JPH05124976A - 酵母誘導ミトゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 酵母から実質的に純粋なミトゲンを得るこ
と、および該ミトゲンを含有する薬剤ならびにこれを使
用する治療方法を提供すること。 【構成】 ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して測定
した約３００,０００ダルトンよりも大きい天然条件下
での分子量を有する酵母から得られた実質的に純粋なミ
トゲン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は高分子量酵母細胞誘導ミ
トゲンに関するものである。ミトゲンは創傷治癒におけ
るような、細胞増殖を必要とする状態において治療学的
有用性を提供する。

【０００２】

【従来の技術】酵母細胞から得られた因子は種々のエフ
ェクター活性を支持することが判明した。例えば、１ま
たはそれ以上の酵母因子は他の酵母培養物の増殖を刺激
し；１またはそれ以上の酵母因子は酵母細胞の呼吸を刺
激し；１またはそれ以上の酵母因子は酵母、培養線維芽
細胞、ラット肝臓およびラット腹部皮膚における酸素摂
取を刺激し；１またはそれ以上の酵母因子はウサギの耳
の創傷においてコラーゲンおよび新しい肉芽組織の形成
よる創傷治癒ならびに上皮形成速度を刺激し；１または
それ以上の酵母因子は脈管形成を刺激する。

【０００３】１またはそれ以上の該因子を含有する粗製
エキスは生酵母細胞のアルコール抽出によって得ること
ができる。それらから得られる誘導体は暗褐色粘性流体
である。該エキスは、一般に、生酵母細胞誘導体と称さ
れる。

【０００４】米国特許第２,３２０,４７８号においてス
ペルチ(Ｓperti)は、皮膚呼吸を刺激すると言われてい
る酵母のアルコールエキスを開示した。活性物質は蛋白
を実質的に含有していないと主張された。米国特許第
４,５７５,４５７号においてマザリン(Ｍazarin)は、歯
肉炎の治癒速度を改善するのに有用であると提案された
練り歯磨きにおいてスペルチ(上記)に従って得られる酵
母エキスを使用した。酵母のアルコールエキスは店頭販
売の痔疾治療用製剤の一成分である。

【０００５】カプラン(Ｋaplan)［アーカイブス・オブ
・サージェリー(Ａrch.Ｓurg.)、１１９：１００５−１
００８、１９８４］は、本質的にスペルチ(上記)におい
て本質的に教示されているとおりに調製された酵母細胞
のアルコールエキスが創傷部位に軟膏剤として塗布され
ると脈管形成および上皮形成を増強すると思われると開
示した。

【０００６】ベントリィ(Ｂentley)ら［アーカイブス・
オブ・サージェリー(Ａrch.Ｓurg.)、１２５：６４１−
６４６、１９９０］は、脈管形成活性を示し、かつ創傷
治癒を刺激する６,０００〜１７,０００ダルトンの大き
さの範囲の低分子量のペプチド類の混合物を得たと主張
した。粗製アルコールエキスを遠心分離して細胞破片を
除去し、清澄上澄液を調製用ゲル濾過カラムに付した。
得られた濾液をゲル濾過、ポリアクリロアミド電気泳動
およびイオン交換クロマトグラフィーによって分析し
た。

【０００７】得られた濾液はゲル濾過、ポリアクリルア
ミド電気泳動およびイオン交換クロマトグラフィーによ
って分析された。

【０００８】脈管形成活性は低分子量ペプチド類に制限
された。化学分析によって、グルコース分子が１→１結
合によってお互いに結合しているグルコース二糖類を該
エキスが含有することが明らかにされた。酵母中に豊富
にある二糖類であるトレハロースは、まさにこのような
結合関係によって特徴付けられる。

【０００９】バイオアッセイにおいて、低分子量ペプチ
ド類は創傷治癒活性を示すと主張されたが、しかしなが
ら、生物学的応答に影響を与えるために必要とされるペ
プチド類の濃度は当技術分野において知られている他の
増殖因子が必要とする濃度よりも数桁大きい濃度であっ
た。かくして、ベントリィらは、酵母誘導ペプチド類が
細胞表面レセプター類およびチロシンキナーゼ機構を介
して作用する古典的増殖因子ではないと推論した。

