JPH05137568A - 発酵法によるピルビン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】エシェリヒア属に属し、生育のためにリポ酸を
要求し、かつH+-ATPaseを欠失し、更にピルビン酸生産
能を有する変異株、並びに当該変異株を液体培地に培養
し、培養液中にピルビン酸を生成蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とする発酵法によるピルビン酸の製造
法 【効果】本発明の新規ピルビン酸生産菌を用いたピルビ
ン酸の発酵生産法では、従来に比べ、より安価でかつ効
率のよいピルビン酸発酵生産を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ピルビン酸生産菌及
び、これを用いてピルビン酸を発酵法により生産する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、ピルビン酸を発酵生産する微生物
は、細菌、かび、酵母に広く認められており、特に収量
の高いものとしては、コリネバクテリウム・エスピー
（嶋村睦夫，吉武寿一：農化誌 ,44 ,195-201 ,(197
0)）、アシネトバクター・エスピー（Y. Izumi, Y. Mat
umura, Y. Tani and H. Yamada: Agric.Biol. Chem.,4
6,2673-2679 ,(1982)）、カンディダ・リポリティカ
（内尾良輔，菊地健二，前尾敷勇，江井 仁，広瀬義
夫：日本農芸化学会大会講演要旨集，129 ,(1975)）、
トルロプシス・グラブラータ（米原 徹，宮田令子：日
本発酵工学会大会講演要旨集）等が知られている。

【０００３】これらの微生物はピルビン酸脱水素酵素複
合体の補酵素の一つであるチアミンの要求性を付与する
ことによりピルビン酸を生成蓄積せしめるようにされた
ものである。これに対して本発明者らは、エンテロバク
ター属に属し、この酵素のもう一つの補酵素であるリポ
酸を要求する変異株によってもピルビン酸生産が可能で
あることを初めて見いだし、既に報告した（A. Yokotaa
nd S. Takao:Agric.Biol. Chem., 53, 705-711 ,(198
9)）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ピル
ビン酸を短時間の培養において高収率、高蓄積量で生成
する新規ピルビン酸生産菌を取得し、安価かつ効率的な
発酵法によるピルビン酸の製造法を提供することであ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行なった結果、発酵法によるピ
ルビン酸生産においてリポ酸要求かつH+-ATPaseの欠失
変異株が糖消費速度、ピルビン酸生産速度、及び蓄積
量、収率を著しく高めることを見いだし、本発明を完成
するに至った。即ち本発明は、エシェリヒア属に属し、
生育のためにリポ酸を要求し、かつH+-ATPaseを欠失
し、更にピルビン酸生産能を有する変異株、並びに当該
変異株を液体培地に培養し、培養液中にピルビン酸を生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法
によるピルビン酸の製造法を提供するものである。

【０００６】本発明において使用される変異株は、リポ
酸要求かつH+-ATPaseの欠失を有する変異株である。具
体的に例示すると、エシェリヒア・コリ AJ12631 (FER
M P-12381)等が挙げられる。このような本発明で使用す
る変異株は、例えばエシェリヒア・コリのリポ酸要求株
を親株として、通常の変異操作、形質導入、形質転換等
によってH+-ATPaseの欠失を導入することによって得る
ことができる。

【０００７】リポ酸要求性の親株として具体的には、エ
シェリヒア・コリW1485 lip2 (ATCC25645)等が挙げられ
る。リポ酸要求性変異株の取得方法としては、通常の変
異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはN-メチル
-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸などの化学
薬剤処理を施し、変異処理した菌体を寒天平板培地で培
養し、リポ酸要求性となったコロニーを分離することに
よって得られる（A. A. Herbert and J. R. Guest: J.
Gen. Microbiol.,53 ,363-381 ,(1968)） 。

【０００８】このようなリポ酸要求性変異株に、例えば
形質導入により H+-ATPase の欠失を導入することによ
って本発明の変異株が得られるが、H+-ATPase欠失変異
を供与する株としてはエシェリヒア・コリ AN718（E. c
oli Genetic Stock Center Department of Biology ,Ne
w Havenより入手）等が挙げられる。H+-ATPase欠失変異
株は、例えば上記の通常の変異誘導操作を行い変異処理
した菌株のうち、コハク酸を唯一の炭素源とする寒天平
板培地で生育できず、グルコースを唯一の炭素源とする
平板培地で生育できる変異株を取得し、さらにこの中よ
りH+-ATPase活性を欠失している株を取得することによ
って得られる。

