JPH07138295A - 新規なヒトタンパク質およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト由来、分子量が約２６Ｋダルトンで２９
６個または３３４個のアミノ酸から成るコンドロモデュ
リンタンパク質（ＣｈＭ）及びそのｃＤＮＡを分離取得
し、該遺伝子を発現ベクターに組込み、動物細胞により
ＣｈＭを生産させた。 【効果】 ＣｈＭは軟骨細胞増殖作用かつ血管内皮細胞
増殖抑制作用を有するため、骨折及び各種軟骨疾患の治
療薬として、また癌等の腫瘍に対する治療薬として有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、軟骨細胞増殖活性を有
する新規なヒトタンパク質（以下、「ｈＣｈＭ−Ｉ」ま
たは「ヒトコンドロモジュリン−Ｉタンパク質」と略記
することがある）およびそれをコードする遺伝子（以
下、「ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子」と略記することがある）に
関する。詳しくは、軟骨細胞の増殖及び分化機能を促進
する新規なｈＣｈＭ−ＩおよびｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子、少
なくともｈＣｈＭ−Ｉを遺伝子組換え技術により発現さ
せるために必要なプロモーター配列、ｈＣｈＭ−Ｉをコ
ードするＤＮＡ配列およびターミネーター配列を有する
発現ベクターにより形質転換された形質転換体、さらに
その形質転換体を培養することにより当該タンパク質を
産生させる方法、ならびに該形質転換体を培養して得ら
れる培養液、分離された形質転換体、形質転換体処理
物、組換えｈＣｈＭ−Ｉ、またはこれらの固定化物を有
効成分として各種軟骨疾患に対する治療効果を有する薬
剤、ｈＣｈＭ−Ｉの血管浸潤抑制活性を用いて癌等の腫
瘍に対する治療効果を有する薬剤としてのｈＣｈＭ−Ｉ
の用途に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】哺乳
類の大部分の骨（頭蓋骨等の平板な骨は除く）は、胎児
期にまず軟骨原基が出現した後、軟骨細胞の増殖と分
化、プロテオグリカンや２型、９型、１０型コラーゲン
等の軟骨原基の産生を経て、毛細血管の侵入と共に軟骨
原基が分解して、基質小胞を中心とする石灰化が始ま
り、最後は骨に置換する、いわゆる「内軟骨性骨化」と
いう仕組みによって作られる。従って軟骨代謝は骨の形
成、特に長軸方向への伸長において非常に重要な役割を
演じている。

【０００３】この一連の過程において種々のホルモンや
成長因子が関与している。この中にはインスリン様増殖
因子（ＩＧＦ１，ＩＧＦ２）、繊維芽細胞増殖因子（Ｆ
ＧＦ）、癌細胞増殖因子（ＴＧＦ）、成長ホルモンなど
が含まれる。これらの他に軟骨細胞の増殖、分化機能の
促進作用を有する因子（コンドロモジュリン）が軟骨中
に存在する事が知られていた。しかし、これまでこの因
子の単一バンドまでの精製はなされておらず、その生理
活性を明確に示すことはなされていなかった。

【０００４】また骨折の治癒、各種軟骨疾患の治癒過程
においては軟骨細胞の増殖、分化機能の発現が重要であ
る。骨折治癒過程においては、骨折部位における炎症反
応、骨膜由来細胞の増殖に続き、軟骨細胞が出現、増殖
し、軟骨細胞外基質を合成した後に、石灰化し、骨組織
に置換されて骨折治癒が完成する。すなわち軟骨破壊、
損傷を伴う軟骨疾患からの回復過程においては軟骨細胞
の増殖が重要である事は明白である。

【０００５】さらには癌組織の増殖、転移においては、
エネルギー獲得のために組織内への血管侵入が必須であ
る。この増殖、転移の抑制には血管浸潤を抑制する事が
重要である。しかしながらこれらの疾患に対する軟骨細
胞増殖、血管浸潤抑制を有する有効な薬剤は現在まで存
在しない。Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｎｅａｍｅら（Ｔｈｅ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，２６５，９６２８−９６３３（１９９
０））は、牛軟骨より軟骨中に存在する構成タンパク質
を同定する目的でコンドロモジュリンと極めて類似した
アミノ酸配列を持つ糖タンパク質を分離した。しかし彼
らはこのタンパク質の生物学的機能の解明には至ってい
ない。

【０００６】開らは、牛軟骨より作成したｃＤＮＡライ
ブラリーより牛コンドロモジュリン−Ｉ遺伝子をクロー
ニングし、動物細胞で発現させた。発現された組換え牛
コンドロモジュリン−Ｉタンパク質は、精製された牛コ
ンドロモジュリン−Ｉタンパク質と同等の活性がある事
が報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄＢ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１７５，９７１−９７７（１９９
１），欧州公開特許第４７３０８０号公報）。

【０００７】しかしながら、牛コンドロモジュリン−Ｉ
タンパク質を人体に対して安全に適用させる為には、ま
ずヒト型のコンドロモジュリン−Ｉ遺伝子（ｈＣｈＭ−
Ｉ遺伝子）の構造解析を行い、抗原性の有無を予想する
ために牛コンドロモジュリン−Ｉタンパク質との差異を
明らかにしなければならない。またそこで差異が明らか
になった場合は、遺伝子工学の技術を用い牛型からヒト
型へコンドロモジュリン−Ｉ遺伝子の改良を行い、組換
えコンドロモジュリンタンパク質をより抗原性の低いも
のに作り換え、適用したほうが望ましい。一方ヒト型の
コンドロモジュリン−Ｉタンパク質をヒト軟骨細胞から
抽出し精製する事は、コスト的にも材料的にも不可能で
あるのが現状であった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、ｈ
ＣｈＭ−Ｉを組換えＤＮＡ技術により大量に生産させる
べく鋭意検討を重ねた結果、かかる目的に有用な新規な
ｈＣｈＭ−Ｉをコードするヒト遺伝子を初めて分離取得
し、さらにこの遺伝子を発現ベクターに組み込み形質転
換体を得て、その形質転換体により組換えｈＣｈＭ−Ｉ
を大量かつ安価に生産させることに成功し、本発明を完
成するに至った。

【０００９】すなわち本発明の要旨は、下記の理化学的
性質を有することを特徴とする新規なタンパク質および
それをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形
質転換体によるヒトコンドロモジュリンタンパク質−Ｉ
の製造方法に存する。 １つのポリペプチドから構成される水溶性タンパク
質であって、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約２６Ｋダルトンである。

【００１０】 軟骨細胞を単独でまたは繊維芽細胞増
殖因子共存下において増殖させる活性を有する。 軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
る。 血管内皮細胞の増殖を抑制する活性を有する。 以下本発明をさらに詳細に説明するに、本発明のｈＣｈ
Ｍ−Ｉは、例えばヒト軟骨等の組織を破砕し、それを遠
心分離した上清を限外ろ過膜により分画、濃縮したもの
を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ２００カラム等による分子
ふるいクロマトグラフィーによりさらに分画した後、Ｙ
ＭＣ ｐａｃｋ Ｃ４カラムクロマトグラフィー等によ
り溶出条件を変えて繰り返し精製することによって得る
ことができる。しかしヒト組織を多量に安定して得るこ
とは困難であることから、後述の実施例に記述するよう
に、ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子を導入した形質転換体の培養液
をブルーセファロースカラム等にかけアルブミンと共に
他のタンパク質より分離した後、ＹＭＣ ｐａｃｋ Ｃ
４カラムクロマトグラフィー等により溶出条件を変えて
繰り返し精製する事によって得ることもできる。精製さ
れた本発明のタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動による分子量が約２６，０００ダルトンであ
り、軟骨細胞を単独でまたは繊維芽細胞増殖因子共存下
で増殖させる活性および軟骨細胞の分化機能を促進する
活性さらに内皮細胞の増殖を抑制する活性を有する。

【００１１】また、本発明のｈＣｈＭ−Ｉは、配列表の
配列番号２〜４に示すようなアミノ酸配列を有するタン
パク質であり、軟骨細胞を増殖させる活性および軟骨細
胞の分化機能を促進する活性さらに内皮細胞の増殖を抑
制する活性を損なわない範囲で一部のアミノ酸を除去、
置換、修飾または追加するなどの改変を行ったものも、
本発明のｈＣｈＭ−Ｉに含まれる。

【００１２】上記のｈＣｈＭ−Ｉをコードする遺伝子と
しては、例えば配列表の配列番号２〜７に示すような塩
基配列を有するものが挙げられる。この中で配列表の配
列番号２〜４に記載されている配列は、以下で述べるＰ
ＣＲ用プライマーが牛コンドロモジュリン遺伝子に由来
する配列であったため、その一部に牛遺伝子の塩基配列
を有するが、遺伝子組換え技術により種々の形質転換体
を作成し該遺伝子を発現させる場合において得られる組
換えタンパク質のアミノ酸配列にｈＣｈＭ−Ｉと何ら変
化が認められない為、ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子と同等の効果
を持つものと考えられる。

【００１３】本発明のｈＣｈＭ−Ｉをコードする遺伝子
のＤＮＡ断片は、例えば次のような方法によって得るこ
とができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を
含有するＤＮＡライブラリーとしては、正常ヒト軟骨ま
たはヒトコンドロザルコーマなどの組織から調製してき
たＲＮＡを用いて公知の常法により作成したプラスミド
ｃＤＮＡライブラリー、ファージｃＤＮＡライブラリ
ー、ファージゲノミックライブラリー等が利用できる。

【００１４】例えばファージｃＤＮＡライブラリーの場
合、まず正常ヒト軟骨またはヒトコンドロザルコーマな
どの組織を液体窒素中で粉砕し、グアニジウムイソチオ
シアネート水溶液等中でホモジナイズし、Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２
９４−５２９９（１９７９））に従って塩化セシウム平
衡密度勾配遠心法によって全ＲＮＡを沈澱として分離す
る。分離後、フェノール抽出、エタノール沈澱により全
ＲＮＡを精製し、これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラ
ムクロマトグラフィーにかけて精製して、目的のｈＣｈ
Ｍ−ＩのｍＲＮＡを含むポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ（ｐｏ
ｌｙＡ⁺ ｍＲＮＡ）を単離し、ｍＲＮＡ群を得ることが
できる。

【００１５】次に、上記で調製したｍＲＮＡ群と、例え
ばＮａｔｕｒｅ，３２９，８３６−８３８（１９８７）
に記載されているような、具体的には配列表の配列番号
１１および１２で表されるＤＮＡにより構成されるプラ
イマーＤＮＡ、あるいはデオキシチミジンが１２個から
１８個つながったいわゆるＯｌｉｇｏ（ｄＴ）とをハイ
ブリダイズさせ、逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合
成する。次に大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌の
ＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨ等を用い、常法に従い２
本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼによりｃＤＮＡの末端を平滑化した後、いわゆるＥ
ｃｏＲＩアダプター等の、制限酵素により切断された形
をなすＤＮＡの小断片をＴ４ＤＮＡリガーゼによりｃＤ
ＮＡ鎖の両末端に付加する。

【００１６】この際、例えばＥｃｏＲＩメチレース等の
メチレースでｃＤＮＡ中のＥｃｏＲＩ切断点をメチル化
し、制限酵素ＥｃｏＲＩの切断からｃＤＮＡを保護して
おき、末端にいわゆるＥｃｏＲＩリンカー等をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより付加した後、制限酵素ＥｃｏＲＩでリ
ンカーＤＮＡ部分のみを切断しても同様な結果が得られ
る。ベクターのクローニングサイトとして、例えばＢａ
ｍＨＩなどの他の制限酵素の切断点を選択する場合は、
前述の一連の末端処理の操作を例えばＢａｍＨＩアダプ
ター、もしくはＢａｍＨＩメチレース，ＢａｍＨＩリン
カー，ＢａｍＨＩ等の組み合わせにする事により同様な
結果を得ることができる。上記の様に末端処理されたｃ
ＤＮＡ鎖を、市販のλファージベクター、例えばλＺＡ
Ｐ（プロメガ・バイオテック社）等のλファージベクタ
ーまたはｐＧＥＭ２（プロメガ・バイオテック社）等の
プラスミドベクターのＥｃｏＲＩ切断部位に常法に従い
挿入して、組換えλファージＤＮＡ群または組換えプラ
スミドＤＮＡ群を得る。

【００１７】このようにして得られた組換えλファージ
ＤＮＡ群を材料とし、市販の例えばギガパック・ゴール
ド（プロメガ・バイオテック社）などのイン・ビトロ・
パッケージング・キットを説明書に従い使用しいわゆる
イン・ビトロ・パッケージングを行い、組換えλファー
ジＤＮＡを有するλファージ粒子を得ることが出来る。
得られたλファージ粒子を常法、例えばＴ．Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらの方法（「モレキュラー クローニング」，コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー，８５
（１９８２））に従い、宿主、例えば大腸菌に形質導入
し、増殖させる。また、組換えプラスミドＤＮＡ群では
常法に従い、宿主、例えば大腸菌を形質転換し、増殖さ
せる。次にこれらファージを、例えばジーンスクリーニ
ングプラスなどのナイロン膜あるいはニトロセルロース
膜上に移し取り、アルカリ存在下で蛋白を除き、ｃＤＮ
Ａを含むλファージＤＮＡあるいはプラスミドＤＮＡに
したものに対して、すでにクローニングされている牛コ
ンドロモジュリン遺伝子の断片から常法に従い、あるい
は市販のキット等により作製した³²Ｐ標識プローブとこ
れらｃＤＮＡクローンのＤＮＡ群とをハイブリダイズさ
せ、プラークハイブリダイゼーション法（「モレキュラ
ー クローニング」，コールド スプリングハーバー
ラボラトリー，３２０〜３２８（１９８２））によって
選択し、目的とするｈＣｈＭ−ＩをコードするｃＤＮＡ
クローンの全部または一部を得ることができる。

