化した。消化混合物をフェノールで抽出し、
工程Ａの詳述に従って沈殿させた。ＤＮＡ沈殿をＣｓｐ
４５Ｉ緩衝液１００μｌに溶解し、１０単位のＣｓｐ４
５Ｉの存在下に３７℃で２時間消化した。次いで消化し
たＤＮＡをフェノール抽出し、工程Ａの詳述に従って沈
殿させた。ＤＮＡ沈殿を２０μｌの水に溶解し、１０μ
ｌアリコートを０．９％アガロースゲルの隣接ウェル２
個に装填した。電気泳動ののち、レーンの１つに対応す
るゲル部分を染色し、これを用いて未染色レーン中のｐ
ＨＳＡ１１３△Ｃ１ａのＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフ
ラグメントの位置を決定した。大きい方のＣｓｐ４５Ｉ
−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを含むゲル部分を切り出
し、ゲル中のＤＮＡを５００μｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）中へ電気泳動により溶出した（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。ＤＮＡ溶液を工程Ａの詳述に従
ってフェノール抽出し、ＤＮＡ沈殿を１００μｌの水に
溶解した。次いで大きい方のＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩ
Ｉフラグメントを下記のＢｓｔＥＩＩ−Ｃｓｐ４５Ｉオ
リゴヌクレオチドリンカーとリゲートした。アリコート
（１０μｌ）を４℃で一夜、２０ｎｇのアニールしたリ
ンカーオリゴヌクレオチド５′−ＣＧＡＡＡＣＧ ＡＴ
ＧＡＡＧ ＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）および
５′−ＧＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＴＴＴ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：５）と、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡお
よび１単位のＴ4ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩
衝液２０μｌ中においてリゲートした。リゲーション混
合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転換し、ｐＸＨＳ
Ａ１１３△Ｃ１ａを得た。ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａベ
クターは上記リンカーにより、外来ＤＮＡ配列を含まな
い天然ＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロモーター）の
３′末端とＨＳＡのＡＴＧ開始コドンとの間のイグザク
ト結合を有する。
液１００μｌ中のＢｓｔＥＩＩ １０単位により３７℃
で１時間消化した。消化混合物をフェノールで抽出し、
工程Ａの詳述に従って沈殿させた。ＤＮＡ沈殿をＣｓｐ
４５Ｉ緩衝液１００μｌに溶解し、１０単位のＣｓｐ４
５Ｉの存在下に３７℃で２時間消化した。次いで消化し
たＤＮＡをフェノール抽出し、工程Ａの詳述に従って沈
殿させた。ＤＮＡ沈殿を２０μｌの水に溶解し、１０μ
ｌアリコートを０．９％アガロースゲルの隣接ウェル２
個に装填した。電気泳動ののち、レーンの１つに対応す
るゲル部分を染色し、これを用いて未染色レーン中のｐ
ＨＳＡ１１３△Ｃ１ａのＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩＩフ
ラグメントの位置を決定した。大きい方のＣｓｐ４５Ｉ
−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを含むゲル部分を切り出
し、ゲル中のＤＮＡを５００μｌの５ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）中へ電気泳動により溶出した（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。ＤＮＡ溶液を工程Ａの詳述に従
ってフェノール抽出し、ＤＮＡ沈殿を１００μｌの水に
溶解した。次いで大きい方のＣｓｐ４５Ｉ−ＢｓｔＥＩ
Ｉフラグメントを下記のＢｓｔＥＩＩ−Ｃｓｐ４５Ｉオ
リゴヌクレオチドリンカーとリゲートした。アリコート
（１０μｌ）を４℃で一夜、２０ｎｇのアニールしたリ
ンカーオリゴヌクレオチド５′−ＣＧＡＡＡＣＧ ＡＴ
ＧＡＡＧ ＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）および
５′−ＧＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＴＴＴ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：５）と、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡお
よび１単位のＴ4ＤＮＡリガーゼを含有するリガーゼ緩
衝液２０μｌ中においてリゲートした。リゲーション混
合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転換し、ｐＸＨＳ
Ａ１１３△Ｃ１ａを得た。ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａベ
クターは上記リンカーにより、外来ＤＮＡ配列を含まな
い天然ＡＯＸ１ ５′側調節領域（プロモーター）の
３′末端とＨＳＡのＡＴＧ開始コドンとの間のイグザク
ト結合を有する。
【００４３】Ｃ．ｐＨＳＡ３１３の形成 １μｇのｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａをＲＥａｃｔ１緩衝
液１００μｌ中のＣ１ａＩにより３７℃で４時間消化し
た。消化後に反応混合物をアルカリホスファターゼ緩衝
液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファタ
ーゼで２００μｌの反応容量において３７℃で３０分間
処理した。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により
終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させ、約
１０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解し、−２０℃に保存し
た。
液１００μｌ中のＣ１ａＩにより３７℃で４時間消化し
た。消化後に反応混合物をアルカリホスファターゼ緩衝
液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファタ
ーゼで２００μｌの反応容量において３７℃で３０分間
処理した。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により
終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させ、約
