JPH05119035A - イメージングフローサイトメータ - Google Patents

イメージングフローサイトメータ

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JPH05119035A
JPH05119035A JP3277560A JP27756091A JPH05119035A JP H05119035 A JPH05119035 A JP H05119035A JP 3277560 A JP3277560 A JP 3277560A JP 27756091 A JP27756091 A JP 27756091A JP H05119035 A JPH05119035 A JP H05119035A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 フローセルの照射光が照射される側とは反対
側に励起光を反射し蛍光は透過させる波長選択手段ある
いは、励起光を反射させる反射手段を設けることで、励
起光の強度を向上することによって、細胞から発せられ
る蛍光強度を増し蛍光画像の撮像を常に可能とする。 【構成】 フローセル５を流れる粒子の蛍光画像を撮像
するイメージングフローサイトメータにおいて、光源と
して蛍光励起用光源１を使用し、フローセル５から透過
した励起光を反射し細胞からの蛍光を透過させる波長選
択手段であるダイクロイックミラー３、３ａと、細胞か
らの蛍光を検出する光電子増倍管８と、該検出信号に基
づき被検出粒子が蛍光画像撮像に適したものであるか否
かを判定し所定の制御信号ｓｎを発する細胞通過判定回
路１３を備えたものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は細胞の蛍光像を撮像する
イメージングフローサイトメータに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】細胞から発せられる蛍光または蛍光染色
を施した細胞から発せられる蛍光を測定するフローサイ
トメータにおいて、励起用光源としてレーザ光源が使用
されることが多い。これは、レーザを使用することによ
って測定領域を小さく絞り込むことが可能となるため測
定領域での単位面積当たりの照射強度を強くすることが
でき、細胞から得られる蛍光の強度を強くすることがで
きるからである。
【０００３】しかし、レーザを使用した場合、励起波長
が特定の波長に制限されるため蛍光染色液が制限される
という問題があった。また、光源の大きさが大きく、価
格が高いという問題もあった。これらの問題を解決する
ために励起用光源としてＸｅランプ等を使用し、励起光
選択フィルターとして干渉フィルターを使用することに
よって励起光の波長を選択するという方法が用いられて
いた。しかし、レーザのように照射領域を小さく絞るこ
とができないため、高い蛍光強度が得られないという問
題があった。励起光強度の問題は、特願平３−３３１５
１，３３１８９，３３１３７，３３１３８号のように蛍
光像を撮像する装置において顕著に示されている。そし
て、細胞の蛍光像を得るためより強い蛍光強度とするた
め以下の方法が取られていた。
【０００４】１．励起光源として発光強度の高いものを
使用する。
【０００５】２．励起光を極力小さな領域に絞り込む。
【０００６】３．光電子増倍率素子であるイメージイン
テンシファイアにより弱い蛍光を増幅する。
【０００７】しかしながら、細胞から発せられる蛍光強
度が弱い場合に、イメージインテンシファイアによって
過度の増幅をすると光電ノイズによりＳ／Ｎ比が下がる
ため画質が劣化するという欠点があった。このため、実
質的な最大増幅率を制限されてしまい、細胞の蛍光像の
撮像に必要な蛍光の強度が不足するという問題点があっ
た。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】解決しようとする問題
点は、励起用光源の光強度が弱い場合に細胞の蛍光像の
撮像に必要な蛍光の強度が不足するという点である。
【０００９】
【課題を解決するたもの手段】本発明は、イメージング
フローサイトメータにおいてフローセルの照射光が照射
される側とは反対側に励起光を反射し蛍光は透過させる
波長選択手段あるいは、励起光を反射させる反射手段を
設け、励起光の強度を向上させるものである。
【００１０】
【実施例】図１は、本発明装置の第一の実施例の構成図
である。本装置は、試料液を扁平な流れにする流路が形
成されたフローセル５中に細胞を流し特定の細胞に対し
てその細胞像を撮像するものである。特に、本発明で
は、フローセル５を流れる細胞を常時監視し蛍光を発す
る細胞の蛍光像のみを選択的に撮像するものである。な
お、図１、図７の実施例は落射型と呼ばれる構成となっ
ている。蛍光励起用光源１は、連続発光型のＸｅランプ
を使用し、励起光を発するものであり、撮像用光源とし