【００１０】本発明者らはこの点につき検討を重ね、高
分子量酵母誘導因子を実質的に純粋な形態で得、該因子
が有意なミトゲン活性(有糸分裂誘発活性)を有すること
を見出した。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、酵母から得られる実質的に純粋なミトゲンを提供す
ることである。本発明の別の目的は、該酵母誘導ミトゲ
ンを製造する方法を提供することである。本発明のさら
なる目的は、該ミトゲンからなる組成物で、宿主、好ま
しくは哺乳動物、より好ましくはヒトを治療する方法を
提供することである。

【００１２】上記および他の目的は、高分子量ミトゲン
を酵母から精製するための方法の開発において達成され
た。

【００１３】「図１」は、有糸分裂誘発アッセイから得
られたデータを表す。内皮細胞はＬＹＣＤ量に対するＤ
ＮＡ取込みの用量応答を呈する。「図２」は、スーペロ
ーズ(Ｓuperose) １２ ＨＲ １０／３０カラムから溶離
した２８０nm吸収性物質のクロマトグラムを表す。「図
３」は、スーペローズ １２ カラムから得られ、かつ逆
相Ｃ８カラムを通過した蛋白のクロマトグラムを表す。
実線は２８０nmでの吸光度である。線上の番号は溶出時
間を示す。画分を回収し、ミトゲン活性について試験し
た。各画分２.５マイクロリットルのミトゲン応答は、
４回の測定の平均として報告された。負の対照は１３１
２cpmであった。正の対照、すなわち生酵母細胞誘導体
の参照標準から調製し、透析した清澄エキス(実施例３)
１０マイクロリットルは７７０２cpmであった。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は生酵母細胞のア
ルコール抽出によって得られるミトゲンを提供するもの
である。(ここで、ミトゲンはここに記載した細胞増殖
能力を有する１またはそれ以上の種を示す。）

【００１５】天然ミトゲンの分子量は約６００,０００
ダルトンまたはそれ以上である。大きいサイズはサブユ
ニット構造または低分子量の種類の凝集体を示し得る。
透析した酵母エキスを液体クロマトグラフィーの間にゲ
ル排除カラムに通過させると、ミトゲンはカラムに適用
した物質の大部分よりも非常に早く溶出する単一のよく
分解した画分中で回収される。活性画分はカラムに適用
した全物質の約１％を含んでおり、ミトゲンは各試料の
ミトゲン活性に対する全蛋白およびアミノ酸の割合に基
づいて粗製エキスから約１,５００倍(以下、１,５００
倍)精製される。

【００１６】ミトゲン画分は初期エキス中で蛋白アミノ
酸約０.０５％および炭水化物０.０１％を表す。分子は
加熱および冷却に対して安定である。透析した酵母エキ
ス中のミトゲンは酸によって可逆的に沈澱される。デー
タは活性成分が糖蛋白であることを示唆する。

【００１７】ミトゲンの存在は、バイオアッセイによっ
て、例えば培養した内皮細胞を使用して細胞増殖／ＤＮ
Ａ合成アッセイにおいて決定できる。この性質のアッセ
イによって、精製工程を介して活性ミトゲンを追跡する
ことが可能である。

【００１８】すなわち、短時間、例えば一晩、試験試料
および対照試薬の連続希釈に細胞を暴露する。次いで、
該細胞を細胞分裂をモニターするのに使用される標識化
合物に暴露する。標識化合物の例は、トリチウムチミジ
ンのような放射性標識ヌクレオチドである。刺激されて
分割される細胞において、純ＤＮＡ合成が生じ、標識Ｄ
ＮＡ前駆体が新しく形成された核酸に取込まれる。ＤＮ
Ａに取込まれた放射能の量は、液体シンチレーション計
数のように、技術認識された方法を使用して測定した。
一般的に、試料は、反復操作し、試料あたりの取込みの
平均レベルは目盛りの表示から決定される。データを分
析するための好都合な方法は、各反応に添加した試験試
薬の体積に対する標識取込みの平均量をプロットするこ
とである。