１０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解し、−２０℃に保存し
た。
【００４４】１μｇのｐＡＯ８０７Ｎ（図８、その構成
は欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書に記載）
をＲＥａｃｔ２緩衝液１００μｌ中のＰｓｔＩにより３
７℃で４時間消化した。消化したＤＮＡをアルカリホス
ファターゼ緩衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アル
カリホスファターゼで２００μｌの反応容量において５
５℃で１５分間処理した。１５分間の終了時にさらに１
０単位のホスファターゼを添加し、１５分間インキュベ
ートした。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により
終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させた。
１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＲＥａｃｔ１緩衝
液１００μｌ中のＣ１ａＩ ５単位によりＤＮＡを３７
℃で４時間消化し、工程Ａの記載に従ってフェノール抽
出し、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を約２０ｎｇ／
μｌの濃度で水に溶解した。
は欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書に記載）
をＲＥａｃｔ２緩衝液１００μｌ中のＰｓｔＩにより３
７℃で４時間消化した。消化したＤＮＡをアルカリホス
ファターゼ緩衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アル
カリホスファターゼで２００μｌの反応容量において５
５℃で１５分間処理した。１５分間の終了時にさらに１
０単位のホスファターゼを添加し、１５分間インキュベ
ートした。ホスファターゼ処理をフェノール抽出により
終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させた。
１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＲＥａｃｔ１緩衝
液１００μｌ中のＣ１ａＩ ５単位によりＤＮＡを３７
℃で４時間消化し、工程Ａの記載に従ってフェノール抽
出し、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を約２０ｎｇ／
μｌの濃度で水に溶解した。
【００４５】約１００ｎｇ（１０μｌ）のＣ１ａＩ開裂
−ホスファターゼ処理ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、約
８０ｎｇのＰｓｔＩ消化−ホスファターゼ処理およびＣ
１ａＩ開裂−ｐＡＯ８０７Ｎ（４μｌ）、４μｌの５×
リガーゼ緩衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡと混合
し、１単位のＴ4ＤＮＡリガーゼをを用いて４℃で一夜
リゲートした。リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ
７５′を形質転換し、ｐＨＳＡ３１３を得た。このリゲ
ーションによるｐＨＳＡ３１３プラスミドは、ＨＩＳ４
遺伝子およびＡＯＸ１ ３′側第２挿入性配列（ＡＯ８
０７Ｎ由来）に結合した完全ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ
配列を含む。ｐＨＳＡ３１３プラスミドのこれらの成分
の相対配向は図７にｐＨＳＡ１１３プラスミドにつき示
したものと同じである。
−ホスファターゼ処理ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、約
８０ｎｇのＰｓｔＩ消化−ホスファターゼ処理およびＣ
１ａＩ開裂−ｐＡＯ８０７Ｎ（４μｌ）、４μｌの５×
リガーゼ緩衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡと混合
し、１単位のＴ4ＤＮＡリガーゼをを用いて４℃で一夜
リゲートした。リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ
７５′を形質転換し、ｐＨＳＡ３１３を得た。このリゲ
ーションによるｐＨＳＡ３１３プラスミドは、ＨＩＳ４
遺伝子およびＡＯＸ１ ３′側第２挿入性配列（ＡＯ８
０７Ｎ由来）に結合した完全ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ
配列を含む。ｐＨＳＡ３１３プラスミドのこれらの成分
の相対配向は図７にｐＨＳＡ１１３プラスミドにつき示
したものと同じである。
【００４６】例２ 発現ベクターｐＰＧＰ１の構成 発現ベクターｐＰＧＰ１を下記に従って構成した。ｐＸ
ＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ（例１参照）をＢｓｕ３６Ｉおよ
びＰｖｕＩＩ（部分）で消化し、ベクター主鎖を単離し
た。ｐＨＳＡ１１３（欧州特許出願第０ ３４４ ４５
９号明細書に記載）に含まれる構造遺伝子に類似のＰｖ
ｕＩＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ上のＨＳＡ構造遺伝子をこのベク
ター主鎖にリゲートしてｐＰＧＰ１△Ｃ１ａを得た。約
１００ｎｇのｐＰＧＰ１△Ｃ１ａをＣ１ａＩにより３７
℃で１時間消化した。例１に従ってＤＮＡを採取した。
約１００ｎｇのｐＡＯ８０７Ｎ（本明細書の図８に示
し、欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書に記
載）をＰｓｔＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理
し、次いで例１Ｃの詳述に従ってＣ１ａＩで消化した。
次いでこのフラグメントをＣ１ａＩ消化−アルカリホス
ファターゼ処理ｐＰＧＰ１△Ｃ１ａにリゲートしてｐＰ
ＧＰ１を得た。（ＧＳ１１５ ｐＰＧＰ１−９−６はピ
チア・パストリスＧＳ１１５をｐＰＧＰ１で形質転換す
ることにより得たクローンであり、このクローンを発酵
に用いた。）例３ ５′側および３′側イグザクトＨＳＡ発現プラスミドｐ
ＨＳＡ４１３の構成 ＡＯＸ１ ５′側調節領域の３′末端とＨＳＡ構造遺伝
子の開始コドンとの間のイグザクト結合、およびＡＯＸ
１ ３′側ターミネーション配列の５′末端とＨＳＡ構
造遺伝子の３′末端との間のイグザクト結合を有するベ
クターを提供するｐＨＳＡ４１３ベクターを構成した。
ＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ（例１参照）をＢｓｕ３６Ｉおよ
びＰｖｕＩＩ（部分）で消化し、ベクター主鎖を単離し
た。ｐＨＳＡ１１３（欧州特許出願第０ ３４４ ４５
９号明細書に記載）に含まれる構造遺伝子に類似のＰｖ
ｕＩＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ上のＨＳＡ構造遺伝子をこのベク
ター主鎖にリゲートしてｐＰＧＰ１△Ｃ１ａを得た。約
