JPH05137580A - 新規なプロテインおよびそれをコードする遺伝子 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 アメリカヤマゴボウ由来の抗ウィルス活性を
有する、新規なプロテインおよびそれをコードする遺伝
子。 【効果】 季節、天候などによって影響を受けず、安定
して、リシンと同程度の試験管内蛋白質合成阻害活性等
を持つ新規なＰＡＰを供給することができる。
有する、新規なプロテインおよびそれをコードする遺伝
子。 【効果】 季節、天候などによって影響を受けず、安定
して、リシンと同程度の試験管内蛋白質合成阻害活性等
を持つ新規なＰＡＰを供給することができる。
Description
【０００１】
【０００２】本発明は新規なプロテインおよびそれをコ
ードする遺伝子に関し、例えば、アメリカヤマゴボウの
組織から得られる塩基性蛋白質である新規なポークウィ
ードアンチバイラルプロテイン（以下、ＰＡＰという）
およびそれをコードする遺伝子に関する。
ードする遺伝子に関し、例えば、アメリカヤマゴボウの
組織から得られる塩基性蛋白質である新規なポークウィ
ードアンチバイラルプロテイン（以下、ＰＡＰという）
およびそれをコードする遺伝子に関する。
【０００３】本発明の新規なＰＡＰは、農業および園芸
の分野において、ウィルス病の防除に利用することがで
きる。
の分野において、ウィルス病の防除に利用することがで
きる。
【０００４】また、本発明の新規なＰＡＰは、医薬の分
野において癌の治療において用いられるミサイル療法等
に利用することが期待できる。
野において癌の治療において用いられるミサイル療法等
に利用することが期待できる。
【０００５】
【０００６】癌の治療において種々の治療法が用いられ
てきたが、最近ミサイル療法と呼ばれる新たな治療法が
開発された。
てきたが、最近ミサイル療法と呼ばれる新たな治療法が
開発された。
【０００７】該ミサイル療法は、癌細胞のみを認識する
抗体に、強い細胞毒性を持つ物質を結合させ、該毒性物
質を目標となる癌細胞に集中させて効率的に癌の治療を
行なう方法である。
抗体に、強い細胞毒性を持つ物質を結合させ、該毒性物
質を目標となる癌細胞に集中させて効率的に癌の治療を
行なう方法である。
【０００８】現在このミサイル療法の核弾頭として、強
い試験管内蛋白質合成阻害活性をもつリシンが使用され
ている。
い試験管内蛋白質合成阻害活性をもつリシンが使用され
ている。
【０００９】ところで、リシンに変わる新たな核弾頭と
して、リシンと同程度の試験管内蛋白質合成阻害活性を
持つＰＡＰを利用することが期待されている。
して、リシンと同程度の試験管内蛋白質合成阻害活性を
持つＰＡＰを利用することが期待されている。
【００１０】また、ＰＡＰは単独使用で、エイズウィル
スの増殖を阻害することも知られており、新たな抗エイ
ズウィルス薬としての利用も期待されている。
スの増殖を阻害することも知られており、新たな抗エイ
ズウィルス薬としての利用も期待されている。
【００１１】このようなＰＡＰは、現在、アメリカヤマ
ゴボウの種子、葉および根より単離精製することで得ら
れている。
ゴボウの種子、葉および根より単離精製することで得ら
れている。
【００１２】
【００１３】しかし、上記のようにアメリカヤマゴボウ
の種子、葉および根より単離精製してＰＡＰを得るため
には、アメリカヤマゴボウの栽培が前提となる。
の種子、葉および根より単離精製してＰＡＰを得るため
には、アメリカヤマゴボウの栽培が前提となる。
【００１４】そのため、目的とするＰＡＰの供給量は、
アメリカヤマゴボウの栽培が季節、天候などによって左
右されると不安定となり、しかも、ＰＡＰを得るための
精製も容易なものではない。
アメリカヤマゴボウの栽培が季節、天候などによって左
右されると不安定となり、しかも、ＰＡＰを得るための
精製も容易なものではない。
【００１５】従って、季節、天候などによって影響を受
けず、安定して供給することが可能な、リシンと同程度
の試験管内蛋白質合成阻害活性等を持つ新規なＰＡＰが
望まれていた。
けず、安定して供給することが可能な、リシンと同程度
の試験管内蛋白質合成阻害活性等を持つ新規なＰＡＰが
望まれていた。
【００１６】本発明は、真核生物に対し強い細胞毒性を
持つ化学物質を微生物等（例えば大腸菌など）で生産さ
せることにより、季節、天候などに影響されずに安定し
て供給可能な新規なＰＡＰを得ることを目的とする。
持つ化学物質を微生物等（例えば大腸菌など）で生産さ
せることにより、季節、天候などに影響されずに安定し
て供給可能な新規なＰＡＰを得ることを目的とする。
【００１７】また、本発明は、形質転換植物において、
時期および器官特異的に目的遺伝子を発現させることが
可能な塩基配列の遺伝子を供給することを目的とする。
時期および器官特異的に目的遺伝子を発現させることが
可能な塩基配列の遺伝子を供給することを目的とする。
【００１８】
【００１９】本発明者らは上記の目的を達成するため
に、アメリカヤマゴボウの種子、葉および根に含まれる
ｍＲＮＡを抽出し、これを鋳型として既に知られている
ＰＡＰ−Ｓのアミノ酸配列をもとに作製した合成プライ
マーを用いてポリメレースチェインリアクション（Poly
merase Chaine Reaction）（以下、ＰＣＲと略す）によ
り部分ｃＤＮＡを合成した。
に、アメリカヤマゴボウの種子、葉および根に含まれる
ｍＲＮＡを抽出し、これを鋳型として既に知られている
ＰＡＰ−Ｓのアミノ酸配列をもとに作製した合成プライ
マーを用いてポリメレースチェインリアクション（Poly
merase Chaine Reaction）（以下、ＰＣＲと略す）によ
り部分ｃＤＮＡを合成した。
【００２０】これをプローブとしてアメリカヤマゴボウ
の染色体ＤＮＡライブラリーより目的タンパク質をコー
ドする領域とそれに付随する領域を単離し、塩基配列を
決定した。
の染色体ＤＮＡライブラリーより目的タンパク質をコー
ドする領域とそれに付随する領域を単離し、塩基配列を
決定した。
【００２１】即ち、本発明の課題を解決するための手段
は、下記の通りである。
は、下記の通りである。
【００２２】第１に、配列表の配列番号１のアミノ酸配
列中、１〜２６１で示されるアミノ酸配列を有する、新
規なプロテインである。
列中、１〜２６１で示されるアミノ酸配列を有する、新
規なプロテインである。
【００２３】第２に、配列表の配列番号１のアミノ酸配
列中、１〜２６１で示されるアミノ酸配列をコードす
る、遺伝子である。
列中、１〜２６１で示されるアミノ酸配列をコードす
る、遺伝子である。
【００２４】第３に、配列表の配列番号１の塩基配列
中、１０８６〜１８６８の塩基配列で示される、遺伝子
である。
中、１０８６〜１８６８の塩基配列で示される、遺伝子
である。
【００２５】第４に、配列表の配列番号１の塩基配列
中、１０１４〜１８９５の塩基配列で示される、発現型
遺伝子である。
中、１０１４〜１８９５の塩基配列で示される、発現型
遺伝子である。
【００２６】以下に順をおって詳細に説明する。
【００２７】ＰＡＰのｍＲＮＡを含む全ｍＲＮＡは、ア
メリカヤマゴボウの種子、葉および根から得られる。
メリカヤマゴボウの種子、葉および根から得られる。
【００２８】全ＲＮＡの抽出は常法によればよく、フェ
ノール抽出、チオシアン酸グアニジン溶液中での抽出、
塩化セシウム抽出などの操作を単独あるいは適宜併用す
ればよい。
ノール抽出、チオシアン酸グアニジン溶液中での抽出、
塩化セシウム抽出などの操作を単独あるいは適宜併用す
ればよい。
【００２９】本発明において、一般的にはアメリカヤマ
ゴボウの組織にチオシアン酸グアニジンを含むトリス緩
衝液を加えてホモジナイザー（ポリトロン社製）で磨砕
し、遠心分離により液体画分を得る。
ゴボウの組織にチオシアン酸グアニジンを含むトリス緩
衝液を加えてホモジナイザー（ポリトロン社製）で磨砕
し、遠心分離により液体画分を得る。
【００３０】これを塩化セシウムを含む緩衝液に重層
し、超遠心分離によって全ＲＮＡを得る。
し、超遠心分離によって全ＲＮＡを得る。
【００３１】全ｍＲＮＡの精製は常法によればよく、オ
リゴｄＴセルロースカラムまたはオリゴテックスｄＴ−
３０を用いて全ＲＮＡより精製する。
リゴｄＴセルロースカラムまたはオリゴテックスｄＴ−
３０を用いて全ＲＮＡより精製する。
【００３２】本全ｍＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴプラ
イマー存在下で逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成
した。
イマー存在下で逆転写酵素により第一鎖ｃＤＮＡを合成
した。
【００３３】このｃＤＮＡを既に知られているＰＡＰ−
Ｓのアミノ酸配列をもとに作製した合成プライマーを用
いてＰＣＲに供したところ、反応生成物を得た。
Ｓのアミノ酸配列をもとに作製した合成プライマーを用
いてＰＣＲに供したところ、反応生成物を得た。
【００３４】この反応生成物を、プラスミドベクターに
クローニングし複数の独立クローンを得た。
クローニングし複数の独立クローンを得た。
【００３５】これらクローンの一部の全塩基配列を決定
し、コンピューターを用いてこれら塩基配列を解析し、
ＰＡＰ−Ｓのアミノ酸配列と高い相同性を示すアミノ酸
配列を持つ蛋白質をコードすることが可能なＤＮＡ断片
を２個得た。
し、コンピューターを用いてこれら塩基配列を解析し、
ＰＡＰ−Ｓのアミノ酸配列と高い相同性を示すアミノ酸
配列を持つ蛋白質をコードすることが可能なＤＮＡ断片
を２個得た。
【００３６】染色体ＤＮＡの単離精製は常法によればよ
く、本染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全分解も
しくは部分分解する。
く、本染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全分解も
しくは部分分解する。
【００３７】分解されたＤＮＡをシュウクロース溶液に
よる密度勾配遠心により、ＤＮＡ断片の大きさにより分
画した。
よる密度勾配遠心により、ＤＮＡ断片の大きさにより分
画した。
【００３８】得られた分画に存在するＤＮＡの大きさを
アガロース電気泳動により確認し、７−２３キロベース
ペアの大きさを持つＤＮＡを含む分画を集めエタノール
沈澱を行なった。
アガロース電気泳動により確認し、７−２３キロベース
ペアの大きさを持つＤＮＡを含む分画を集めエタノール
沈澱を行なった。
【００３９】本ＤＮＡをクローニングベクターＥＭＢＬ
３に組み込んだ。
３に組み込んだ。
【００４０】組み換えＥＭＢＬ３ＤＮＡを試験管内でパ
ッケイジングした後、宿主大腸菌ＰＬＫ−１７（Ｐ２）
に感染させた。
ッケイジングした後、宿主大腸菌ＰＬＫ−１７（Ｐ２）
に感染させた。
【００４１】この組み換えファージをソフト寒天に包埋
後、寒天培地にまき一夜培養することにより、多数の組
み換えファージ（染色体ＤＮＡライブラリー）を得た。
後、寒天培地にまき一夜培養することにより、多数の組
み換えファージ（染色体ＤＮＡライブラリー）を得た。
【００４２】この染色体ＤＮＡライブラリーをＰＣＲに
よって得られた部分ＰＡＰｃＤＮＡをプローブとして、
常法によりプラークハイブリダイゼーションを行ない、
プローブとハイブリダイズする複数個の独立した、組み
換えファージを得た。
よって得られた部分ＰＡＰｃＤＮＡをプローブとして、
常法によりプラークハイブリダイゼーションを行ない、
プローブとハイブリダイズする複数個の独立した、組み
換えファージを得た。
【００４３】これらファージをプラークハイブリダイゼ
ーションを繰り返すことにより単一のファージに精製し
た。
ーションを繰り返すことにより単一のファージに精製し
た。
【００４４】これらファージをＬＥ３９２に感染後、プ
レートライセート法によりファージを増殖させ、常法に
より組み換えファージＤＮＡを抽出した。
レートライセート法によりファージを増殖させ、常法に
より組み換えファージＤＮＡを抽出した。
【００４５】本組み換えファージＤＮＡを種々の制限酵
素で切断しサザンハイブリダイゼーション分析を行な
い、制限酵素の切断様式により分類した。
素で切断しサザンハイブリダイゼーション分析を行な
い、制限酵素の切断様式により分類した。
【００４６】各グループを代表するファージＤＮＡを制
限酵素ＢａｍＨＩで切断し、プラスミドベクターのＢａ
ｍＨＩサイトにクローニングし、ダイデオキシ法で塩基
配列を決定した。
限酵素ＢａｍＨＩで切断し、プラスミドベクターのＢａ
ｍＨＩサイトにクローニングし、ダイデオキシ法で塩基
配列を決定した。
【００４７】これら塩基配列をコンピューターを用いて
解析したところ、部分ＰＡＰｃＤＮＡと同一の塩基配列
を示すクローンを認めることができた。
解析したところ、部分ＰＡＰｃＤＮＡと同一の塩基配列
を示すクローンを認めることができた。
【００４８】本遺伝子にコードされる蛋白質には、成熟
ＰＡＰには存在しないシグナルペプチドと予想される比
較的短いペプチドがＮ−末端に認められ、成熟ＰＡＰに
は存在しない比較的短いペプチドがＣ−末端に認められ
た。
ＰＡＰには存在しないシグナルペプチドと予想される比
較的短いペプチドがＮ−末端に認められ、成熟ＰＡＰに
は存在しない比較的短いペプチドがＣ−末端に認められ
た。
【００４９】
【実施例】以下に、実施例により、本発明を詳細に説明
する。
する。
【００５０】［実施例１］（全ＲＮＡの精製）
【００５１】アメリカヤマゴボウの種子、葉および根の
各組織１０ｇずつを、液体窒素で急速凍結した後、粉砕
器（鶴田科学社製）を使用して粉状にした。
各組織１０ｇずつを、液体窒素で急速凍結した後、粉砕
器（鶴田科学社製）を使用して粉状にした。
【００５２】これを４Ｍグアニジン酸チオシアネイト、
０．５％サルコシン、０．１％２−メルカプトルエタノ
ールを含む２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で
ホモジナイザー（ポリトロン社製）を使用して磨砕し
た。
０．５％サルコシン、０．１％２−メルカプトルエタノ
ールを含む２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で
ホモジナイザー（ポリトロン社製）を使用して磨砕し
た。
【００５３】得られた磨砕液を、高速遠心機ＣＸ２１０
（トミー社製）でアングルローター（Ｎｏ．１２Ｎ）を
用いて１００００ｒｐｍ，４℃で１５分間遠心分離し、
上清を回収した。
（トミー社製）でアングルローター（Ｎｏ．１２Ｎ）を
用いて１００００ｒｐｍ，４℃で１５分間遠心分離し、
上清を回収した。
【００５４】２０ｍｌの本上清を１５ｍｌの５．７Ｍ塩
化セシウムを含む２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に重層し、分離用超遠心機（日立社製）でスイング
ローター（ＳＲＰ２８ＳＡ）を用いて２８０００ｒｐ
ｍ、１２℃で１５時間超遠心分離することにより、全Ｒ
ＮＡを沈澱物として回収し、１ｍｌの滅菌水に溶解し
た。
化セシウムを含む２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に重層し、分離用超遠心機（日立社製）でスイング
ローター（ＳＲＰ２８ＳＡ）を用いて２８０００ｒｐ
ｍ、１２℃で１５時間超遠心分離することにより、全Ｒ