【０００９】また、H+-ATPaseは８種類のサブユニット
が複雑に集合した分子量約50万の膜結合性酵素であり、
ATPを加水分解して生じる自由エネルギー変化によってH
+を膜外に排出するポンプ機能と、細胞内呼吸により生
じた膜内外のH+の濃度勾配を利用してATPを合成する機
能とがある。またこの酵素は、膜内在性でH+輸送活性を
持つＦ0画分と、膜表在性でATPの分解及び合成を触媒す
るＦ1画分に分けられ、Ｆ0はa、b、cの３種、Ｆ1はα、
β、γ、δ、εの５種のサブユニットから構成されてい
る。形質導入するべき変異遺伝子はこれらのどのサブユ
ニットの物でもよい。

【００１０】本発明でピルビン酸を生産するために使用
する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応
じてアミノ酸、ビタミン、核酸などの有機微量栄養素を
含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源としては
使用する変異株の利用可能なものであればよく、例えば
グルコース、フラクトース、澱粉分解物糖蜜などの糖類
が使用され、その他菌株によっては、シュークロース、
マルトースや、エタノール、プロパノール等のアルコー
ル類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、ノルマルパラフィ
ン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使用される。

【００１１】窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、
硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有
機の窒素源が使用される。有機微量栄養素としてはアミ
ノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含
有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物
等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求
性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添す
ることが必要である。

【００１２】培養は好気的条件で行うことが望ましく、
培養期間中培地のpHを５乃至９、温度を20℃乃至40℃に
制御しつつ１日乃至４日間振とう培養または通気撹拌培
養することによりピルビン酸が蓄量培養液中に蓄積され
る。

【００１３】培養液からピルビン酸を採取する方法は公
知の方法に従って行えばよく、培養液から菌体を分離除
去した後、ピルビン酸塩として濃縮晶析する方法あるい
はイオン交換樹脂を用いる方法などにより採取される。

【００１４】

【実施例】以下、実施例をもとに更に具体的に説明す
る。

【００１５】（実施例１ ピルビン酸生成菌の取得）リ
ポ酸要求性ピルビン酸生産菌としてエシェリヒア・コリ
W1485 lip2(ATCC25645)(lip-)を選択し、H+-ATPaseの
Ｆ1のαサブユニットに変異を持つエシェリヒア・コリ
AN718 (CGSC6308) (F-, entA403, pyrE41, atpA401, ar
gH1,rspL109,λ-, supE44)の変異遺伝子であるatpA401
を供与遺伝子としてP1kcファージによって形質導入する
ことにより、リポ酸要求性かつ H+-ATPase が欠失した
変異株エシェリヒア・コリAJ12631(FERM P-12381)を取
得した。

【００１６】まず、エシェリヒア・コリ AN718株由来の
H+-ATPase欠失変異を、リポ酸要求性ピルビン酸生産菌
であるエシェリヒア・コリ W1485 lip2(ATCC25645)(lip
-)に形質導入し目的株を選択する際、コロニー１個づつ
について、直接H+-ATPase欠失の有無を調べるには多大
の労力を必要とする。そこで効率よく目的株を得るため
に、atpA401遺伝子（83分）の近傍に位置するbgl遺伝子
（82-83分）をマーカーとして利用することにした。bgl
遺伝子はホスホ−β−グルコシダーゼをコードしてお
り、この遺伝子上に変異を持つエシェリヒア・コリは、
通常資化することのできないサリシンを唯一の炭素源と
して生育できるようになり、平板培地にBromothymol bl
ue(BTB)を添加しておくとサリシン資化性株のコロニー
は自ら生産した有機酸によって黄色に着色する。このこ
とを利用して、変異bgl遺伝子(bgl+)とatpA401遺伝子を
P1kc（IFO20008）によって連鎖形質導入すれば、サリ
シンを唯一の炭素源とする培地で生育できることを示標
として、ポジティブ・セレクションにより効率よくH+-A
TPase欠失変異株を選択することができる。

【００１７】そこでまず、AN718株からのサリシン資化
性(bgl+)株の分離を行った。分離は次のように行なっ
た。まず、L-brothで37℃一夜培養したAN718株を、炭素
源をサリシン5 g/lとし、BTBを0.2 g/l添加した表１に
示したAN718培地に107-108cells/ plateの菌体を塗抹
接種して、37℃で２日間培養後に出現した黄色のコロニ
ーを釣り上げた。このようにして取得した株をAN718(bg
l+)とした。

【００１８】

【表１】

【００１９】上記のようにして取得したAN718(bgl+)
が、Ｆ1-ATPase活性を欠失していることの確認をおこな
った。確認の方法は、AN718(bgl+)株のコハク酸非資化
性を確認し、さらにＦ1-ATPase活性を測定することによ
って行った。