１００ｎｇのｐＰＧＰ１△Ｃ１ａをＣ１ａＩにより３７
℃で１時間消化した。例１に従ってＤＮＡを採取した。
約１００ｎｇのｐＡＯ８０７Ｎ（本明細書の図８に示
し、欧州特許出願第０ ３４４ ４５９号明細書に記
載）をＰｓｔＩで消化し、アルカリホスファターゼ処理
し、次いで例１Ｃの詳述に従ってＣ１ａＩで消化した。
次いでこのフラグメントをＣ１ａＩ消化−アルカリホス
ファターゼ処理ｐＰＧＰ１△Ｃ１ａにリゲートしてｐＰ
ＧＰ１を得た。（ＧＳ１１５ ｐＰＧＰ１−９−６はピ
チア・パストリスＧＳ１１５をｐＰＧＰ１で形質転換す
ることにより得たクローンであり、このクローンを発酵
に用いた。）例３ ５′側および３′側イグザクトＨＳＡ発現プラスミドｐ
ＨＳＡ４１３の構成 ＡＯＸ１ ５′側調節領域の３′末端とＨＳＡ構造遺伝
子の開始コドンとの間のイグザクト結合、およびＡＯＸ
１ ３′側ターミネーション配列の５′末端とＨＳＡ構
造遺伝子の３′末端との間のイグザクト結合を有するベ
クターを提供するｐＨＳＡ４１３ベクターを構成した。
【００４７】Ａ．ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａの形成 １μｇのｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、ＲＥａｃｔ３緩
衝液１００μｌ中のＥｃｏＲＩ １０単位により３７℃
で４時間消化した。消化混合物をフェノール抽出し、例
１の詳述に従ってＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を２
０μｌの水に溶解し、Ｂｓｕ３６Ｉ緩衝液１００μｌ中
のＢｓｕ３６Ｉ ２０単位により３７℃で１時間消化し
た。消化混合物をフェノール抽出し、例１の詳述に従っ
てＤＮＡを沈殿させ、１００μｌの水に溶解した。約１
００ｎｇのＥｃｏＲＩおよびＢｓｕ３６Ｉ開裂ＤＮＡ
を、１０ｎｇのアニールしたオリゴヌクレオチド５′−
ＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６）および５′−ＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＧＣＣ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：７）と混合し、１００μｇ／ｍｌのＢ
ＳＡおよび１０単位のＴ4ＤＮＡリガーゼを含有するＴ4
ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌ中において４℃で一夜リ
ゲート（ｌｉｇａｔｅ）した。リゲーション混合物（ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）を用いて大腸菌を形
質転換し、ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。このプ
ラスミドにおいては、ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ中に存
在するＢｓｕ３６ＩとＥｃｏＲＩの間の下記配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤＮＯ：８）： が下記の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）により置換さ
れている： ５′−ＣＣ ＴＴＡ ＧＧＣ ＴＴＡ ＴＡＡ ＧＡＡＴＴＣ Ｂｓｕ３６Ｉ ＥｃｏＲＩＢ．ｐＨＳＡ４１３の形成 １μｇのｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａをＲＥａｃｔ１緩
衝液１００μｌ中のＣ１ａＩにより３７℃で４時間消化
した。消化後に反応混合物をアルカリホスファターゼ緩
衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファ
ターゼで２００μｌの反応容量において３７℃で３０分
間処理した。ホスファターゼ処理をフェノール抽出によ
り終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させ、
約１０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解し、−２０℃に保存
した。
衝液１００μｌ中のＥｃｏＲＩ １０単位により３７℃
で４時間消化した。消化混合物をフェノール抽出し、例
１の詳述に従ってＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡ沈殿を２
０μｌの水に溶解し、Ｂｓｕ３６Ｉ緩衝液１００μｌ中
のＢｓｕ３６Ｉ ２０単位により３７℃で１時間消化し
た。消化混合物をフェノール抽出し、例１の詳述に従っ
てＤＮＡを沈殿させ、１００μｌの水に溶解した。約１
００ｎｇのＥｃｏＲＩおよびＢｓｕ３６Ｉ開裂ＤＮＡ
を、１０ｎｇのアニールしたオリゴヌクレオチド５′−
ＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６）および５′−ＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＧＣＣ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：７）と混合し、１００μｇ／ｍｌのＢ
ＳＡおよび１０単位のＴ4ＤＮＡリガーゼを含有するＴ4
ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μｌ中において４℃で一夜リ
ゲート（ｌｉｇａｔｅ）した。リゲーション混合物（ｌ
ｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）を用いて大腸菌を形
質転換し、ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを得た。このプ
ラスミドにおいては、ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ中に存
在するＢｓｕ３６ＩとＥｃｏＲＩの間の下記配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤＮＯ：８）： が下記の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）により置換さ
れている： ５′−ＣＣ ＴＴＡ ＧＧＣ ＴＴＡ ＴＡＡ ＧＡＡＴＴＣ Ｂｓｕ３６Ｉ ＥｃｏＲＩＢ．ｐＨＳＡ４１３の形成 １μｇのｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａをＲＥａｃｔ１緩
衝液１００μｌ中のＣ１ａＩにより３７℃で４時間消化
した。消化後に反応混合物をアルカリホスファターゼ緩
衝液条件に調整し、１０単位のウシ腸アルカリホスファ
ターゼで２００μｌの反応容量において３７℃で３０分
間処理した。ホスファターゼ処理をフェノール抽出によ
り終結させ、工程Ａの記載に従ってＤＮＡを沈殿させ、
約１０ｎｇ／μｌの濃度で水に溶解し、−２０℃に保存
した。
【００４８】約１００ｎｇ（１０μｌ）のＣ１ａＩ開裂
−ホスファターゼ処理ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、