ＮＡを沈澱物として回収し、１ｍｌの滅菌水に溶解し
た。
【００５５】［実施例２］（全ｍＲＮＡの精製）
【００５６】全ＲＮＡ３０μｌ（１００μｇの全ＲＮＡ
を含む）に、終濃度１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
０）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳとなるように全
量５０μｌに調製した。
を含む）に、終濃度１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
０）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳとなるように全
量５０μｌに調製した。
【００５７】これに等量のオリゴテックス−ｄＴ３０
（日本合成ゴム株式会社製）を加え、６５℃で５分間加
熱後、氷中で５分間急冷した。
（日本合成ゴム株式会社製）を加え、６５℃で５分間加
熱後、氷中で５分間急冷した。
【００５８】これに２０μｌの５Ｍ塩化ナトリウム溶液
を添加し、３７℃で１０分間加熱した。
を添加し、３７℃で１０分間加熱した。
【００５９】卓上遠心器ＭＲＸ−１５０（トミー社製）
でアングルローター（ＴＭＡ−４）を用いて１５０００
ｒｐｍ，２０℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去
した。
でアングルローター（ＴＭＡ−４）を用いて１５０００
ｒｐｍ，２０℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去
した。
【００６０】沈澱物を１００μｌの滅菌水に懸濁後良く
分散させた後、６５℃で５分間加熱した。
分散させた後、６５℃で５分間加熱した。
【００６１】これを前述の卓上遠心器とアングルロータ
ーで１５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分間遠心分離する
ことにより、上清を得た。
ーで１５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分間遠心分離する
ことにより、上清を得た。
【００６２】これに１０μｌの１０Ｍ塩化リチウムと２
５０μｌのエタノールを加え、−８０℃で３０分間冷却
し、前述の卓上遠心器とアングルローターにより１５０
００ｒｐｍ，−１０℃で１０分間遠心分離することによ
り全ｍＲＮＡを沈澱物として回収した。１００μｌのエ
タノールを加え同条件で遠心分離し，エタノールを除去
した後沈澱を乾燥させ１０μｌの滅菌水に溶解した。
５０μｌのエタノールを加え、−８０℃で３０分間冷却
し、前述の卓上遠心器とアングルローターにより１５０
００ｒｐｍ，−１０℃で１０分間遠心分離することによ
り全ｍＲＮＡを沈澱物として回収した。１００μｌのエ
タノールを加え同条件で遠心分離し，エタノールを除去
した後沈澱を乾燥させ１０μｌの滅菌水に溶解した。
【００６３】［実施例３］（ＰＣＲによる部分ＰＡＰｃ
ＤＮＡの合成）
ＤＮＡの合成）
【００６４】実施例２で得られた全ｍＲＮＡを２０μｌ
の反応液中で１μｌの１μＭのオリゴｄＴプライマー
（ファルマシア社製）、２μｌの各１００μＭのｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（宝酒造社製）、１
０ユニットの人胎盤由来のアールエヌエース阻害剤（フ
ァルマシア社製）、１μｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ベ
セスダリサーチ社製）存在下で酵素に添付されてきた反
応緩衝液を用いて４２℃、６０分間インキュベートする
ことにより第一鎖ｃＤＮＡを合成した。
の反応液中で１μｌの１μＭのオリゴｄＴプライマー
（ファルマシア社製）、２μｌの各１００μＭのｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（宝酒造社製）、１
０ユニットの人胎盤由来のアールエヌエース阻害剤（フ
ァルマシア社製）、１μｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ベ
セスダリサーチ社製）存在下で酵素に添付されてきた反
応緩衝液を用いて４２℃、６０分間インキュベートする
ことにより第一鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００６５】本反応液に８０μｌの滅菌水と１００μｌ
のフェノール／クロロフォルムを加え攪拌後，前述の卓
上遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，２０
℃で１０分遠心し２層に分離させた。上層の水層を取り
これに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと３００μｌのエ
タノールを加え攪拌後−８０℃で冷却した。前述の卓上
遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１０
℃で１０分遠心しｃＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７
０％エタノールを２００μｌ加え同条件で遠心分離後，
本エタノールを除去し本第一鎖ｃＤＮＡを乾燥させた。
本第一鎖ｃＤＮＡを１０μｌの滅菌水に溶解した。
のフェノール／クロロフォルムを加え攪拌後，前述の卓
上遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，２０
℃で１０分遠心し２層に分離させた。上層の水層を取り
これに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと３００μｌのエ
タノールを加え攪拌後−８０℃で冷却した。前述の卓上
遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１０
℃で１０分遠心しｃＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７
０％エタノールを２００μｌ加え同条件で遠心分離後，
本エタノールを除去し本第一鎖ｃＤＮＡを乾燥させた。
本第一鎖ｃＤＮＡを１０μｌの滅菌水に溶解した。
【００６６】本第一鎖ｃＤＮＡ、ＤＮＡシンセサイザー
（ＡＢＩ社製）により作成した１μｌの１μＭの合成Ｄ
ＮＡプライマー（プライマー１）、１μｌの１μＭのオ
リゴｄＴプライマー（ファルマシア社製）をもとにＤＮ
Ａ増幅試薬キット（宝酒造社製）を用いて、キットに添
付されてきた説明書に従い反応液５０μｌを調製した。
なお、プライマー１の配列を配列番号２に示す。
（ＡＢＩ社製）により作成した１μｌの１μＭの合成Ｄ
ＮＡプライマー（プライマー１）、１μｌの１μＭのオ
リゴｄＴプライマー（ファルマシア社製）をもとにＤＮ
Ａ増幅試薬キット（宝酒造社製）を用いて、キットに添
付されてきた説明書に従い反応液５０μｌを調製した。
なお、プライマー１の配列を配列番号２に示す。
【００６７】反応の条件は、１サイクルを９５℃で１．
５分加熱後、４２℃で２．５分インキュベートし、７２
℃で３．５分反応させるものとし、ＤＮＡサーマルサイ
クラー（宝酒造社製）で２５回このサイクルを行なっ
た。
５分加熱後、４２℃で２．５分インキュベートし、７２
℃で３．５分反応させるものとし、ＤＮＡサーマルサイ
クラー（宝酒造社製）で２５回このサイクルを行なっ
た。
【００６８】この反応物１μｌを第一鎖ｃＤＮＡの代わ
りに用い、ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製）により
作成した１μｌの前述の合成プライマー（プライマー
１）と１μｌの１μＭの合成ＤＮＡプライマー（プライ
マー２）とを用いて、その他の条件は前述と同一で新た
にＰＣＲを行なった。なお、プライマー２の配列を配列
番号３に示す。
りに用い、ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製）により
作成した１μｌの前述の合成プライマー（プライマー
１）と１μｌの１μＭの合成ＤＮＡプライマー（プライ
マー２）とを用いて、その他の条件は前述と同一で新た
にＰＣＲを行なった。なお、プライマー２の配列を配列
番号３に示す。
【００６９】この反応物５μｌを、１％濃度のアガロー
ス中で電気泳動しエチディンブロマイドで染めたとこ
ろ、およそ７００塩基対ほどのＤＮＡが認められた。
ス中で電気泳動しエチディンブロマイドで染めたとこ
ろ、およそ７００塩基対ほどのＤＮＡが認められた。
【００７０】残りの反応液４５μｌに５５μｌの滅菌水
と１００μｌのクロロフォルムを加え攪拌後，前述の卓
上遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，２０
℃で１０分遠心し２層に分離させた。上層の水層を取り
これに５０μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムと５００μ
ｌのエタノールを加え攪拌後すぐに，前述の卓上遠心機
とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１０℃で１
０分遠心しＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％エタ
ノールを２００μｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノ
ールを除去し本ＤＮＡを乾燥させた。本ＤＮＡを１０μ
ｌの滅菌水に溶解した。
と１００μｌのクロロフォルムを加え攪拌後，前述の卓
上遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，２０
℃で１０分遠心し２層に分離させた。上層の水層を取り
これに５０μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウムと５００μ
ｌのエタノールを加え攪拌後すぐに，前述の卓上遠心機
とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１０℃で１
０分遠心しＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％エタ
ノールを２００μｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノ
ールを除去し本ＤＮＡを乾燥させた。本ＤＮＡを１０μ
ｌの滅菌水に溶解した。
【００７１】精製本ＤＮＡを７ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．５），２０ｍＭ塩化ナトリウム，７ｍＭ塩化マグネ
シウム，０．１ｍＭＥＤＴＡ，各１００μＭのｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（宝酒造社製）、１
ユニットのＤＮＡポリメレースクレノウフラグメント
（ベーリンガー社製）を用いて２０μｌの反応液中で、
３７℃で３０分保温することにより本ＤＮＡの末端を修
復した。本反応液に８０μｌの滅菌水と１００μｌのフ
ェノール／クロロフォルムを加え攪拌後，前述の卓上遠
心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，２０℃で
１０分遠心し２層に分離させた。上層の水層を取りこれ
に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと３００μｌのエタノ
ールを加え攪拌後−８０℃で冷却した。前述の卓上遠心
機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１０℃で
１０分遠心しｃＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％
エタノールを２００μｌ加え同条件で遠心分離後，本エ
タノールを除去し本ＤＮＡを乾燥させた。本ＤＮＡを１
０μｌの滅菌水に溶解した。
７．５），２０ｍＭ塩化ナトリウム，７ｍＭ塩化マグネ
シウム，０．１ｍＭＥＤＴＡ，各１００μＭのｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ（宝酒造社製）、１
ユニットのＤＮＡポリメレースクレノウフラグメント
（ベーリンガー社製）を用いて２０μｌの反応液中で、
３７℃で３０分保温することにより本ＤＮＡの末端を修
復した。本反応液に８０μｌの滅菌水と１００μｌのフ
ェノール／クロロフォルムを加え攪拌後，前述の卓上遠
心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，２０℃で
１０分遠心し２層に分離させた。上層の水層を取りこれ
に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと３００μｌのエタノ
ールを加え攪拌後−８０℃で冷却した。前述の卓上遠心
機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１０℃で
１０分遠心しｃＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％
エタノールを２００μｌ加え同条件で遠心分離後，本エ
タノールを除去し本ＤＮＡを乾燥させた。本ＤＮＡを１
０μｌの滅菌水に溶解した。
【００７２】１μｇのプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）を１０
ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造製）と本酵素に
添付されてきた緩衝液を使用して２０μｌ中で３７℃で
２時間保温することにより切断した。本反応液に８０μ
ｌの滅菌水と１００μｌのフェノール／クロロフォルム
を加え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで
１５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離さ
せた。上層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナト
リウムと３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃
で冷却した。前述の卓上遠心機とアングルローターで１
５０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心しｃＤＮＡを沈
澱させ上清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加
え同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し本ベクタ
ーＤＮＡを乾燥させた。本ベクターＤＮＡ１μｌと前述
のＰＣＲで得られたＤＮＡ１０μｌをＴ４ＤＮＡライゲ
ース（ベセスダリサーチ社製）により本酵素に添付され
てきた反応緩衝液を使用して、２０μｌ中で１４℃で２
０時間インキュベートすることにより、組み換えＤＮＡ