【００１９】ミトゲン活性はアッセイあたり約０.０１m
g／ミリリットルの蛋白で検出可能である。ミトゲン活
性は純度１０％よりも低い試料中約０.００１mg／ミリ
リットルの蛋白で検出可能である。該アッセイはナノグ
ラムのレベルでミトゲンを検出するのに充分敏感であ
る。

【００２０】ミトゲン活性について評価されるべき各試
験試料は、培養細胞について非細胞毒性であることが確
認されなければならない。かくして、分析前に、試験試
料を濾過殺菌し、該溶液を組成物において生理的に、す
なわち、塩濃度および他の生理的条件に払われると同様
の注意をもって約７.４のpＨにする。

【００２１】ミトゲンは種々の酵母菌株、特に種々のサ
ッカロミセス(Ｓaccharomyces)属から得ることができ
る。他の適切な種としては、サッカロミセス・ジアスタ
ティカス(Ｓ.diastaticus)およびサッカロミセス・ステ
イネリ(Ｓ.steineri)が挙げられる。特に有用なもの
は、ニュージャージー州イースト・ブランヅウィクのジ
スト−ブロケーズ・フード・イングリーディエンツ(Ｇi
st-Ｂrocades Ｆood Ｉntegredients)およびペンシルベ
ニア州ウィロウ・グロウブのユニバーサル・フーズ・コ
ーポレイション(Ｕniversal Ｆoods Ｃorporation)から
のような市販のビール酵母、サッカロミセス・セレビシ
ェ(Ｓ.cerevisiae)である。生酵母細胞をエタノールに
添加し、スラリーを約３時間またはそれ以上、約７０℃
でインキュベートする。該混合物を冷却し、特定の物質
を除去する。濾液を木炭または他の清澄剤で透明にす
る。透明剤の除去後、真空下でアルコールを蒸発させ、
粘性茶色のシロップを得る。

【００２２】さらなる精製の通常の第１処理は該シロッ
プの清澄化である。粗製エキスを水で希釈し、遠心分離
によって清澄化する。次いで、約１,０００分子量遮断
管［スペクトラム(Ｓpectrum)］中、約４℃で、清澄エ
キスを水または適切な生理緩衝液に対して透析する。有
効な精製工程として、清澄エキスを５００,０００ＭＷ
遮断管［スペクトラム(Ｓpectrum)］を使用して透析し
てもよい。透析物は実質的に純粋なミトゲンを含有して
おり、これをさらに精製することができる。

【００２３】所望により、透析物のpＨを約４またはそ
れ以下に低下させてミトゲンの沈澱を容易にする。約１
時間のインキュベーションの後、該沈澱物を取り出し、
生理的緩衝液中に溶解する。

【００２４】１,５００倍精製を得る方法はサイズ排除
クロマトグラフィーである。透析物または溶解された酸
沈澱物を、サイズによって分子を区別するゲル濾過マト
リックス上で分離する。このタイプのクロマトグラフィ
ーの例は、分子量３００,０００の排除限界を有する約
１０μmのアガロースビーズからなるスーペローズ(Ｓup
erose) １２ ＨＲ １０／３０のような架橋アガロース
マトリックスを使用するファルマシア(Ｐharmacia)(ニ
ュージャージー州ピスカタウエイ)のカラムフォーマッ
ト高速蛋白液体クロマトグラフィー(ＦＰＬＣ)システム
である。このシステムを使用するとボイド容積において
実質的に全てのミトゲン活性が回収され、ミトゲンが３
００,０００より大きい分子量を有することを示す。活
性ピークは、ブルーデキストラン(分子量約２,０００,
０００)と一緒に溶出し、分子量６６９,０００を有する
チログロブリンの前に測定可能に溶出する。したがっ
て、天然ミトゲンの分子量は、チログロブリンの分子量
よりも大きいと思われる。