約８０ｎｇ（４μｌ）のＰｓｔＩ消化−ホスファターゼ
処理およびＣ１ａＩ開裂−ｐＡＯ８０７Ｎ（例１の工程
３、第２節を参照されたい）、４μｌの５×リガーゼ緩
衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌＢＳＡと混合し、１単位の
Ｔ4ＤＮＡリガーゼを用いて４℃で一夜リゲートした。
リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転
換し、ｐＨＳＡ４１３を得た。このリゲーションによる
ｐＨＳＡ４１３プラスミドは、ＨＩＳ４遺伝子およびＡ
ＯＸ１ ３′側第２挿入性配列（ＡＯ８０７Ｎ由来）に
結合した完全ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ配列を含む。ｐ
ＨＳＡ３１３プラスミドのこれらの成分の相対配向は図
７にプラスミドｐＨＳＡ１１３につき示したものと同じ
である。
−ホスファターゼ処理ｐＸＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａを、
約８０ｎｇ（４μｌ）のＰｓｔＩ消化−ホスファターゼ
処理およびＣ１ａＩ開裂−ｐＡＯ８０７Ｎ（例１の工程
３、第２節を参照されたい）、４μｌの５×リガーゼ緩
衝液、２μｌの１ｍｇ／ｍｌＢＳＡと混合し、１単位の
Ｔ4ＤＮＡリガーゼを用いて４℃で一夜リゲートした。
リゲーション混合物を用いて大腸菌ＤＧ７５′を形質転
換し、ｐＨＳＡ４１３を得た。このリゲーションによる
ｐＨＳＡ４１３プラスミドは、ＨＩＳ４遺伝子およびＡ
ＯＸ１ ３′側第２挿入性配列（ＡＯ８０７Ｎ由来）に
結合した完全ｐＸＨＳＡ１１３△Ｃ１ａ配列を含む。ｐ
ＨＳＡ３１３プラスミドのこれらの成分の相対配向は図
７にプラスミドｐＨＳＡ１１３につき示したものと同じ
である。
【００４９】例４ ｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＰＧＰ１によ
るピチア・パストリスの形質転換 Ａ．ベクターの調製 それぞれ約１０μｇのｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１
３、ｐＰＧＰ１およびｐＡＯ８０７Ｎ（陰性対照）をＨ
Ｓ緩衝液２００μｌ中において、５０単位のＮｏｔＩに
より３７℃で１２時間消化した。消化したＤＮＡ試料を
フェノール抽出し、例１の記載に従って沈殿させ、２０
μｌのＣａＳに溶解し、次いでピチア・パストリスＧＳ
１１５の形質転換に用いた。同様にそれぞれ約１０μｇ
のｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＡＯ８０７
Ｎを、２０単位のＳｓｔＩにより、１００μｇ／ｍｌの
ＢＳＡを含むＲＥａｃｔ２緩衝液２００μｌ中において
３７℃で１２時間消化した。消化したＤＮＡ試料をフェ
ノール抽出し、例１の記載に従って沈殿させ、２０μｌ
のＣａＳに溶解した。
るピチア・パストリスの形質転換 Ａ．ベクターの調製 それぞれ約１０μｇのｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１
３、ｐＰＧＰ１およびｐＡＯ８０７Ｎ（陰性対照）をＨ
Ｓ緩衝液２００μｌ中において、５０単位のＮｏｔＩに
より３７℃で１２時間消化した。消化したＤＮＡ試料を
フェノール抽出し、例１の記載に従って沈殿させ、２０
μｌのＣａＳに溶解し、次いでピチア・パストリスＧＳ
１１５の形質転換に用いた。同様にそれぞれ約１０μｇ
のｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＡＯ８０７
Ｎを、２０単位のＳｓｔＩにより、１００μｇ／ｍｌの
ＢＳＡを含むＲＥａｃｔ２緩衝液２００μｌ中において
３７℃で１２時間消化した。消化したＤＮＡ試料をフェ
ノール抽出し、例１の記載に従って沈殿させ、２０μｌ
のＣａＳに溶解した。
【００５０】Ｂ．細胞の増殖 ピチア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８
５１）を約１０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で１
２−２０時間振盪培養した。１００ｍｌのＹＰＤ培地に
種培養物を接種して、約０．００１のＯＤ600を得た。
この培地を振盪フラスコ中において３０℃で約１２−２
０時間培養した。ＯＤ600が約０．２−０．３となった
時点で、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＢ５Ｃを用いて
１５５５ｇで５分間遠心分離することにより培養物を採
取した。
５１）を約１０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、３０℃で１
２−２０時間振盪培養した。１００ｍｌのＹＰＤ培地に
種培養物を接種して、約０．００１のＯＤ600を得た。
この培地を振盪フラスコ中において３０℃で約１２−２
０時間培養した。ＯＤ600が約０．２−０．３となった
時点で、ソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＢ５Ｃを用いて
１５５５ｇで５分間遠心分離することにより培養物を採
取した。
【００５１】Ｃ．スフェロプラストの調製 細胞を１０ｍｌの滅菌水で洗浄し、次いで１５００ｇで
５分間遠心分離した。（遠心分離は特に指示しない限
り、各細胞洗浄ののち、ソルバルＲＴ６０００Ｂを用い
て１５００ｇで５分間行う。）細胞を１０ｍｌの新たに
調製したＳＥＤ中で１回、１０ｍｌの無菌１Ｍソルビト
ール中で１回洗浄し、最後に１０ｍｌのＳＣＥ緩衝液に
再懸濁した。７．５μｌの３ｍｇ／ｍｌチモリアーゼ
（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）（１００，０００単位／ｇ、マ
イルズ・ラボラトリーズより入手）を細胞懸濁液に添加
した。細胞を３０℃で約１０分間インキュベートした。
（５％ＳＤＳ中におけるＯＤ600の６０％低下を正確な
時間マーカーとして利用しうる。）スフェロプラストを
１０ｍｌの無菌１Ｍソルビトール中において７００ｇで
５−１０分間遠心分離することにより洗浄した。１０ｍ
ｌの無菌ＣａＳを細胞の最終洗浄液として用い、細胞を
再度７００ｇで５−１０分間遠心分離し、次いで０．６
ｍｌのＣａＳに再懸濁した。
５分間遠心分離した。（遠心分離は特に指示しない限
り、各細胞洗浄ののち、ソルバルＲＴ６０００Ｂを用い
て１５００ｇで５分間行う。）細胞を１０ｍｌの新たに
調製したＳＥＤ中で１回、１０ｍｌの無菌１Ｍソルビト
ール中で１回洗浄し、最後に１０ｍｌのＳＣＥ緩衝液に
再懸濁した。７．５μｌの３ｍｇ／ｍｌチモリアーゼ
（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）（１００，０００単位／ｇ、マ
イルズ・ラボラトリーズより入手）を細胞懸濁液に添加
した。細胞を３０℃で約１０分間インキュベートした。
（５％ＳＤＳ中におけるＯＤ600の６０％低下を正確な
時間マーカーとして利用しうる。）スフェロプラストを
１０ｍｌの無菌１Ｍソルビトール中において７００ｇで
５−１０分間遠心分離することにより洗浄した。１０ｍ