を作製した。
ｃｒｉｐｔ ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）を１０
ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造製）と本酵素に
添付されてきた緩衝液を使用して２０μｌ中で３７℃で
２時間保温することにより切断した。本反応液に８０μ
ｌの滅菌水と１００μｌのフェノール／クロロフォルム
を加え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで
１５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離さ
せた。上層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナト
リウムと３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃
で冷却した。前述の卓上遠心機とアングルローターで１
５０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心しｃＤＮＡを沈
澱させ上清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加
え同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し本ベクタ
ーＤＮＡを乾燥させた。本ベクターＤＮＡ１μｌと前述
のＰＣＲで得られたＤＮＡ１０μｌをＴ４ＤＮＡライゲ
ース（ベセスダリサーチ社製）により本酵素に添付され
てきた反応緩衝液を使用して、２０μｌ中で１４℃で２
０時間インキュベートすることにより、組み換えＤＮＡ
を作製した。
【００７３】本組み換えＤＮＡにより宿主大腸菌ＪＭ１
０９（宝酒造社製）を常法により形質転換し（モレキュ
ラークローニング第２版参照）、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃で１５時間培養
することにより形質転換体を得た。
０９（宝酒造社製）を常法により形質転換し（モレキュ
ラークローニング第２版参照）、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃で１５時間培養
することにより形質転換体を得た。
【００７４】本形質転換体５個より、組み換えプラスミ
ドを常法のアルカリ−ＳＤＳ法（モレキュラークローニ
ング第２版参照）により調製し、１００μｌの滅菌水に
懸濁した。これに５０μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウム
を加え攪拌後，氷中で２時間放置した。これを前述の卓
上遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，４℃
で１０分遠心した後，上清を回収した。本上清に３００
μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で３０分冷却
し，前述の卓上遠心機とアングルローターで１５０００
ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心しＤＮＡを沈澱させ上清
を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え同条件で
遠心分離後，本エタノールを除去し本組み換えＤＮＡを
乾燥させた。本組み換えＤＮＡを１０μｌの滅菌水に溶
解した。本組み換えＤＮＡの塩基配列は，Ｔ７シークエ
ンスキット（ファルマシア社製）を用い本キットに添付
された手順書に従い全塩基配列を決定した。
ドを常法のアルカリ−ＳＤＳ法（モレキュラークローニ
ング第２版参照）により調製し、１００μｌの滅菌水に
懸濁した。これに５０μｌの７．５Ｍ酢酸アンモニウム
を加え攪拌後，氷中で２時間放置した。これを前述の卓
上遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，４℃
で１０分遠心した後，上清を回収した。本上清に３００
μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で３０分冷却
し，前述の卓上遠心機とアングルローターで１５０００
ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心しＤＮＡを沈澱させ上清
を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え同条件で
遠心分離後，本エタノールを除去し本組み換えＤＮＡを
乾燥させた。本組み換えＤＮＡを１０μｌの滅菌水に溶
解した。本組み換えＤＮＡの塩基配列は，Ｔ７シークエ
ンスキット（ファルマシア社製）を用い本キットに添付
された手順書に従い全塩基配列を決定した。
【００７５】本塩基配列を、ダナシス塩基配列解析シス
テム（宝酒造社製品）を用いて解析したところ、２種の
ＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミノ酸配列が、ＰＡ
Ｐ−Ｓと非常に高い相同性を持つことが明らかになり、
この２種のＤＮＡ断片がＰＡＰ−Ｓもしくはその類似蛋
白質をコードする遺伝子の一部であった。
テム（宝酒造社製品）を用いて解析したところ、２種の
ＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミノ酸配列が、ＰＡ
Ｐ−Ｓと非常に高い相同性を持つことが明らかになり、
この２種のＤＮＡ断片がＰＡＰ−Ｓもしくはその類似蛋
白質をコードする遺伝子の一部であった。
【００７６】［実施例４］（アメリカヤマゴボウの染色
体ＤＮＡの抽出と精製）
体ＤＮＡの抽出と精製）
【００７７】アメリカヤマゴボウの染色体ＤＮＡの抽出
は常法によればよく、具体的には以下のように行なっ
た。
は常法によればよく、具体的には以下のように行なっ
た。
【００７８】アメリカヤマゴボウの種子を播種箱に蒔
き、温室でおよそ２０日間栽培した。
き、温室でおよそ２０日間栽培した。
【００７９】１０ｃｍ程に育った植物体約５０ｇを液体
窒素中で急速凍結し、前述の粉砕器を使用して粉末状に
した。
窒素中で急速凍結し、前述の粉砕器を使用して粉末状に
した。
【００８０】これを１Ｍヘキシレングリコール、１０ｍ
ＭＰｉｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ塩化マ
グネシウム，５ｍＭ２−メルカプトルエタノールからな
る３００ｍｌの核抽出用緩衝液に懸濁した。
ＭＰｉｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ塩化マ
グネシウム，５ｍＭ２−メルカプトルエタノールからな
る３００ｍｌの核抽出用緩衝液に懸濁した。
【００８１】本懸濁液を４枚重ねのガーゼで濾過した。
【００８２】遠心分離用チューブに５００ｍＭヘキシレ
ングリコール，１０ｍＭＰｉｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．
０），１０ｍＭ塩化マグネシウム，０．５％トライトン
Ｘ−１００，５ｍＭ２−メルカプトルエタノールを含む
６０％パーコール（ファルマシア社製）溶液を７．５ｍ
ｌ入れ、その上に５００ｍＭヘキシレングリコール，１
０ｍＭＰｉｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ塩
化マグネシウム，０．５％トライトンＸ−１００，５ｍ
Ｍ２−メルカプトルエタノールを含む３０％パーコール
溶液を７．５ｍｌ重層した。
ングリコール，１０ｍＭＰｉｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．
０），１０ｍＭ塩化マグネシウム，０．５％トライトン
Ｘ−１００，５ｍＭ２−メルカプトルエタノールを含む
６０％パーコール（ファルマシア社製）溶液を７．５ｍ
ｌ入れ、その上に５００ｍＭヘキシレングリコール，１
０ｍＭＰｉｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ塩
化マグネシウム，０．５％トライトンＸ−１００，５ｍ
Ｍ２−メルカプトルエタノールを含む３０％パーコール
溶液を７．５ｍｌ重層した。
【００８３】さらにこの上に３０ｍｌの前述の濾過液を
のせ、前述の高速遠心機とローターを用い１３００ｒｐ
ｍ，４℃で３０分間遠心分離した。
のせ、前述の高速遠心機とローターを用い１３００ｒｐ
ｍ，４℃で３０分間遠心分離した。
【００８４】得られた沈澱物をパーコールを含まない緩
衝液２０ｍｌに懸濁した。
衝液２０ｍｌに懸濁した。
【００８５】この懸濁液を前述の６０％パーコール溶液
１０ｍｌに重層し、同条件で遠心分離した。
１０ｍｌに重層し、同条件で遠心分離した。
【００８６】得られた沈澱物をパーコールを含まない緩
衝液２０ｍｌに懸濁し、同条件で遠心分離した。
衝液２０ｍｌに懸濁し、同条件で遠心分離した。
【００８７】得られた沈澱物を５ｍｌのパーコールを含
まない緩衝液に懸濁し、等量の２００ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ８．０），５０ｍＭＥＤＴＡ，１ＭＮａＣｌ，２
％ＳａｒｋｏｓｙｌからなるＤＮＡ抽出用緩衝液を加え
た。
まない緩衝液に懸濁し、等量の２００ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ８．０），５０ｍＭＥＤＴＡ，１ＭＮａＣｌ，２
％ＳａｒｋｏｓｙｌからなるＤＮＡ抽出用緩衝液を加え
た。
【００８８】これにプロテネースＫ（ベーリンガー社
製）を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように加え、６５℃
で３０分間保温した。
製）を終濃度５０μｇ／ｍｌになるように加え、６５℃
で３０分間保温した。
【００８９】この溶液に１．０ｇ／ｍｌの割合で塩化セ
シウムを加え溶解させた後、３２０μｇ／ｍｌの割合で
エチディウムブロマイドを加えた。
シウムを加え溶解させた後、３２０μｇ／ｍｌの割合で
エチディウムブロマイドを加えた。
【００９０】本溶液を超遠心用チューブに入れ前述の超
遠心分離機を用いアングルローター（ＲＰ６５Ｔ）を使
用して、６５０００ｒｐｍ，２０℃で１２時間遠心分離
を行なった。
遠心分離機を用いアングルローター（ＲＰ６５Ｔ）を使
用して、６５０００ｒｐｍ，２０℃で１２時間遠心分離
を行なった。
【００９１】本遠心チューブのおよそ中央部に生じた赤
色のバンドの部分を注射器を使用して抜き取り、新たな
遠心チューブに移し、前述の条件で再度超遠心分離を行
なった。
色のバンドの部分を注射器を使用して抜き取り、新たな
遠心チューブに移し、前述の条件で再度超遠心分離を行
なった。
【００９２】再度、本遠心チューブのおよそ中央部に生
じた赤色のバンドの部分を注射器を使用して抜き取り、
等量のイソプロパノールを加えた。
じた赤色のバンドの部分を注射器を使用して抜き取り、
等量のイソプロパノールを加えた。
【００９３】これを穏やかに攪拌することにより、ＤＮ
Ａに絡んでいるエチディウムブロマイドを上層のイソプ
ロパノール層に吸収させこの層を除去した。
Ａに絡んでいるエチディウムブロマイドを上層のイソプ
ロパノール層に吸収させこの層を除去した。
【００９４】本操作を４回繰り返すことにより、ＤＮＡ
を含む水層部からエチディウムブロマイドを完全に除去
した。
を含む水層部からエチディウムブロマイドを完全に除去
した。
【００９５】本溶液およそ２ｍｌに２００μｌの３Ｍ酢
酸ナトリウムと，５ｍｌのエタノールを加え−２０℃で
３時間冷却後、前述の高速遠心機とアングルローター
（Ｎｏ．４Ｎ−ＩＶ）を使用して５０００ｒｐｍ，４℃
で１５分間遠心分離することによりアメリカヤマゴボウ
の染色体ＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％エタノ
ールを２ｍｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノールを
除去し本染色体ＤＮＡを乾燥させた。
酸ナトリウムと，５ｍｌのエタノールを加え−２０℃で
３時間冷却後、前述の高速遠心機とアングルローター
（Ｎｏ．４Ｎ−ＩＶ）を使用して５０００ｒｐｍ，４℃
で１５分間遠心分離することによりアメリカヤマゴボウ
の染色体ＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％エタノ
ールを２ｍｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノールを
除去し本染色体ＤＮＡを乾燥させた。
【００９６】本染色体ＤＮＡを１ｍｌの滅菌蒸留水に溶
解させ、その後の実験まで−２０℃で保存した。
解させ、その後の実験まで−２０℃で保存した。
【００９７】［実施例５］（アメリカヤマゴボウの染色
体ＤＮＡの分画）
体ＤＮＡの分画）
【００９８】実施例４で得られたアメリカヤマゴボウの
染色体ＤＮＡ各２００μｇを、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝
酒造社製）で以下のように２つの条件下で切断した。
染色体ＤＮＡ各２００μｇを、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝
酒造社製）で以下のように２つの条件下で切断した。
【００９９】(1) 本ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全
分解することを目的として、本酵素２００ユニットを本
ＤＮＡに加え本酵素に添付されてきた緩衝液を使用して
５００μｌ中で３７℃で２時間保温することにより切断
した。
分解することを目的として、本酵素２００ユニットを本
ＤＮＡに加え本酵素に添付されてきた緩衝液を使用して
５００μｌ中で３７℃で２時間保温することにより切断
した。
【０１００】(2) 本ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで部分
分解することを目的として、本酵素１０ユニットを本Ｄ
ＮＡに加え本酵素に添付されてきた緩衝液を使用して５
００μｌ中で３７℃で１５分間保温することにより切断
した。
分解することを目的として、本酵素１０ユニットを本Ｄ
ＮＡに加え本酵素に添付されてきた緩衝液を使用して５
００μｌ中で３７℃で１５分間保温することにより切断
した。
【０１０１】各反応終了後、６５℃で１５分間加熱する
ことにより制限酵素を不活化し、氷中で保存した。
ことにより制限酵素を不活化し、氷中で保存した。
【０１０２】本ＤＮＡを超遠心分離により、その大きさ
により分画するためにまず、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．９），１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭＥＤＴ
ＡよりなるＳＤＧ緩衝液を含む６０％，４０％および１
０％のシュークロース溶液を作製した。