【００２０】コハク酸非資化性については、H+-ATPase
欠失変異株が基質レベルのリン酸化によってATPを獲得
できるグルコースのような炭素源には生育できるが、コ
ハク酸のような炭素源ではそれができないため生育でき
ないことを利用してＦ1-ATPase活性の欠失を確認してい
る。実際、炭素源をグルコースあるいはコハク酸とした
AN718培地にエシェリヒア・コリAN718(bgl+)を塗抹接種
した結果、グルコース資化性は有するが、コハク酸資化
性の無いことを確認した。

【００２１】またこの株のＦ1-ATPase活性を小林の方法
で測定した。本法はATPから遊離するリン酸を硫酸酸性
下でモリブデンと反応呈色させ、そのＯＤ660を測定す
ることを原理とするが、膜からＦ1成分を遊離させて活
性測定することから、Ｆ0成分の変化は確認されず、Ｆ1
-ATPase活性のみを測定することができる。H+-ATPaseＦ
1標品の調製法を以下に示した。なお操作はすべて４℃
または氷冷下で行った。

【００２２】まずL-brothで対数増殖後期まで培養した
菌体を9000rpm、４℃、５分間の遠心分離で集め、30mM
NaClを含む10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.20)で３回洗浄
後、湿菌体１gに対して５mlの２mMのトリス塩酸緩衝液
(pH7.20)に懸濁した。この４mlを20W、５分間超音波処
理し、10000g、10分間の遠心で未破壊細胞を取り除いた
後、上澄みを更に30000g、40分間遠心して膜画分を得
た。これを１g当り30mlの2mMトリス塩酸緩衝液(pH7.20)
に再懸濁し、再び30000g、40分間遠心してその上澄みに
メタノールを20%となるように添加したものをATPase Ｆ
1標品とした。反応は2.5mM ATP、1mM塩化マグネシウ
ム、10μg/lアルブミンを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH
8.40)550μlにＦ1標品50μlを添加し、37℃で開始し
た。反応10分後、0.1N塩酸溶液の添加と同時に氷冷して
反応を停止させ、リン酸発色液2.1mlを加え、室温で10
分間放置し、直ちにＯＤ660を測定した。リン酸発色液
は5N硫酸、25g/lモリブデン酸アンモニウム塩、10g/l
p-メチルアミノフェノールスルフェート＋30g/l硫酸水
素ナトリウム、脱塩水を1:1:1:4(V/V)の割合で使用前に
混合した。活性は１分間に１μmoleのATPを分解する酵
素量を１ユニットとし、比活性はタンパク質１mg当りの
ユニット数として表示した。タンパク質の定量はバイオ
ラッドプロテインアッセイキットによって行った。測定
結果は表２に示した通りで AN718 (bgl+)株は親株AN71
8と同様Ｆ1-ATPase活性が欠失していることが確認され
たのでH+-ATPase欠失変異の供与株として用いることに
した。

【００２３】

【表２】

【００２４】次に W1485lip2 株へのH+-ATPase欠失変異
の導入を行った。AN718 (bgl+)株にP1kcを常法通り感染
させ、5.3×109PFU/mlの溶菌液を得た。このlysateを用
いてW1485lip2株に形質導入を行った。すなわちW1485li
p2のL-broth一夜培養液に塩化カルシウムを10mMになる
ように添加し、ファージ液をmoi(multiplicity of infe
ction)が0.2-0.02になるようにL-brothで希釈したもの
と0.5mlづつ混合して、37℃で15ー20分ファージを吸着さ
せた。これにクエン酸ナトリウムを10mMになるように添
加して遠心集菌後、10mMクエン酸ナトリウムを含む生理
食塩水で３回洗浄し、この0.1mlづつを、炭酸源をサリ
シン5g/lに置き換え、BTB 0.2g/l、DL-リポ酸20μg/l
を含むM9平板培地に塗抹し、37℃で２日培養した。その
結果、W1485lip2のサリシン資化性株の自然突然変異株
出現率が1×10-7であるのに対し形質導入を行った場合
にはmoi0.2で、3×10-5、moi0.02で1.25×10-6と10-100
倍高い頻度であった。これらのサリシン資化性コロニー
を同じ培地でコロニー分離し、分離株を塗抹試験によっ
てコハク酸の非資化性及び親株の性質であるリポ酸要求
性の確認を行った。コハク酸の非資化性については、炭
素源をグルコースあるいはコハク酸とし、DL-リポ酸20
μg/l、カザミノ酸1g/lを添加したM9平板培地での生
育、リポ酸要求性はM9平板培地にDL-リポ酸20μg/l添
加、無添加での生育を調べることで判定した。その結
果、コハク酸非資化性かつリポ酸要求性を示す菌株とし
てエシェリヒア・コリAJ12631が得られ、この株のＦ1-A
TPase活性を上記方法で測定したところ、表２に示した
ように活性が検出されなかった。