ｌの無菌ＣａＳを細胞の最終洗浄液として用い、細胞を
再度７００ｇで５−１０分間遠心分離し、次いで０．６
ｍｌのＣａＳに再懸濁した。
【００５２】Ｄ．形質転換 ピチア・パストリスＧＳ１１５細胞を１０μｇの線状Ｄ
ＮＡ（工程Ａ参照）により、スリークリシュナ（Ｓｒｅ
ｅｋｒｉｓｈｎａ）ら，Ｇｅｎｅ５９，１１５−１２５
（１９８７）のスフェロプラスト形質転換法によって形
質転換した。ＤＮＡ試料を１２×７５ｍｍの無菌ポリプ
ロピレン試験管に添加した（２０μｌの容量となるま
で）。（ＤＮＡは適切な緩衝液、たとえばＴＥ緩衝液、
またはＣａＳ中に含有すべきである。）１００μｌのス
フェロプラストを各ＤＮＡ試料に添加し、室温で約２０
分間インキュベートした。１ｍｌのＰＥＧ溶液を各試料
に添加し、室温で約１５分間インキュベートし、７００
ｇで５−１０分間遠心分離した。ＳＯＳ（１５０μｌ）
をペレットに添加し、室温で約３０分間インキュベート
した。最後に８５０μｌの１Ｍソルビトールを添加し
た。
ＮＡ（工程Ａ参照）により、スリークリシュナ（Ｓｒｅ
ｅｋｒｉｓｈｎａ）ら，Ｇｅｎｅ５９，１１５−１２５
（１９８７）のスフェロプラスト形質転換法によって形
質転換した。ＤＮＡ試料を１２×７５ｍｍの無菌ポリプ
ロピレン試験管に添加した（２０μｌの容量となるま
で）。（ＤＮＡは適切な緩衝液、たとえばＴＥ緩衝液、
またはＣａＳ中に含有すべきである。）１００μｌのス
フェロプラストを各ＤＮＡ試料に添加し、室温で約２０
分間インキュベートした。１ｍｌのＰＥＧ溶液を各試料
に添加し、室温で約１５分間インキュベートし、７００
ｇで５−１０分間遠心分離した。ＳＯＳ（１５０μｌ）
をペレットに添加し、室温で約３０分間インキュベート
した。最後に８５０μｌの１Ｍソルビトールを添加し
た。
【００５３】Ｅ．スフェロプラストのリジェネレーショ
ン 形質転換試料を用意する少なくとも３０分前に、平板当
たり２０ｍｌのリジェネレーション用寒天ＳＤＲの底部
アガロース層を注入した。さらに、形質転換試料がＳＯ
Ｓ中にある期間中に、４５℃の水浴中の１５ｍｌコニカ
ルボトム型コーニング試験管に８ｍｌアリコートのリジ
ェネレーション用寒天を分配した。形質転換した試料５
０または２５０μｌアリコートを４５℃に保持された溶
融リジェネレーション用寒天８ｍｌアリコートに添加
し、２０ｍｌ固形底部寒天層を含む平板上に注入した。
これらの平板を３０℃で３−５日間インキュベートし
た。
ン 形質転換試料を用意する少なくとも３０分前に、平板当
たり２０ｍｌのリジェネレーション用寒天ＳＤＲの底部
アガロース層を注入した。さらに、形質転換試料がＳＯ
Ｓ中にある期間中に、４５℃の水浴中の１５ｍｌコニカ
ルボトム型コーニング試験管に８ｍｌアリコートのリジ
ェネレーション用寒天を分配した。形質転換した試料５
０または２５０μｌアリコートを４５℃に保持された溶
融リジェネレーション用寒天８ｍｌアリコートに添加
し、２０ｍｌ固形底部寒天層を含む平板上に注入した。
これらの平板を３０℃で３−５日間インキュベートし
た。
【００５４】Ｆ．形質転換体の選択 ヒスチジンを欠如する培地ＳＤＲ上で培養することによ
り形質転換体を選択した。ＮｏｔＩ線状ベクターを用い
て得た形質転換体の場合は、ヒスチジンの不在下で増殖
したコロニーを″メタノール−スロー″表現型（Ｎｏｔ
Ｉ ＤＮＡフラグメントによるＡＯＸ１構造遺伝子の置
換を示す）についてもスクリーニングした。次いで″メ
タノール−ノーマル″（ＳｓｔＩ線状ＤＮＡを用いて得
たもの）およびメタノール−スローを示す数種類の形質
転換ＧＳ１１５細胞を培養し、ＨＳＡの産生につきアッ
セイした。
り形質転換体を選択した。ＮｏｔＩ線状ベクターを用い
て得た形質転換体の場合は、ヒスチジンの不在下で増殖
したコロニーを″メタノール−スロー″表現型（Ｎｏｔ
Ｉ ＤＮＡフラグメントによるＡＯＸ１構造遺伝子の置
換を示す）についてもスクリーニングした。次いで″メ
タノール−ノーマル″（ＳｓｔＩ線状ＤＮＡを用いて得
たもの）およびメタノール−スローを示す数種類の形質
転換ＧＳ１１５細胞を培養し、ＨＳＡの産生につきアッ
セイした。
【００５５】例５ ピチア・パストリスのインテグラティブ形質転換体にお
けるメタノール誘導ＨＳＡ分泌 ｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＰＧＰ１を用
いて形質転換したピチア・パストリスＧＳ１１５株を振
盪試験管培養においてＨＳＡ分泌につき分析した。メタ
ノール−スローおよびメタノール−ノーマル双方の株を
用いた。それぞれの場合、３６の独立コロニーを試験し
た。ｐＡＯ８０７Ｎを用いて得た形質転換体を陰性対照
とした。培地中へのＨＳＡの効果的な分泌および安定な
蓄積を保証するためのプロトコールを開発した。
けるメタノール誘導ＨＳＡ分泌 ｐＨＳＡ３１３、ｐＨＳＡ４１３およびｐＰＧＰ１を用
いて形質転換したピチア・パストリスＧＳ１１５株を振
盪試験管培養においてＨＳＡ分泌につき分析した。メタ
ノール−スローおよびメタノール−ノーマル双方の株を
用いた。それぞれの場合、３６の独立コロニーを試験し
た。ｐＡＯ８０７Ｎを用いて得た形質転換体を陰性対照
とした。培地中へのＨＳＡの効果的な分泌および安定な
蓄積を保証するためのプロトコールを開発した。
【００５６】細胞を５０ｍｌの試験管に入れた１０ｍｌ
のＢＭＧＲまたはＢＭＧＹ中で飽和に達するまで増殖さ
せた（２−３日間）。細胞は１０−２０Ａ600単位であ
る。細胞を採取し、上澄液を廃棄し、次いでペレットを
２ｍｌのＢＭＭＲまたはＢＭＭＹに再懸濁した。試験管
にキャップの代わりに無菌ガーゼ（チーズクロス）で蓋
をした。次いで試験管を３０℃の振盪機に戻した。２−
３日間の終了時に細胞をペレット化し、上澄液を産生物
につきアッセイした。ペレットを新鮮な培地で再懸濁
し、新たな分泌のために振盪機へ戻すことができる。ピ
チア−ＨＳＡ株については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで
クマシー染色による分析のために、１０μｌの培地上澄
液で十分であった。これらの条件下でＨＳＡに対応する
６７ｋＤの単一バンドが認められた。形質転換体ＧＳ１
１５／ｐＨＳＡ３１３とＧＳ１１５／ｐＨＳＡ４１３の
発現水準に有為差はなく、これはｐＨＳＡ３１３中に存
在するＨＳＡ遺伝子からの３′側非翻訳配列の欠失は発
現水準に有為に影響を与えないことを示す。メタノール
−スローとメタノール−ノーマルの形質転換体間にＨＳ
Ａ発現水準の有為差は認められず、これはＡＯＸ１の分
断が効果的ＨＳＡ発現にとって本質的でないことを示
す。予想どおりＧＳ１１５／ｐＡＯ８０７Ｎ形質転換体
（陰性対照）の培地および細胞抽出液のいずれにもＨＳ
Ａは存在しなかった。ＨＳＡ分泌水準の上昇を示した変
異クローンを選択した。
のＢＭＧＲまたはＢＭＧＹ中で飽和に達するまで増殖さ
せた（２−３日間）。細胞は１０−２０Ａ600単位であ
る。細胞を採取し、上澄液を廃棄し、次いでペレットを
２ｍｌのＢＭＭＲまたはＢＭＭＹに再懸濁した。試験管
にキャップの代わりに無菌ガーゼ（チーズクロス）で蓋
をした。次いで試験管を３０℃の振盪機に戻した。２−
３日間の終了時に細胞をペレット化し、上澄液を産生物
につきアッセイした。ペレットを新鮮な培地で再懸濁
し、新たな分泌のために振盪機へ戻すことができる。ピ