により分画するためにまず、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．９），１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭＥＤＴ
ＡよりなるＳＤＧ緩衝液を含む６０％，４０％および１
０％のシュークロース溶液を作製した。
【０１０３】２本の１３ｍｌ容量のスイング用超遠心チ
ューブの底に、６０％シュークロース溶液を１ｍｌ入れ
た。
ューブの底に、６０％シュークロース溶液を１ｍｌ入れ
た。
【０１０４】その上にグラジエント作製器（アトー社
製）を用いて４０％−１０％シュークロース溶液（各５
ｍｌ）の直線状グラジエントをそれぞれ作製した。
製）を用いて４０％−１０％シュークロース溶液（各５
ｍｌ）の直線状グラジエントをそれぞれ作製した。
【０１０５】本グラジエントの上にさらに氷中で保存し
たＤＮＡ溶液を静かに重層し、前述の超遠心機を用いス
イングローター（ＲＰＳ４０Ｔ）を使用して３３０００
ｒｐｍ，２０℃で１６時間超遠心分離を行なった。
たＤＮＡ溶液を静かに重層し、前述の超遠心機を用いス
イングローター（ＲＰＳ４０Ｔ）を使用して３３０００
ｒｐｍ，２０℃で１６時間超遠心分離を行なった。
【０１０６】超遠心分離終了後、ガラス細管を静かにチ
ューブの底まで差込み、ペリシターポンプ（アトー社
製）を使用しておよそ２滴／秒の流量で抜き取った。
ューブの底まで差込み、ペリシターポンプ（アトー社
製）を使用しておよそ２滴／秒の流量で抜き取った。
【０１０７】抜き取った溶液を５００μｌずつマイクロ
チューブに分画しながら集めた後、各分画に５０μｌの
３Ｍ酢酸ナトリウムと１ｍｌのエタノールを加え、−８
０℃で３０分間冷却し、前述の卓上遠心器により１５０
００ｒｐｍ，−１０℃で１０分間遠心分離することによ
り各分画のＤＮＡを沈澱物として回収した。７０％エタ
ノールを１ｍｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノール
を除去し本ＤＮＡを乾燥させた。
チューブに分画しながら集めた後、各分画に５０μｌの
３Ｍ酢酸ナトリウムと１ｍｌのエタノールを加え、−８
０℃で３０分間冷却し、前述の卓上遠心器により１５０
００ｒｐｍ，−１０℃で１０分間遠心分離することによ
り各分画のＤＮＡを沈澱物として回収した。７０％エタ
ノールを１ｍｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノール
を除去し本ＤＮＡを乾燥させた。
【０１０８】本ＤＮＡを５０μｌの滅菌水に懸濁した。
５μｌの各分画のＤＮＡを使用して、１％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない各分画に含まれるＤＮＡの大きさを
調べた。
５μｌの各分画のＤＮＡを使用して、１％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない各分画に含まれるＤＮＡの大きさを
調べた。
【０１０９】およそ９キロベースペアから２３キロベー
スペアの大きさのＤＮＡを含む１０個の分画を集め、５
０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと１ｍｌのエタノールを加
え、−８０℃で３０分間冷却し、前述の卓上遠心器によ
り１５０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分間遠心分離する
ことにより目的の大きさを持つＤＮＡを沈澱物として回
収した。７０％エタノールを１ｍｌ加え同条件で遠心分
離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを乾燥させた後，
５０μｌの滅菌水に懸濁した。
スペアの大きさのＤＮＡを含む１０個の分画を集め、５
０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと１ｍｌのエタノールを加
え、−８０℃で３０分間冷却し、前述の卓上遠心器によ
り１５０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分間遠心分離する
ことにより目的の大きさを持つＤＮＡを沈澱物として回
収した。７０％エタノールを１ｍｌ加え同条件で遠心分
離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを乾燥させた後，
５０μｌの滅菌水に懸濁した。
【０１１０】［実施例６］（アメリカヤマゴボウの染色
体ＤＮＡライブラリーの作製）
体ＤＮＡライブラリーの作製）
【０１１１】実施例５で得られたＤＮＡ各２μｇを制限
酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断しイソプロパノール
沈澱することにより調製された２μｇのクローニングベ
クターＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）と混合し、２
ユニットのＴ４ＤＮＡライゲース（ベセスダリサーチ社
製）で酵素に添付されてきた反応緩衝液を使用して６μ
ｌ中で，室温で１時間保温し４℃で２日間放置すること
により接続した。
酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断しイソプロパノール
沈澱することにより調製された２μｇのクローニングベ
クターＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）と混合し、２
ユニットのＴ４ＤＮＡライゲース（ベセスダリサーチ社
製）で酵素に添付されてきた反応緩衝液を使用して６μ
ｌ中で，室温で１時間保温し４℃で２日間放置すること
により接続した。
【０１１２】本反応液３μｌを、ガイガーパックゴール
ド（ストラタジーン社製）を使用し添付されてきた手順
書に従ってインビトロパッケイジングし、室温で２時間
インキュベートし、組み換えファージを作製した。
ド（ストラタジーン社製）を使用し添付されてきた手順
書に従ってインビトロパッケイジングし、室温で２時間
インキュベートし、組み換えファージを作製した。
【０１１３】本組み換えファージに５００μｌのファー
ジ希釈液（ガイガーパックゴールドに添付されてきた手
順書に記載されているもの）と２０μｌのクロロフォル
ムを加え混合後、前述の卓上遠心器で５０００ｒｐｍ，
１０秒間遠心分離し組み換えファージ懸濁液を得た。
ジ希釈液（ガイガーパックゴールドに添付されてきた手
順書に記載されているもの）と２０μｌのクロロフォル
ムを加え混合後、前述の卓上遠心器で５０００ｒｐｍ，
１０秒間遠心分離し組み換えファージ懸濁液を得た。
【０１１４】この組み換えファージの宿主大腸菌ＰＬＫ
−１７（Ｐ２）（ＥＭＢＬ３に添付されてきたもの）
を、０．２％マルトースと１０ｍＭＭｇＳＯ4 を含むＬ
Ｂ培地２０ｍｌ中３７℃で一夜培養した。
−１７（Ｐ２）（ＥＭＢＬ３に添付されてきたもの）
を、０．２％マルトースと１０ｍＭＭｇＳＯ4 を含むＬ
Ｂ培地２０ｍｌ中３７℃で一夜培養した。
【０１１５】本培養液を、前述の高速遠心器とアングル
ローター（Ｎｏ．４Ｎ−ＩＶ）を用いて３０００ｒｐ
ｍ，４℃で１０分間遠心分離して、菌体を回収し１０ｍ
ｌの１０ｍＭＭｇＳＯ4 に懸濁した。
ローター（Ｎｏ．４Ｎ−ＩＶ）を用いて３０００ｒｐ
ｍ，４℃で１０分間遠心分離して、菌体を回収し１０ｍ
ｌの１０ｍＭＭｇＳＯ4 に懸濁した。
【０１１６】大腸菌懸濁液１ｍｌと、ファージ懸濁液１
００μｌを混合し、３７℃で１５分間インキュベートし
た。
００μｌを混合し、３７℃で１５分間インキュベートし
た。
【０１１７】７．５ｍｌの０．８％アガロースを含むＮ
ＺＹ培地（ガイガーパックゴールドに添付されてきた手
順書に記載されているもの）に本混合液を懸濁し、１．
５％寒天を含むＮＺＹ寒天培地上に広げ、３７℃で１２
時間培養し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
ＺＹ培地（ガイガーパックゴールドに添付されてきた手
順書に記載されているもの）に本混合液を懸濁し、１．
５％寒天を含むＮＺＹ寒天培地上に広げ、３７℃で１２
時間培養し、染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。
【０１１８】［実施例７］（プラークハイブリダイゼー
ションによるＰＡＰ遺伝子の単離）
ションによるＰＡＰ遺伝子の単離）
【０１１９】実施例６で作製した寒天培地上の染色体Ｄ
ＮＡライブラリー上に、ナイロン膜、バイオダインＡ
（ポール社製商品名）を乗せ２分間放置することによ
り、寒天培地上の各ファージの一部を、ナイロン膜に移
した。
ＮＡライブラリー上に、ナイロン膜、バイオダインＡ
（ポール社製商品名）を乗せ２分間放置することによ
り、寒天培地上の各ファージの一部を、ナイロン膜に移
した。
【０１２０】ファージが吸着した面を上にして、１．５
ＭＮａＣｌと０．５ＮＮａＯＨよりなる変性液の上にの
せ、５分間放置することにより、ファージ粒子とその中
に含まれる組み換えＤＮＡを変性させた。
ＭＮａＣｌと０．５ＮＮａＯＨよりなる変性液の上にの
せ、５分間放置することにより、ファージ粒子とその中
に含まれる組み換えＤＮＡを変性させた。
【０１２１】次に本ナイロン膜を、３Ｍ酢酸ナトリウム
よりなる中和液の上に５分間のせ、中和した。
よりなる中和液の上に５分間のせ、中和した。
【０１２２】本ナイロン膜を室温で３０分間風乾後、乾
燥機を用いて、８０℃で２時間焼付けを行なった。
燥機を用いて、８０℃で２時間焼付けを行なった。
【０１２３】実施例３で得られた組み換えＤＮＡ５μｇ
を各２０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉとで酵素に添付されてきた反応緩衝液を用いて１００
μｌ中で、３７℃で２時間インキュベートすることによ
り切断し、１％アガロースゲル電気泳動で分離し、ＰＡ
ＰｃＤＮＡを含むアガロース断片を切り出し、このＤＮ
Ａをミリカップ（ミリポア社製）を用い本製品に添付さ
れた手順書に従い回収した。回収されたＤＮＡを含む約
３００μｌの溶液と３００μｌのフェノール／クロロフ
ォルムを加え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルロー
ターで１５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に
分離させた。上層の水層を取りこれに３０μｌの３Ｍ酢
酸ナトリウムと１０００μｌのエタノールを加え攪拌後
−８０℃で冷却した。前述の卓上遠心機とアングルロー
ターで１５０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心しｃＤ
ＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％エタノールを１０
００μｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノールを除去
し本ＰＡＰｃＤＮＡを乾燥させ，２０μｌの滅菌水に懸
濁した。
を各２０ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩ
Ｉとで酵素に添付されてきた反応緩衝液を用いて１００
μｌ中で、３７℃で２時間インキュベートすることによ
り切断し、１％アガロースゲル電気泳動で分離し、ＰＡ
ＰｃＤＮＡを含むアガロース断片を切り出し、このＤＮ
Ａをミリカップ（ミリポア社製）を用い本製品に添付さ
れた手順書に従い回収した。回収されたＤＮＡを含む約
３００μｌの溶液と３００μｌのフェノール／クロロフ
ォルムを加え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルロー
ターで１５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に
分離させた。上層の水層を取りこれに３０μｌの３Ｍ酢
酸ナトリウムと１０００μｌのエタノールを加え攪拌後
−８０℃で冷却した。前述の卓上遠心機とアングルロー
ターで１５０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心しｃＤ
ＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％エタノールを１０
００μｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノールを除去
し本ＰＡＰｃＤＮＡを乾燥させ，２０μｌの滅菌水に懸
濁した。
【０１２４】本ＤＮＡ１μｌを、クイックプライムＤＮ
Ａラベリングキット（ファルマシア社製）を用い，本キ
ットに添付された手順書に従い、（ａ−３２Ｐ）ｄＣＴ
Ｐ（ニュウイングランドニュウクリアーデュポン社製）
を使用してラジオアイソトープでラベルされた核酸プロ
ーブを作成した。本プローブはニックカラム（ファルマ
シア社製）を用いて本カラムに添付された手順書に従い
精製した。
Ａラベリングキット（ファルマシア社製）を用い，本キ
ットに添付された手順書に従い、（ａ−３２Ｐ）ｄＣＴ
Ｐ（ニュウイングランドニュウクリアーデュポン社製）
を使用してラジオアイソトープでラベルされた核酸プロ
ーブを作成した。本プローブはニックカラム（ファルマ
シア社製）を用いて本カラムに添付された手順書に従い
精製した。
【０１２５】焼付けの終了したナイロン膜２０枚をハイ
ブリバッグ（コスモバイオ社製）に入れ、５ｘＳＳＰＥ
（モレキュラークローニング第２版参照）、５ｘデンハ
ルト液（モレキュラークローニング第２版参照）、０．
２％ＳＤＳ、熱変性した５ｍｇ／ｍｌ牛胸腺ＤＮＡから
なる２００ｍｌのハイブリダイゼーション液を加え熱に
より本バッグを密封した後、緩やかに振盪しながら、６
５℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行なった。
ブリバッグ（コスモバイオ社製）に入れ、５ｘＳＳＰＥ
（モレキュラークローニング第２版参照）、５ｘデンハ
ルト液（モレキュラークローニング第２版参照）、０．
２％ＳＤＳ、熱変性した５ｍｇ／ｍｌ牛胸腺ＤＮＡから
なる２００ｍｌのハイブリダイゼーション液を加え熱に
より本バッグを密封した後、緩やかに振盪しながら、６
５℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行なった。
【０１２６】ハイブリダイゼーション溶液を新たなもの
に入れ換えた後、９５℃で１０分間加熱変性し氷上で急
冷して得られた前述のハイブリダイゼーションプローブ
を加え熱により本バッグを密封した後、６５℃で１５時
間緩やかに振盪しながら、ハイブリダイゼーションを行
なった。
に入れ換えた後、９５℃で１０分間加熱変性し氷上で急
冷して得られた前述のハイブリダイゼーションプローブ
を加え熱により本バッグを密封した後、６５℃で１５時
間緩やかに振盪しながら、ハイブリダイゼーションを行
なった。
【０１２７】ナイロン膜を本バッグより取り出し、１０
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２％ＳＤＳ、１ｍ
ＭＥＤＴＡよりなる洗浄液中室温で、激しく３０分間振
盪した。
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２％ＳＤＳ、１ｍ