【００２５】（実施例２ 発酵法によるピルビン酸の生
産）エシェリヒア・コリAJ12631株のピルビン酸生産能
をジャーファーメンターを用いて培養評価し、親株W148
5lip2と比較した。培養方法は次の通りである。培養温
度はすべて37℃である。W1485lip2株は、LA培地（表
３）にDL-リポ酸を20μg/l添加した寒天平板培地で一夜
培養した菌体１白金耳分を、DL-リポ酸を２μg/l含むLB
培地（表４）120mlに接種し18時間振とう培養して前培
養菌液を得た。またAJ12631株はLuria broth培地にDL-
リポ酸20μg/lと寒天20 g/lを含む寒天平板培地で一夜
培養後、菌体１白金耳分を、グルコース2g/lおよびDL-
リポ酸2μg/lを添加した120mlのLB培地に接種し、18時
間振とう培養し前培養菌液を得た。また比較のため親株
もAJ12631と同じグルコース添加培地で培養して前培養
菌液を調製した。ジャー培養用のピルビン酸生産培地の
組成は表５に示した。この培地３lを５l容のミニジャー
ファーメンターに分注し、120℃、10分間滅菌した。前
培養菌液120ml全量を接種し、通気３l/min、撹拌600rp
m、３N NaOHでpH6.0にコントロールしつつ、培養した。
培養中発泡が激しいときには消泡剤(LG109,旭電化製)を
一滴添加した。培養液中のピルビン酸はHPLC、グルコー
スはグルコースオキシダーゼによる酵素法、生育はＯＤ
590によって測定した。その結果、表６に示したよう
に、AJ12631では親株に比べて著しいピルビン酸生産性
の向上が認められた。すなわち、ピルビン酸生産量は親
株W1485lip2が前培養にグルコース無添加で48時間後に1
4.3g/l、前培養にグルコースを添加した場合が40時間で
12.7g/lであったのに対し、AJ12631株では40時間でグル
コースを消費し、最大生産量が29.2g/lと、糖消費促
進、ピルビン酸生産量および速度の著しい向上が認めら
れた。

【００２６】

【表３】

【００２７】

【表４】

【００２８】

【表５】

【００２９】

【表６】

【００３０】さらにこの表６の結果から、残糖を10g/l
以上残しピルビン酸蓄積量の上昇する時点でのグルコー
ス消費量当りの菌体形成量(生育／ク゛ルコース)と、ピルビ
ン酸生成量(ヒ゜ルヒ゛ン酸／ク゛ルコース)をそれぞれ算出し、
その比を求めて菌体当りのピルビン酸生成量(ヒ゜ルヒ゛ン
酸／生育)を表７に示した。

【００３１】

【表７】

【００３２】消費糖（グルコース）当りの生育及びピル
ビン酸収率とその比を見てみると、グルコース1g当りの
生育量は、親株W1485lip2（グルコース無添加前培養）
の方がAJ12631よりも1.4倍高いのに対し、ピルビン酸蓄
積量はAJ12631の方が2.0倍も親株より高く、菌体当りの
ピルビン酸生産量ではAJ12631の方が2.8倍も高かった。
さらに、理論的にはグルコース１モルから２モルのピル
ビン酸が生成するが、菌体形成にグルコースが使われた
ことを無視してピルビン酸のモル収率を求めると、W148
5lip2、AJ12631はそれぞれ33%,65%となり、H+-ATPase欠
失変異を付与することによって、グルコースからピルビ
ン酸への転換効率が高められることが分かった。

【００３３】このように、AJ12631に代表されるリポ酸
要求性かつH+-ATPase欠失変異株でピルビン酸が蓄積す
るのには、エネルギー獲得が効率の悪い基質レベルのリ
ン酸化のみとなるため、菌体内のATPレベルが低下し、
結果として解糖系が活性化されるためであると推定され
る。

【００３４】

【発明の効果】本発明において使用される変異株は親株
に比べて著しいピルビン酸生産性の向上が認められた。
すなわち、ピルビン酸蓄積量増大、糖消費促進、ピルビ
ン酸生産速度の著しい向上が認められた。また、グルコ
ースからピルビン酸への転換効率も高められた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エシェリヒア属に属し、生育のためにリ
   ポ酸を要求し、かつH+-ATPaseを欠失し、更にピルビン
   酸生産能を有する変異株
2. 【請求項２】 請求項１記載の変異株を液体培地に培養
   し、培養液中にピルビン酸を生成蓄積せしめ、これを採
   取することを特徴とする発酵法によるピルビン酸の製造
   法