JPH0734012B2 - フローイメージサイトメータ - Google Patents

フローイメージサイトメータ

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JPH0734012B2
JPH0734012B2 JP3033137A JP3313791A JPH0734012B2 JP H0734012 B2 JPH0734012 B2 JP H0734012B2 JP 3033137 A JP3033137 A JP 3033137A JP 3313791 A JP3313791 A JP 3313791A JP H0734012 B2 JPH0734012 B2 JP H0734012B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フローイメージサイト
メータに関するものであり、対象に応じて適当に蛍光染
色された細胞をフローセルに導いて平面シースフローを
形成し、白色光（ストロボ光）を照射して得られる自然
画像とともに、レーザ光で励起して得られる蛍光画像と
を効率良く、かつ１台のビデオカメラで同時に撮像し、
解析することのできるフロー画像分析装置を提供する。
【０００２】
【従来の技術】スライドガラス上に染色、塗抹された細
胞に対して、顕微鏡下において可視光、紫外光等を照射
し、対象とする細胞の蛍光画像を撮像し、その画像を解
析して細胞の生理学的情報を得ようとする試みは既に行
なわれている。ただこの方法では、多数個の細胞を単時
間で分析処理するには不向きであり、蛍光画像を用いて
の分析は、その用途が限られていた。
【０００３】また、従来のフローサイトメータにおいて
は、蛍光染色された細胞から発せられる蛍光をグロスと
して、すなわち細胞の各部から発せられる蛍光の細胞全
体の積分値として、その情報を得ていた。この方法で
は、短時間に多数個の細胞を分析することができるが、
個々の細胞のどの部分が染色されて蛍光を発しているか
の詳細な情報は得ることができないため、分析能力の点
で限りがあった。
【０００４】一方、対象に応じて適当に染色された細胞
をフローセルに導いて平面シースを形成し、ストロボ光
を照射し、ビデオカメラで静止画像を得て画像処理する
という方式を用いての細胞分類装置が既に実用化されて
いる。ただし、この方式を用いての個々の細胞の蛍光画
像の撮像、解析は、蛍光撮像感度の問題でまだ実用化に
至っていないのが現状である。本発明は、既に提出され
ている高撮像効率型のフローイメージサイトメータのア
イデア（特願平２−１８５７９４）を利用する。
【０００５】
【解決すべき課題】撮像エリアを通過する細胞を検知
し、その細胞に対して励起光を集中させて照射すること
によって、必要な蛍光強度を確保し、蛍光画像を得、さ
らに従来の白色光源による自然画像と蛍光画像を、１台
のビデオカメラで効率良く撮像し解析するフロー画像分
析装置の構想は未だ具体化されていなかった。
【０００６】
【課題の解決手段】本発明は、前出の高撮像効率型フロ
ーイメージサイトメータのアイデア（特願平２−１８５
７９４。以下先願という。）をベースとし、そのシステ
ムをさらに発展させたものであり、従来のストロボ光
（白色光）照射による自然光画像に加えて、蛍光染色さ
れた細胞から発せられる蛍光を２次元の画像として同時
にとらえるシステムとして構成したものである。そのた
め、本発明は、被検出粒子成分を含む試料液を偏平な流
れにするための偏平な流路が形成されたフローセルと、
フローセルの一方の側に配置されフローセル中の試料液
に光を照射する光源と、フローセルの他方の側に配置さ
れ、光源により照射された試料液中の被検出粒子の静止
画像を撮像する撮像手段と、撮像手段からの画像信号に
基づいて所望の分析を行う画像処理手段と、を含むフロ
ーイメージサイトメータであって、フローセルの一方の
側に配置されフローセル中の試料液をパルス光照射する
めたの蛍光励起用の第１の光源および白色光発生用の第
３の光源と、フローセルの他方の側に配置され第１の光
源および第３の光源により照射された試料液中の被検出
粒子の静止画像を撮像するためのビデオカメラである第
１の撮像手段と、フローセルの一方の側に配置されフロ
ーセル中の試料液を常時照射し細胞通過を監視するため
の第２の光源と、フローセルの他方の側に配置され第２
の光源により照射された試料液を撮像し細胞通過を監視
するためのラインセンサである第２の撮像手段と、２の
撮像手段の撮像信号に基づき被検出粒子を検出しこの検
出に基づき第１の撮像手段の撮像期間内にまず第３の光
源を照射し引き続き所定時間を置いて第１の光源を照射