【００１８】牛コンドロモジュリンの配列を基にＰＣＲ
プライマーを設計し、いわゆるＰＣＲ法にてｈＣｈＭ−
Ｉをコードする遺伝子の一部を取得することもできる。
その場合ＰＣＲ法に用いる鋳型には、ヒトコンドロザル
コーマもしくはヒト正常軟骨細胞より抽出したＲＮＡを
基に常法に従い合成したｃＤＮＡを用いると良い。また
ＰＣＲ法を繰り返し行うことにより、またはＰＣＲ法の
鋳型として用いるｃＤＮＡを合成する際に用いるプライ
マーに対するＰＣＲ用プライマーを設計し、これを用い
てＰＣＲ法を行ったり、または３’末端側に適当なアン
カー配列を付加しそれに対応するＰＣＲ用プライマーを
用いてＰＣＲ法を行うことにより、ｈＣｈＭ−Ｉの全長
をコードする遺伝子を取得することもできる。

【００１９】さらに、前述のライブラリーのスクリーニ
ングで陽性のプラークからＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方
法（「モレキュラー クローニング」，コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー，８５（１９８２））
によりＤＮＡを調製し、適当な制限酵素、例えばＥｃｏ
ＲＩ等で切断後，ｐＵＣ１８等のプラスミドにクローニ
ングし、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法（プロシーディ
ングス オブ ナショナル アカデミー サイエンス
ユー エス エー［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ］，７４，５４６３（１９７７））によっ
て目的とするＤＮＡ断片の塩基配列が決定できる。

【００２０】このようにして決定されるＤＮＡ断片は、
全長８９２または１００６ヌクレオチド長からなる断片
であり、その塩基配列（例えば、配列表の配列番号２〜
７）は、成熟型タンパク質のアミノ酸配列を含む２９６
個または３３４個のアミノ酸からなるタンパク質をコー
ドしている。また配列番号２〜４に示す塩基配列はその
一部に牛コンドロモジュリン遺伝子の配列を有するが、
それがコードするアミノ酸配列はｈＣｈＭ−Ｉと一致す
る。また本発明によるＤＮＡ断片は、配列表の配列番号
２〜４に示すアミノ酸配列をコードするものに限らず、
軟骨細胞を増殖させる活性および軟骨細胞の分化機能を
促進する活性さらに内皮細胞の増殖を抑制する活性を持
つ限りは、そのアミノ酸配列を改変したものも含まれ
る。

【００２１】上記のようにして得られるＤＮＡ断片は、
その５’末端を修飾して公知の発現ベクターにそれ自体
公知の方法でプロモーターの下流に挿入され、次いで上
記のＤＮＡが挿入された発現ベクターは、大腸菌、酵
母、昆虫細胞、動物細胞宿主等、公知の細胞中にそれ自
体公知の方法により導入される。本発明のｈＣｈＭ−Ｉ
の産生方法につき詳細に説明すると、発現ベクターとし
ては上記のようにして得られたｈＣｈＭ−Ｉをコードす
るＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有してい
るものが使用される。ｈＣｈＭ−Ｉの工業生産のために
は、安定した宿主−ベクター系を構築すること、さらに
生物学的に活性を有するｈＣｈＭ−Ｉを発現しうる系を
用いる必要がある。特に天然のｈＣｈＭ−Ｉが糖蛋白質
であること、ｈＣｈＭ−Ｉ分子が多くのシステインを含
み、そのリフォールディングが生理活性の獲得に重要で
あること、また細胞（生体）内で成熟型ｈＣｈＭ−Ｉに
プロセスされること等を考慮すると、宿主としては動物
細胞を用いることが望ましい。

【００２２】しかし形質転換に用いる宿主としては、例
えば後述の実施例で使用される動物細胞が挙げられる
が、とくに動物細胞に限定されるものではなく、他の微
生物、昆虫細胞などの宿主生物を用いることができる。
動物細胞としては、例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マ
ウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞
等が挙げられる。またこれらの細胞を宿主とするとする
場合は、前駆体タンパク質の形でｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子を
導入することにより、成熟型になったｈＣｈＭ−Ｉが分
泌生産されるという利点が期待される。これらの細胞を
宿主とした発現用プラスミドは、プロモーターとしては
ＳＶ４０プロモーターまたはメタロチオネイン遺伝子の
プロモーターを有していることが好ましい。このプロモ
ーターの下流に、シグナル配列を含むｈＣｈＭ−Ｉ遺伝
子を５’側から挿入する。またｈＣｈＭ−Ｉの生産量を
上げるため、ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子を５’側から２−３個
つなげたものを挿入してもよいし、各ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝
子の５’側にＳＶ４０などのプロモーターを挿入したも
のを２−３個つなげてもよい。このｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子
の下流にはポリアデニル化部位が含まれる。ポリアデニ
ル化部位としては、例えばＳＶ４０ＤＮＡ、β−グロビ
ン遺伝子またはメタルチオネイン遺伝子由来のもの等が
挙げられる。

【００２３】この発現ベクターには、動物細胞、例えば
ＣＨＯ細胞に形質転換した際の選択マーカーを有してい
る場合とそうでない場合の両者があげられる。選択マー
カーとしては、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ
遺伝子、３’―デオキシストレプタミン抗生物質Ｇ−４
１８遺伝子などが挙げられ、各耐性遺伝子の５’側には
例えばＳＶ４０由来のプロモーターが挿入されており、
各耐性遺伝子の３’側には、ポリアデニル化部位が含ま
れる。ｈＣｈＭ−Ｉの発現ベクターにこれらの耐性遺伝
子を挿入する場合、ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子のポリアデニル
化部位の下流に挿入すればよい。またかかる発現ベクタ
ーは、形質転換体の選択マーカーを有していなくてもよ
い。この場合、ｈＣｈＭ−Ｉの発現ベクターと共に形質
転換体の選択のマーカーを有するベクター、例えばｐＳ
Ｖ２ｎｅｏ，ｐＳＶ２ｇｐｔ，ｐＭＴＶｄｈｆｒなどを
二重形質転換してやればよい。

【００２４】この二重形質転換法によってｈＣｈＭ−Ｉ
発現ベクターで形質転換した動物細胞を選択するために
は、選択マーカーの発現による上記した表現形質によ
り、ｈＣｈＭ−Ｉ形質転換細胞を選択することが可能で
ある。さらにｈＣｈＭ−Ｉの発現量の上昇を目的とし
て、二重形質転換法にてｈＣｈＭ−Ｉの発現が確認され
た細胞に対し選択マーカーを変更し、二重形質転換を繰
り返してもよい。発現ベクターに使用されるプラスミド
ベクターの具体例としては、ＳＶ４０初期プロモータ
ー、ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス
配列ＤＮＡ、ウサギのβ−グロビン遺伝子からのポリア
デニル化部位、ＳＶ４０初期領域からのポリアデニル化
部位、並びにｐＢＲ３２２由来の複製開始点およびアン
ピシリン耐性遺伝子を含有するｐＫＣＲ（プロシーディ
ングス オブ ナショナルアカデミー オブ サイエン
ス ユー エス エー［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］，７８，１５２８（１９８１））
などが挙げられる。

【００２５】発現ベクターの動物細胞への移入は、リン
酸カルシウムによるトランスフェクション法が一般的で
ある。形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮
遊培養または付着培養で行うことができる。培地として
は、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０などを用い、５−１０％
血清存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメサ
ゾン、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下に
て培養する。ｈＣｈＭ−Ｉを発現している動物細胞はそ
の培養上清中にｈＣｈＭ−Ｉを分泌するものと考えら
れ、かかる組換え体の培養上清を用いｈＣｈＭ−Ｉの分
離精製を行うことが可能である。生産されたｈＣｈＭ−
Ｉを含む培養上清は、各種クロマトグラフィー、例えば
ヘパリンセファロースもしくはブルーセファロース等を
用いたクロマトグラフィー等により精製可能である。

【００２６】また大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とす
るときには、発現ベクターはプロモーター、リボゾーム
結合（ＳＤ）配列、ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子、転写終結配
列、およびプロモーターを制御する遺伝子より成ること
が好ましい。プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
Ｐ_L 、Ｐ_R 、Ｔ₅ ファージの初期遺伝子のプロモーター
であるＰ₂₅、Ｐ₂₆プロモーター等が挙げられる。また、
これらは例えばｐａｃプロモーター（アグリカルチュラ
ル アンド バイオロジカル ケミストリー［Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．］５２、９８３−９８８（１
９８８））のように独自に改変、設計された配列でも良
い。

【００２７】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。更にこれらの発現に必要な因子の発現プ
ラスミド上での配列順序は、５’上流から、プロモータ
ー、ＳＤ配列、ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子、転写終結因子の順
に並ぶ事が望ましい。また発現ベクター上のＳＤ配列と
ｈＣｈＭ−Ｉ遺伝子とのユニットを複数個同方向に挿入
することにより、ベクター上の転写単位のコピー数を増
加させる方法（特開平１−９５７９８号公報）を用いる
こともできる。

【００２８】発現ベクターとして使用できるものとして
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）や市販
のｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）等がある。ま
た、融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシ
リーズ（ファルマシア社製）等も同様にして使用でき
る。宿主の形質転換法としては、常法に従い行うことが
できる。形質転換体の培養は、モレキュラー クローニ
ング（コールド スプリングハーバー ラボラトリー，
（１９８２））に記載の方法を参考にして行うことがで
きる。培養温度としては、２８〜４２℃が適当である。

【００２９】昆虫細胞としては、例えばインビトロジェ
ン社のバキュロウイルス発現マニュアルであるマックス
バック（ＭＡＸＢＡＣ^TM，ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ Ｅ
ＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＭＡＮＵＡＬ Ｖ
ＥＲＳＩＯＮ １．４）に従い、このキットを使用す
る。この時、発現量を上げるためにポリヘドリンのプロ
モーターから開始コドンまでの距離を変えることが好ま
しい。上記形質転換体を培養して得られるｈＣｈＭ−Ｉ
は、公知の方法で宿主から単離・精製される。大腸菌等
の微生物、昆虫細胞、および動物細胞で発現させて得ら
れる該組換えポリペプチドは、例えばｈＣｈＭ−Ｉの一
部配列を含む合成ペプチドに対するウサギ抗血清との免
疫学的反応性により、ｈＣｈＭ−Ｉであることが確認さ
れる。かかる方法としては、常法であるウェスタンブロ
ッティング法が利用できる。

【００３０】本発明のｈＣｈＭ−Ｉは、軟骨細胞の増
殖、軟骨細胞の分化機能の促進、さらに内皮細胞の増殖
の抑制等の作用により、骨折、各種軟骨疾患の予防また
は治療薬として、さらには癌の治療薬として有効であ
る。ｈＣｈＭ−Ｉの生理活性は、例えば次のようにして
測定される。軟骨細胞増殖活性の評価のための細胞取
得、培養および評価方法は、鈴木らの方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４６，３１３−
３２０（１９８７））に従って行う。すなわちウサギよ
り成長肋軟骨を分離し、初代軟骨細胞を９６穴プレート
を用いて培養する。細胞がコンフルエントに達した後、
約０．６から約２００ｎｇ／ｍｌのｈＣｈＭ−Ｉおよび
０．４ｎｇ／ｍｌ程度の繊維芽細胞増殖因子を加え、
〔 ³Ｈ〕チミジンの取り込みを測定する。その結果、
０．４ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞増殖因子のみ添加時に比
べｈＣｈＭ−Ｉを同時に加えた時の方が多量の放射性チ
ミジンの取り込みがみられ、ｈＣｈＭ−Ｉが強力な軟骨
細胞の増殖促進効果を有することを示された。