て作用する。コリメータレンズ２は、蛍光励起用光源１
から発する光を平行にすることを目的とする。励起光選
択フィルター４は、フローセル５を流れる細胞を通過す
る光の波長を選択するものである。具体的には、対象と
する細胞あるいは、蛍光染色液に対して最適な波長を選
択して、光を透過するものである。 ダイクロイックミ
ラー３は、励起光選択フィルター４を透過した励起光を
所定の方向に反射することによって対物レンズ６に入射
させるものである。なお、ダイクロイックミラー３は、
蛍光は透過する特性を有する。また、ダイクロイックミ
ラー３ａはフローセル５内の細胞から発せられた蛍光を
選択透過し、励起光を反射するものである。ダイクロイ
ックミラー３、３ａの波長透過率の特性例を図２に示
す。対物レンズ６ａは、細胞から発せられた蛍光を集
光、収束して、検出手段である光電子増倍管８に導くも
のである。光電子増倍管８と対物レンズ６ａとの間に配
され、光電子増倍管８の前方にあるスリット７は、フロ
ーセル５内の撮像領域において細胞から発せられる蛍光
の検出領域を制限するものである。スリット７の光透過
部ａは、図３に示すように一辺は、ビデオカメラ１２の
視野領域の幅150μｍに一致しており、他辺は、フロー
セル５に対応して約20μｍであることが望ましい。この
ため、対物レンズ６ａとして１０倍のレンズを使用する
場合には0.2×1.5mm, ４０倍を使用する場合には0.8×6
mmとすれば良い。従って、スリット７の光透過部ａは、
20×150μｍであり、蛍光像撮像部ｂは、150×150μｍ
の大きさとなっている。細胞通過判定回路１３は光電子
増倍管８から出力された信号に所定の処理を行い目的と
する細胞であるか否かを判断し、目的の細胞である場合
には、電子シャッター９を動作させるシャッター動作ト
リガー信号ｓｎを発する機能を有する回路である。細胞
通過判定回路１３の信号処理の例を図８、図９により説
明する。細胞から発せられた蛍光信号ｋｓのパルス幅が
所定のパルス幅ｐｗを有する信号である場合、もしくは
信号強度が所定のスレショホルドレベルｓｌ以上の値で
ある場合、もしくはその両方の条件を満たす場合のいず
れかにより目的とする細胞であるか否かを判断する。電
子シャッター９は、細胞から発せられた蛍光のうち対物
レンズ６によって受光された光をイメージインテンシフ
ァイア１０に入射させるか否かを選択するものであり、
細胞通過判定回路１３によって、その動作が制御され
る。また、電子シャッター９の開放時間はサンプルとし
て使用される細胞の流速によって決定される。例えば、
細胞の流速が１ｍ／ｓｅｃの場合、およそ１μｓとしな
ければならない。これ以上の時間開放すると、イメージ
インテンシファイア１０に結像する蛍光像が流れてしま
い静止像が得られなくなってしまう。イメージインテン
シファイア１０は、光電子増倍素子であり、その光電面
に入射した光を１０３から１０６倍に増幅して蛍光面側
に出力する。また、電子シャッター９の代わりに電子シ
ャッター９の機能を内蔵したイメージインテンシファイ
ア１０とすることもできる。結像レンズ１１は、イメー
ジインテンシファイア１０の蛍光面より出力された像を
集光、収束し、ビデオカメラ１２のＣＣＤ素子に結像す
るものである。
【００１１】以下、装置の動作に従って説明する。蛍光
励起用光源１から出力された励起光は、コリメータレン
ズ２を通過後、ダイクロイックミラー３によって反射さ
れる。その反射光は、対物レンズ６で集光されて常時、
フローセル５に照射されている。フローセル５内の細胞
から発せられる蛍光のみがダイクロイックミラー３ａを
通過してスリット７を透過後、光電子増倍管８に入射す
る。光電子増倍管８からの検出信号は細胞通過判定回路
１３によって目的とする細胞か否かが判定される。そし
て、目的とする細胞であれば、細胞通過判定回路１３か
ら出力されるシャッター動作トリガー信号ｓｎにより電
子シャッター９が開放される。なお、ダイクロイックミ
ラー３ａによって反射された励起光成分の光は、再びフ
ローセル５内の細胞に照射される。この時、フローセル
５とダイクロイックミラー３ａの間隔は十分に短いので
細胞に直接照射される励起光と反射されてきた励起光の
時間差は殆ど無く、同時に照射されたのと同じ状態とな
るため、細胞には約２倍の照度の励起光が照射されたの
と等価な励起光強度が得られることとなる。細胞から発
せられる蛍光は、すべての方向に対して等方的であるの
で、フローセル５からの蛍光は、光電子増倍管８が蛍光
信号を検出するのと同時に対物レンズ６を介して電子シ
ャッター９にも入射する。この際、細胞通過判定回路１
３によって目的とする細胞であると判定されている場合
には、電子シャッター９が開放されており、細胞の蛍光
像がイメージインテンシファイア１０の光電面に結像す
る。イメージインテンシファイア１０によって蛍光像が
増幅され出力面である蛍光面に出力され、この増幅され