ＭＥＤＴＡよりなる洗浄液中室温で、激しく３０分間振
盪した。
【０１２８】この操作を再度行ない、非特異的に吸着し
たプローブを取り除いた。
たプローブを取り除いた。
【０１２９】本ナイロン膜を風乾後，バイオイメージア
ナライザー（富士フィルム社製）による解析、もしくは
Ｘ線フィルム（富士フィルム社製）を用いたオートラジ
オグラフィによる解析により、プローブとハイブリダイ
ズした組み換えＤＮＡを持つファージの存在する位置を
プレート上に同定した。
ナライザー（富士フィルム社製）による解析、もしくは
Ｘ線フィルム（富士フィルム社製）を用いたオートラジ
オグラフィによる解析により、プローブとハイブリダイ
ズした組み換えＤＮＡを持つファージの存在する位置を
プレート上に同定した。
【０１３０】目的領域を含む、直径１ｃｍ程の領域に存
在するファージを、ソフトアガーごと寒天培地より掻き
取り、１ｍｌの前述のファージ希釈液に懸濁した。
在するファージを、ソフトアガーごと寒天培地より掻き
取り、１ｍｌの前述のファージ希釈液に懸濁した。
【０１３１】本ファージ懸濁液１μｌを１０００μｌの
ファージ希釈液で希釈し、さらに本希釈ファージ懸濁液
１μｌを１０００μｌのファージ希釈液で希釈した。
ファージ希釈液で希釈し、さらに本希釈ファージ懸濁液
１μｌを１０００μｌのファージ希釈液で希釈した。
【０１３２】宿主大腸菌ＬＥ３９２（ＥＭＢＬ３に添付
されてきたもの）を、０．２％マルトースと１０ｍＭＭ
ｇＳＯ4 を含むＬＢ培地２０ｍｌ中３７℃で一夜培養
し、前述の高速遠心器とアングルローター（Ｎｏ．４Ｎ
−ＩＶ）を用いて３０００ｒｐｍ，４℃で１０分間遠心
分離して、菌体を回収し１０ｍｌの１０ｍＭＭｇＳＯ4
に懸濁した。２度希釈された前述の希釈ファージ液１μ
ｌ、５０μｌをそれぞれ１５０μｌの本宿主大腸菌ＬＥ
３９２懸濁液と混合し３７℃で１５分間インキュベート
し感染させた後、前述のようにソフトアガーに包埋後寒
天培地上に蒔いた。
されてきたもの）を、０．２％マルトースと１０ｍＭＭ
ｇＳＯ4 を含むＬＢ培地２０ｍｌ中３７℃で一夜培養
し、前述の高速遠心器とアングルローター（Ｎｏ．４Ｎ
−ＩＶ）を用いて３０００ｒｐｍ，４℃で１０分間遠心
分離して、菌体を回収し１０ｍｌの１０ｍＭＭｇＳＯ4
に懸濁した。２度希釈された前述の希釈ファージ液１μ
ｌ、５０μｌをそれぞれ１５０μｌの本宿主大腸菌ＬＥ
３９２懸濁液と混合し３７℃で１５分間インキュベート
し感染させた後、前述のようにソフトアガーに包埋後寒
天培地上に蒔いた。
【０１３３】本培地上に作製したファージ集団を、前述
の方法でバイオダインＡに移しとり前述の条件で、ハイ
ブリダイゼーションを行ない、目的組み換えファージを
捜し出した。
の方法でバイオダインＡに移しとり前述の条件で、ハイ
ブリダイゼーションを行ない、目的組み換えファージを
捜し出した。
【０１３４】これらの操作を繰り返すことにより、寒天
培地上に蒔かれた全てのファージが、プローブとハイブ
リダイズするようにし、最終的に５６個の独立したファ
ージを得た。
培地上に蒔かれた全てのファージが、プローブとハイブ
リダイズするようにし、最終的に５６個の独立したファ
ージを得た。
【０１３５】［実施例８］（ＰＡＰ染色体ＤＮＡの塩基
配列の決定）
配列の決定）
【０１３６】実施例７で得られた５６個のファージをつ
まようじで突き刺し、それをそれぞれ１５０μｌの前述
の宿主大腸菌ＬＥ３９２懸濁液中に懸濁し、３７℃で１
５分間インキュベートすることにより、感染させた。
まようじで突き刺し、それをそれぞれ１５０μｌの前述
の宿主大腸菌ＬＥ３９２懸濁液中に懸濁し、３７℃で１
５分間インキュベートすることにより、感染させた。
【０１３７】本大腸菌を前述のようにソフトアガーに包
埋後寒天培地上に蒔き、３７℃で８時間保温することに
よりソフトアガー中の大腸菌を溶菌させた。
埋後寒天培地上に蒔き、３７℃で８時間保温することに
よりソフトアガー中の大腸菌を溶菌させた。
【０１３８】各寒天培地上に５ｍｌのファージ希釈液を
重層し、緩やかに振盪しながら４℃で２時間放置した。
重層し、緩やかに振盪しながら４℃で２時間放置した。
【０１３９】本懸濁液を遠心チューブに移し、前述の高
速遠心器を用いアングルローター（Ｎｏ．４Ｎ−ＩＶ）
を使用して５０００ｒｐｍ，４℃で１５分間遠心分離し
その上清に等量の２０％ポリエチレングリコール６００
０および２Ｍ塩化ナトリウムからなるファージ濃縮液を
加え攪拌後氷中で２時間放置した。
速遠心器を用いアングルローター（Ｎｏ．４Ｎ−ＩＶ）
を使用して５０００ｒｐｍ，４℃で１５分間遠心分離し
その上清に等量の２０％ポリエチレングリコール６００
０および２Ｍ塩化ナトリウムからなるファージ濃縮液を
加え攪拌後氷中で２時間放置した。
【０１４０】これを前述の高速遠心器とローターを用い
１５０００ｒｐｍ，４℃で１５分間遠心分離しファージ
を沈澱させた。
１５０００ｒｐｍ，４℃で１５分間遠心分離しファージ
を沈澱させた。
【０１４１】本ファージを１ｍｌの前述のファージ希釈
液に懸濁し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅＩ，宝酒造社
製）とＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅＡ，ファルマシア社
製）をそれぞれ１０ユニットずつ加え、３７℃で３０分
間保温した。
液に懸濁し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅＩ，宝酒造社
製）とＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅＡ，ファルマシア社
製）をそれぞれ１０ユニットずつ加え、３７℃で３０分
間保温した。
【０１４２】これにＳＤＳとＥＤＴＡをそれぞれ終濃度
０．２％，５ｍＭになるように加えた後、タンパク質分
解酵素（プロテネースＫ，ベーリンガー社製）を終濃度
５０μｇ／ｍｌになるように加え、６５℃で３０分間加
熱した。
０．２％，５ｍＭになるように加えた後、タンパク質分
解酵素（プロテネースＫ，ベーリンガー社製）を終濃度
５０μｇ／ｍｌになるように加え、６５℃で３０分間加
熱した。
【０１４３】本溶液に等量のフェノール：クロロフォル
ム（１：１）を加え激しく攪拌した後、前述の高速遠心
器とローターを用いて１００００ｒｐｍ，２０℃で１０
分間遠心分離することによりにより２層に分離させ上層
の水層を回収した。
ム（１：１）を加え激しく攪拌した後、前述の高速遠心
器とローターを用いて１００００ｒｐｍ，２０℃で１０
分間遠心分離することによりにより２層に分離させ上層
の水層を回収した。
【０１４４】本遠心分離操作を３回繰り返した後、１０
０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと３ｍｌのエタノールを加
え−２０℃で３０分間冷却した。これを前述の高速遠心
器とローターを用い５０００ｒｐｍ，−１０℃で１５分
間遠心分離しＤＮＡを沈澱させた。７０％エタノールを
３ｍｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し
本組み換えファージＤＮＡを乾燥させ，１００μｌの滅
菌水に懸濁した。
０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと３ｍｌのエタノールを加
え−２０℃で３０分間冷却した。これを前述の高速遠心
器とローターを用い５０００ｒｐｍ，−１０℃で１５分
間遠心分離しＤＮＡを沈澱させた。７０％エタノールを
３ｍｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し
本組み換えファージＤＮＡを乾燥させ，１００μｌの滅
菌水に懸濁した。
【０１４５】本組み換えファージＤＮＡ５μｌを１０ユ
ニットの制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で本酵素に
添付された反応緩衝液を用いて３７℃で２時間保温する
ことにより切断し、挿入されたアメリカヤマゴボウの染
色体ＤＮＡをベクターであるＥＭＢＬ３より切り離し、
１％アガロースゲル中で電気泳動により分離した。
ニットの制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で本酵素に
添付された反応緩衝液を用いて３７℃で２時間保温する
ことにより切断し、挿入されたアメリカヤマゴボウの染
色体ＤＮＡをベクターであるＥＭＢＬ３より切り離し、
１％アガロースゲル中で電気泳動により分離した。
【０１４６】本アガロースゲルを０．２５Ｎ塩酸中で１
５分間振盪した後、０．４Ｎ水酸化ナトリウム，０．６
Ｎ塩化ナトリウムからなる溶液中で１５分間振盪した。
５分間振盪した後、０．４Ｎ水酸化ナトリウム，０．６
Ｎ塩化ナトリウムからなる溶液中で１５分間振盪した。
【０１４７】キャピラリー法（モレキュラークローニン
グ第２版参照）によりナイロン膜、バイオダインＢ（日
本ポール社商品名）に本ゲル中に含まれるＤＮＡを転写
液として０．４Ｎ水酸化ナトリウム，０．６Ｎ塩化ナト
リウムからなる溶液を使用して１５時間転写した後、実
施例７と同様の条件によりハイブリダイゼーションを行
なった。
グ第２版参照）によりナイロン膜、バイオダインＢ（日
本ポール社商品名）に本ゲル中に含まれるＤＮＡを転写
液として０．４Ｎ水酸化ナトリウム，０．６Ｎ塩化ナト
リウムからなる溶液を使用して１５時間転写した後、実
施例７と同様の条件によりハイブリダイゼーションを行
なった。
【０１４８】本実験によりラジオアイソトープラベルし
たＰＡＰｃＤＮＡプローブと特に強くハイブリダイズす
る断片を同定した。
たＰＡＰｃＤＮＡプローブと特に強くハイブリダイズす
る断片を同定した。
【０１４９】本組み換えファージＤＮＡ５μｌを１０ユ
ニットの制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で本酵素に
添付された反応緩衝液を用いて２０μｌ中で３７℃で２
時間保温することにより切断後、本反応液に８０μｌの
滅菌水と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを加
え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１５
０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させ
た。上層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウムと３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で
冷却した。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５
０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱
させ上清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え
同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを
乾燥させた。乾燥した本ＤＮＡを２０μｌの滅菌水に懸
濁した。
ニットの制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で本酵素に
添付された反応緩衝液を用いて２０μｌ中で３７℃で２
時間保温することにより切断後、本反応液に８０μｌの
滅菌水と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを加
え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１５
０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させ
た。上層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウムと３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で
冷却した。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５
０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱
させ上清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え
同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを
乾燥させた。乾燥した本ＤＮＡを２０μｌの滅菌水に懸
濁した。
【０１５０】１μｇのプラスミドベクター、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）（ストラタジーン社製）を１０
ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で本酵素
に添付された反応緩衝液を用いて２０μｌ中で３７℃で
２時間保温することにより切断後、本反応液に８０μｌ
の滅菌水と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを
加え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１
５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させ
た。上層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウムと３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で
冷却した。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５
０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱
させ上清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え
同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを
乾燥させた。乾燥した本ＤＮＡを２０μｌの滅菌水に懸
濁した。本ベクターＤＮＡ１μｌと前述のＢａｍＨＩで
切断された組み換えファージＤＮＡ５μｌをＴ４ＤＮＡ
ライゲース（ベセスダリサーチ社製）により本酵素に添
付されてきた反応緩衝液を使用して、２０μｌ中で１４
℃で２０時間インキュベートすることにより、組み換え
ＤＮＡを作製した。
ｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）（ストラタジーン社製）を１０
ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で本酵素
に添付された反応緩衝液を用いて２０μｌ中で３７℃で
２時間保温することにより切断後、本反応液に８０μｌ