させ細胞通過を判定する細胞通過判定／光源用制御手段
と、を備え、さらに第１の光源による画像と第３の光源
による画像とを第１の撮像手段の受光面上の異なる領域
にそれぞれ撮像するフローイメージサイトメータ、を特
色とする。
【０００７】また、本発明は、上記ビデオカメラである
第１の撮像手段が試料液の流れ上に２次元をの撮像領域
を有し、上記ラインセンサである第２の撮像手段が試料
液の流れ上にライン状の撮像領域を有し、上記第２の撮
像手段の撮像領域が上記第１の撮像手段の撮像領域内で
試料液の流れを横切るように形成され、上記第１の撮像
手段による撮像領域を、上記第２の撮像手段の撮像領域
を含む領域と含まない領域とに２分し、上記第３の光源
の白色光照射による上記一方の領域の自然光画像と上記
第１の光源の蛍光励起用光照射による上記他方の領域の
蛍光画像とを第１の撮像手段で撮像するフローイメージ
サイトメータ、を特色とする。
【０００８】上記２つの画像を第１の撮像手段の受光面
上で重複させないための手段として、撮像面に光を遮断
するマスクを設けたフローイメージサイトメータもまた
本発明の特色とするところである。
【０００９】本発明はさらに、上記第１の光源からの照
射光を長楕円にする手段を設けたり、蛍光画像の受光系
にイメージインテンシファイアをまた蛍光画像の撮像時
にのみこのイメージインテンシファイアを動作させるよ
うにしたフローイメージサイトメータ、を特色とするも
のである。
【００１０】
【実施例】図１に本発明の実施例を示す。先願で示した
細胞通過監視用の第２の光源４５（例では近赤外半導体
レーザ）と第２の撮像手段である細胞通過監視用ライン
センサ１４に加えて、蛍光画像をとらえるための第１の
光源である蛍光励起用の光源３５と微弱な蛍光を増加す
るためのイメージインテンシファイア２２を付加し、さ
らに、自然光画像と蛍光画像を第１の撮像手段である１
台のビデオカメラ２４でとらえるための各種のミラー、
フィルタ、マスクを付加している。
【００１１】以下順を追って説明する。染色された細胞
を含む試料液を平面シース用フローセル６に導いて、そ
の細胞がビデオカメラ２４の撮像エリアを通過するのを
常時監視するのに、近赤外半導体レーザ４５は常時撮像
エリアに照射する。この半導体レーザ４５からの光は、
コリメータレンズ４６により平行光にされ、シリンドリ
カルレンズ４７を介してダイクロイックミラー４で反射
され、さらにコンデンサレンズ５により細胞進行方向に
対して垂直に細長く絞られて、ラインセンサ１４の撮像
エリアに照射される。本例では、ラインセンサ１４の撮
像エリアは、図２に示すように、ビデオカメラ２４の撮
像エリアの上半分の内のまん中より少し上に設けてい
る。
【００１２】半導体レーザ４５の光による撮像エリアか
らの透過光は、対物レンズ８を介して、ビームスプリッ
タ１１で分けられ、さらにダイクロイックミラー１２を
通過して、投影レンズ１３により、ラインセンサ１４に
結像される。ラインセンサ１４からは、１ライン分の走
査周期時間（数十μｓｅｃ）だけ露光された各画素の光
電変換累積量に応じた電圧が順次出力される。前出の先
願で述べたのと同様の信号処理をすることによって、ビ
デオカメラ２４の偶数フィールド期間中に、細胞がライ
ンセンサ１４の撮像エリアを横切ったことが判定される
と、ストロボ光照射のためのトリガがかかる。
【００１３】ラインセンサ１４の撮像エリアを細胞が横
切ってから、第３の光源である白色光発生用のストロボ
１に対するトリガをかけるまでの処理時間は、ラインセ
ンサ１４の走査周期を、５０μｓｅｃとして場合、１０
０〜２００μｓｅｃであり、フローセル６での細胞の流
速を仮に３０ｍｍ／ｓｅｃとすると、この間に細胞は３
〜６μｍ移動する。従って、ストロボ１を照射して得ら
れる細胞画像は、１枚の撮像画面の上半分のエリア内に
確実にとらえられることになる。
【００１４】ストロボ光は、コリメータレンズ９により
平行光にされ、コンデンサレンズ１０、ダイクロイック
ミラー４，４Ａを介して、さらにコンデンサレンズ５に
より、ビデオカメラ２４の撮像エリア全体にわたってほ
ぼ均一に照射される。その透過光は、対物レンズ８、ビ
ームスプリッタ１１を介してダイクロイックミラー１２
で反射され、フィルタ２０Ａで近赤外光はカットされ、
投影レンズ１５により半円マスク１６に結像される。こ
のマスク１６で撮像画像の下半分はカットされ、リレー
レンズ２７、ハーフミラー１９を介してビデオカメラ２
４のＣＣＤエリアセンサの半分だけに結像される。
【００１５】この時、ビームスプリッタ１１で反射され
た透過光は、フィルタ２０、投影レンズ２１を介してイ
メージインテンシファイア２２の光電面に結像される。