【００２５】ミトゲン活性を含有するクロマトグラフィ
ーの画分は、蛋白について典型的である約２８０nmでの
最大紫外線吸光度(Ａ_max)を示さない。代わりに、波長
が３２０nmから２４０nmに変わると吸収が連続上昇す
る。ミトゲンは等量の標準蛋白のものの１０倍より大き
い２８０nmでの吸光度を有する。ミトゲンは大きい芳香
族内容物を有していてよく、したがって例外的に高い吸
光度または大きいＡ₂₈₀ピークは蛋白吸収によるもので
はない。

【００２６】ミトゲンは広範囲に温度耐性である。活性
は、１００℃で５分間の加熱処理によって、または凍結
乾燥の前およびその間じゅう冷凍することによって左右
されない。かくして、ミトゲンは凍結乾燥後の乾燥状態
で好都合に貯蔵される。

【００２７】透析およびスーペローズ(Ｓuperose) １２
ＨＲ １０／３０クロマトグラフィー後に得られた物質
は蛋白および炭水化物を約３：１の割合で含有する。

【００２８】炭水化物の存在は標準的な方法によって決
定される。例えば、８０％フェノール７０マイクロリッ
トルを試料２ミリリットルに添加する。次いで、濃硫酸
５ミリリットルを添加し、該溶液を室温で１０分間イン
キュベートする。４９０nmでの吸光度は分光光度計で確
かめる。

【００２９】蛋白の存在はニンヒドリンアッセイのよう
な標準的な方法によって、およびピアス(Ｐierce)から
商業的に得られ、かつ製造者の指示に従って使用される
ビシンコニン酸／硫酸銅試薬によっても決定される。試
料を加水分解すべき場合、試料２５０マイクロリットル
をポリプロピレン管に添加し、該管を１５０℃で加熱し
て乾固する。各管に１３.５Ｍ ＮaＯＨ １５０マイクロ
リットルを添加し、該溶液を１５ＰＳＩ(高速排気)で２
０分間オートクレーブ処理する。該管を冷却し、濃酢酸
２５０マイクロリットルを各管に添加する。次いで、該
管にニンヒドリン試薬［ピアス(Ｐierce)］５００マイ
クロリットルを添加し、次いで、加熱ブロック中で１０
０℃で１５分間加熱する。直後に該試料を冷却し、各管
に５０％エタノール２.５ミリリットルを添加する。ブ
ランクとして脱イオン水を使用して、５７０nmでの光学
濃度を読み取る。ロイシンの５００μg／ミリリットル
溶液を対照とすることができる。該試料を加水分解しな
い場合、ニンヒドリン試薬の添加前の工程は必要ない。
ポリプロピレン管に４００マイクロリットルの容量の非
加水分解試料を添加し、これとニンヒドリン試薬を混合
する。

【００３０】精製のこの段階で、すなわち、遠心分離、
透析、所望により酸沈澱およびサイズ排除高速液体クロ
マトグラフィーの後、１,５００倍レベルの精製が達成
される。該精製は、例えば他のゲル濾過カラム、イオン
交換カラム、アフィニティカラム、疎水性相互作用カラ
ムまたは逆相カラムの通過のような別のクロマトグラフ
ィーを含んでいてもよい。かくして、サイズ分離用に設
計された多孔性親水性シリカ支持体からなるバイオ−シ
ル(Ｂio−Ｓil) ＴＳＫ １２５カラム［バイオ−ラッド
(Ｂio−Ｒad)］またはＧ２０００ ＳＷカラム［トソ−
ハース(Ｔoso−Ｈaas)］に透析物または溶解した酸沈澱
物を適用する。ミトゲンはこのカラムに弱く結合する。

【００３１】該ミトゲンは、活性成分がモノ(Ｍono) Ｑ
陰イオン交換カラム［ファルマシア・エルケイビー(Ｐ
harmacia ＬＫＢ)］にしっかりと結合するので非常に陰
イオン性であろう。