の滅菌水と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを
加え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１
５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させ
た。上層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウムと３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で
冷却した。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５
０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱
させ上清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え
同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを
乾燥させた。乾燥した本ＤＮＡを２０μｌの滅菌水に懸
濁した。本ベクターＤＮＡ１μｌと前述のＢａｍＨＩで
切断された組み換えファージＤＮＡ５μｌをＴ４ＤＮＡ
ライゲース（ベセスダリサーチ社製）により本酵素に添
付されてきた反応緩衝液を使用して、２０μｌ中で１４
℃で２０時間インキュベートすることにより、組み換え
ＤＮＡを作製した。
【０１５１】本組み換えプラスミドで、宿主大腸菌ＪＭ
１０９（宝酒造社製）を常法により形質転換し、５０μ
ｇ／ｍｌの抗生物質アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上
に蒔き、３７℃で１５時間培養することにより、組み換
えプラスミドを持つ大腸菌を得た。
１０９（宝酒造社製）を常法により形質転換し、５０μ
ｇ／ｍｌの抗生物質アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上
に蒔き、３７℃で１５時間培養することにより、組み換
えプラスミドを持つ大腸菌を得た。
【０１５２】本大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含む
ＬＢ液体培地中で、３７℃で１２時間振盪培養した。
ＬＢ液体培地中で、３７℃で１２時間振盪培養した。
【０１５３】本菌体を緩衝液に懸濁後、ＳＤＳを含むア
ルカリ溶液を加え、室温で５分間放置することにより、
溶菌させた（モレキュラークローニング第２版参照）。
ルカリ溶液を加え、室温で５分間放置することにより、
溶菌させた（モレキュラークローニング第２版参照）。
【０１５４】これに酢酸カリウムを加え、室温で１５分
放置し中和後、遠心分離により残渣を除き、上清を得た
（モレキュラークローニング第２版参照）。
放置し中和後、遠心分離により残渣を除き、上清を得た
（モレキュラークローニング第２版参照）。
【０１５５】本上清４５０μｌに３００μｌのイソプロ
パノールを加え、−２０℃で３０分間冷却後、前述の卓
上遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１
０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。
７０％エタノールを５００μｌ加え同条件で遠心分離
後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを乾燥させた。乾燥
した本ＤＮＡを１００μｌの滅菌水に懸濁した。
パノールを加え、−２０℃で３０分間冷却後、前述の卓
上遠心機とアングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１
０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。
７０％エタノールを５００μｌ加え同条件で遠心分離
後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを乾燥させた。乾燥
した本ＤＮＡを１００μｌの滅菌水に懸濁した。
【０１５６】本懸濁液に、５０μｌの７．５Ｍ酢酸アン
モニウムを加え、４℃で３０分間冷却後、前述の卓上遠
心機とアングルローターで１２０００ｒｐｍ，４℃で１
０分遠心分離し不溶化物を沈澱させ、上清を得た。
モニウムを加え、４℃で３０分間冷却後、前述の卓上遠
心機とアングルローターで１２０００ｒｐｍ，４℃で１
０分遠心分離し不溶化物を沈澱させ、上清を得た。
【０１５７】本上清に、５００μｌのエタノールを加
え、−８０℃で３０分間冷却後、前述の卓上遠心機とア
ングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分
遠心し本ＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％エタノ
ールを５００μｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノー
ルを除去し本ＤＮＡを乾燥させた。乾燥した本ＤＮＡを
１００μｌの滅菌水に懸濁した。
え、−８０℃で３０分間冷却後、前述の卓上遠心機とア
ングルローターで１５０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分
遠心し本ＤＮＡを沈澱させ上清を捨てた。７０％エタノ
ールを５００μｌ加え同条件で遠心分離後，本エタノー
ルを除去し本ＤＮＡを乾燥させた。乾燥した本ＤＮＡを
１００μｌの滅菌水に懸濁した。
【０１５８】本組み換えＤＮＡの塩基配列を決定するた
めに，既に決定したＰＡＰｃＤＮＡの塩基配列をもとに
ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製）を用いシークエン
シング用プライマーを作成し，ＯＰＣカラム（ＡＢＩ社
製）を使用して本カラムに添付されてきた手順書に従い
精製し滅菌水に懸濁した。
めに，既に決定したＰＡＰｃＤＮＡの塩基配列をもとに
ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製）を用いシークエン
シング用プライマーを作成し，ＯＰＣカラム（ＡＢＩ社
製）を使用して本カラムに添付されてきた手順書に従い
精製し滅菌水に懸濁した。
【０１５９】本シークエンシングプライマーを使用し，
Ｔ７シークエンスキット（ファルマシア社製）を用い本
キットに添付された手順書に従い部分塩基配列を決定し
た。
Ｔ７シークエンスキット（ファルマシア社製）を用い本
キットに添付された手順書に従い部分塩基配列を決定し
た。
【０１６０】得られた部分塩基配列をもとに，新たなシ
ークエンシング用プライマーを前述のように作成し，本
シークエンシングプライマーを使用し，Ｔ７シークエン
スキット（ファルマシア社製）を用い本キットに添付さ
れた手順書に従い部分塩基配列を決定した。
ークエンシング用プライマーを前述のように作成し，本
シークエンシングプライマーを使用し，Ｔ７シークエン
スキット（ファルマシア社製）を用い本キットに添付さ
れた手順書に従い部分塩基配列を決定した。
【０１６１】本部分塩基配列決定の操作を，複数回繰り
返すことにより既に決定されたＰＡＰｃＤＮＡの塩基配
列を含む２４７２塩基対よりなる塩基配列を決定した
（配列番号１に示す）。
返すことにより既に決定されたＰＡＰｃＤＮＡの塩基配
列を含む２４７２塩基対よりなる塩基配列を決定した
（配列番号１に示す）。
【０１６２】本塩基配列を、ダナシス塩基配列解析シス
テム（宝酒造社製品）を用いて解析したところ、ＰＡＰ
をコードする領域の全塩基配列（配列番号１の塩基配列
中、１０８６〜１８６８で示される塩基配列）、ＰＡＰ
遺伝子の発現を調節しているであろうと予想されるその
５′上流の領域（１０１４〜１０８５）および３′下流
の領域（１８６９〜１８９５）の塩基配列を決定した。
テム（宝酒造社製品）を用いて解析したところ、ＰＡＰ
をコードする領域の全塩基配列（配列番号１の塩基配列
中、１０８６〜１８６８で示される塩基配列）、ＰＡＰ
遺伝子の発現を調節しているであろうと予想されるその
５′上流の領域（１０１４〜１０８５）および３′下流
の領域（１８６９〜１８９５）の塩基配列を決定した。
【０１６３】［実施例９］（ＰＡＰ発現ベクターの構
築）
築）
【０１６４】既に決定したＰＡＰの塩基配列をもとに、
プライマー３（配列番号４に示す）およびプライマー４
（配列番号５に示す）の２つのＰＣＲ用プライマーを、
ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製）を用い作成し，Ｏ
ＰＣカラム（ＡＢＩ社製）を使用して本カラムに添付さ
れてきた手順書に従い精製し滅菌水に懸濁した。
プライマー３（配列番号４に示す）およびプライマー４
（配列番号５に示す）の２つのＰＣＲ用プライマーを、
ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社製）を用い作成し，Ｏ
ＰＣカラム（ＡＢＩ社製）を使用して本カラムに添付さ
れてきた手順書に従い精製し滅菌水に懸濁した。
【０１６５】実施例８で得たＰＡＰ遺伝子を組み込んだ
組み換えプラスミド１０ｎｇを鋳型とし、上記２つのプ
ライマー（プライマー３，プライマー４）を用い実施例
３で前述したＰＣＲ条件により、翻訳開始コドン上に制
限酵素サイトNdeIを持つＤＮＡ断片を特異的に増幅し
た。
組み換えプラスミド１０ｎｇを鋳型とし、上記２つのプ
ライマー（プライマー３，プライマー４）を用い実施例
３で前述したＰＣＲ条件により、翻訳開始コドン上に制
限酵素サイトNdeIを持つＤＮＡ断片を特異的に増幅し
た。
【０１６６】本ＤＮＡ断片を実施例３で前述したＰＣＲ
断片クローニング法と同様にして制限酵素HincII（宝酒
造社製）で切断されたプラスミドベクターｐＨＳＧ３９
７（宝酒造製）と本ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡライゲース
（ベセスダリサーチ社製）に結合させ，大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換し，組み換えプラスミドＤＮＡを得た。
断片クローニング法と同様にして制限酵素HincII（宝酒
造社製）で切断されたプラスミドベクターｐＨＳＧ３９
７（宝酒造製）と本ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡライゲース
（ベセスダリサーチ社製）に結合させ，大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換し，組み換えプラスミドＤＮＡを得た。
【０１６７】本プラスミドに組み込まれたＤＮＡ断片の
塩基配列をＭ４シークエンシングプライマー（宝酒造社
製）とリバースシークエンシングプライマー（宝酒造社
製）とを使用し，Ｔ７シークエンスキット（ファルマシ
ア社製）を用い本キットに添付された手順書に従い部分
塩基配列を決定し、塩基配列に変化の無いことを確認し
た。
塩基配列をＭ４シークエンシングプライマー（宝酒造社
製）とリバースシークエンシングプライマー（宝酒造社
製）とを使用し，Ｔ７シークエンスキット（ファルマシ
ア社製）を用い本キットに添付された手順書に従い部分
塩基配列を決定し、塩基配列に変化の無いことを確認し
た。
【０１６８】１μｇの本プラスミドをそれぞれ１０ユニ
ットの制限酵素NdeIとHindIII（宝酒造社製）で本酵素
に添付された反応緩衝液を用いて２０μｌ中で３７℃で
２時間保温することにより切断後、本反応液に８０μｌ
の滅菌水と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを
加え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１
５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させ
た。上層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウムと３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で
冷却した。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５
０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱
させ上清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え
同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを
乾燥させた。乾燥した本ＤＮＡを２０μｌの滅菌水に懸
濁した。
ットの制限酵素NdeIとHindIII（宝酒造社製）で本酵素
に添付された反応緩衝液を用いて２０μｌ中で３７℃で
２時間保温することにより切断後、本反応液に８０μｌ
の滅菌水と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを
加え攪拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１
５０００ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させ
た。上層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリ
ウムと３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で
冷却した。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５
０００ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱
させ上清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え
同条件で遠心分離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを
乾燥させた。乾燥した本ＤＮＡを２０μｌの滅菌水に懸
濁した。
【０１６９】遺伝子発現ベクターは羽深等により作成さ
れたｐＳＨ７（特願平１−２１０７６７号）を使用し
た。
れたｐＳＨ７（特願平１−２１０７６７号）を使用し
た。
【０１７０】本発現ベクターもそれぞれ１０ユニットの
制限酵素NdeIとHindIII（宝酒造社製）で本酵素に添付
された反応緩衝液を用いて２０μｌ中で３７℃で２時間
保温することにより切断後、本反応液に８０μｌの滅菌
水と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを加え攪
拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１５００
０ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させた。上
層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと
３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で冷却し
た。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５０００
ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱させ上
清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え同条件
で遠心分離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを乾燥さ
せた。乾燥した本ＤＮＡを２０μｌの滅菌水に懸濁し
た。
制限酵素NdeIとHindIII（宝酒造社製）で本酵素に添付
された反応緩衝液を用いて２０μｌ中で３７℃で２時間
保温することにより切断後、本反応液に８０μｌの滅菌
水と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを加え攪
拌後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１５００
０ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させた。上
層の水層を取りこれに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと
３００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で冷却し
た。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５０００
ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し本ＤＮＡを沈澱させ上
清を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え同条件
で遠心分離後，本エタノールを除去し本ＤＮＡを乾燥さ
せた。乾燥した本ＤＮＡを２０μｌの滅菌水に懸濁し
た。
【０１７１】上記２つのＤＮＡを１μｌずつ混ぜ実施例
３で前述したようにＴ４ＤＮＡライゲース（ベセスダリ
サーチ社製）により結合させ，大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換した。
３で前述したようにＴ４ＤＮＡライゲース（ベセスダリ
サーチ社製）により結合させ，大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換した。
【０１７２】形質転換体より組み換えプラスミドを調製
し制限酵素による分解パターンを解析したところ、ＰＡ
Ｐの遺伝子を組み込んだ発現ベクターを持つ大腸菌を３
種得ることができた。
し制限酵素による分解パターンを解析したところ、ＰＡ
Ｐの遺伝子を組み込んだ発現ベクターを持つ大腸菌を３
種得ることができた。
【０１７３】［実施例１０］（大腸菌でのＰＡＰの発現
法）
法）
【０１７４】ＰＡＰの発現実験では前述の３種の組織体
と、コントロールとしてｐＳＨ７のみを持つ大腸菌を使
用した。
と、コントロールとしてｐＳＨ７のみを持つ大腸菌を使
用した。
【０１７５】これら菌体を以下のように培養した。
【０１７６】５０μｇ／ｍｌのアンビシリンを含む２ｍ
ｌのルリアブロス（ＬＢ）中で、各菌体を３０℃で９時
間振盪培養した。
ｌのルリアブロス（ＬＢ）中で、各菌体を３０℃で９時
間振盪培養した。
【０１７７】本培養液を２５０ｍｌの前述の培地に０．
１ｍＭのＩＰＴＧを加えた培地に移し３０℃で１５時間
振盪培養を続けた。
１ｍＭのＩＰＴＧを加えた培地に移し３０℃で１５時間
振盪培養を続けた。
【０１７８】翌日、本菌体を前述の高速遠心器を用いア
ングルローター（Ｎｏ．１７Ｎ）を使用して５０００ｒ
ｐｍ，４℃で１５分間遠心分離することにより本菌体を
集め、５０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に懸濁後、超音波破砕器（ブランソンソニファー，セン
トラル科学貿易社製）を用い本装置の出力目盛り１の力
で１分間本懸濁液に作用させ菌体を破砕した。
ングルローター（Ｎｏ．１７Ｎ）を使用して５０００ｒ
ｐｍ，４℃で１５分間遠心分離することにより本菌体を
集め、５０ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
に懸濁後、超音波破砕器（ブランソンソニファー，セン
トラル科学貿易社製）を用い本装置の出力目盛り１の力
で１分間本懸濁液に作用させ菌体を破砕した。
【０１７９】本破砕液を前述の高速遠心器を用いアング
ルローター（Ｎｏ．４Ｎ−ＩＶ）を使用して１００００
ｒｐｍ，４℃で１５分間遠心分離することにより、菌体
の残渣を除き，上清である菌体の粗抽出液を得た。
ルローター（Ｎｏ．４Ｎ−ＩＶ）を使用して１００００
ｒｐｍ，４℃で１５分間遠心分離することにより、菌体
の残渣を除き，上清である菌体の粗抽出液を得た。
【０１８０】本上清およそ１０ｍｌを透析チューブ（池
田理科社製）に入れ前述の緩衝液１０００ｍｌに透析し
た。外液である緩衝液はおよそ１０時間おきに３回新し
いものに交換した。透析終了後の本上清を活性測定に使
用した。
田理科社製）に入れ前述の緩衝液１０００ｍｌに透析し
た。外液である緩衝液はおよそ１０時間おきに３回新し
いものに交換した。透析終了後の本上清を活性測定に使
用した。
【０１８１】［実施例１１］（ＲＮＡ Ｎ−グリコシダ
ーゼ活性の測定法）
ーゼ活性の測定法）
【０１８２】ＰＡＰを含むリボゾーム不活性タンパク質
の生化学的活性は、２５ＳリボゾームＲＮＡ上のただ１
つの特異的アデニンを引き抜くことである。
の生化学的活性は、２５ＳリボゾームＲＮＡ上のただ１
つの特異的アデニンを引き抜くことである。
【０１８３】この活性はＲＮＡ Ｎ−グリコシダーゼ活
性といわれている。
性といわれている。
【０１８４】本活性を調べるため以下のように実験を行
なった。
なった。
【０１８５】小麦胚芽抽出液（アムシャム(Ａｍａｒｓ
ｈａｍ)社製）８μｌとアッセイ緩衝液（２５０ｍＭト
リス緩衝液ｐＨ７．６，２５０ｍＭ ＫＣｌ，５０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ）２μｌに前述の上清１０μｌを加え３７
℃で１時間反応させた。
ｈａｍ)社製）８μｌとアッセイ緩衝液（２５０ｍＭト
リス緩衝液ｐＨ７．６，２５０ｍＭ ＫＣｌ，５０ｍＭ
ＭｇＣｌ2 ）２μｌに前述の上清１０μｌを加え３７
℃で１時間反応させた。
【０１８６】コントロールとして菌体の上清の代わりに
蒸留水または１０ｎｇのＭＡＰ遺伝子（特開平２−１８
６９８８号）を使用した。
蒸留水または１０ｎｇのＭＡＰ遺伝子（特開平２−１８
６９８８号）を使用した。
【０１８７】反応終了後，本反応液に８０μｌの滅菌水
と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを加え攪拌
後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１５０００
ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させた。上層
の水層を取りこれに１０μｌの１０Ｍ塩化リチウムと３
００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で冷却し
た。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５０００
ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し全核酸を沈澱させ上清
を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え同条件で
遠心分離後，本エタノールを除去し本全核酸を乾燥させ
た。
と１００μｌのフェノール／クロロフォルムを加え攪拌
後，前述の卓上遠心機とアングルローターで１５０００
ｒｐｍ，２０℃で１０分遠心し２層に分離させた。上層
の水層を取りこれに１０μｌの１０Ｍ塩化リチウムと３
００μｌのエタノールを加え攪拌後−８０℃で冷却し
た。前述の卓上遠心機とアングルローターで１５０００
ｒｐｍ，−１０℃で１０分遠心し全核酸を沈澱させ上清
を捨てた。７０％エタノールを２００μｌ加え同条件で
遠心分離後，本エタノールを除去し本全核酸を乾燥させ
た。
【０１８８】既に発表されている小麦の２５ＳｒＲＮＡ
の塩基配列をもとに、特異的アデニンの４４塩基下流に
相補的なプライマーをＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社
製）を用い作成し，ＯＰＣカラム（ＡＢＩ社製）を使用
して本カラムに添付されてきた手順書に従い精製し滅菌
水に懸濁した。本プライマー１μＭを、前述のＭ−ＭＬ
Ｖ逆転写酵素用緩衝液中で本核酸とを３７℃で１５分間
保温しアニールさせた。
の塩基配列をもとに、特異的アデニンの４４塩基下流に
相補的なプライマーをＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ社
製）を用い作成し，ＯＰＣカラム（ＡＢＩ社製）を使用
して本カラムに添付されてきた手順書に従い精製し滅菌
水に懸濁した。本プライマー１μＭを、前述のＭ−ＭＬ
Ｖ逆転写酵素用緩衝液中で本核酸とを３７℃で１５分間
保温しアニールさせた。
【０１８９】本反応液（３．５μｌ）にＭ−ＭＬＶ逆転
写酵素（ベセスタリサーチ社製），各１ｍＭのｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰを含む溶液，（α−
３２Ｐ）ｄＣＴＰ（ニュウイングランドニュークリアデ
ュポン社製）をそれぞれ０．５μｌ加え３７℃で１時間
反応させた。
写酵素（ベセスタリサーチ社製），各１ｍＭのｄＡＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰを含む溶液，（α−
３２Ｐ）ｄＣＴＰ（ニュウイングランドニュークリアデ
ュポン社製）をそれぞれ０．５μｌ加え３７℃で１時間
反応させた。
【０１９０】反応終了後、１％のブロムフェノールブル
ーとキシレンシアノールを含む等量のホルムアミドを加
え９５℃で３分間加熱し核酸を変性させ，氷中で急冷し
た。バイオラッド社製の塩基配列決定用装置に添付され
てきた手順書に記載されたように塩基配列決定用ゲルを
作成し，４５ｃｍの長さの塩基配列決定用装置（宝酒造
社製）を用いて１８００ボルトで２時間電気泳動した。
ーとキシレンシアノールを含む等量のホルムアミドを加
え９５℃で３分間加熱し核酸を変性させ，氷中で急冷し
た。バイオラッド社製の塩基配列決定用装置に添付され
てきた手順書に記載されたように塩基配列決定用ゲルを
作成し，４５ｃｍの長さの塩基配列決定用装置（宝酒造
社製）を用いて１８００ボルトで２時間電気泳動した。
【０１９１】泳動終了後、ゲルをろ紙に移しとりゲル乾
燥器で乾燥させた後、オートラジオグラフィを行なっ
た。
燥器で乾燥させた後、オートラジオグラフィを行なっ
た。
【０１９２】ＰＡＰの遺伝子を持つ菌体上清を用いる
と、ＭＡＰを用いた場合と同じ位置に特異的にＤＮＡ鎖
の伸長が停止したことを示すバンドを認めることができ
た。
と、ＭＡＰを用いた場合と同じ位置に特異的にＤＮＡ鎖
の伸長が停止したことを示すバンドを認めることができ
た。
【０１９３】蒸留水やｐＳＨ７の菌体上清を用いた場合
本バンドを認めることはできなかった。
本バンドを認めることはできなかった。
【０１９４】
【０１９５】配列番号：１ 配列の長さ：２４７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：Phytolacca americana 組織の種類：植物全体 配列の特徴 特徴を表わす記号：CAAT signal 存在位置：549..552 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：CAAT signal 存在位置：627..630 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：TATA signal 存在位置：845..850 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1014..1085 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：1086..1868 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表わす記号：polyA site 存在位置：2130..2135 特徴を決定した方法：Ｓ
【０１９６】 配列 TTTATGAATA CTTTATAGTA TTAATAAATG AACATTATTC TATGATGCTA AGCTGCTAAT 60 CACAAGAATA ACTAGGTCTA GCAACTGTAG AGTGACGTTG TGACCACCTT TTTATGTGAT 120 TGGATTTGAC TATCATAGTG ATTATTTTCT TAGAGTGTTA CTTTTTCAAA GACATTTCAG 180 GTGAATAAAA AGAGAATAAA AAAATACTTT CAACAAAATC CATACCAAGA GTGTTTCAGG 240 AGGGCTTGAG GTTTAAGTAT AGAAGTCTTT TCTTTTGGAA ATCAAGTACC ATTTACTGAT 300 TTATATAAAT GGGTGAATCA AATGGTGTTC ATAATGAGGT TAGGAATATA GAATGTACGC 360 AATCATTATC CGTCTTATGC AAGATAGAAA TGTTGTTTTT AGGAGATCCT TGACTCAAAA 420 AAGTTTCAAA ATGACTCATG TTAAAAAAAA ATAAAACCAC TAATTAATAA TGAACATAAA 480 GTAGTAATTT TAGTAATTGT ATTGGTAATA AATATAATAG TACAAGTAAT AGTCATTATA 540 GTAGTAGTCA ATAATAATAA TAATTATTAT TATTATTATT ATTATTATAA CTAAATAAAT 600 AAATAATGAA ATGCTCCTAA TACCAACAAT GAATGAGTAA AATGTAGAGA GAGAGAGTAT 660 ATTTATATCA TCTGCAAATA AAATAAATTA ATAATAAATA AATAGGTAAA ATATAAGAGC 720 GGGGTATTTT TTTACGGTAC GTAAGAAAGG TTGGCATCTA GAAAAGATTC TAGAAAAAAA 780 AGATTGGCTA TATATATATA TATATATATA TATATATATA TATATATATA TATATATATA 840 TATATATAAA GAGAGTGGAA GGGCAGCCTA AAAAGAAATT CTGAAACTCG CGAAACACCA 