【００３１】血管浸潤抑制の指標となる血管内皮細胞の
増殖抑制は、大動脈内皮細胞の〔 ³Ｈ〕チミジンの取り
込みの抑制として測定される。牛大動脈内皮細胞の培地
中にｈＣｈＭ−Ｉを添加して、細胞内に取り込まれる
〔 ³Ｈ〕チミジンの量を測定したところ、ｈＣｈＭ−Ｉ
が内皮細胞への放射能の取り込みを抑制し、血管内皮細
胞の増殖を押さえる活性を有することを示した。かかる
ｈＣｈＭ−Ｉを臨床に応用するに際し、ｈＣｈＭ−Ｉを
単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得
る担体と配合して医薬組成物として用いることもでき
る。このときの有効成分ｈＣｈＭ−Ｉの担体成分に対す
る割合は、１重量％から９０重量％の間で変動され得
る。例えば本発明のｈＣｈＭ−Ｉは、コラーゲン、アテ
ロコラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリエチレン
グリコール、ポリ乳酸、骨セメント、ハイドロキシアパ
タイト、セラミックス、炭素繊維、フィブリン糊等の生
体適合性担体に混合、含浸、塗布することによって、骨
折部位、軟骨疾患部位等に外用剤として投与することが
できる。また、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、硬カプセ
ル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、液剤
等の剤形にして経口投与してもよいし、注射剤として静
脈内投与、筋肉内投与、局所内投与、皮下投与してもよ
いし、坐剤として用いることもできる。経口、経腸、非
経口の組成物を調製する場合は、有機または無機の、固
体または液体の担体もしくは希釈剤が用いられる。固形
製剤を製造する際に用いられる賦形剤としては、例えば
乳糖、ショ糖、デンプン、タルク、セルロース、デキス
トリン、カオリン、炭酸カルシウム等が用いられる。経
口投与のための液体製剤、すなわち乳剤、シロップ剤、
懸濁剤、液剤等は、一般的に用いられる不活性な希釈
剤、例えば水、植物油等を含む。この製剤は、不活性な
希釈剤以外に補助剤、例えば湿潤剤、懸濁補助剤、甘味
剤、芳香剤、着色剤、保存剤等を含むことができる。液
体製剤にしてゼラチンのような吸収され得る物質のカプ
セル中に含ませてもよい。非経口投与の製剤、すなわち
注射剤、坐剤等の製造に用いられる溶剤または懸濁化剤
としては、例えば水、プロピレングリコール、ポリエチ
レングリコール、ベンジルアルコール、オレイン酸エチ
ル、レシチン等が挙げられる。坐剤に用いられる基剤と
しては、例えばカカオ脂、乳化カカオ脂、ラウリン脂、
ウィテップゾール等が挙げられる。これらの調製方法
は、適宜常法に従って行うことができる。

【００３２】本発明のｈＣｈＭ−Ｉの臨床投与量は、そ
の投与形態、患者の年齢、体重、症状等によって適宜設
定されるが、一般に経口剤または外用剤として使用する
場合、成人に対し１日量１ｎｇ〜５０ｍｇ（注射剤の場
合は、その１０分の１以下）であることが望ましい。こ
れは、１日に１回、または適当な間隔をおいて１日に２
〜数回に分けて投与してもよいし、間欠投与してもよ
い。注射剤として用いる場合は、前記量を連続投与また
は間欠投与することが望ましい。なお、医薬用途を目的
として使用されるｈＣｈＭ−Ｉは、精製されたｈＣｈＭ
−Ｉ、組換えｈＣｈＭ−Ｉ、さらには形質転換体の培養
液、分離形質転換体、形質転換体処理物、固定化形質転
換体、粗酵素液、酵素処理物等のいずれであっても構わ
ない。

【００３３】

【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例によって限定されるものではない。 実施例１ 牛コンドロモジュリン遺伝子からのプローブ
ＤＮＡ断片の調製 既に開らによりクローニングされている（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１７５，９
７１−９７７（１９９１）；欧州公開特許第４７３０８
０号公報）牛コンドロモジュリン遺伝子の全タンパク質
をコードする約１．４ｋｂの遺伝子配列を、ｐＵＣ１９
ベクターのＥｃｏＲＩサイトに持つ組換え体の大腸菌か
らＭａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラー クロー
ニング」，コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー，８６〜９６頁（１９８２））に従いプラスミドＤ
ＮＡを回収、精製し、牛コンドロモジュリン遺伝子を持
つプラスミドＤＮＡを大量に得た。

【００３４】得られたプラスミドＤＮＡ２０μｇを、制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ各々約２００Ｕを用い
て３７℃で２時間切断し、常法に従いアガロース電気泳
動を行うことにより、ベクターＤＮＡと牛コンドロモジ
ュリン遺伝子とを分離した。ゲルを常法に従いエチジュ
ウムブロマイドで染色し、牛コンドロモジュリン遺伝子
に対応するＤＮＡ断片の部分をＵＶ下で切り出した。次
にこの牛コンドロモジュリン遺伝子を含むアガロースゲ
ルを、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラー ク
ローニング」，コールド スプリング ハーバー ラボ
ラトリー，１６４〜１７０頁（１９８２））に従いゲル
からＤＮＡ断片を回収、精製した。この操作により、約
２μｇのプローブ用ＤＮＡ断片を得た。このようにして
得られたＤＮＡ断片１００ｎｇを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社製ＲＴＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔを用
いて、添付の説明書に従い³²Ｐ標識した。

【００３５】実施例２ ｈＣｈＭ−Ｉの一部をコードす
るゲノミックＤＮＡクローンのスクリーニング ヒト由来のゲノミックライブラリー（クローンテック
社）のスクリーニングを説明書に従って行った。２４．
５ｃｍ×２４．５ｃｍのシャーレ内の１．５％ＮＺＹ寒
天培地に重層されたＮＺＹ軟寒天培地（［ＮＺＹ培地；
１％ＮＺ−アミン、０．５％イーストイクストラクト、
０．５％塩化ナトリウム溶液をｐＨ７．５に調整し、
０．２５％硫酸マグネシウムを加えたもの］、［１．５
％ＮＺＹ寒天培地；ＮＺＹ培地に１．５％になるように
寒天沫を加えオートクレイブしたもの］、［ＮＺＹ軟寒
天培地；ＮＺＹ培地に０．７％になるように寒天沫を加
えオートクレイブしたもの］）中で、約１００万クロー
ンのファージをシャーレ一枚あたり２０万クローンの割
合で大腸菌Ｐ２−３９２株に感染させ、３７℃で一晩培
養した。次に市販のニトロセルロース膜であるＢＡ８５
（Ｓ＆Ｓ社）を軟寒天培地上にかぶせて静かにはがすこ
とにより培地中のλファージクローンをニトロセルロー
ス膜上に移し取り、以下に説明するプラークハイブリダ
イゼーションを行った。

【００３６】即ち、一枚のシャーレあたりニトロセルロ
ース膜２枚の割合で前述の軟寒天培地上にかぶせてファ
ージ粒子を移し取り、培地との間に印をつけておく。こ
の印は２枚のニトロセルロース膜で等しくつけておく。
その様にしてできたニトロセルロース膜を０．２Ｍ水酸
化ナトリウム−１．５Ｍ塩化ナトリウムが染み込んだろ
紙上に２分間静置し、別に用意した乾いたろ紙上で水分
を除いた後、次に同様に２×ＳＳＣＰ（２倍の濃度のＳ
ＳＣＰ溶液のこと、以下同様の表記方法をとる。１０×
ＳＳＣＰは１．２Ｍ塩化ナトリウム、１５０ｍＭクエン
酸ナトリウム、１３０ｍＭ燐酸二水素カリウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡ ｐＨ７．２）−０．２Ｍトリス−塩酸（ｐＨ
７．４）を染み込ませたろ紙上でこのニトロセルロース
膜を静置し、乾いたろ紙上で風乾した後、同じ操作を再
び繰り返した。

【００３７】このようにして処理したニトロセルロース
膜を、８０℃で２時間加熱することにより膜上に核酸を
固定した。次に膜を３×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは２０倍
の濃度のＳＳＣ溶液；３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍク
エン酸ナトリウム）−０．１％ＳＤＳで６０℃１５分間
２回洗浄し、次にニトロセルロース膜１枚当り５ｍｌの
ハイブリダイゼーシヨン液（３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ［５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ
は５０倍の濃度のＤｅｎｈａｒｄｔ溶液；１％牛血清ア
ルブミン、１％ポリビニルピロリドンおよび１％フィコ
ール４００］、２０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、１０％硫
酸デキストラン）に６５℃で３時間保温した。

【００３８】次に実施例１で作製した³²Ｐ標識ＤＮＡ断
片を、鋳型ＤＮＡ換算で５ｎｇ／ｍｌの濃度になるよう
ハイブリダイゼーション液に加えた後、５５℃で１８時
間保温した。その後、ニトロセルロース膜を取り出し、
３×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液中、室温で３０分間洗
い、これを２回繰り返した。次に、０．２×ＳＳＣ−
０．１％ＳＤＳ溶液で５５℃で１５分間洗い、これを２
回繰り返した後に膜を乾かし、オートラジオグラフィー
をとった。このようにして２枚１組のニトロセルロース
膜のオートラジオグラフィー上のシグナルが一致したも
のは１個あった。得られたシグナルに相当するクローン
を単離するために、これらシグナルと一致する軟寒天培
地上のプラークをガラス管で打ち抜き、５０μｌのクロ
ロフォルム存在下１ｍｌのＴＭＧ緩衝液［５０ｍＭトリ
ス−塩酸 ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１
０ｍＭ塩化マグネシウムおよび０・０１％ゼラチン］中
でファージ粒子を一晩抽出し、常法に従い大腸菌Ｐ２−
３９２株に感染させて９ｃｍシャーレ中で適当量培養
し、前述の方法の様にプラークハイブリダイゼーション
を行った。この一連の操作を繰り返すことにより、シグ
ナルに相当するクローンを純化することができた。その
結果独立した１個のクローンλ４１１を得た。

【００３９】実施例３ ファージＤＮＡからコード領域
を含むＤＮＡ断片のサブクローニングおよび塩基配列の
決定 前述の実施例２で得られたファージクローンλ４１１か
ら以下のようにＤＮＡを抽出し、プラスミドベクターｐ
ＵＣ１８、ｐＵＣ１９にサブクローニングを行った。即
ち、５００ｍｌ三角フラスコ中の２００ｍｌのＮＺＹ培
地中において、２００μｌのＴＭＧ溶液に懸濁してある
λファージクローン２×１０⁷ ｐ．ｆ．ｕ．（ｐ．ｆ．
ｕ．；プラーク形成単位）と４０μｌの大腸菌Ｐ２−３
９２株２×１０⁸ を３７℃１５分置くことにより感染さ
せた。１５分後さらに１ｍｌの１Ｍ塩化カルシウムを加
え、一晩、概ね１４時間ほど培養した。次に、２ｍｌの
クロロフォルムを加え１０分ほど置き、１５．８ｇの塩
化ナトリウムを加え溶かし、それらを４℃において日立
冷却遠心機ＳＣＲ２０ＢＢ（ローターＲＰＲ９−２）を
用いて６０００回転２０分間遠心した上清に２０ｇのポ
リエチレングリコール６０００を加えて十分に溶解した
後に、氷中で１時間静置した。

【００４０】これを日立冷却遠心機ＳＣＲ２０ＢＢ（ロ
ーターＲＰＲ９−２）で６０００回転２０分間遠心し、
沈澱を６ｍｌのＡ緩衝液［０．５％ＮＰ４０、３６ｍＭ
塩化カルシウム、３０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、
５０ｍＭ塩化マグネシウム、１２５ｍＭ塩化カリウム、
０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．２５％ＤＯＣ、０．６ｍＭメ
ルカプトエタノール］に懸濁し、ここに１００μｌの１
０ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩと１０μｌ
の１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡを加え、３０℃
で３０分間保温することにより大腸菌由来の核酸を分解
した。その後上記反応液に等量のクロロフォルムを加
え、良く攪はんした後にトミー遠心機ＬＣ−０６（ロー
ターＴＳ−７）で３０００回転１０分間遠心し、上清を
分取した。

【００４１】一方、予め日立超遠心機ローターＲＰＳ４
０Ｔ用遠心管に４０％グリセロール溶液［０．５％ＮＰ
４０、３０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１２５ｍＭ
塩化カリウム、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．６ｍＭメルカ
プトエタノール、４０％グリセロール］を１ｍｌ入れて
おき、その上に３ｍｌの１０％グリセロール溶液［０．
５％ＮＰ４０、３０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１
２５ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．６ｍ
Ｍメルカプトエタノール、１０％グリセロール］を重層
して準備しておいた上に先ほどのヌクレアーゼ処理をし
たファージ懸濁液を重層し、日立超遠心機７０Ｐ７２
（ローターＲＰＳ４０Ｔ）で３５０００回転１時間遠心
した。遠心後沈澱として落ちてきたファージ粒子を０．
４ｍｌの４０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳに懸濁し、４μｌの１０ｍｇ／ｍ
ｌのプロテナーゼＫを加えて５５℃１時間保温を行っ
た。その後溶液をエッペンドルフチューブに移し、等量
のフェノール／クロロフォルムにてファージＤＮＡを抽
出し、エタノール沈澱を行うことにより目的とするファ
ージＤＮＡを２００μｇ得ることが出来た。