チア−ＨＳＡ株については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで
クマシー染色による分析のために、１０μｌの培地上澄
液で十分であった。これらの条件下でＨＳＡに対応する
６７ｋＤの単一バンドが認められた。形質転換体ＧＳ１
１５／ｐＨＳＡ３１３とＧＳ１１５／ｐＨＳＡ４１３の
発現水準に有為差はなく、これはｐＨＳＡ３１３中に存
在するＨＳＡ遺伝子からの３′側非翻訳配列の欠失は発
現水準に有為に影響を与えないことを示す。メタノール
−スローとメタノール−ノーマルの形質転換体間にＨＳ
Ａ発現水準の有為差は認められず、これはＡＯＸ１の分
断が効果的ＨＳＡ発現にとって本質的でないことを示
す。予想どおりＧＳ１１５／ｐＡＯ８０７Ｎ形質転換体
（陰性対照）の培地および細胞抽出液のいずれにもＨＳ
Ａは存在しなかった。ＨＳＡ分泌水準の上昇を示した変
異クローンを選択した。
【００５７】例６ ＨＳＡ産生のためのＭｕｔ-ピチア・パストリスのバッ
チ供給式発酵 ピチア・パストリスＧＳ１１５：ｐＨＳＡ ４１３−６
およびｐＰＧＰ１−９−６を作業容量８．５リットルの
２０リットル容バイオラフィッテ（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔ
ｅ）発酵槽２個に接種した。接種物は下記の方法で調製
された：培養物をＹＭ平板上で増殖させ、次いで振盪フ
ラスコ中のＹＭブロス１００ｍｌに移し、約２４時間増
殖させた。この培養物５０ｍｌを振盪フラスコ中のＹＭ
ブロス１リットルに移し、同様に約２４時間増殖させ
た。次いでこの１リットルをバイオラフィッテ発酵槽中
の発酵培地８．５リットルに移した。発酵培地は最少塩
類＋ビオチン＋５％グリセリンからなっていた。バッチ
増殖条件には下記のものが含まれる：ｐＨ＝５．８（Ｎ
Ｈ3で調整）、温度＝３０℃、および空気飽和２０％以
上の溶存酸素。
チ供給式発酵 ピチア・パストリスＧＳ１１５：ｐＨＳＡ ４１３−６
およびｐＰＧＰ１−９−６を作業容量８．５リットルの
２０リットル容バイオラフィッテ（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔ
ｅ）発酵槽２個に接種した。接種物は下記の方法で調製
された：培養物をＹＭ平板上で増殖させ、次いで振盪フ
ラスコ中のＹＭブロス１００ｍｌに移し、約２４時間増
殖させた。この培養物５０ｍｌを振盪フラスコ中のＹＭ
ブロス１リットルに移し、同様に約２４時間増殖させ
た。次いでこの１リットルをバイオラフィッテ発酵槽中
の発酵培地８．５リットルに移した。発酵培地は最少塩
類＋ビオチン＋５％グリセリンからなっていた。バッチ
増殖条件には下記のものが含まれる：ｐＨ＝５．８（Ｎ
Ｈ3で調整）、温度＝３０℃、および空気飽和２０％以
上の溶存酸素。
【００５８】約２４時間後にグリセリン消費が完了し、
この時点で１０−１５ｍｌ／時の量で緩徐なメタノール
供給を開始した。発酵槽中のメタノール濃度を監視し、
ブロス中のメタノール濃度０．５−０．９％を維持すべ
く供給量を調整した。
この時点で１０−１５ｍｌ／時の量で緩徐なメタノール
供給を開始した。発酵槽中のメタノール濃度を監視し、
ブロス中のメタノール濃度０．５−０．９％を維持すべ
く供給量を調整した。
【００５９】クマシーブルー染色したＳＤＳ含有ポリア
クリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の濃度測定によ
り、培地中に分泌されたＨＳＡを定量した。領域は同じ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で実験した一連の既知重量の真
正ＨＳＡを参考にした。これらのゲルから得たデータを
表３および４に示す。
クリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の濃度測定によ
り、培地中に分泌されたＨＳＡを定量した。領域は同じ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で実験した一連の既知重量の真
正ＨＳＡを参考にした。これらのゲルから得たデータを
表３および４に示す。
【００６０】次表はｐＨ変化がＨＳＡ産生量に及ぼす影
響を示す：
響を示す：
【表３】バッチ供給式発酵によるＨＳＡ産生 実験 菌株 ｐＨ ＨＳＡ g/l １ GS115:pPGP1-9-6 ５．２２−５．３２ ０．７１ ２ GS115:pPGP1-9-6 ５．２２ ０．８１ ３ GS115:pPGP1-9-6 ５．９１ １．２８ ４ GS115:pPGP1-9-6 ５．７８ １．５９ ５ GS115:pPGP1-9-6 ５．７８ １．９８ ６ GS115:pPGP1-9-6 ５．７９ １．３２ 次表は比較的高いｐＨ水準において達成されるＨＳＡ産
生水準を示す：
生水準を示す：
【表４】バッチ供給式発酵によるＨＳＡ産生 MeOH 乾燥細胞 ブロス中の実験 菌株 pH 時間 重量 HSA g/l 1 GS115:pHSA 413-6 5.79 101 ND 2.13 2 GS115:pHSA 413-6 5.85 237 101 3.39 3 GS115:pHSA 413-6 5.85 265 98 2.70 4 GS115:pHSA 413-6 5.97 258 117 2.90 ＮＤ＝測定せず例７ ピチア・パストリスからの振盪試験管および振盪フラス
コ内蛋白質分泌に関するプロトコール 振盪試験管および振盪フラスコ内でのＨＳＡの効果的な
分泌および安定な蓄積のためには、発酵培地について
５．０または５．２の代わりに５．７−６．４のｐＨを
用い、発酵槽培地に少量の酵母エキス（０．５−０．１
％）およびペプトン（０．１−０．２％）を添加し、低
い細胞密度（乾燥細胞重量２０−２５ｇ／ｌ）において
発現を誘発することが必要である。これらの方法を利用
して、本発明者らは振盪試験管およびフラスコ内で増殖
する細胞からＨＳＡを効果的に分泌させうるプロトコー
ルを開発した。このプロトコールはピチア・パストリス
からの蛋白質の分泌一般に利用しうると考えられる。
コ内蛋白質分泌に関するプロトコール 振盪試験管および振盪フラスコ内でのＨＳＡの効果的な
分泌および安定な蓄積のためには、発酵培地について
５．０または５．２の代わりに５．７−６．４のｐＨを
用い、発酵槽培地に少量の酵母エキス（０．５−０．１
％）およびペプトン（０．１−０．２％）を添加し、低
い細胞密度（乾燥細胞重量２０−２５ｇ／ｌ）において
発現を誘発することが必要である。これらの方法を利用
して、本発明者らは振盪試験管およびフラスコ内で増殖
する細胞からＨＳＡを効果的に分泌させうるプロトコー
ルを開発した。このプロトコールはピチア・パストリス
からの蛋白質の分泌一般に利用しうると考えられる。
【００６１】振盪試験管：細胞を５０ｍｌの試験管に入
れた１０ｍｌのＢＭＧＲまたはＢＭＧＹ中で飽和に達す
るまで増殖させた（２−３日間）。細胞のＡ600は１０
−２０単位である。細胞を採取し、上澄液を廃棄し、ペ
レットを２ｍｌのＢＭＭＲまたはＢＭＭＹに再懸濁し
た。試験管にキャップの代わりに無菌ガーゼ（チーズク
ロス）で蓋をした。試験管を振盪機に戻し、振盪機を約
３０℃に保持した。２−３日間の終了時に細胞をペレッ
ト化し、上澄液を産生物につき分析した。ペレットを新
鮮な培地で再懸濁し、新たな分泌のために振盪機へ戻す