【００３２】逆相クロマトグラフィーは、疎水性化合物
を分離するのに有用である。一般に、マトリックスは、
μmサイズ範囲のビーズによるシリカゲルおよびＣ結合
の種々の組み合わせによる１００〜３００Åのオーダー
の孔サイズからなる。例えば、１,５００倍精製ミトゲ
ンをシンクロパク(ＳynＣhropak)ＲＰ−８カラム［シン
クロム(ＳynＣhrom)］に適用してよい。

【００３３】逆相カラムから活性ピークを溶出するのに
必要とされる高濃度のアセトニトリルは、ミトゲンが疎
水性分子であることを示唆する。

【００３４】例えば以下に記載する有糸分裂誘発アッセ
イにおいて明らかにされるように、本発明化合物がミト
ゲン活性によって定義されることは理解されるであろ
う。したがって、本発明化合物は、ミトゲン活性が維持
される限り、サブユニットに減少され、短く切断され、
アミノ酸置換基を含有し、修飾して多少の炭水化物など
を含有することができる。ミトゲン活性は、本発明化合
物をここに記載の内皮細胞アッセイのような有糸分裂誘
発モニターシステムに暴露しない基線レベルと比較し
て、該モニターシステムにおいてＤＮＡ合成を刺激する
ことが可能であると定義される。

【００３５】実質的に純粋なミトゲンは医薬製剤の形態
で治療形式として使用することができる。該薬剤は有効
量のミトゲンおよび医薬的に許容される担体、希釈剤ま
たは補形剤からなる。ミトゲンの有効量は、適当な動物
モデル、好ましくは非ヒト霊長類における用量−応答曲
線を確立し、ヒトについて推定することによるか、また
は臨床試験における有効性を決定することによるような
技術認識された方法を使用して決定することができる。

【００３６】ミトゲンは経口、非経口および局所的のよ
うな種々の方法で投与することができる。投与量、治療
回数および治療期間は個体および疾病の重篤度に従って
変わるであろう。

【００３７】薬剤は、錠剤、カプセル、バルクまたは単
位投薬散剤もしくは顆粒剤のような種々の剤形を取るこ
とができ；リポソーム内に含有されてよく；または溶液
剤、乳濁液剤、懸濁液剤、軟膏、ペースト、クリーム、
ゲル、泡またはジェリー中に製剤化してよい。非経口投
与形態としては、溶液剤、懸濁液剤などが挙げられる。
薬剤は、種々の技術認識されている補形剤、希釈剤、充
填剤などのいずれかを含有すると思われる。このような
補助的な成分としては、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面
活性剤、乳化剤、緩衝剤、湿度調整剤、可溶化剤および
保存剤が挙げられる。技術者は、ミトゲンからなり、か
つグッドマン・アンド・ギルマン(Ｇoodman ＆ Ｇilma
n)のザ・ファーマシューティカル・ベイシス・オブ・セ
ラピューティクス(Ｔhe Ｐharmaceutical Ｂasis of Ｔ
herapeutics)［第６版、グッドマン(Ｇoodman)ら、編
集、ＭacＭillan Ｐubl.Ｃo.、ニューヨーク、１９８
０］のような多くの権威書および文献から教示を求める
適当な製剤を形成することができる。

【００３８】ミトゲンは、創傷治癒のような細胞増殖を
必要とする環境において治療的有用性を提供する。表皮
剥脱、裂傷、穿刺または他の外傷の場合、例えば、液
体、ゲルまたはクリームの形態で所定の有効量のミトゲ
ンを創傷部位に直接投与することができる。該ミトゲン
製剤は、単一で、または複数治療において投与すること
ができる。

【００３９】連続的な細胞増殖によって特徴付けられる
か、あるいは損傷または機能不全のために細胞増殖を必
要とし、皮膚ほど得易くはない身体部位において、該ミ
トゲンの有効な局所的濃度を確実にするために適してい
る形態で該ミトゲンを投与することができる。例えば、
ミトゲンは、デポー剤または補助剤中で注射するか、一
定時間かけて一定量のミトゲンを徐々に放出する外科的
移植またはリザーバー中に担持させるか、あるいはミト
ゲンを必要とする部位に結合することができる能力を有
する認識分子と複合されてよい。