この時点では、イメージインテンシファイア２２に対し
て電圧をかけないようにゲートをかけているので、イメ
ージインテンシファイア２２の出力面には像は現われな
い。このためのゲート信号は、細胞通過判定／光源コン
トロール部２８で作られる。
【００１６】次に、ストロボ１の光を照射してから細胞
が撮像エリアの下半分の位置まで移動するのを待って、
励起用光源３５（例えばＨｅ−Ｃｄレーザ）を照射す
る。そのためのトリガ信号は、上記光源コントロール部
２８で作られる。光源３５からのレーザ光は、シリンド
リカルレンズ３６により横長にされ、ダイクロイックミ
ラー４Ａで反射され、さらにコンデンサレンズ５によ
り、細胞進行方向に対して細長く垂直に絞られて、ビデ
オカメラ２４の撮像エリアの下半分の内のまん中あたり
に照射される（図２参照）。この時、この照射エリアに
細胞が移動していることになる。フローセル６中の細胞
の移動速度は３０ｍｍ／ｓｅｃ、ビデオカメラ２４の撮
像エリアを１５０×１５０μｍとした場合には、ストロ
ボ１の光を照射してから約２．５ｍｓｅｃ後に励起光を
照射するようにコントロールすれば良い。励起光の照射
持続時間は、蛍光が微弱であるので、なるべく長いほう
が良いが、画像が大きく振れない程度の時間とすると、
数十μｓｅｃとなる。
【００１７】厳密に言うと、励起光の照射タイミング
も、ビデオカメラ２４の偶数フィールド期間中でなけれ
ばならないので、細胞の通過を監視した時にストロボ光
を照射できるタイミングは、奇数フィールドになる手前
２．５ｍｓｅｃまでの偶数フィールド期間中となる。
【００１８】
【作用】励起光の照射によって細胞から発せられた蛍光
は、対物レンズ８を介して、反射率の高いビームスプリ
ッタ１１で反射される。撮像エリアを通過した励起光
は、励起光ビームストッパ３０でさえぎられ、さらにフ
ィルタ２０で迷光分もカットする。細胞通過監視用に常
時照射されている近赤外光もこのフィルタ２０でカット
する。
【００１９】フィルタ２０を通過した蛍光は、投影レン
ズ２１により、イメージインテンシファイア２２の光電
面に結像される。この時、イメージインテンシファイア
２２には、高電圧がかけられており、内部のＭＣＰ（マ
イクロチャンネルプレート）により増倍されて蛍光出力
面に像を結ぶ。半円マスク２３で半分カットされた像
は、ミラー１７を介してリレーレンズ１８により、ハー
フミラー１９を通過して、ビデオカメラ２４のＣＣＤエ
リアセンサの半分だけに結像される。
【００２０】一方、ビームスプリッタ１１を通過した蛍
光は、ダイクロイックミラー１２で反射されて半円マス
ク１６の位置で結像されるが、ここでさえぎられる。ま
た、ビームスプリッタ１１を通過した近赤外光は、ダイ
クロイックミラー１２でほとんど透過し、さらにフィル
タ２０Ａによってカットされるので、ビデオカメラ２４
のＣＣＤエリアセンサの自然光撮像側が多重露光される
ことはない。（既にストロボ照射時に露光されてい
る。）以上の様なシーケンスで、撮像エリアを通過する
細胞を検知してから、その細胞の自然光画像と蛍光画像
を１台のビデオカメラ２４で撮像できる。図４に、撮像
画面の例を示す。図３は、撮像エリアを通過する細胞を
検知してからのストロボ光、励起光照射タイミングおよ
びイメージインテンシファイア用ゲート信号のタイミン
グを示す例であり、これらを制御するための信号は、図
１の細胞通過判定／光源コントロール部２８で作られ
る。
【００２１】細胞がラインセンサ１４の撮像エリアを通
過してから励起光照射エリアにちょうど移動した時に励
起光の照射をする必要があるが、このタイミングの制御
は、細胞の流速が一定で変動しなければ、細胞の通過を
検知してから一定の遅延を与えれば良い。この流速が変
動するような場合には、画像処理によって細胞の蛍光画
像が、１画面中のどの位置に写っているか容易に判断で
きるので、その位置が期待する位置よりずれていれば、
励起光照射までの遅延時間を補正するようにフィードバ
ック制御すれば良い。
【００２２】
【他の実施例】上記実施例では、細胞通過監視用光源と
して近赤外半導体レーザ４５を用いているが、近赤外の
ＬＥＤを用いることもできる。また、図１の蛍光画像受
光系と自然光画像受光系の左右を逆に配置することも可
能である。さらに、図２において、励起光照射エリアを
近赤外光照射エリア側と同様に撮像エリアの上側に持っ
て来ることによって、細胞の通過を検知してからまず蛍
光画像を撮像し、次に細胞が撮像エリアの下側に移動す
るのを待ってストロボ光を照射し、自然光画像は後で撮
像するというふうにもできる。上記実施例（図１）で
は、蛍光励起用光源（第１の光源）３５とビデオカメラ