【００４２】このファージＤＮＡ１０μｇ（１０μｌ）
を、宝酒造社製の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩを
各々２０ユニットを用い、指定された制限酵素緩衝液中
で３７℃で３時間反応させた後、常法に従いアガロース
電気泳動法を行った。次に前記実施例１のプローブを用
いてモレキュラー クローニング（コールド スプリン
グ ハーバー ラボラトリー，３８２〜３８９頁（１９
８２））に記載の方法に従いサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った結果、約５．６Ｋｂの位置にプローブと強
くハイブリダイズするＤＮＡ断片が存在することが明ら
かになった。そこでファージＤＮＡ１００μｇを制限酵
素ＢａｍＨＩとＳａｌＩによって切断し、アガロースゲ
ルから該ＤＮＡ断片を常法に従い回収することにより、
目的とするＤＮＡ断片を分離精製することが出来た。こ
のＤＮＡ断片約１００ｎｇを、予め常法に従い制限酵素
ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩによって切断しておいたｐＵ
Ｃ１８、ｐＵＣ１９プラスミドベクター２００ｎｇと１
０μｌの反応液［６６ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．６、
６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイト
ール、６６μＭＡＴＰ、基質ＤＮＡ］中で３５０ユニッ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、その反応液１μ
ｌを用いて、東洋紡績社製の大腸菌ＤＨ５αのコンピテ
ントセル（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ＨＩＧＨ）のトランス
フォーメーションを行い、直径１５ｃｍのシャーレ中の
アンピシリン含有（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地（１
％酵母抽出物、０．５％バクトトリプトン、０．５％塩
化ナトリウム）に菌液を塗布した。シャーレに出現した
耐性菌のコロニーを各々５ｍｌずつ培養し、Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらの方法（「モレキュラー クローニング」，コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー，３６５
〜３７０頁（１９８２））に従いプラスミドＤＮＡを回
収し、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動で解析することにより目的の５．６ｋ
ｂのＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮＡを持つ組換え体
ｐ４１１ＢＳを得た。

【００４３】純化したポジティブクローンのうちの一つ
からプラスミドＤＮＡを常法（「モレキュラー クロー
ニング」，コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー，８６〜９６頁（１９８２））に従い調製し、必要
なＤＮＡ領域を適宜制限酵素で小断片化した後に、プラ
スミドベクターｐＵＣ１９にサブクローニングを行っ
た。得られたサブクローンからプラスミドＤＮＡを常法
により調製し、デュポン社製蛍光シークエンサーＧＥＮ
ＥＳＩＳ ２，０００システムを用いて、配列を決定し
た。シークエンスプライマーとして次の２種の合成プラ
イマー５’−ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ
Ｔ）３’（配列表の配列番号９）、５’−ｄ（ＣＡＧＧ
ＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）３’（配列表の配列番号
１０）を使用し、該ＤＮＡ断片の＋鎖、一鎖の塩基配列
を決定した（配列表の配列番号１）。この結果、独立し
た１個のクローンλ４１１由来のｐ４１１ＢＳは、５’
上流配列、ｈＣｈＭ−Ｉのアミノ酸配列でＮ末端側の１
番目のアミノ酸目から７２番目のアミノ酸までに相当す
るコーディング領域（エクソン）の一部とイントロン配
列を有していた。

【００４４】実施例４ ｃＤＮＡの作製 配列表の配列番号１１に示すような、ＮｏｔＩ切断部位
およびその５’末にＸｈｏＩ切断部位等を含んだ合成Ｄ
ＮＡで、一方の鎖のＮｏｔＩ切断部位の３’側に４０個
のＴの配列を含むＤＮＡ、即ち、５’−ｄ（ＣＴＣＧＡ
ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴ）３’と、Ｔのクラスターを除き、これに相
補的な配列表の配列番号１２に示すような配列、５’−
ｄ（ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧＡＧ）３’
をそれぞれ１．２μｇ／μｌ、および０．４μｇ／μｌ
になるように混和し，９５℃で５分加温してから３７℃
で１時間保温した。このようにしてアニールさせたもの
をｃＤＮＡを合成する際のプライマーとした。

【００４５】ＲＮＡの調製は以下のように行った。まず
ヒトコンドロザルコーマの組織１０ｇを液体窒素中で粉
砕し，グアニジウムチオシアネート水溶液等中でホモジ
ナイズし、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９（１９７９））
に従って塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により、約１
ｍｇのＴｏｔａｌＲＮＡを得た。このＴｏｔａｌＲＮＡ
を常法（「モレキュラー クローニング」，コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー，１９７〜１９８
頁（１９８２））に従い、ファルマシア社ｏｌｉｇｏ
（ｄＴ）セルロースｔｙｐｅ７を用いてｐｏｌｙＡ⁺ Ｒ
ＮＡに精製した。このようにして得られたｐｏｌｙＡ⁺
ＲＮＡ約１μｇに対し、前述のようにアニールさせたプ
ライマー８０ｐｍｏｌｅを用いて、５０μｌの反応液
［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化
カリウム、８ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１０ｍ
Ｍジチオスレイトールおよび４０μＣｉα−³²Ｐ−ｄＣ
ＴＰ］中で１００ユニットのＡＭＶ逆転写酵素を加え
て、３７℃で反応させた。その結果、第一鎖ｃＤＮＡが
鋳型ＲＮＡとハイブリッドを形成した状態で合成され
た。

【００４６】実施例５ ＰＣＲ法およびそれにより増幅
されたＤＮＡ断片の解析 ＰＣＲはパーキン・エルマー・シータス・ＤＮＡ・サー
マル・サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔ
ｕｓ・ＤＮＡ・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）を使用
して、使用説明書に基づき、ジーンアンプキット（Ｇｅ
ｎｅ ＡｍｐＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒ
ｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ；宝酒造製）を使って行った。す
なわち鋳型ＤＮＡとしては実施例４で記載のｃＤＮＡ合
成の反応液より１μｌを鋳型として用い、これに１０倍
濃度の反応緩衝液［５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2
、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］１０μｌ、１．２５
ｍＭ ４ｄＮＴＰ １６μｌ、２０μＭのプライマー＃
１および２０μＭのプライマー＃２を各５μｌ、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えて１００μｌの系
とした。反応は９４℃、１０分間の前処理後、９４℃１
分間（変性ステップ）、５５℃１．５分間（アニーリン
グステップ）、７２℃２分間（伸長ステップ）のインキ
ュベーションを３５サイクル行った。最後に７２℃で７
分間のインキュベーションを行い反応を終了した。

【００４７】プライマー＃１としては配列表の配列番号
１３の配列のＤＮＡプライマーで、実施例３で得られた
ヒト遺伝子から設計した遺伝子の上流部配列である、す
なわち５’−ｄ（ＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＣＴＣＡ
ＣＴ）３’（１９ヌクレオチド）、またプライマー＃２
としては配列表の配列番号１４に記載のＤＮＡプライマ
ーで、ｃＤＮＡ合成の際のプライマーとして用いた配列
表の配列番号１２の配列の一部に相補的な５’−ｄ（Ｃ
ＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣ）３’（１６ヌクレオ
チド）を用いた。

【００４８】次に得られた反応液を２ｎｄＰＣＲへと進
めた。すなわち基質ＤＮＡは前述のＰＣＲの反応系より
２μｌを抜き取り、鋳型として用いた。プライマー＃３
としては実施例３で得られたヒト遺伝子から設計したｈ
ＣｈＭ−Ｉをコードしている領域の開始の部分に対応す
る配列、すなわち配列表の配列番号１５のＤＮＡプライ
マーで５’−ｄ（ＣＡＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＧ
Ａ）３’（１８ヌクレオチド）、またプライマー＃４と
してはウシＣｈＭ−Ｉ由来の配列で、ＣｈＭ−Ｉタンパ
ク質の終止の部分に対応する配列で、配列表の配列番号
１６のＤＮＡプライマー５’−ｄ（ＡＣＡＣＣＡＴＧＣ
ＣＣＡＧＧＡＴＧＣ）３’（１８ヌクレオチド）を用い
た。その他の緩衝液、ｄＮＴＰ、酵素の各処理は１ｓｔ
ＰＣＲと同様に行い、蒸留水で反応系を１００μｌにし
た。反応は９４℃、１０分間の前処理後、９４℃１分間
（変性ステップ）、５５℃１．５分間（アニーリングス
テップ）、７２℃２分間（伸長ステップ）のインキュベ
ーションを３５サイクル行った。最後に７２℃で７分間
のインキュベーションを行い、反応を終了した。

【００４９】反応混合液１００μｌ中の１０μｌを１％
アガロースゲル電気泳動で解析し、約１ｋｂのバンドを
常法に従って切り出しＤＮＡフラグメントを回収し、フ
ェノール：クロロホルム＝１：１で抽出し、エタノール
沈澱を行った。ＤＮＡ沈澱を２０μｌの滅菌脱イオン水
に溶解し、このＤＮＡ断片の溶液５μｌと市販のｐＣＲ
２ベクター（インビトロジェン社）０．２５μｇを１０
μｌの反応液［６６ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ７．６、
６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイト
ール、６６μＭＡＴＰ、基質ＤＮＡ］中で３５０ユニッ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で１２時間反応さ
せることにより、ｐＣＲ２ベクターのクローニングサイ
トに挿入し結合した。

【００５０】この反応液３μｌを用いて、東洋紡績社製
の大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（ＣＯＭＰＥＴ
ＥＮＴ ＨＩＧＨ）のトランスフォーメーションを行
い、直径１５ｃｍのシャーレ中のアンピシリン含有（５
０μｇ／ｍｌ）Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ寒天培地
（１％酵母抽出物、０．５％バクトトリプトン、０．５
％塩化ナトリウム、０．００４％Ｘ−Ｇａｌ、１ｍＭＩ
ＰＴＧ）に菌液を塗布した。シャーレに出現した耐性菌
でかつＸ−Ｇａｌにより発色していないコロニーを１２
個選び、各々５ｍｌずつ培養し、Ｍａｎｉａｔｉｓらの
方法（「モレキュラー クローニング」，コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー，３６５〜３７０頁
（１９８２））に従いプラスミドＤＮＡを回収し、制限
酵素ＥｃｏＲＩで切断しアガロースゲル電気泳動で解析
した。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断された際認
められる断片の大きさが異なる、３種類のＤＮＡ断片を
含むプラスミドＤＮＡを持つ組換え体ｐｈＣＨＭ−Ｉ３
−６、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−３、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−５、
を得た。

【００５１】純化したポジティブクローンｐｈＣＨＭ−
Ｉ３−６、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−３、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−
５のそれぞれからプラスミドＤＮＡを常法（「モレキュ
ラークローニング」，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，８６〜９６頁（１９８２））に従い調
製し、デュポン社製蛍光シークエンサーＧＥＮＥＳＩＳ
２，０００システムを用いて、配列を決定した。シー
クエンスプライマーとして次の２種の合成プライマー
５’−ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）３’
（配列表の配列番号９）、５’−ｄ（ＣＡＧＧＡＡＡＣ
ＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）３’（配列表の配列番号１０）を
使用し、該ＤＮＡ断片の＋鎖、一鎖の塩基配列を決定し
た。この結果から得られた配列を基に、さらに数カ所の
配列に相補的な合成ＤＮＡを作成して同様に配列を決定
し、配列表の配列番号２から４に示すような塩基配列が
得られた。なお、かかる塩基配列から推定されるアミノ
酸配列も、配列表の配列番号２から４に併せて表記し
た。

【００５２】実施例６ ヒトコンドロモジュリン遺伝子
の３’下流配列のクローニング 実施例５で得られたクローンｐｈＣＨＭ−Ｉ３−６、ｐ
ｈＣＨＭ−Ｉ６−３、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−５の配列は２
ｎｄＰＣＲに用いた３’下流コーディング領域の配列す
なわち、配列表の配列番号１６のＤＮＡプライマー５’
−ｄ（ＡＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＡＴＧＣ）３’
（１８ヌクレオチド）に相当する配列は合成ＤＮＡの配
列であり、牛コンドロモジュリン遺伝子に由来する配列
であった。そこでこの配列表の配列番号１６のＤＮＡプ
ライマーに相当する領域およびこれより下流の領域のヒ
ト塩基配列を取得するため、新たにＰＣＲ法を用いてク
ローニングを行った。

【００５３】ＲＮＡの調製は以下のように行った。まず
ヒト正常肋軟骨組織約２０ｇを液体窒素中で粉砕し、グ
アニジウムチオシアネート水溶液等中でホモジナイズ
し、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，１８，５２９４−５２９９（１９７９））に従っ
て、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法により約２ｍｇの
ＴｏｔａｌＲＮＡを得た。このＴｏｔａｌＲＮＡ２０μ
ｇに対し、実施例４のｃＤＮＡ合成に用いたプライマー
のようにアニールさせたプライマー８０ｐｍｏｌｅを用
いて５０μｌの反応液［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、８ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＴＴＰ），１０ｍＭジチオスレイトールおよび４
０μＣｉα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ］中で１００ユニットのＡ
ＭＶ逆転写酵素を加えて、３７℃で反応させた。その結
果、第一鎖ｃＤＮＡが鋳型ＲＮＡとハイブリッドを形成
した状態で合成され、以後のＰＣＲ反応の鋳型として反
応液の一部を用いた。

【００５４】ＰＣＲはパーキン・エルマー・シータス・
ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍ
ｅｒ・Ｃｅｔｕｓ・ＤＮＡ・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌ
ｅｒ）を使用して、使用説明書に基づき、ジーンアンプ
キット（Ｇｅｎｅ ＡｍｐＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ；宝酒造製）を使っ
て行った。すなわち鋳型ＤＮＡとしては前述のＴｏｔａ
ｌＲＮＡから合成したｃＤＮＡ合成反応液より１μｌを
用い、これに１０培濃度の反応緩衝液［５００ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、
１５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］
１０μｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ１６μｌ、２０μ
Ｍのプライマー＃５および２０μＭのプライマー＃２を
各５μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加え
て１００μｌの系とした。反応は９４℃、１０分間の前
処理後、９４℃１分間（変性ステップ）、５５℃１．５
分間（アニーリングステップ）、７２℃２分間（伸長ス
テップ）のインキュベーションを３５サイクル行った。
最後に７２℃で７分間のインキュベーションを行い、反
応を終了した。