ことができる。ピチア−ＨＳＡ株については、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ、次いでクマシー染色による分析のために、１
０μｌの培地上澄液で十分であった。これらの条件下で
ＨＳＡサイズ（６７ｋＤ）に対応する単一バンドが認め
られた。
れた１０ｍｌのＢＭＧＲまたはＢＭＧＹ中で飽和に達す
るまで増殖させた（２−３日間）。細胞のＡ600は１０
−２０単位である。細胞を採取し、上澄液を廃棄し、ペ
レットを２ｍｌのＢＭＭＲまたはＢＭＭＹに再懸濁し
た。試験管にキャップの代わりに無菌ガーゼ（チーズク
ロス）で蓋をした。試験管を振盪機に戻し、振盪機を約
３０℃に保持した。２−３日間の終了時に細胞をペレッ
ト化し、上澄液を産生物につき分析した。ペレットを新
鮮な培地で再懸濁し、新たな分泌のために振盪機へ戻す
ことができる。ピチア−ＨＳＡ株については、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ、次いでクマシー染色による分析のために、１
０μｌの培地上澄液で十分であった。これらの条件下で
ＨＳＡサイズ（６７ｋＤ）に対応する単一バンドが認め
られた。
【００６２】振盪フラスコ：細胞を上記に従って２リッ
トルのフラスコ中の１リットルの培地（ＢＭＧＲまたは
ＢＭＧＹ）中で増殖させた。細胞を採取し、発酵フラス
コ（チューンエア（Ｔｕｎａｉｒ、商標）振盪フラスコ
発酵システム、リサーチ・プロダクツ・インタナショナ
ル・コーポレーション）またはチーズクロスで蓋をした
バフル付きフラスコ中のＢＭＭＲまたはＢＭＭＹ５０−
７５ｍｌに懸濁した。３０℃の振盪機に戻し、２−４日
間誘導した。２−４日間の終了時に細胞をペレット化
し、上澄液を産生物につき分析した。ペレット化した細
胞を新鮮な培地に再懸濁することにより、振盪試験管分
泌を再開することができる。
トルのフラスコ中の１リットルの培地（ＢＭＧＲまたは
ＢＭＧＹ）中で増殖させた。細胞を採取し、発酵フラス
コ（チューンエア（Ｔｕｎａｉｒ、商標）振盪フラスコ
発酵システム、リサーチ・プロダクツ・インタナショナ
ル・コーポレーション）またはチーズクロスで蓋をした
バフル付きフラスコ中のＢＭＭＲまたはＢＭＭＹ５０−
７５ｍｌに懸濁した。３０℃の振盪機に戻し、２−４日
間誘導した。２−４日間の終了時に細胞をペレット化
し、上澄液を産生物につき分析した。ペレット化した細
胞を新鮮な培地に再懸濁することにより、振盪試験管分
泌を再開することができる。
【００６３】
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：９４０ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：６００ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： （３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１８３０ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：ゲノムＤＮＡ （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： （４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１６ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： （５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１９ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： （６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１３ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： （７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１４ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： （８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２３１ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：リンカーオリゴヌクレオチド （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： （９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２０ｂｐ （Ｂ）種類：ＤＮＡ （Ｃ）鎖形成状態：１本 （Ｄ）位相幾何学的状態：線状 （ｉｉ）分子の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｘ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂｇ１ＩＩからＢｇ１ＩＩへ時計回りにフラグ
メント中に線状部位特異性インテグラティブベクターを
含むプラスミドｐＡＯ８０４を示す図である。構造遺伝
子をこのプラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入す
ることができる。このプラスミドはＮＲＲＬ Ｂ−１８
１１４のプラスミドＤＮＡから、ＥｃｏＲＩ消化および
ゲル電気泳動を行い、図１に対応する線状の〜７．４ｋ
ｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを採取することにより得ら
れる。
メント中に線状部位特異性インテグラティブベクターを
含むプラスミドｐＡＯ８０４を示す図である。構造遺伝
子をこのプラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入す
ることができる。このプラスミドはＮＲＲＬ Ｂ−１８
１１４のプラスミドＤＮＡから、ＥｃｏＲＩ消化および
ゲル電気泳動を行い、図１に対応する線状の〜７．４ｋ
ｂ ＥｃｏＲＩフラグメントを採取することにより得ら
れる。
【図２】環状のｐＨＳＡ１３を示す図である。
【図３】ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１
５′側調節領域を示す制限地図である。
５′側調節領域を示す制限地図である。
【図４】ピチア・パストリスから単離されたＤＡＳ１
５′側調節領域を示す制限地図である。
５′側調節領域を示す制限地図である。
【図５】ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１
３′側ターミネーション配列を示す制限地図である。
３′側ターミネーション配列を示す制限地図である。
【図６】ピチア・パストリスから単離されたＤＡＳ１
３′側ターミネーション配列を示す制限地図である。
３′側ターミネーション配列を示す制限地図である。
【図７】線状ｐＨＳＡ１１３を示す図である。
【図８】ＮｏｔＩからＮｏｔＩへ時計回りにフラグメン
ト中に線状部位特異性インテグラティブベクターを含む