【００４０】

【実施例】本発明は、以下の限定しない実施例において
さらに詳細に説明されるであろう。

【００４１】実施例１ スペルチ(Ｓperti)(前記)によって教示された方法を使
用して、粗製エキスを得た。すなわち、メタノール−変
性アルコール１７０３ｌを含有するジャケット付反応容
器に新しい生のパン酵母［サッカロミセス・セレビシェ
(Ｓaccharomyces cerevisiae)］１６３６kgを、撹拌し
ながら添加した。混合物をゆっくりと撹拌し、７０℃±
２℃で３時間、還流加熱した。撹拌し続けながら、該混
合物を５０℃に冷却し、セライト１１４kgを添加した。
該混合物を３５℃に冷却した後、真空濾過した。次い
で、該濾液に木炭１０kgを添加し、室温で１時間撹拌
し、次いで、セライト７.７kgを添加し、該混合物を真
空濾過した。真空下、アルコールを除去して、２５℃で
約１.１８g／ミリリットルの比重を有する水溶液を得
た。該溶液をゆっくりと撹拌し、９０℃で４時間加熱
し、３０〜３５℃に冷却し、セライト６８ｋｇおよび脱
イオン水３００ガロンから調製した加熱セライト濾過ケ
ーキを介して真空濾過した。濾液にセライト７.７kgを
添加し、濾過後、該溶液を１.２４〜１.３０g／ミリリ
ットルの比重に真空濃縮した。濃縮物を４０〜４１℃に
加熱し、セライト７.７kgおよび脱イオン水２５ガロン
から調製した濾過ケーキを含有する濾過プレスに通し
た。得られた酵母の香りを有する暗褐色のシロップは
１.２５〜１.３０g／ミリリットルの比重を有し、固体
を約４５〜６０％含有した。

【００４２】実施例２ 実施例１の粘性茶色の水性シロップからなる酵母誘導ア
ルコールエキスは、ニュージャージー州ハモントンのホ
ワイトホール・ラボラトリーズ(Ｗhitehall Ｌaborator
ies)から入手した。該シロップを２倍の容量の蒸留水で
希釈し、４３,０００×gで１時間の遠心分離によって清
澄化した。清澄化した上澄液を回収した。

【００４３】実施例３ 実施例２の試料を、１０００の分子量遮断を有する多孔
性膜管中に置き、次いで、透析緩衝液(１０mＭ硫酸ナト
リウム、pＨ７.０、１０mＭ塩化ナトリウム)４リットル
中に懸濁した。［透析膜は、ＳＰＥＣＴＲＡ−ＰＯＲ^R
系透析膜を配給しているカリフォルニア州ロサンジェル
スのスペクトラム・メディカル・インダストリーズ・イ
ンコーポレイテッド(Ｓpectrum Ｍedical Ｉndustries,
Ｉnc.)のような多くの供給源から商業的に入手可能であ
る。適切なＳＰＥＣＴＲＡ−ＰＯＲ^R透析管は１,０００
の分子量遮断を有するＳＰＥＣＴＲＡ−ＰＯＲ^R ６であ
る。一般に、該管はアジ化ナトリウムのような保存剤を
含有している水溶液中で輸送される。該透析管を脱イオ
ン水もしくは蒸留水または緩衝液で広範囲に洗浄して、
保存剤の全ての痕跡を除去する。該管の一端をクリップ
で止めるかまたは密封し、該管に試料を加え、管の残り
の端部を密封する。］次いで、緩衝液および透析バッグ
を含有するビーカーを磁気撹拌器の上に置き、概して、
４℃で維持した。緩衝液を定期的に取替え、透析を少な
くとも一晩進行させた。