【００５５】プライマー＃５としては、配列表の配列番
号１７に示すＤＮＡプライマーで、実施例５で得られた
ヒト遺伝子から設計した遺伝子のコーディング領域の配
列である、すなわち５’−ｄ（ＣＣＣＴＡＧＡＣＴＧＧ
ＡＴＣＡＣ）３’（１６ヌクレオチド）、またプライマ
ー＃２としては、ｃＤＮＡ合成の際のプライマーとして
用いた配列表の配列番号１２の配列の一部に相補的な配
列表の配列番号１４に記載の５’−ｄ（ＣＧＡＧＧＣＣ
ＡＴＧＧＣＧＧＣＣ）３’（１６ヌクレオチド）を用い
た。

【００５６】ＰＣＲ反応混合液１００μｌ中の１０μｌ
を１％アガロースゲル電気泳動で解析し、約０．６ｋｂ
のバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラグメント
を回収し、フェノール：クロロホルム＝１：１で抽出
し、エタノール沈澱を行った。ＤＮＡ沈澱を２０μｌの
滅菌脱イオン水に溶解し、このＤＮＡ断片の溶液５μｌ
と市販のｐＣＲ２ベクター（インビトロジェン社）０．
２５μｇを１０μｌの反応液［６６ｍＭトリス−塩酸
ｐＨ７．６、６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジ
チオスレイトール、６６μＭＡＴＰ、基質ＤＮＡ］中で
３５０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼにより１６℃で１
２時間反応させることにより、ｐＣＲ２ベクターのクロ
ーニングサイトに挿入し結合した。

【００５７】この反応液３μｌを用いて、東洋紡績社製
の大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（ＣＯＭＰＥＴ
ＥＮＴ ＨＩＧＨ）のトランスフォーメーションを行
い、直径１５ｃｍのシャーレ中のアンピシリン含有（５
０μｇ／ｍｌ）Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ寒天培地
（１％酵母抽出物、０．５％バクトトリプトン、０．５
％塩化ナトリウム、０．００４％Ｘ−Ｇａｌ、１ｍＭＩ
ＰＴＧ）に菌液を塗布した。シャーレに出現した耐性菌
で、かつＸ−Ｇａｌにより発色していないコロニーを１
２個選び、各々５ｍｌずつ培養し、Ｍａｎｉａｔｉｓら
の方法（「モレキュラー クローニング」，コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー，３６５〜３７０
頁（１９８２））に従いプラスミドＤＮＡを回収し、制
限酵素ＥｃｏＲＩで切断してアガロースゲル電気泳動で
解析した。その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断された
際のベクターＤＮＡ断片とは別に、約０．６ｋｂの大き
さのＤＮＡ断片が認められるプラスミドＤＮＡを持つ組
換え体、ｐｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ８、ｐｈＣＨＭ−ＩＬ
ＡＳＴ１２を得た。

【００５８】純化したクローンｐｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ
８、ｐｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ１２のそれぞれからプラス
ミドＤＮＡを常法（「モレキュラー クローニング」，
コールド スプリング ハーバー ラボラトリー，８６
〜９６頁（１９８２））に従い調製し、デュポン社製蛍
光シークエンサーＧＥＮＥＳＩＳ ２，０００システム
を用いて、配列を決定した。シークエンスプライマーと
して次の２種の合成プライマー５’−ｄ（ＧＴＡＡＡＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）３’（配列表の配列番号
９）、５’−ｄ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
Ｃ）３’（配列表の配列番号１０）を使用し、該ＤＮＡ
断片の＋鎖、一鎖の塩基配列を決定した。この結果から
得られた配列を基に、さらに数カ所の配列に相補的な合
成ＤＮＡを作成し、同様に配列を決定した。ｐｈＣＨＭ
−ＩＬＡＳＴ８、ｐｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ１２は共に配
列が一致した。その結果、配列表の配列番号８に示すよ
うな塩基配列を含む３’下流配列が得られた。

【００５９】実施例７ ｈＣｈＭ−Ｉ発現プラスミドの
調製 実施例６で得られたクローンｐｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ
８、ｐｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ１２のｈＣｈＭ−Ｉの塩基
配列と、実施例５で得られたｃＤＮＡクローン、ｐｈＣ
ＨＭ−Ｉ３−６、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−３、ｐｈＣＨＭ−
Ｉ６−５とを比較した。ｐｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ８、ｐ
ｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ１２のどちらのクローンにおいて
も、実施例５の２ｎｄＰＣＲに用いた３’下流コーディ
ング領域の配列、すなわち配列表の配列番号１６のＤＮ
Ａプライマー ５’−ｄ（ＡＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧ
ＧＡＴＧＣ）３’（１８ヌクレオチド）に相当する配列
が、実施例５で得られたコンドロモジュリンの塩基配列
と比較して２塩基の変異が確認された。しかしアミノ酸
配列では変異が無いことが判明した。このことはまた、
実施例５で得られたｐｈＣＨＭ−Ｉ３−６、ｐｈＣＨＭ
−Ｉ６−３、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−５の各クローンを形質
転換体で発現させた場合、それらクローンの塩基配列の
一部がウシコンドロモジュリン遺伝子の塩基配列であっ
たとしても、アミノ酸配列上は完全なｈＣｈＭ−Ｉを発
現し得ることを示している。

【００６０】そこで実施例５で得られたｃＤＮＡクロー
ン、ｐｈＣＨＭ−Ｉ３−６、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−３、ｐ
ｈＣＨＭ−Ｉ６−５よりＭａｎｉａｔｉｓらの方法
（「モレキュラー クローニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ），コールドスプリング ハーバー
ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），８６〜９６頁（１９８
２））に従いプラスミドＤＮＡを取得した。得られたプ
ラスミドＤＮＡｐｈＣＨＭ−Ｉ３−６、ｐｈＣＨＭ−Ｉ
６−３、ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−５それぞれから制限酵素Ｎ
ｏｔＩとＮｓｉＩで切断し、一部ベクター部分の配列を
含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を各々のクローンから得た。
これらのＤＮＡ断片は、ｈＣｈＭ−Ｉをコードする全て
の領域、すなわち蛋白翻訳開始点ＡＴＧから終止コドン
ＴＡＡまでの領域を含む領域をカバーしていた。一方、
市販の発現ベクターｐｃＤＮＡ１ｎｅｏ（インビトロジ
ェン社）を、予め常法に従い制限酵素ＮｏｔＩとＮｓｉ
Ｉで切断しておいた。これと先ほどのＣｈＭ−Ｉ３−
６、ＣｈＭ−Ｉ６−３、ＣｈＭ−Ｉ６−５の各ｃＤＮＡ
断片を、常法に従いＴ４ＤＮＡリガーゼにより１０μｌ
の反応系で結合反応を行った。

【００６１】次にこの発現ベクターとｈＣｈＭ−Ｉ遺伝
子との結合反応の反応液を、それぞれ東洋紡績社製の大
腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ
ＨＩＧＨ）を用いてトランスフォーメーションを行
い、直径１５ｃｍのシャーレ中のアンピシリン含有（５
０μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地（１％酵母抽出物、０．５
％バクトトリプトン、０．５％塩化ナトリウム）に菌液
を塗布した。シャーレに出現した耐性菌のコロニーを各
々５ｍｌずつ培養し、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モ
レキュラー クローニング」，コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー，３６５〜３７０頁（１９８
２））に従いプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素Ｎｏ
ｔＩとＮｓｉＩで切断してアガロースゲル電気泳動で解
析した。その結果、目的の各ｈＣｈＭ−ＩｃＤＮＡ断片
を発現ベクターｐｃＤＮＡ１ｎｅｏの制限酵素ＮｏｔＩ
とＮｓｉＩ切断部位に持つプラスミドＤＮＡ、ｐｃＤＮ
ＡｈＣｈＭ−Ｉ３−６、ｐｃＤＮＡｈＣｈＭ−Ｉ６−３
とｐｃＤＮＡｈＣｈＭ−Ｉ６−５により形質転換された
組換え体を得た。

【００６２】得られた組換え体の大腸菌から、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓらの方法（「モレキュラークローニング」，コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー，８６〜
９６頁（１９８２））に従いプラスミドＤＮＡを回収、
精製し、ｈＣｈＭ−Ｉ発現プラスミドＤＮＡを大量に得
た。 実施例８ ｈＣｈＭ−Ｉの動物細胞での発現 実施例６により得られたｐｃＤＮＡｈＣｈＭ−Ｉ３−
６、ｐｃＤＮＡｈＣｈＭ−Ｉ６−３とｐｃＤＮＡｈＣｈ
Ｍ−Ｉ６−５を、市販のリポフェクチン試薬（ＬＩＰＯ
ＦＥＣＴＩＮ^TM Ｒｅａｇｅｎｔ ギブコ（ＧＩＢＣ
Ｏ）社製）を用いて説明書に従いＣＯＳ細胞にトランス
フェクションして、ＣＯＳ細胞を形質転換した。

【００６３】すなわち、まず直径９ｃｍのシャーレ中の
ＤＭＥＭ培地でＣＯＳ細胞を培養した。次にシャーレか
ら培地を除き、ＰＢＳ（−）［０．８％塩化ナトリウ
ム、０．０２％塩化カリウム、０．１４４％燐酸水素二
ナトリウム、０．０２４％燐酸二水素カリウム、ｐＨ
７．４］で二回洗った。ＰＢＳ（−）を除き、Ｓｅｒｕ
ｍ−ｆｒｅｅＤＭＥＭ培地を８ｍｌ加えた。一方、細胞
にトランスフェクションするＤＮＡ溶液は、次のように
予め調製をしておいた。まず、２０μｇのｐｃＤＮＡｈ
ＣｈＭ−Ｉ３−６、ｐｃＤＮＡｈＣｈＭ−Ｉ６−３また
はｐｃＤＮＡｈＣｈＭ−Ｉ６−５の各ＤＮＡを、アマシ
ャム社製Ｎｏ．５５，４２６，０１３チューブ中で１０
０μｌのＳｅｒｕｍ−ｆｒｅｅＤＭＥＭ培地に溶解して
おく。次に、ギブコ社製リポフェクチン試薬５０μｌと
Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅＤＭＥＭ培地５０μｌを混和した
溶液をＤＮＡ溶液に加え、１５分間室温で静置してお
く。このようにして調製したリポフェクチン−ＤＮＡ懸
濁液２００μｌを前述のＰＢＳ（−）で洗浄した細胞に
加え、３７℃で５％ＣＯ2 存在下で一晩培養した。その
後、リポフェクチンを含んだ培地を除き、１０％ＦＣＳ
の入ったＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）を１０ｍｌシャ
ーレに入れて、３７℃、５％ＣＯ₂ 存在下で約５６時間
培養を続けた。その後細胞の培地を集め、ｈＣｈＭ−Ｉ
の生理活性を鈴木らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４６，３１３−３２０（１９８
７））により測定し活性の存在を確認すると共に、常法
に従いウエスタンブロット法を行いｈＣｈＭ−Ｉの発現
を確認した。

【００６４】実施例９ ｈＣｈＭ−Ｉの活性の評価 評価のための細胞の取得、培養および評価方法は、鈴木
らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，１４６，３１３−３２０（１９８７））に従って行
った。すなわち４００〜６００ｇの若いニュージーラン
ドウサギより成長肋軟骨を分離し、分離した細胞をＨａ
ｍ’ｓ Ｆ−１２培地とダルベッコ修飾培地の１：１混
合培養液（以下［ＦＡＤ培養液」と称す）に、１０％牛
胎児血清を加えた物に対し、１０⁵ 細胞／ｍｌとなるよ
う懸濁した。この細胞懸濁物０．１ｍｌを、タイプＩコ
ラーゲン溶液（５０μｇ／ｍｌ）で一夜コートし、ＦＡ
Ｄ培養液で一度洗浄した９６穴培養プレートに蒔き、５
％ＣＯ₂ を含む空気存在下で３７℃で培養した。培地は
１日おきに交換した。

【００６５】ＤＮＡ合成のアッセイは以下のごとく行っ
た。すなわち上記細胞が９６穴培養プレート中でコンフ
ルエントに達した後、細胞を０．３％牛胎児血清を含む
ＦＡＤ培養液で２４時間培養した。次に培養液に約０．
０６〜約２０ｎｇのｈＣｈＭ−Ｉを含む形質転換体の培
養液、０．０４ｎｇＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、
０．３％牛胎児血清を含むＦＡＤ培養液０．１ｍｌを加
え、２２時間培養した。さらに１０μｌの〔 ³Ｈ〕チミ
ジン（１３０μＣｉ／ｍｌ）を加え、４時間培養した
後、細胞を氷冷した燐酸緩衝食塩水（２０ｍＭ燐酸緩衝
液 ｐＨ７．０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）で３回洗
った。これを５％トリクロロ酢酸で抽出し、さらにエタ
ノール：エーテル＝３：１（体積比）で抽出した。抽出
後の沈澱を０．３Ｍ水酸化ナトリウムに溶解し、これを
１／２０容の６Ｍ塩酸で中和した物をシンチレーション
カウンターで放射活性を測定した。その結果、ＦＧＦの
み添加した場合に比べ、ｈＣｈＭ−Ｉを同時に加えた時
の方が多量の放射性チミジンの取り込みが見られ、ｈＣ
ｈＭ−Ｉが強力な軟骨細胞の増殖促進効果を有すること
が示された。