（第１の撮像手段）２４とをフローセル６をはさんで対
向する側に配置したが、図６に示すように両者を同じ側
に配置してもよい。この場合には励起光を遮ぎるための
ビームストッパ３０は不要であるが、蛍光と励起光の方
向が異なるので励起光の影響がより一層少ない蛍光画像
を撮像することが出来る。
【００２３】
【効果】１．撮像エリアを細胞が通過するのを常時監視
しているので、濃度のうすい細胞でも効率良く、また選
択的にその細胞の画像をとらえられる。
【００２４】２．細胞の蛍光画像をとらえるための照射
光は、ビデオカメラの撮像エリア全体に照射する必要が
なく、特定エリアにしぼることができるので、単位面積
当たりの照射光強度を上げることができ、露光時間が短
くても微弱な蛍光を画像としてとらえることができる。
【００２５】３．１台のビデオカメラで、１枚の撮像画
面に自然画像と蛍光画像の２つの画像をとらえることが
でき、画像解析処理が楽になり、コストの点でも有利で
ある。 ４．フローイメージングの手法により、単位時間当たり
に多数個の細胞の画像をとらえて解析処理することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明によるフローイメージサイトメー
タの構成を示す。
【図２】図２はフローセル部の光照射エリアと撮像エリ
アの例を示す説明図である。
【図３】図３は光照射タイミングとインテンシファイア
用ゲート信号のタイミングチャートを示す。
【図４】図４はビデオカメラによる撮像画面の例を示
す。
【図５】図５は半円マスクの例を示す。
【図６】図６はフローイメージサイトメータの異型実施
例を示す。
【符号の説明】６…フローセル、１…第３の光源、４５
…第２の光源、３５…第１の光源、２４…第１の撮像手
段、１４…第２の撮像手段、２８…細胞通過判定／光源
用制御手段。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被検出粒子成分を含む試料液を偏平な流
    れにするための偏平な流路が形成されたフローセルと、
    フローセル中の試料液に光を照射する光源と、上記光源
    により照射され試料液中の被検出粒子の静止画像を撮影
    する撮像手段と、上記撮像手段からの画像信号に基づい
    て所望の分析を行う画像処理手段と、を含むフローイメ
    ージサイトメータにおいて、上記フローセル中の試料液
    をパルス光照射するめたの第１の光源および第３の光源
    と、上記第１の光源および第３の光源により照射された
    試料液中の被検出粒子の静止画像を撮像するための第１
    の撮像手段と、上記フローセル中の試料液を常時照射す
    るための第２の光源と、上記第２の光源により照射され
    た試料液中の被検出粒子を撮像するための第２の撮像手
    段と、第２の撮像手段撮像信号に基づき被検出粒子を検
    出しこの検出に基づき第１の撮像手段の撮像可能期間内
    に第３の光源と第１の光源とを所定時間を置いて照射さ
    せる細胞通過判定／光源用制御手段と、を備え、上記第
    １の光源が蛍光励起用の光源であり、第３の光源は白色
    光を発する光源であり、第１の光源による画像は蛍光画
    像であり、第３の光源による画像は白色光透過画像であ
    り、さらに上記第１の光源による画像と上記第３の光源
    による画像とを上記の第１の撮像手段の受光面上に異な
    る領域にそれぞれ撮像すること、を特徴とするフローイ
    メージサイトメータ。
  2. 【請求項２】 請求項１記載のフローイメージサイトメ
    ータにおいて、上記第１の撮像手段が試料液の流れ上に
    ２次元の撮像領域を有し、上記第２の撮像手段が試料液
    の流れ上にライン状の撮像領域を有し、上記第２の撮像
    手段の撮像領域が上記第１の撮像手段の撮像領域内で試
    料液の流れを横切るように形成され、上記第１の撮像手
    段による撮像領域を２分し、上記第３の光源の照射によ
    る上記一方の領域の画像と上記第１の光源の照射による
    上記他方の領域の画像とを第１の撮像手段で撮像するこ
    と、を特徴とするフローイメージサイトメータ。
JP3033137A 1991-02-27 1991-02-27 フローイメージサイトメータ Expired - Lifetime JPH0734012B2 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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