【００４４】清澄エキスの透析によって、該して、ミト
ゲンの約１６倍精製が得られる。ミトゲンの存在および
活性は前記および次の実施例にさらに記載されるバイオ
アッセイを使用して決定した。

【００４５】実施例４in vitro アッセイを使用してミトゲン活性をモニターし
た。ウシ胎児心臓内皮細胞はアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃol
lection)から入手した(ＣＲＬ １３９５、公然と利用可
能な特許されていない細胞株)。該細胞を１０％ウシ胎
児血清および１００ng／ミリリットル線維芽細胞増殖因
子を補足したダルベッコ修飾イーグル培地(完全培地)中
に維持した。細胞を１週間に２回、スプリット比１：３
で通過させた。

【００４６】９６ウエルの微量滴定プレート中に該細胞
を、ウエルあたり１００マイクロリットルの容量でウエ
ルあたり約８,０００細胞で接種した。細胞が付着した
後、完全培地を０.５％血清を含有する培地１５０マイ
クロリットルと代えた。細胞を、これらの条件下で少な
くとも４８時間インキュベートした。次いで、試験薬物
５０マイクロリットルを添加してウエルを複製した。該
細胞を３７℃で約１８時間試験薬物に暴露した。５０マ
イクロリットルの容量の４μＣi／ミリリットルの濃度
のトリチウムチミジンを各ウエルに添加して、最終容量
２００マイクロリットルおよび最終濃度１μＣi／ミリ
リットルを得た。該混合物を３７℃で４時間インキュベ
ートした。次いで、該細胞をリン酸塩緩衝化食塩水で洗
浄し、次いで、０.１％ドデシル硫酸ナトリウムおよび
１mＭ ＥＤＴＡで溶解した。溶解産物を濾過板上で冷５
％トリクロロ酢酸で１２回洗浄して収穫した。濾過板を
取り出し、適切なカクテルを添加したシンチレーション
バイアル中に置いた。次いで、該試料を液体シンチレー
ションカウンターで測定した。代表的な実験からのデー
タを「図１」に示す。

【００４７】実施例５ 生理的pＨの透析したエキスを希塩酸の添加によってpＨ
３.５に酸性化した。４℃で１時間インキュベートした
後、沈澱物を遠心分離によって分離した。沈澱物をリン
酸塩緩衝化食塩水中に溶解した。バイオアッセイによっ
て測定すると、透析および酸沈殿によって清澄ミトゲン
の約２４０倍精製が得られた。

【００４８】実施例６ ＦＰＬＣシステムは、ファルマシア(Ｐharmacia)から配
給され、ポンプ、ＵＶモニターユニット、画分コレクタ
ーおよびレコーダーのような液体クロマトグラフィー装
置を含んでいる。カラムに予め詰められたスーペローズ
１２ ＨＲ １０／３０を使用した。クロマトグラフィ
ーは製造者の推奨に実質的に従って行った。

【００４９】すなわち、ポンプラインおよびカラムを緩
衝液、例えばＨＰＬＣグレード水中で調製した５００m
Ｍ ＫＣl、５０mＭ Ｔris、pＨ８および０.０２％アジ
化ナトリウムで洗浄した。カラムに適用する前に、該ミ
トゲン調製物を、０.２２ミクロンのフィルターを介し
て濾過殺菌した。内部標準としてトリプトファンを使用
した。(上記緩衝液中２.５mg／ミリリットルの濃度のト
リプトファン貯蔵溶液を調製した。１日あたり１つのア
リコットを使用した。）該カラムにミトゲンおよびトリ
プトファンを含有している試料を適用し、画分を回収し
た。一般に、トリプトファン標準は約２８ミリリットル
で溶出した。

【００５０】慣習に従って、流速０.５ミリリットル／
分で２８０nmでのＵＶモニターを使用して、３つのピー
クが見られた。最初にミトゲン活性を含有する小さい排
除ピークがあり、大きい離散第２ピークがあり、最後に
トリプトファン標準からなる離散第３ピークがあった
［「図２」；試料：Ｄ−ＬＹＣＤ ３３０マイクロリッ
トルおよびトリプトファン(２.５mg／ミリリットル)１
０マイクロリットルの混合液３００マイクロリット
ル］。