900 GTGGTCAAGA AACTACATAT TGGTTAAAAT GAAATTCGAT TTAATTTCAA GCATTAATAT 960 GTGTTTTCTT TATGTTGCAT AGGTGAAAGT GTTGAAAGCA GCAACAAGGG AAG 1013 ATG AAG ATG ATG GTG GTG GTT GTT GTG ATG ATG TTA TCA TGG CTC 1058 Met Lys Met Met Val Val Val Val Val Met Met Leu Ser Trp Leu -24 -20 -15 -10 ATT CTT AAA CCA CCT TCA ACT TGG GCC ATA AAT ACA ATC ACC TTC 1103 Ile Leu Lys Pro Pro Ser Thr Trp Ala Ile Asn Thr Ile Thr Phe -5 1 5 GAT GTT GGA AAT GCA ACC ATT AAC AAG TAT GCC ACC TTT ATG AAA 1148 Asp Val Gly Asn Ala Thr Ile Asn Lys Tyr Ala Thr Phe Met Lys 10 15 20 TCG ATT CAT AAT CAA GCG AAA GAT CCC ACC CTG AAG TGC TAT GGC 1193 Ser Ile His Asn Gln Ala Lys Asp Pro Thr Leu Lys Cys Tyr Gly 25 30 35 ATA CCA ATG TTG CCC AAT ACT AAT TTG ACT CCC AAG TAC TTG TTG 1238 Ile Pro Met Leu Pro Asn Thr Asn Leu Thr Pro Lys Tyr Leu Leu 40 45 50 GTT ACG CTC CAA GAT TCA AGT TTA AAA ACC ATC ACA CTA ATG CTG 1283 Val Thr Leu Gln Asp Ser Ser Leu Lys Thr Ile Thr Leu Met Leu 55 60 65 AAG CGA AAC AAC TTG TAT GTG ATG GGC TAT GCT GAC ACC TAT AAT 1328 Lys Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ala Asp Thr Tyr Asn 70 75 80 GGC AAG TGT CGT TAT CAT ATA TTT AAG GAT ATC TCA AAT ACT ACT 1373 Gly Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Lys Asp Ile Ser Asn Thr Thr 85 90 95 GAA CGA AAT GAT GTG ATG ACT ACT CTT TGC CCA AAT CCG AGT TCT 1418 Glu Arg Asn Asp Val Met Thr Thr Leu Cys Pro Asn Pro Ser Ser 100 105 110 CGT GTT GGT AAA AAC ATT AAC TAT GAT AGC AGT TAT CCA GCA TTG 1463 Arg Val Gly Lys Asn Ile Asn Tyr Asp Ser Ser Tyr Pro Ala Leu 115 120 125 GAA AAG AAA GTA GGA CGA CCA AGA AGT CAA GTC CAA CTC GGA ATT 1508 Glu Lys Lys Val Gly Arg Pro Arg Ser Gln Val Gln Leu Gly Ile 130 135 140 CAA ATA CTC AAC AGT GGC ATT GGA AAG ATC TAT GGA GTG GAT TCA 1553 Gln Ile Leu Asn Ser Gly Ile Gly Lys Ile Tyr Gly Val Asp Ser 145 150 155 TTC ACT GAG AAA ACT GAA GCC GAA TTC CTG TTA GTA GCC ATC CAA 1598 Phe Thr Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala Ile Gln 160 165 170 ATG GTT TCA GAG GCA GCG CGG TTC AAG TAC ATA GAA AAT CAG GTG 1643 Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln Val 175 180 185 AAG ACT AAT TTT AAT AGA GCA TTC TAC CCT AAT GCC AAA GTA CTT 1688 Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala Phe Tyr Pro Asn Ala Lys Val Leu 190 195 200 AAC TTG GAG GAG AGT TGG GGT AAG ATC TCT ACG GCG ATT CAC AAT 1733 Asn Leu Glu Glu Ser Trp Gly Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asn 205 210 215 GCC AAG AAT GGG GCT TTA ACC AGT CCT CTA GAG CTA AAA AAT GCA 1778 Ala Lys Asn Gly Ala Leu Thr Ser Pro Leu Glu Leu Lys Asn Ala 220 225 230 AAC GGT AGC AAG TGG ATA GTG CTG AGA GTG GAT GAT ATC GAA CCT 1823 Asn Gly Ser Lys Trp Ile Val Leu Arg Val Asp Asp Ile Glu Pro 235 240 245 GAT GTG GGA CTC CTT AAG TAT GTT AAT GGG ACC TGC CAG GCA ACT 1868 Asp Val Gly Leu Leu Lys Tyr Val Asn Gly Thr Cys Gln Ala Thr 250 255 260 TAC CAA AGT GCC ATG TTC CCT CAC CTA TAA TGTCTACTTA TTATAATTAC 1918 Tyr Gln Ser Ala Met Phe Pro His Leu *** 265 270 ATGGCTAATC TTGGTGACTC TATTTGAAGG ATTCTAATCA TAGACATAAT ACGGAGTATA 1978 TATATATTAC TCAAACTATA TTATAAAGCT TAAATAAGAG GCCGTGCCAA TGGGTACTTG 2038 TTGCCTTGTG CTATACGGTG TTGTTTATTA TGCCTTGTAT GCTTGTAATA TTATCTGAGA 2098 ACAAGTTGTA CTGTGTAATA GTCTTGTTTG AAATAAATCT TTCAATTATG ATGGGTTTAG 2158 ATACATCTCA TATATGTTTT TTAATAGGTA TGATTTGGCT AGTTACTAGG GCTAAAACAA 2218 AACTGGGCTG GGCAATCAAA GTCAATGTAG ATGCTTCCAA TCAATCTTGT ACACTAAAAA 2278 TGGGATGCAT CTAAGCCCAT CGAAATTTTT CTTGACCCTC TCCCATTCCG TGAACCAATC 2338 AAAGTTAACG TAGATGTTTC TTTCTACCCT AACTCTGATT TTACAGGCTT AGTGTCTGTT 2398 GGTAGAGACA GCTCGAGACA GGTGATGACT GCCTTGCTCA CCATGGTCAT GCTTACGCGA 2458 CTATGCATCA GGAG 2472
【０１９７】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：Phytolacca americana 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：１２番目および１５番目のＮはＡ又はＣ又は
Ｇ又はＴを表わす。 配列 AAYAARTAYG CNACNTTYAT G 21
Ｇ又はＴを表わす。 配列 AAYAARTAYG CNACNTTYAT G 21
【０１９８】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：Phytolacca americana 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｓ 他の情報：６番目のＮはＡ又はＣ又はＧ又はＴを表わ
す。 配列 ATYTTNCCCC ARTTYTCYTC 20
す。 配列 ATYTTNCCCC ARTTYTCYTC 20
【０１９９】配列番号：４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：Phytolacca americana 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGGCATATGA AGATGATGGT GGTGGTTGTT GTG 33
【０２００】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源 生物名：Phytolacca americana 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGTACAACTT GTTCTCAGAT 20
【０２０１】
【０２０２】本発明によれば、季節、天候などによって
影響を受けず、安定して、リシンと同程度の試験管内蛋
白質合成阻害活性等を持つ新規なＰＡＰを供給すること
ができる。
影響を受けず、安定して、リシンと同程度の試験管内蛋
白質合成阻害活性等を持つ新規なＰＡＰを供給すること
ができる。
【０２０３】また、本発明によれば、形質転換植物にお
いて、時期および器官特異的に目的遺伝子を発現させる
ことが可能な塩基配列の遺伝子を供給することができ
る。
いて、時期および器官特異的に目的遺伝子を発現させる
ことが可能な塩基配列の遺伝子を供給することができ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 宮野 雅司 神奈川県横浜市緑区梅が丘６−２ 日本た ばこ産業株式会社生命科学研究所内 (72)発明者 小岩井 晃 神奈川県横浜市緑区梅が丘６−２ 日本た ばこ産業株式会社生命科学研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列中、
１〜２６１で示されるアミノ酸配列を有する、新規なプ
ロテイン。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１のアミノ酸配列中、
１〜２６１で示されるアミノ酸配列をコードする、遺伝
子。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１の塩基配列中、１０
８６〜１８６８の塩基配列で示される、遺伝子。 - 【請求項４】 配列表の配列番号１の塩基配列中、１０
１４〜１８９５の塩基配列で示される、発現型遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32967291A JPH05137580A (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 新規なプロテインおよびそれをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32967291A JPH05137580A (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 新規なプロテインおよびそれをコードする遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05137580A true JPH05137580A (ja) | 1993-06-01 |
Family
ID=18223981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32967291A Pending JPH05137580A (ja) | 1991-11-20 | 1991-11-20 | 新規なプロテインおよびそれをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05137580A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0808902A3 (en) * | 1996-05-22 | 1998-02-04 | Jinro Limited | Novel genes encoding antiviral proteins of Phytolacca insularis Nakai and recombinant microorganisms expressing the same proteins |
| WO2013065439A1 (ja) | 2011-11-01 | 2013-05-10 | 味の素株式会社 | 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法 |
-
1991
- 1991-11-20 JP JP32967291A patent/JPH05137580A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0808902A3 (en) * | 1996-05-22 | 1998-02-04 | Jinro Limited | Novel genes encoding antiviral proteins of Phytolacca insularis Nakai and recombinant microorganisms expressing the same proteins |
| WO2013065439A1 (ja) | 2011-11-01 | 2013-05-10 | 味の素株式会社 | 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法 |
| US10617122B2 (en) | 2011-11-01 | 2020-04-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Plant virus infection inhibitor and a method for inhibiting plant virus infection using the same |
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