た像が結像レンズ１１によりビデオカメラ１２のみがＣ
ＣＤ素子に結像され、細胞の蛍光像が得られることとな
る。 図４は、本発明のフローセル５付近の図を示す。
【００１２】励起光は、対物レンズ６で集光されて図の
右側からフローセル５に照射される。また、フローセル
５の左側のダイクロイックミラー３ａにより、励起光は
反射され再び細胞に照射される。一方、細胞から発せら
れた蛍光はダイクロイックミラー３ａを通過し、光電子
増倍管８に入射する。なお、ダイクロイックミラー３ａ
は、図５に示すような凹面形状のものを使用することも
可能である。この場合、ダイクロイックミラー３ａから
の反射光の焦点位置をフローセル５内の測定領域に合わ
せておけば凹面鏡の周辺部に入射する励起光についても
測定領域に集光できるため励起光の照度をさらに向上す
ることができる。また、図６に示すように、フローセル
５の背面に波長選択膜を蒸着することも可能である。
【００１３】図７に、本発明の第二の実施例を示す。
【００１４】本実施例は、細胞監視系と撮像系を同一光
路内に配置することことによって構成を簡略化したもの
である。なお、この場合にはダイクロイックミラー３と
電子シャッター９との間にハーフミラー１６を挿入する
必要がある。これは、ハーフミラー１６により反射した
蛍光を光電子増倍管８で検出し、ハーフミラー１６を透
過した蛍光を撮像手段１２で撮像するためである。図１
０に本発明の第三の実施例を示す。
【００１５】本実施例は、細胞監視系、撮像系と励起光
照射系を直角に配置することによってダイクロイックミ
ラー３、３ａを省いたものである。この場合、細胞から
発する蛍光として、側方からの蛍光を測定するため波長
選択手段としてのダイクロイックミラー３、３ａの代わ
りに反射手段１７を蛍光励起用光源１とは反対側のフロ
ーセル５の側方に配置する必要がある。反射手段１７と
しては、例えば平面鏡または、図５と同様に焦点位置を
フローセル５内の測定領域の位置に合わせた凹面鏡を使
用する。反射手段１７の配置は図４、図５、図６の実施
例のダイクロイックミラー３ａと同様に考えれば良い。
【００１６】さらに、図１１に示すように励起光の集光
レンズ１５とフローセル５と間に図１２に示すような中
心に円形開口を有する凹面鏡１７を設けることによって
凹面部の反射のため励起光の照度をさらに向上させるこ
とも可能である。
【００１７】
【発明の効果】以上説明したように本発明のイメージン
グフローサイトメータは、試料液扁平流の背後に設けら
れた波長選択手段あるいは反射手段の反射によって、細
胞から発せられる励起光を細胞全体に照射することがで
き、かつ試料液の細胞に反射による励起光が照射される
ため、試料液の片側から照射した場合の約２倍の励起光
照度が得られるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】イメージングフローサイトメータの第一の実施
例の構成図である。
【図２】波長選択手段であるダイクロイックミラーの波
長透過率の特性図である。
【図３】フローセルにおける撮像エリアとスリットの関
係を示す図である。
【図４】フローセル付近の構成図である。
【図５】ダイクロイックミラーを凹面とした場合のフロ
ーセル付近の構成図である。
【図６】フローセルの背面に波長選択手段である蒸着膜
を設けた場合のフローセル付近の構成図である。
【図７】イメージングフローサイトメータの第二の実施
例の構成図である。
【図８】細胞通過判定回路の信号処理の説明図である。
【図９】細胞通過判定回路の信号処理の説明図である。
【図１０】イメージングフローサイトメータの第三の実
施例の構成図である。
【図１１】第三の実施例において凹面鏡を設けた場合の
フローセル付近の構成図である。
【図１２】凹面鏡の円形開口をしめす平面図である。
【符号の説明】
１ 蛍光励起用光源 ２ コリメータレンズ ３、３ａ ダイクロイックミラー ４ 励起光選択フィルター ５ フローセル ６、６ａ 対物レンズ ７ スリット ８ 光電子増倍管 ９ 電子シャッター １０ イメージインテンシファイア １１ 結像レンズ １２ ビデオカメラ １３ 細胞通過判定回路 １４ 画像処理装置 １５ 集光レンズ １６ ハーフミラー １７、１７ａ 反射鏡
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年３月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、イメージング
フローサイトメータにおいてフローセルの照射光が照射
される側とは反対側に励起光を反射し蛍光は透過させる
波長選択手段あるいは、励起光を反射させる反射手段を
設け、励起光の強度を向上させることによって、細胞か
ら発せられる蛍光強度を向上させるものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】さらに、図１１に示すように励起光の集光