【００６６】ｈＣｈＭ−Ｉの血管内皮細胞に対する効果
はウシ大動脈内皮細胞を用いて以下のように行った。ウ
シ大動脈内皮細胞２×１０³ ／ウェルになるように９６
穴培養プレートに０．１ｍｌの２０％ウシ新生児血清を
含むαＭＥＭ培地と共に播種した。ＣＯ₂ インキュベー
ター中で３７℃で４８時間培養した後、培地を新しい物
に換えると同時に終濃度が０から３μｇ／ｍｌになるよ
うにｈＣｈＭ−Ｉを含む形質転換体の培養液を加えた。
さらに３７℃で１２時間培養した後、〔 ³Ｈ〕チミジン
を１μＣｉ／ウェルになるように加え、３７℃で４時
間、放射能の取り込みを行わせた。その後セルハーベス
ターで細胞を回収し、ＬＫＢβプレートを用いて放射能
を測定した。その結果、ｈＣｈＭ−Ｉを加えた場合放射
性チミジンの取り込みが抑制され、ｈＣｈＭ−Ｉが血管
内皮細胞の増殖を抑制する活性を有することが示され
た。

【００６７】

【発明の効果】本発明のｈＣｈＭ−Ｉは、ヒト由来の新
規なタンパク質であり、それをコードする遺伝子を用い
ることにより、組み換えｈＣｈＭ−Ｉを安定に供給する
ことができる。またｈＣｈＭ−Ｉは、軟骨細胞を増殖さ
せる活性、軟骨細胞の分化機能を促進する活性さらに内
皮細胞の増殖を抑制する活性等を有することから、医薬
品としての利用が期待される。かかるｈＣｈＭ−Ｉは、
既知の牛由来のものとはそのアミノ酸配列、遺伝子配列
等において区別されるものであり、実際の臨床の場でヒ
トに適用する際は、より抗原性が低く、より効果的であ
ると考えられる。

【００６８】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１０００ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｃｅ） 直接の起源 クローン名：λ４１１ サブクローン名：ｐ４１１ＢＳ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１６１．．．２３２ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：６９１．．．８３４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AGGTGAGGCG CTAGAAGGGG TGGGGACCGC TGGGCTGGCC CAGGCGGGAC CGTGCACCGT 60 GTGTGCGCGC GGCGTTGAAA TGCCCTGCAC GTCGGGGCAG CGGGACAGAT CCCAGGGTGC 120 CCAGGGAGTC TCCAAGTGCC TCACTCCTCC CGCCGCAAAC ATG ACA GAG AAC TCC 175 Met Thr Glu Asn Ser 1 5 GAC AAA GTT CCC ATT GCC CTG GTG GGA CCT GAT GAC GTG GAA TTC TGC 223 Asp Lys Val Pro Ile Ala Leu Val Gly Pro Asp Asp Val Glu Phe Cys 10 15 20 AGC CCC CCG GTGAGTAC CGCCAGGGAT TCCACACGCA GGGCCTGGGT TGTGTGAGTA 280 Ser Pro Pro TCAGGTTCCA CAGTTCGGAC TCAGGGGTGC GTGCCACCGA ATGGGTGTGT TGGCGGGGGA 340 ATAAATTTGG GTCCCAAATG TGTGGGTGGG ATGTCGCCCC ACGCGTATGA GTGTGCAGGG 400 GTCACGGCAT CCACAGGCGG GTGCGGAGGG ACGTCCCGTG GCCGGTAGAG GGTGCAGGTC 460 CTGGGGCGAA GGCCCTGTGC TGCGGGGTTT GCTCATCCCA CTTCCACGCC CGACTGCAAA 520 GGACCCTCGG GAGGGAGCGC GGCGAAAGGG GCACCCGTAG GAGCCCGGGC GAGCTGTTTC 580 CCGCCCGACT CCCCACTCCC TGGGGGCTAC CGCGTGGGGC CCGGGTGCGC TGGGGGCCGC 640 AGGTGCTGGC GGCACAAACG CGACGGTCCC TCTCCCGCCC CGGCCCGCAG GCG TAC 696 Ala Tyr 25 GCT ACG CTG ACG GTG AAG CCC TCC AGC CCC GCG CGG CTG CTC AAG GTG 744 Ala Thr Leu Thr Val Lys Pro Ser Ser Pro Ala Arg Leu Leu Lys Val 30 35 40 GGA GCC GTG GTC CTC ATT TCG GGA GCT GTG CTG CTG CTC TTT GGG GCC 792 Gly Ala Val Val Leu Ile Ser Gly Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala 45 50 55 ATC GGG GCC TTC TAC TTC TGG AAG GGG AGC GAC AGT CAC ATT AGTCCA 840 Ile Gly Ala Phe Tyr Phe Trp Lys Gly Ser Asp Ser His Ile 60 65 70 GAGGGCGGCG CGCGGGGACC CCCGTGTCGC CCATGGTGCC CCTAGGGGGG GCCCGAGCGC 900 GGGCCGGCGA GGGGCGCGCG GCTGCCCGGC GGCCCCTCGG GCCCAGCGTG AGCTCCCCTC 960 TCCCATCCCA CTCTGGCACG CGGCTTTCCG CCTTAGGTCA 1000

【００６９】配列番号：２ 配列の長さ：１００６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｃｅ） 直接の起源 クローン名：ｐｈＣＨＭ−Ｉ３−６ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ 存在位置：２．．１００３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 C ATG ACA GAG AAC TCC GAC AAA GTT CCC ATT GCC CTG GTG GGA CCT GAT 49 Met Thr Glu Asn Ser Asp Lys Val Pro Ile Ala Leu Val Gly Pro Asp 1 5 10 15 GAC GTG GAA TTC TGC AGC CCC CCG GCG TAC GCT ACG CTG ACG GTG AAG 97 Asp Val Glu Phe Cys Ser Pro Pro Ala Tyr Ala Thr Leu Thr Val Lys 20 25 30 CCC TCC AGC CCC GCG CGG CTG CTC AAG GTG GGA GCC GTG GTC CTC ATT 145 Pro Ser Ser Pro Ala Arg Leu Leu Lys Val Gly Ala Val Val Leu Ile 35 40 45 TCG GGA GCT GTG CTG CTG CTC TTT GGG GCC ATC GGG GCC TTC TAC TTC 193 Ser Gly Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ile Gly Ala Phe Tyr Phe 50 55 60 TGG AAG GGG AGC GAC AGT CAC ATT TAC AAT GTC CAT TAC ACC ATG AGT 241 Trp Lys Gly Ser Asp Ser His Ile Tyr Asn Val His Tyr Thr Met Ser 65 70 75 80 ATC AAT GGG AAA CTA CAA GAT GGG TCA ATG GAA ATA GAC GCT GGG AAC 289 Ile Asn Gly Lys Leu Gln Asp Gly Ser Met Glu Ile Asp Ala Gly Asn 85 90 95 AAC TTG GAG ACC TTT AAA ATG GGA AGT GGA GCT GAA GAA GCA ATT GCA 337 Asn Leu Glu Thr Phe Lys Met Gly Ser Gly Ala Glu Glu Ala Ile Ala 100 105 110 GTT AAT GAT TTC CAG AAT GGC ATC ACA GGA ATT CGT TTT GCT GGA GGA 385 Val Asn Asp Phe Gln Asn Gly Ile Thr Gly Ile Arg Phe Ala Gly Gly 115 120 125 GAG AAG TGC TAC ATT AAA GCG CAA GTG AAG GCT CGT ATT CCT GAG GTG 433 Glu Lys Cys Tyr Ile Lys Ala Gln Val Lys Ala Arg Ile Pro Glu Val 130 135 140 GGC GCC GTG ACC AAA CAG AGC ATC TCC TCC AAA CTG GAA GGC AAG ATC 481 Gly Ala Val Thr Lys Gln Ser Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gly Lys Ile 145 150 155 160 ATG CCA GTC AAA TAT GAA GAA AAT TCT CTT ATC TGG GTG GCT GTA GAT 529 Met Pro Val Lys Tyr Glu Glu Asn Ser Leu Ile Trp Val Ala Val Asp 165 170 175 CAG CCT GTG AAG GAC AAC AGC TTC TTG AGT TCT AAG GTG TTA GAA CTC 577 Gln Pro Val Lys Asp Asn Ser Phe Leu Ser Ser Lys Val Leu Glu Leu 180 185 190 TGC GGT GAC CTT CCT ATT TTC TGG CTT AAA CCA ACC TAT CCA AAA GAA 625 Cys Gly Asp Leu Pro Ile Phe Trp Leu Lys Pro Thr Tyr Pro Lys Glu 195 200 205 ATC CAG AGG GAA AGA AGA GAA GTG GTA AGA AAA ATT GTT CCA ACT ACC 673 Ile Gln Arg Glu Arg Arg Glu Val Val Arg Lys Ile Val Pro Thr Thr 210 215 220 ACA AAA AGA CCA CAC AGT GGA CCA CGG AGC AAC CCA GGC GCT GGA AGA 721 Thr Lys Arg Pro His Ser Gly Pro Arg Ser Asn Pro Gly Ala Gly Arg 225 230 235 240 CTG AAT AAT GAA ACC AGA CCC AGT GTT CAA GAG GAC TCA CAA GCC TTC 769 Leu Asn Asn Glu Thr Arg Pro Ser Val Gln Glu Asp Ser Gln Ala Phe 245 250 255 AAT CCT GAT AAT CCT TAT CAT CAG CAG GAA GGG GAA AGC ATG ACA TTC 817 Asn Pro Asp Asn Pro Tyr His Gln Gln Glu Gly Glu Ser Met Thr Phe 260 265 270 GAC CCT AGA CTG GAT CAC GAA GGA ATC TGT TGT ATA GAA TGT AGG CGG 865 Asp Pro Arg Leu Asp His Glu Gly Ile Cys Cys Ile Glu Cys Arg Arg 275 280 285 AGC TAC ACC CAC TGC CAG AAG ATC TGT GAA CCC CTG GGG GGC TAT TAC 913 Ser Tyr Thr His Cys Gln Lys Ile Cys Glu Pro Leu Gly Gly Tyr Tyr 290 295 300 CCA TGG CCT TAT AAT TAT CAA GGC TGC CGT TCG GCC TGC AGA GTC ATC 961 Pro Trp Pro Tyr Asn Tyr Gln Gly Cys Arg Ser Ala Cys Arg Val Ile 305 310 315 320 ATG CCA TGT AGC TGG TGG GTG GCC CGC ATC CTG GGC ATG GTG TAA 1006 Met Pro Cys Ser Trp Trp Val Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Stop 325 330 335