【００５１】プラスチック管中に画分を回収し、バイオ
アッセイにおいてミトゲン活性の表示によって測定した
場合にミトゲン活性を含有することが判明したものをプ
ールし、凍結乾燥した。凍結乾燥は、標準的な方法を使
用して行った。すなわち、該試料を少量のアリコットに
し、冷凍し、真空下に置いた。試料を、乾燥後、低温で
維持した。

【００５２】実施例７ 所望により、実施例４のミトゲンをＴＳＫサイズ排除樹
脂上で精製した。ミトゲンは４５％アセトニトリル、
０.１％トリフルオロ酢酸溶液からなる緩衝液中、ＴＳ
Ｋバイオ−シル(Ｂio−Ｓil)カラムに結合した。ミトゲ
ンは主たる不活性ピークよりも僅かに遅く溶出した。

【００５３】ミトゲンの酸沈澱物を、６０％アセトニト
リルおよび０.１％トリフルオロ酢酸の溶液中、ＴＳＫ
バイオ−シル(Ｂio−Ｓil)カラム上でクロマトグラフィ
ーによって約９倍精製した。しかし、ＴＳＫクロマトグ
ラフィーは、スーペローズ(Ｓuperose) １２生成物を充
分には精製しなかった。再度、バイオアッセイを使用し
て活性をモニターした。

【００５４】実施例８ 逆相カラムは、しばしば、疎水性における差異に基づい
て、蛋白の非常に高い分解精製を行うことができる。ス
ーペローズ(Ｓuperose) １２ クロマトグラフィー後の
活性画分を、０.０５Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム(p
Ｈ５.６)９５％およびアセトニトリル５％からなる水性
緩衝液で平衡化したＣ８逆相カラムに適用した。アセト
ニトリル濃度を５分間かけて４５％に増加させ、次い
で、９０分間かけて１００％に再度増加させた。溶出し
た蛋白を２８０nmでの吸光度によってモニターした。結
果、多くのピークが得られた(第３図)。バイオアッセイ
によって測定すると、ミトゲン活性は、ピークの特異的
なグループに限定される。画分を回収し、窒素流を伴う
蒸発によってアセトニトリルを除去し、該水溶液を凍結
乾燥した。

【００５５】本明細書に引用および詳述した刊行物およ
び文献は、引用によって明確に記載される。

【００５６】本発明の好ましい具体例を記載したが、本
発明の意図を逸脱せずに多くの変化および修飾をなすこ
とができることは当業者に明白であろう。かくして、記
載された具体例は、説明的であり、限定的ではないと考
えられるべきである。したがって、本発明の範囲は前記
によるよりもむしろ特許請求の範囲によって示される。
等価の意味および範囲内で起こる全ての変化は本発明の
範囲内に包含されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 有糸分裂誘発アッセイから得られたデータを
表すグラフ。

【図２】 スーペローズ(Ｓuperose) １２ ＨＲ １０／
３０カラムから溶離した２８０nm吸収性物質のクロマト
グラム。

【図３】 スーペローズ １２ カラムから得られ、かつ
逆相Ｃ８カラムを通過した蛋白のクロマトグラム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リチヤード・サイモン・ブロツデイ アメリカ合衆国43085オハイオ州ワーシン トン、アロウエイ・ストリート6775番

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して
   測定した約３００,０００ダルトンよりも大きい天然条
   件下での分子量を有する酵母から得られた実質的に純粋
   なミトゲン。
2. 【請求項２】 分子量が約６００,０００ダルトンより
   も大きい請求項１記載のミトゲン。
3. 【請求項３】 酵母がサッカロミセス・セレビシェ(Ｓa
   ccharomyces cerevisiae)である請求項１記載のミトゲ
   ン。
4. 【請求項４】 請求項１〜３いずれか１項記載のミトゲ
   ンを含有することによって特徴付けられる細胞増殖を刺
   激するための薬物。