レンズ１５とフローセル５との間に図１２に示すような
中心に円形開口を有する凹面鏡１７を設けることによっ
て凹面部の反射させ励起光の照度をさらに向上させるこ
とも可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】
【発明の効果】以上説明したように本発明のイメージン
グフローサイトメータは、試料液偏平流の背後に設けら
れた波長選択手段あるいは反射手段による励起光の反射
によって、励起光を細胞全体に照射することができ、か
つ試料液中の細胞に反射による励起光が照射されるた
め、試料液の片側から照射した場合の約２倍の励起光照
度が得られる。その結果、細胞から発せられる蛍光の強
度が向上するという効果がある。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞の被検出粒子成分を含む試料液を扁
    平な流れにする流路が形成されたフローセルと、該フロ
    ーセルの試料液に光を照射する光源と、試料液中の被検
    出粒子の静止画像を撮像する撮像手段と、該撮像手段か
    らの画像データに基づき所望のデータ処理を行う画像処
    理手段とを含み、該フローセル中を流れる粒子の蛍光画
    像を撮像し分析するイメージングフローサイトメータに
    おいて、該光源からの照射光は蛍光励起用の光であり試
    料液の扁平流に対し正面から照射され、該撮像手段は正
    面あるいは背面からの細胞の蛍光画像を撮像するもので
    あり、該フローセルから透過した励起光を反射させ細胞
    から発せられた蛍光を透過させる波長選択手段と、該撮
    像手段とは別に該フローセル内の細胞から発せられた蛍
    光を検出する検出手段と、該検出手段の検出信号に基づ
    き被検出粒子を検出し該被検出粒子が該撮像手段の蛍光
    画像撮像に適したものであるか否かを判定し所定の制御
    信号を発する判定制御手段とを備えたことを特徴とする
    イメージングフローサイトメータ。
  2. 【請求項２】 請求項１の波長選択手段は平面を有する
    ことを特徴とするイメージングフローサイトメータ。
  3. 【請求項３】 請求項１の波長選択手段は凹面を有する
    ことを特徴とするイメージングフローサイトメータ。
  4. 【請求項４】 請求項１の波長選択手段は前記フローセ
    ル背面に密着して設けられたことを特徴とするイメージ
    ングフローサイトメータ。
  5. 【請求項５】 請求項１の波長選択手段は前記フローセ
    ル背面上に形成された蒸着膜であることを特徴とするイ
    メージングフローサイトメータ。
  6. 【請求項６】 細胞の被検出粒子成分を含む試料液を扁
    平な流れにする流路が形成されたフローセルと、該フロ
    ーセルの試料液扁平流領域に光を照射する光源と、試料
    液中の被検出粒子の静止画像を撮像する撮像手段と、該
    撮像手段からの画像データに基づき所望のデータ処理を
    行う画像処理手段とを含み、該フローセル中を流れる粒
    子の蛍光画像を撮像し分析するイメージングフローサイ
    トメータにおいて、該光源からの照射光は蛍光励起用の
    光であり試料液扁平流に対し一側面から照射され、該撮
    像手段は正面あるいは背面からの細胞粒子の蛍光画像を
    撮像するものであり、該フローセルから透過した励起光
    を反射させる反射手段と、該撮像手段とは別に該フロー
    セル内の細胞から発せられる蛍光を検出する検出手段
    と、該検出手段の検出信号に基づき被検出粒子を検出
    し、該被検出粒子が該撮像手段の蛍光画像撮像に適した
    ものであるか否かを判定し所定の制御信号を発する判定
    制御手段とを備えたことを特徴とするイメージングフロ
    ーサイトメータ。
  7. 【請求項７】 請求項６の反射手段は平面を有すること
    を特徴とするイメージングフローサイトメータ。
  8. 【請求項８】 請求項６の反射手段は凹面を有すること
    を特徴とするイメージングフローサイトメータ。
  9. 【請求項９】 請求項６の反射手段はフローセル面に密
    着して設けられたことを特徴とするイメージングフロー
    サイトメータ。
  10. 【請求項１０】 請求項６の反射手段はフローセル背面
    上に形成された蒸着膜であることを特徴とするイメージ
    ングフローサイトメータ。
  11. 【請求項１１】 請求項６のフローセルの一側面に照射
    励起光を通過させる開口部を設けた凹面を有する反射手
    段をさらに備えたことを特徴とするイメージングフロー
    サイトメータ。
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