【００７０】配列番号：３ 配列の長さ：１００６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｃｅ） 直接の起源 クローン名：ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−３ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ 存在位置：２．．１００３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 C ATG ACA GAG AAC TCC GAC AAA GTT CCC ATT GCC CTG GTG GGA CCT GAT 49 Met Thr Glu Asn Ser Asp Lys Val Pro Ile Ala Leu Val Gly Pro Asp 1 5 10 15 GAC GTG GAA TTC TGC AGC CCC CCG GCG TAC GCT ACG CTG ACG GTG AAG 97 Asp Val Glu Phe Cys Ser Pro Pro Ala Tyr Ala Thr Leu Thr Val Lys 20 25 30 CCC TCC AGC CCC GCG CGG CTG CTC AAG GTG GGA GCC GTG GTC CTC ATT 145 Pro Ser Ser Pro Ala Arg Leu Leu Lys Val Gly Ala Val Val Leu Ile 35 40 45 TCG GGA GCT GTG CTG CTG CTC TTT GGG GCC ATC GGG GCC TTC TAC TTC 193 Ser Gly Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ile Gly Ala Phe Tyr Phe 50 55 60 TGG AAG GGG AGC GAC AGT CAC ATT TAC AAT GTC CAT TAC ACC ATG AGT 241 Trp Lys Gly Ser Asp Ser His Ile Tyr Asn Val His Tyr Thr Met Ser 65 70 75 80 ATC AAT GGG AAA CTA CAA GAT GGG TCA ATG GAA ATA GAC GCT GGG AAC 289 Ile Asn Gly Lys Leu Gln Asp Gly Ser Met Glu Ile Asp Ala Gly Asn 85 90 95 AAC TTG GAG ACC TTT AAA ATG GGA AGT GGA GCT GAA GAA GCA ATT GCA 337 Asn Leu Glu Thr Phe Lys Met Gly Ser Gly Ala Glu Glu Ala Ile Ala 100 105 110 GTT AAT GAT TTC CAG AAT GGC ATC ACA GGA ATT CGT TTT GCT GGA GGA 385 Val Asn Asp Phe Gln Asn Gly Ile Thr Gly Ile Arg Phe Ala Gly Gly 115 120 125 GAG AAG TGC TAC ATT AAA GCG CAA GTG AAG GCT CGT ATT CCT GAG GTG 433 Glu Lys Cys Tyr Ile Lys Ala Gln Val Lys Ala Arg Ile Pro Glu Val 130 135 140 GGC GCC GTG ACC AAA CAG AGC ATC TCC TCC AAA CTG GAA GGC AAG ATC 481 Gly Ala Val Thr Lys Gln Ser Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gly Lys Ile 145 150 155 160 ATG CCA GTC AAA TAT GAA GAA AAT TCT CTT ATC TGG GTG GCT GTA GAT 529 Met Pro Val Lys Tyr Glu Glu Asn Ser Leu Ile Trp Val Ala Val Asp 165 170 175 CAG CCT GTG AAG GAC AAC AGC TTC TTG AAT TCT AAG GTG TTA GAA CTC 577 Gln Pro Val Lys Asp Asn Ser Phe Leu Asn Ser Lys Val Leu Glu Leu 180 185 190 TGC GGT GAC CTT CCT ATT TTC TGG CTT AAA CCA ACC TAT CCA AAA GAA 625 Cys Gly Asp Leu Pro Ile Phe Trp Leu Lys Pro Thr Tyr Pro Lys Glu 195 200 205 ATC CAG AGG GAA AGA AGA GAA GTG GTA AGA AAA ATT GTT CCA ACT ACC 673 Ile Gln Arg Glu Arg Arg Glu Val Val Arg Lys Ile Val Pro Thr Thr 210 215 220 ACA AAA AGA CCA CAC AGT GGA CCA CGG AGC AAC CCA GGC GCT GGA AGA 721 Thr Lys Arg Pro His Ser Gly Pro Arg Ser Asn Pro Gly Ala Gly Arg 225 230 235 240 CTG AAT AAT GAA ACC AGA CCC AGT GTT CAA GAG GAC TCA CAA GCC TTC 769 Leu Asn Asn Glu Thr Arg Pro Ser Val Gln Glu Asp Ser Gln Ala Phe 245 250 255 AAT CCT GAT AAT CCT TAT CAT CAG CAG GAA GGG GAA AGC ATG ACA TTC 817 Asn Pro Asp Asn Pro Tyr His Gln Gln Glu Gly Glu Ser Met Thr Phe 260 265 270 GAC CCT AGA CTG GAT CAC GAA GGA ATC TGT TGT ATA GAA TGT AGG CGG 865 Asp Pro Arg Leu Asp His Glu Gly Ile Cys Cys Ile Glu Cys Arg Arg 275 280 285 AGC TAC ACC CAC TGC CAG AAG ATC TGT GAA CCC CTG GGG GGC TAT TAC 913 Ser Tyr Thr His Cys Gln Lys Ile Cys Glu Pro Leu Gly Gly Tyr Tyr 290 295 300 CCA TGG CCT TAT AAT TAT CAA GGC TGC CGT TCG GCC TGC AGA GTC ATC 961 Pro Trp Pro Tyr Asn Tyr Gln Gly Cys Arg Ser Ala Cys Arg Val Ile 305 310 315 320 ATG CCA TGT AGC TGG TGG GTG GCC CGC ATC CTG GGC ATG GTG TAA 1006 Met Pro Cys Ser Trp Trp Val Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Stop 325 330 335

【００７１】配列番号：４ 配列の長さ：８９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｃｅ） 直接の起源 クローン名：ｐｈＣＨＭ−Ｉ６−５ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ 存在位置：２．．８８９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 C ATG ACA GAG AAC TCC GAC AAA GTT CCC ATT GCC CTG GTG GGA CCT GAT 49 Met Thr Glu Asn Ser Asp Lys Val Pro Ile Ala Leu Val Gly Pro Asp 1 5 10 15 GAC GTG GAA TTC TGC AGC CCC CCG GCG TAC GCT ACG CTG ACG GTG AAG 97 Asp Val Glu Phe Cys Ser Pro Pro Ala Tyr Ala Thr Leu Thr Val Lys 20 25 30 CCC TCC AGC CCC GCG CGG CTG CTC AAG GTG GGA GCC GTG GTC CTC ATT 145 Pro Ser Ser Pro Ala Arg Leu Leu Lys Val Gly Ala Val Val Leu Ile 35 40 45 TCG GGA GCT GTG CTG CTG CTC TTT GGG GCC ATC GGG GCC TTC TAC TTC 193 Ser Gly Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ile Gly Ala Phe Tyr Phe 50 55 60 TGG AAG GGG AGC GAC AGT CAC ATT TAC AAT GTC CAT TAC ACC ATG AGT 241 Trp Lys Gly Ser Asp Ser His Ile Tyr Asn Val His Tyr Thr Met Ser 65 70 75 80 ATC AAT GGG AAA TTA CAA GAT GGG TCA ATG GAA ATA GAC GCT GGG AAC 289 Ile Asn Gly Lys Leu Gln Asp Gly Ser Met Glu Ile Asp Ala Gly Asn 85 90 95 AAC TTG GAG ACC TTT AAA ATG GGA AGT GGA GCT GAA GAA GCA ATT GCA 337 Asn Leu Glu Thr Phe Lys Met Gly Ser Gly Ala Glu Glu Ala Ile Ala 100 105 110 GTT AAT GAT TTC CAG AAT GAA GGC AAG ATC ATG CCA GTC AAA TAT GAA 385 Val Asn Asp Phe Gln Asn Glu Gly Lys Ile Met Pro Val Lys Tyr Glu 115 120 125 GAA AAT TCT CTT ATC TGG GTG GCT GTA GAT CAG CCT GTG AAG GAC AAC 433 Glu Asn Ser Leu Ile Trp Val Ala Val Asp Gln Pro Val Lys Asp Asn 130 135 140 AGC TTC TTG AGT TCT AAG GTG TTA GAA CTC TGC GGT GAC CTT CCT ATT 481 Ser Phe Leu Ser Ser Lys Val Leu Glu Leu Cys Gly Asp Leu Pro Ile 145 150 155 160 TCC TGG CTT AAA CCA ACC TAT CCA AAA GAA ATC CAG AGG GAA AGA AGA 529 Ser Trp Leu Lys Pro Thr Tyr Pro Lys Glu Ile Gln Arg Glu Arg Arg 165 170 175 GAA GTG GTA AGA AAA ATT GTT CCA ACT ACC ACA AAA AGA CCA CAC AAT 577 Glu Val Val Arg Lys Ile Val Pro Thr Thr Thr Lys Arg Pro His Asn 180 185 190 GGA CCA CGG AGC AAC CCA GGC GCT GGA AGA CTG AAT AAT GAA ACC AGA 625 Gly Pro Arg Ser Asn Pro Gly Ala Gly Arg Leu Asn Asn Glu Thr Arg 195 200 205 CCC AGT GTT CAA GAG GAC TCA CAA GCC TTC AAT CCT GAT AAT CCT TAT 673 Pro Ser Val Gln Glu Asp Ser Gln Ala Phe Asn Pro Asp Asn Pro Tyr 210 215 220 CAT CAG CAG GAA GGG GAA AGC ATG ACA TTC GAC CCT AGA CTG GAT CAC 721 His Gln Gln Glu Gly Glu Ser Met Thr Phe Asp Pro Arg Leu Asp His 225 230 235 240 GAA GGA ATC TGT TGT ATA GAA TGT AGG CGG AGC TAC ACC CAC TGC CAG 769 Glu Gly Ile Cys Cys Ile Glu Cys Arg Arg Ser Tyr Thr His Cys Gln 245 250 255 AAG ATC TGT GAA CCC CTG GGG GGC TAT TAC CCA TGG CCT TAT AAT TAT 817 Lys Ile Cys Glu Pro Leu Gly Gly Tyr Tyr Pro Trp Pro Tyr Asn Tyr 260 265 270 CAA GGC TGC CGT TCG GCC TGC AGA GTC ATC ATG CCA TGT AGC TGG TGG 865 Gln Gly Cys Arg Ser Ala Cys Arg Val Ile Met Pro Cys Ser Trp Trp 275 280 285 GTG GCC CGC ATC CTG GGC ATG GTG TAA 892 Val Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Stop 290 295

【００７２】配列番号：５ 配列の長さ：１００６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｃｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ 存在位置：２．．１００３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 C ATG ACA GAG AAC TCC GAC AAA GTT CCC ATT GCC CTG GTG GGA CCT GAT 49 Met Thr Glu Asn Ser Asp Lys Val Pro Ile Ala Leu Val Gly Pro Asp 1 5 10 15 GAC GTG GAA TTC TGC AGC CCC CCG GCG TAC GCT ACG CTG ACG GTG AAG 97 Asp Val Glu Phe Cys Ser Pro Pro Ala Tyr Ala Thr Leu Thr Val Lys 20 25 30 CCC TCC AGC CCC GCG CGG CTG CTC AAG GTG GGA GCC GTG GTC CTC ATT 145 Pro Ser Ser Pro Ala Arg Leu Leu Lys Val Gly Ala Val Val Leu Ile 35 40 45 TCG GGA GCT GTG CTG CTG CTC TTT GGG GCC ATC GGG GCC TTC TAC TTC 193 Ser Gly Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ile Gly Ala Phe Tyr Phe 50 55 60 TGG AAG GGG AGC GAC AGT CAC ATT TAC AAT GTC CAT TAC ACC ATG AGT 241 Trp Lys Gly Ser Asp Ser His Ile Tyr Asn Val His Tyr Thr Met Ser 65 70 75 80 ATC AAT GGG AAA CTA CAA GAT GGG TCA ATG GAA ATA GAC GCT GGG AAC 289 Ile Asn Gly Lys Leu Gln Asp Gly Ser Met Glu Ile Asp Ala Gly Asn 85 90 95 AAC TTG GAG ACC TTT AAA ATG GGA AGT GGA GCT GAA GAA GCA ATT GCA 337 Asn Leu Glu Thr Phe Lys Met Gly Ser Gly Ala Glu Glu Ala Ile Ala 100 105 110 GTT AAT GAT TTC CAG AAT GGC ATC ACA GGA ATT CGT TTT GCT GGA GGA 385 Val Asn Asp Phe Gln Asn Gly Ile Thr Gly Ile Arg Phe Ala Gly Gly 115 120 125 GAG AAG TGC TAC ATT AAA GCG CAA GTG AAG GCT CGT ATT CCT GAG GTG 433 Glu Lys Cys Tyr Ile Lys Ala Gln Val Lys Ala Arg Ile Pro Glu Val 130 135 140 GGC GCC GTG ACC AAA CAG AGC ATC TCC TCC AAA CTG GAA GGC AAG ATC 481 Gly Ala Val Thr Lys Gln Ser Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gly Lys Ile 145 150 155 160 ATG CCA GTC AAA TAT GAA GAA AAT TCT CTT ATC TGG GTG GCT GTA GAT 529 Met Pro Val Lys Tyr Glu Glu Asn Ser Leu Ile Trp Val Ala Val Asp 165 170 175 CAG CCT GTG AAG GAC AAC AGC TTC TTG AGT TCT AAG GTG TTA GAA CTC 577 Gln Pro Val Lys Asp Asn Ser Phe Leu Ser Ser Lys Val Leu Glu Leu 180 185 190 TGC GGT GAC CTT CCT ATT TTC TGG CTT AAA CCA ACC TAT CCA AAA GAA 625 Cys Gly Asp Leu Pro Ile Phe Trp Leu Lys Pro Thr Tyr Pro Lys Glu 195 200 205 ATC CAG AGG GAA AGA AGA GAA GTG GTA AGA AAA ATT GTT CCA ACT ACC 673 Ile Gln Arg Glu Arg Arg Glu Val Val Arg Lys Ile Val Pro Thr Thr 210 215 220 ACA AAA AGA CCA CAC AGT GGA CCA CGG AGC AAC CCA GGC GCT GGA AGA 721 Thr Lys Arg Pro His Ser Gly Pro Arg Ser Asn Pro Gly Ala Gly Arg 225 230 235 240 CTG AAT AAT GAA ACC AGA CCC AGT GTT CAA GAG GAC TCA CAA GCC TTC 769 Leu Asn Asn Glu Thr Arg Pro Ser Val Gln Glu Asp Ser Gln Ala Phe 245 250 255 AAT CCT GAT AAT CCT TAT CAT CAG CAG GAA GGG GAA AGC ATG ACA TTC 817 Asn Pro Asp Asn Pro Tyr His Gln Gln Glu Gly Glu Ser Met Thr Phe 260 265 270 GAC CCT AGA CTG GAT CAC GAA GGA ATC TGT TGT ATA GAA TGT AGG CGG 865 Asp Pro Arg Leu Asp His Glu Gly Ile Cys Cys Ile Glu Cys Arg Arg 275 280 285 AGC TAC ACC CAC TGC CAG AAG ATC TGT GAA CCC CTG GGG GGC TAT TAC 913 Ser Tyr Thr His Cys Gln Lys Ile Cys Glu Pro Leu Gly Gly Tyr Tyr 290 295 300 CCA TGG CCT TAT AAT TAT CAA GGC TGC CGT TCG GCC TGC AGA GTC ATC 961 Pro Trp Pro Tyr Asn Tyr Gln Gly Cys Arg Ser Ala Cys Arg Val Ile 305 310 315 320 ATG CCA TGT AGC TGG TGG GTG GCC CGT ATC TTG GGC ATG GTG TGA 1006 Met Pro Cys Ser Trp Trp Val Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Stop 325 330 335