プラスミドｐＡＯ８０７Ｎを示す図である。構造遺伝子
をこのプラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入する
ことができる。
ト中に線状部位特異性インテグラティブベクターを含む
プラスミドｐＡＯ８０７Ｎを示す図である。構造遺伝子
をこのプラスミドのユニークＥｃｏＲＩ部位に挿入する
ことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/14 Ｃ１２Ｒ 1:84）
Claims (18)
- 【請求項１】 形質転換したピチア・パストリス（Ｐｉ
ｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞において異種蛋白質
を分泌させるための、下記よりなる改良法： （ａ）分泌シグナル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコー
ドし、該シグナル配列が成熟ＨＳＡ蛋白質をコードする
配列にオペラブル結合しているＨＳＡ構造遺伝子を発現
しうる形質転換したピチア・パストリス細胞を、発酵ブ
ロス中において、形質転換したピチア・パストリス細胞
の生存を維持するのに適した条件下で、該ピチア・パス
トリス細胞による成熟ＨＳＡ蛋白質の発現に適した条件
下に培養し、そして （ｂ）異種蛋白質の発現と同時期に、該発酵ブロスのｐ
Ｈを約５．７−約６．４のｐＨに保持する。 - 【請求項２】 ピチア・パストリスが環状プラスミドお
よび線状プラスミドよりなる群から選ばれるベクターに
より形質転換される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ベクターが線状インテグラティブ部位特
異性ベクターである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 線状インテグラティブ部位特異性ベクタ
ーが下記の順次配置を含み： （ａ）第１挿入性ＤＮＡフラグメント、 （ｂ）マーカー遺伝子少なくとも１個、ならびにシグナ
ル配列および成熟ＨＳＡ蛋白質をコードし、ピチア・パ
ストリスＡＯＸ１調節領域およびターミネーション配列
にオペラブル結合しているＨＳＡ構造遺伝子を含む発現
カセット少なくとも１個、ならびに （ｃ）第２挿入性ＤＮＡフラグメント；その際成分
（ｂ）のマーカー遺伝子とカセットの順序は互いに交換
することができ、用いられる第１および第２挿入性ＤＮ
Ａフラグメントはピチア・パストリスゲノムの別個の部
分と相同であり、これらの挿入性フラグメントはピチア
・パストリスゲノム中に存在するものと同一の相対配向
である、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 第１挿入性ＤＮＡフラグメントおよび第
２挿入性ＤＮＡフラグメントが、ＡＯＸ１遺伝子、ｐ４
０遺伝子、ＤＡＳ遺伝子、ＧＡＰ遺伝子、ＰＨＯ１遺伝
子およびＨＩＳ４遺伝子よりなる群から選ばれるピチア
・パストリスからの遺伝子のＤＮＡ配列より得られる、
請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 マーカー遺伝子が、ピチア・パストリス
から単離されたＨＩ Ｓ４、ピチア・パストリスから単離
されたＡＲＧ４、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたＳＵＣ
２、Ｔｎ９０３のＧ４１８R遺伝子、およびＴｎ６０１
のＧ４１８R遺伝子よりなる群から選ばれる、請求項４
または５に記載の方法。 - 【請求項７】 異種蛋白質発現に際して発酵ブロスのｐ
Ｈが約５．７−約６．０に保持される、請求項４、５ま
たは６に記載の方法。 - 【請求項８】 プラスミドが自己複製ＤＮＡ配列および
マーカー遺伝子からなる、請求項４、５、６または７に
記載の方法。 - 【請求項９】 プラスミドが下記よりなる、請求項２−
８のいずれかに記載の方法： （ａ）ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１調節
領域；下記にオペラブル結合： （ｂ）ＨＳＡに対する天然シグナル配列および成熟ＨＳ
Ａ蛋白質をコードし、該ＨＳＡシグナル配列が成熟ＨＳ
Ａ蛋白質をコードする配列にオペラブル結合しているＨ
ＳＡ構造遺伝子；下記にオペラブル結合： （ｃ）ピチア・パストリスから単離されたＡＯＸ１のタ
ーミネーション配列；下記にオペラブル結合： （ｄ）少なくとも１個のマーカー遺伝子、ならびに （ｅ）約０．１９キロベース配列の自己複製ＤＮＡ配列
である第２ＤＮＡフラグメント。 - 【請求項１０】 形質転換したピチア・パストリス細胞
をＨＳＡの発現に際してバッチ供給式で増殖させ、異種
蛋白質発現に際して発酵ブロスのｐＨが約５．７−約
６．０に保持される、請求項１−９のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１１】 形質転換したピチア・パストリス細胞
の生存を維持するために、発酵ブロスが有効量の適切な
最少塩類混合物、増殖因子、ならびにメタノール、グリ
セリン、ソルビトール、グルコース、フルクトースおよ
びそれらのうち１または２以上の組み合わせよりなる群
から選ばれる少なくとも１種類の適切な炭素源を含有す
る、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 発酵ブロスの炭素源が消費されたの
ち、形質転換したピチア・パストリス細胞をメタノール
と接触させ、その際メタノールがそれと接触するピチア
・パストリス細胞の生存を維持するのに十分な量で供給
され、かつメタノール濃度が約５．０重量％を越えな
い、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 ピチア・パストリス細胞のバッチ供給
式増殖に際してのｐＨがｐＨ５．８である、請求項１０
に記載の方法。 - 【請求項１４】 形質転換したピチア・パストリス細胞
を含む発酵ブロスを、グルタミン酸、メチオニン、リジ
ン、ロイシンおよびイソロイシンよりなる群から選ばれ
る添加アミノ酸２．５−１０ｍｇ／ｌ、ならびにペプト
ン約１−約５０ｇ／ｌ（分泌が振盪試験管または振盪フ
ラスコ内で行われる場合）と接触させる、請求項１−１
３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】 異種蛋白質発現に際して発酵ブロスの
ｐＨが約５．７−約６．０に保持される、請求項１４に
記載の方法。 - 【請求項１６】 異種構造遺伝子が、成熟ＨＳＡ蛋白質
をコードする配列にオペラブル結合しているＨＳＡ天然
シグナル配列をコードする、請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 アミノ酸が酵母エキスの形で約１−約
１５ｇ／ｌの濃度において供給される、請求項１４、１
５または１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 ペプトンが約１−約５０ｇ／ｌの濃度
において供給される、請求項１７に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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