【００７３】配列番号：６ 配列の長さ：１００６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｃｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ 存在位置：２．．１００３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 C ATG ACA GAG AAC TCC GAC AAA GTT CCC ATT GCC CTG GTG GGA CCT GAT 49 Met Thr Glu Asn Ser Asp Lys Val Pro Ile Ala Leu Val Gly Pro Asp 1 5 10 15 GAC GTG GAA TTC TGC AGC CCC CCG GCG TAC GCT ACG CTG ACG GTG AAG 97 Asp Val Glu Phe Cys Ser Pro Pro Ala Tyr Ala Thr Leu Thr Val Lys 20 25 30 CCC TCC AGC CCC GCG CGG CTG CTC AAG GTG GGA GCC GTG GTC CTC ATT 145 Pro Ser Ser Pro Ala Arg Leu Leu Lys Val Gly Ala Val Val Leu Ile 35 40 45 TCG GGA GCT GTG CTG CTG CTC TTT GGG GCC ATC GGG GCC TTC TAC TTC 193 Ser Gly Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ile Gly Ala Phe Tyr Phe 50 55 60 TGG AAG GGG AGC GAC AGT CAC ATT TAC AAT GTC CAT TAC ACC ATG AGT 241 Trp Lys Gly Ser Asp Ser His Ile Tyr Asn Val His Tyr Thr Met Ser 65 70 75 80 ATC AAT GGG AAA CTA CAA GAT GGG TCA ATG GAA ATA GAC GCT GGG AAC 289 Ile Asn Gly Lys Leu Gln Asp Gly Ser Met Glu Ile Asp Ala Gly Asn 85 90 95 AAC TTG GAG ACC TTT AAA ATG GGA AGT GGA GCT GAA GAA GCA ATT GCA 337 Asn Leu Glu Thr Phe Lys Met Gly Ser Gly Ala Glu Glu Ala Ile Ala 100 105 110 GTT AAT GAT TTC CAG AAT GGC ATC ACA GGA ATT CGT TTT GCT GGA GGA 385 Val Asn Asp Phe Gln Asn Gly Ile Thr Gly Ile Arg Phe Ala Gly Gly 115 120 125 GAG AAG TGC TAC ATT AAA GCG CAA GTG AAG GCT CGT ATT CCT GAG GTG 433 Glu Lys Cys Tyr Ile Lys Ala Gln Val Lys Ala Arg Ile Pro Glu Val 130 135 140 GGC GCC GTG ACC AAA CAG AGC ATC TCC TCC AAA CTG GAA GGC AAG ATC 481 Gly Ala Val Thr Lys Gln Ser Ile Ser Ser Lys Leu Glu Gly Lys Ile 145 150 155 160 ATG CCA GTC AAA TAT GAA GAA AAT TCT CTT ATC TGG GTG GCT GTA GAT 529 Met Pro Val Lys Tyr Glu Glu Asn Ser Leu Ile Trp Val Ala Val Asp 165 170 175 CAG CCT GTG AAG GAC AAC AGC TTC TTG AAT TCT AAG GTG TTA GAA CTC 577 Gln Pro Val Lys Asp Asn Ser Phe Leu Asn Ser Lys Val Leu Glu Leu 180 185 190 TGC GGT GAC CTT CCT ATT TTC TGG CTT AAA CCA ACC TAT CCA AAA GAA 625 Cys Gly Asp Leu Pro Ile Phe Trp Leu Lys Pro Thr Tyr Pro Lys Glu 195 200 205 ATC CAG AGG GAA AGA AGA GAA GTG GTA AGA AAA ATT GTT CCA ACT ACC 673 Ile Gln Arg Glu Arg Arg Glu Val Val Arg Lys Ile Val Pro Thr Thr 210 215 220 ACA AAA AGA CCA CAC AGT GGA CCA CGG AGC AAC CCA GGC GCT GGA AGA 721 Thr Lys Arg Pro His Ser Gly Pro Arg Ser Asn Pro Gly Ala Gly Arg 225 230 235 240 CTG AAT AAT GAA ACC AGA CCC AGT GTT CAA GAG GAC TCA CAA GCC TTC 769 Leu Asn Asn Glu Thr Arg Pro Ser Val Gln Glu Asp Ser Gln Ala Phe 245 250 255 AAT CCT GAT AAT CCT TAT CAT CAG CAG GAA GGG GAA AGC ATG ACA TTC 817 Asn Pro Asp Asn Pro Tyr His Gln Gln Glu Gly Glu Ser Met Thr Phe 260 265 270 GAC CCT AGA CTG GAT CAC GAA GGA ATC TGT TGT ATA GAA TGT AGG CGG 865 Asp Pro Arg Leu Asp His Glu Gly Ile Cys Cys Ile Glu Cys Arg Arg 275 280 285 AGC TAC ACC CAC TGC CAG AAG ATC TGT GAA CCC CTG GGG GGC TAT TAC 913 Ser Tyr Thr His Cys Gln Lys Ile Cys Glu Pro Leu Gly Gly Tyr Tyr 290 295 300 CCA TGG CCT TAT AAT TAT CAA GGC TGC CGT TCG GCC TGC AGA GTC ATC 961 Pro Trp Pro Tyr Asn Tyr Gln Gly Cys Arg Ser Ala Cys Arg Val Ile 305 310 315 320 ATG CCA TGT AGC TGG TGG GTG GCC CGT ATC TTG GGC ATG GTG TGA 1006 Met Pro Cys Ser Trp Trp Val Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Stop 325 330 335

【００７４】配列番号：７ 配列の長さ：８９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｃｅ） 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ 存在位置：２．．８８９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 C ATG ACA GAG AAC TCC GAC AAA GTT CCC ATT GCC CTG GTG GGA CCT GAT 49 Met Thr Glu Asn Ser Asp Lys Val Pro Ile Ala Leu Val Gly Pro Asp 1 5 10 15 GAC GTG GAA TTC TGC AGC CCC CCG GCG TAC GCT ACG CTG ACG GTG AAG 97 Asp Val Glu Phe Cys Ser Pro Pro Ala Tyr Ala Thr Leu Thr Val Lys 20 25 30 CCC TCC AGC CCC GCG CGG CTG CTC AAG GTG GGA GCC GTG GTC CTC ATT 145 Pro Ser Ser Pro Ala Arg Leu Leu Lys Val Gly Ala Val Val Leu Ile 35 40 45 TCG GGA GCT GTG CTG CTG CTC TTT GGG GCC ATC GGG GCC TTC TAC TTC 193 Ser Gly Ala Val Leu Leu Leu Phe Gly Ala Ile Gly Ala Phe Tyr Phe 50 55 60 TGG AAG GGG AGC GAC AGT CAC ATT TAC AAT GTC CAT TAC ACC ATG AGT 241 Trp Lys Gly Ser Asp Ser His Ile Tyr Asn Val His Tyr Thr Met Ser 65 70 75 80 ATC AAT GGG AAA TTA CAA GAT GGG TCA ATG GAA ATA GAC GCT GGG AAC 289 Ile Asn Gly Lys Leu Gln Asp Gly Ser Met Glu Ile Asp Ala Gly Asn 85 90 95 AAC TTG GAG ACC TTT AAA ATG GGA AGT GGA GCT GAA GAA GCA ATT GCA 337 Asn Leu Glu Thr Phe Lys Met Gly Ser Gly Ala Glu Glu Ala Ile Ala 100 105 110 GTT AAT GAT TTC CAG AAT GAA GGC AAG ATC ATG CCA GTC AAA TAT GAA 385 Val Asn Asp Phe Gln Asn Glu Gly Lys Ile Met Pro Val Lys Tyr Glu 115 120 125 GAA AAT TCT CTT ATC TGG GTG GCT GTA GAT CAG CCT GTG AAG GAC AAC 433 Glu Asn Ser Leu Ile Trp Val Ala Val Asp Gln Pro Val Lys Asp Asn 130 135 140 AGC TTC TTG AGT TCT AAG GTG TTA GAA CTC TGC GGT GAC CTT CCT ATT 481 Ser Phe Leu Ser Ser Lys Val Leu Glu Leu Cys Gly Asp Leu Pro Ile 145 150 155 160 TCC TGG CTT AAA CCA ACC TAT CCA AAA GAA ATC CAG AGG GAA AGA AGA 529 Ser Trp Leu Lys Pro Thr Tyr Pro Lys Glu Ile Gln Arg Glu Arg Arg 165 170 175 GAA GTG GTA AGA AAA ATT GTT CCA ACT ACC ACA AAA AGA CCA CAC AAT 577 Glu Val Val Arg Lys Ile Val Pro Thr Thr Thr Lys Arg Pro His Asn 180 185 190 GGA CCA CGG AGC AAC CCA GGC GCT GGA AGA CTG AAT AAT GAA ACC AGA 625 Gly Pro Arg Ser Asn Pro Gly Ala Gly Arg Leu Asn Asn Glu Thr Arg 195 200 205 CCC AGT GTT CAA GAG GAC TCA CAA GCC TTC AAT CCT GAT AAT CCT TAT 673 Pro Ser Val Gln Glu Asp Ser Gln Ala Phe Asn Pro Asp Asn Pro Tyr 210 215 220 CAT CAG CAG GAA GGG GAA AGC ATG ACA TTC GAC CCT AGA CTG GAT CAC 721 His Gln Gln Glu Gly Glu Ser Met Thr Phe Asp Pro Arg Leu Asp His 225 230 235 240 GAA GGA ATC TGT TGT ATA GAA TGT AGG CGG AGC TAC ACC CAC TGC CAG 769 Glu Gly Ile Cys Cys Ile Glu Cys Arg Arg Ser Tyr Thr His Cys Gln 245 250 255 AAG ATC TGT GAA CCC CTG GGG GGC TAT TAC CCA TGG CCT TAT AAT TAT 817 Lys Ile Cys Glu Pro Leu Gly Gly Tyr Tyr Pro Trp Pro Tyr Asn Tyr 260 265 270 CAA GGC TGC CGT TCG GCC TGC AGA GTC ATC ATG CCA TGT AGC TGG TGG 865 Gln Gly Cys Arg Ser Ala Cys Arg Val Ile Met Pro Cys Ser Trp Trp 275 280 285 GTG GCC CGT ATC TTG GGC ATG GTG TGA 892 Val Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Stop 290 295

【００７５】配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｃｅ） 直接の起源 クローン名：ｐｈＣＨＭ−ＩＬＡＳＴ８ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ 存在位置：１．．２７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GTG GCC CGT ATC TTG GGC ATG GTG TGA 27 Val Ala Arg Ile Leu Gly Met Val Stop 1 5

【００７６】配列番号：９ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAAAACGAC GGCCAGT 17

【００７７】配列番号：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17

【００７８】配列番号：１１ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCGAGGCCA TGGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 60

【００７９】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCGGCCGCCA TGGCCTCGAG 20

【００８０】配列番号：１３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTCTCCAAG TGCCTCACT 19

【００８１】配列番号：１４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGAGGCCATG GCGGCC 16

【００８２】配列番号：１５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CATGACAGAG AACTCCGA 18

【００８３】配列番号：１６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACACCATGCC CAGGATGC 18

【００８４】配列番号：１７ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCCTAGACTG GATCAC 16

【００８５】配列番号：１８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCACACCATG CCCAAGATAC GGGCCAC 27

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (72)発明者 鈴木 淳子 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 近藤 淳 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 小原 淳子 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 森 哲子 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内 (72)発明者 山田 英 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
   とする新規なヒトコンドロモジュリン−Ｉタンパク質。 １つのポリペプチドから構成される水溶性タンパク
   質であって、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   による分子量が約２６Ｋダルトンである。 軟骨細胞を単独でまたは繊維芽細胞増殖因子共存下
   において増殖させる活性を有する。 軟骨細胞に対し分化機能を促進させる活性を有す
   る。 血管内皮細胞の増殖を抑制する活性を有する。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２、３または４に記載
   のアミノ酸配列で表されることを特徴とする請求項１記
   載のタンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載のタンパク質を
   コードする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２、３、４、５、６ま
   たは７に記載の塩基配列で表されることを特徴とする請
   求項３に記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号５、６または７に記載
   の塩基配列で表されることを特徴とするヒトコンドロモ
   ジュリン−Ｉタンパク質をコードする遺伝子。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号１５および１６に記載
   の合成ＤＮＡで増幅されることを特徴とするＤＮＡ断
   片。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１５および１８に記載
   の合成ＤＮＡもしくはその断片で増幅されることを特徴
   とするＤＮＡ断片。
8. 【請求項８】 請求項３、４、５、６および７に記載の
   遺伝子またはＤＮＡ断片から選ばれる遺伝子またはＤＮ
   Ａ断片によりコードされるポリペプチドを発現可能な組
   換え発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の組換え発現ベクター
   で、宿主細胞を形質転換させて得られた形質転換体。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の形質転換体を培養し
    てヒトコンドロモジュリン−Ｉタンパク質を産生させる
    方法。
11. 【請求項１１】 組換えヒトコンドロモジュリン−Ｉタ
    ンパク質。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のタンパク質および薬
    学的に許容され得る担体よりなる医薬組成物。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載のタンパク質を有効成
    分とする軟骨細胞増殖剤。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載のタンパク質を有効成
    分とする抗腫瘍剤。